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¿Cuál es el papel del tritón en el tampón para el ensayo de transferencia de Western?

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¿Cuál es el papel del tritón en el tampón para el ensayo de transferencia de Western? Entiendo que tiene que ver con la prevención de la unión no específica del anticuerpo.


Eso es exactamente. Triton es un detergente e incorporarlo solo hace que sea un poco más difícil para todo para unir. Así es como imagino que el búfer de bloqueo funciona:

PBS / TBS: pH amortiguador

leche / BSA: interactuando uniformemente con la totalidad de la mancha. La idea es que estos a) se adsorberán en las partes de la mancha que aún no tienen mucha muestra en ellas (ya que las áreas "vacías" de la mancha adsorberían los anticuerpos de detección (esta es una fuente de unión inespecífica) ).

Triton (o, más comúnmente, Tween-20): Bien, ahora piensa en lo que hay en tu mancha. Tu anticuerpo voluntad tener interacciones débiles con casi cualquier cosa allí. Un detergente interactúa con todo lo que toca (anticuerpos y proteínas adsorbidas en la mancha) para reducir la afinidad de unión en muchas de estas interacciones (aunque aquí se pueden encontrar algunos contraejemplos interesantes), lo que hace que la unión menos favorable sea aún menos favorable, disminuyendo la posibilidades de que su anticuerpo de detección retenga estas interacciones más débiles (fuera del objetivo). El artículo anterior también sugiere que el uso de detergentes no iónicos reduce la intensidad de la señal de Western (y en un grado diferente a través de las proteínas).


Análisis de Western Blot

Leonard G. Davis Ph.D. ,. James F. Battey M.D., Ph.D. , en Métodos básicos en biología molecular, 1986

Resumen del editor

Este capítulo proporciona una descripción general del método de análisis de transferencia Western, que permite al investigador identificar proteínas específicas resueltas por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS mediante la unión con antisueros específicos. Las proteínas resueltas en un gel de acrilamida se transfieren a un filtro de nitrocelulosa (NC) que se incuba con el antisuero. El tampón de transferencia utilizado en el método de análisis de transferencia Western consta de base Tris, glicina, agua y metanol. El pH del tampón de transferencia se mantiene con HCl. El anticuerpo primario se une específicamente a su epítopo y el anticuerpo unido se detecta con una especie secundaria, tal como [125] I] -proteína A o anti-IgG de cabra biotinilado. El método de análisis de transferencia Western implica la preparación de gel de poliacrilamida-SDS para la separación de proteínas, y se obtiene el anticuerpo contra la secuencia de proteína de interés. La proteína se transfiere electroforéticamente del gel de poliacrilamida al filtro NC.


Objeto y función de los pasos de bloqueo

Los soportes de membrana utilizados en la transferencia Western tienen una alta afinidad por las proteínas. Por lo tanto, después de la transferencia de las proteínas del gel, es importante bloquear la superficie restante de la membrana para evitar la unión inespecífica de los anticuerpos de detección durante los pasos posteriores. Se han utilizado una variedad de tampones de bloqueo que van desde la leche o el suero normal hasta proteínas altamente purificadas para bloquear los sitios libres en una membrana. El búfer de bloqueo debería mejorar la sensibilidad del ensayo reduciendo la interferencia de fondo y mejorando la relación señal / ruido. El tampón de bloqueo ideal se unirá a todos los sitios potenciales de interacción inespecífica, eliminando el fondo por completo sin alterar u oscurecer el epítopo para la unión del anticuerpo.

La elección adecuada del bloqueador para una mancha determinada depende del antígeno en sí y del tipo de etiqueta de detección utilizada. Por ejemplo, en aplicaciones en las que se utilizan conjugados de AP, debe seleccionarse un tampón de bloqueo en TBS porque el PBS interfiere con la fosfatasa alcalina. Para una verdadera optimización del paso de bloqueo para un inmunoensayo particular, las pruebas empíricas son esenciales. Muchos factores, incluidas diversas interacciones proteína-proteína exclusivas de un conjunto dado de reactivos de inmunoensayo, pueden influir en la unión inespecífica. El parámetro más importante a la hora de seleccionar un bloqueador es la relación señal / ruido, medida como la señal obtenida con una muestra que contiene el analito diana, en comparación con la obtenida con una muestra sin el analito diana. El uso de cantidades inadecuadas de bloqueador dará como resultado una tinción de fondo excesiva y una relación señal / ruido reducida. El uso de concentraciones excesivas de bloqueador puede enmascarar las interacciones anticuerpo-antígeno o inhibir la enzima marcadora, provocando nuevamente una reducción de la relación señal / ruido. Al desarrollar un nuevo inmunoensayo, es importante probar varios bloqueadores diferentes para obtener la relación señal / ruido más alta en el ensayo. Ningún agente bloqueante es ideal para cada ocasión, ya que cada par de anticuerpo-antígeno tiene características únicas.

Manual técnico de detección de proteínas

Este manual de 84 páginas proporciona una descripción profunda del último paso en el flujo de trabajo de Western Blot: la detección de proteínas. Con una variedad de técnicas de detección para elegir (quimioluminiscencia, fluorescencia o cromogénica), puede seleccionar una tecnología que se adapte a sus requisitos experimentales y los instrumentos que tiene disponibles. Ya sea para visualización rápida o cuantificación precisa, detección de sonda única o multiplexación, Thermo Fisher Scientific ofrece una gama de reactivos y kits para la detección de transferencia Western y análisis posterior.


¿Cuál es el papel del tritón en el tampón para el ensayo de transferencia de Western? - biología

A continuación presentamos una revisión exhaustiva de los detergentes de laboratorio y sus aplicaciones en experimentos biomédicos. Esta revisión incluye discusiones sobre detergentes iónicos, no iónicos y bipolares, sus propiedades generales, así como información sobre los detergentes de uso común de cada grupo. Finalmente, incluimos una breve discusión de los resultados de la encuesta de Labome para algunos detergentes comunes.

Los detergentes utilizados en los laboratorios biomédicos son tensioactivos suaves (agentes de acción superficial), utilizados para la lisis celular (es decir, la ruptura de las membranas celulares) y la liberación de materiales intracelulares. Son moléculas anfifílicas, que contienen regiones hidrofílicas e hidrofóbicas. Esta propiedad anfifílica permite que los detergentes rompan las asociaciones proteína-proteína, proteína-lípido y lípido-lípido, desnaturalicen proteínas y otras macromoléculas, y eviten la unión inespecífica en ensayos inmunoquímicos y cristalización de proteínas.

Hay muchos tipos de detergentes que se utilizan en la investigación de laboratorio. Se siguen desarrollando nuevos compuestos anfifílicos, normalmente diseñados para aplicaciones específicas (por ejemplo, maltosa-neopentilglicol [1] y dicarboxilatos sustituidos con glicosilo [2]). En este artículo se revisan las características y aplicaciones de los detergentes de laboratorio más utilizados.

EscribeProductos quimicos
iónicododecil sulfato de sodio (SDS), desoxicolato, colato, sarcosilo
no iónicoTriton X-100, DDM, digitalización, interpolación 20, interpolación 80
zwiteriónicoCHAPS
caotrópicourea

Los detergentes son compuestos orgánicos anfifílicos compuestos por un resto hidrocarburo no polar hidrófobo (cola) y un grupo de cabeza polar hidrófilo (Fig. 1A). Esta estructura molecular es muy similar a los fosfolípidos anfifílicos que forman nuestras membranas celulares, excepto que los fosfolípidos poseen un par de colas hidrófobas unidas al grupo de cabeza hidrófilo (Fig. 1D). Cuando se disuelven en agua a concentraciones y temperaturas adecuadas, las moléculas anfifílicas se autoensamblan en estructuras que mantienen sus grupos de cabeza hidrófilos en el exterior y las colas hidrófobas en el interior lejos del agua. Debido a sus diferencias moleculares, las moléculas de detergente forman micelas esféricas (Fig. 1C) mientras que los fosfolípidos tienen más probabilidades de desarrollar una bicapa (Fig. 1D). La similitud en las estructuras moleculares permite que el detergente penetre en las bicapas de fosfolípidos y, por lo tanto, rompa las membranas celulares.

Además, el núcleo hidrófobo de la micela puede unirse a regiones hidrófobas de proteínas (Fig. 1B). El número de moléculas de detergente en una micela se denomina número de agregación, un parámetro importante que se utiliza para evaluar la solubilidad de las proteínas de la membrana [3]. La longitud de la región hidrofóbica es directamente proporcional al grado de hidrofobicidad y es bastante constante entre los detergentes, mientras que el grupo de cabeza cargado es variable. Tanto la temperatura como la concentración son parámetros importantes de la separación de fases y la solubilidad de un detergente. La concentración mínima de detergente a la que se observan las micelas a una temperatura determinada se denomina Concentración micelar crítica (CMC). En cualquier concentración más baja que la CMC, solo se observan monómeros en concentraciones más altas que la CMC, tanto las micelas como los monómeros coexisten, junto con otras fases no micelares que no se disuelven en agua. Asimismo, la temperatura más baja a la que se forman las micelas se denomina temperatura micelar crítica (CMT). La CMC también se ve afectada por el grado de lipofilia del grupo de cabeza. Generalmente, un carácter lipofílico o lipofóbico bajo da como resultado una CMC alta.

Los detergentes comunes se clasifican en tres grupos según sus características: iónicos (aniónicos o catiónicos), no iónicos y bipolares. A continuación, analizo los detergentes comunes en cada una de estas categorías y proporciono información importante sobre la selección y el uso de detergentes de laboratorio.

Los detergentes iónicos se componen de una cadena hidrófoba y un grupo de cabeza cargado que puede ser aniónico o catiónico. Por lo general, tienen valores de CMC más altos que los detergentes no iónicos y tienden a ser bastante duros. Debido a sus grupos de cabeza cargados, los detergentes iónicos no pueden eliminarse mediante cromatografía de intercambio iónico. Además, se deben tomar precauciones adicionales cuando se usan detergentes iónicos porque algunas de sus propiedades pueden alterarse en tampones con fuerza iónica variable (por ejemplo, la CMC puede caer drásticamente cuando la concentración de NaCl aumenta de 0 a 500 mM).

El SDS aniónico es un tensioactivo muy utilizado y eficaz para solubilizar la mayoría de las proteínas. Rompe los enlaces no covalentes dentro y entre las proteínas, desnaturalizándolas y provocando la pérdida de su conformación y función nativas. El SDS se une a una proteína con una proporción de 1,4: 1 p / p (correspondiente a aproximadamente una molécula de SDS por dos aminoácidos), enmascarando la carga de la proteína. Por tanto, el SDS añade una carga negativa global a todas las proteínas de la muestra independientemente de su punto isoeléctrico (pI). Una vez unidas por moléculas de SDS cargadas negativamente, las proteínas se pueden separar en función del tamaño. Esa es una gran razón para el amplio uso de la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) para separar y estudiar proteínas. Por lo general, para la lisis celular completa en presencia de SDS, una muestra se debe sonicar o cortar (p. Ej., Pasar a través de una aguja de 19G) varias veces para asegurar la degradación del ADN. La SDS no se puede utilizar cuando se requieren proteínas activas o cuando se están estudiando interacciones proteína-proteína porque ambas son interrumpidas por la SDS. Cuando se trabaja con SDS, es importante saber que SDS precipita a bajas temperaturas y este efecto se potencia en presencia de sales de potasio. En ocasiones, este fenómeno puede aprovecharse para eliminar el SDS de una muestra de proteína [4].

El desoxicolato de sodio y el colato de sodio son detergentes de sales biliares. Ambos son detergentes aniónicos. Estos detergentes se utilizan a menudo para la alteración de la membrana y la extracción de proteínas de la membrana, por ejemplo, el receptor de apelina [5]. El desoxicolato desnaturaliza las proteínas, mientras que el colato es un detergente no desnaturalizante. Un beneficio potencial de ambos detergentes es que pueden eliminarse de las muestras mediante diálisis, lo que puede ayudar con la cuantificación y / o análisis posteriores de proteínas.

El sarcosilo, también conocido como sarcosilo o lauroil sarcosinato de sodio, es un tensioactivo aniónico. Es anfifílico debido a la cadena hidrofóbica de 14 carbonos (lauroilo) y al carboxilato hidrofílico. El carboxilato con un valor de pKa de 3,6 se carga negativamente en cualquier solución fisiológica. El sarcosilo se prepara a partir de cloruro de lauroilo y sarcosina en presencia de hidróxido de sodio y se purifica por recristalización en alcohol o por acidificación con un ácido mineral, separación del ácido libre y neutralización del ácido libre. Sarkosyl también se ha utilizado para mejorar la humectación y la penetración de productos farmacéuticos tópicos. En la industria alimentaria, el sarkosyl está aprobado para su uso en el procesamiento, envasado y transporte de alimentos para consumo humano y en adhesivos utilizados en el almacenamiento o transporte de alimentos. Es ampliamente utilizado en formulaciones cosméticas como champús y jabones corporales en concentraciones alrededor del 3-13% [6]. Sarkosyl también se utiliza en el procesamiento de extremos de acabado de metales por sus propiedades modificadoras de cristales, antioxidantes y anticorrosivas.

Sarkosyl se utiliza ampliamente en experimentos de laboratorio, por ejemplo, para solubilizar tau en la investigación de la enfermedad de Alzheimer [7], debido a su buena solubilidad en agua, alta estabilidad de la espuma y fuerte capacidad de absorción de proteínas. Sarkosyl sirve como detergente para permeabilizar las células y extraer proteínas en técnicas de aislamiento y purificación como Western blot y ELISA indirecto. También puede inhibir el inicio de la transcripción del ADN.

Una aplicación importante del sarcosilo es para solubilizar y replegar proteínas de cuerpos de inclusión (agregados de proteínas dentro del citoplasma o núcleos). Proteínas recombinantes eucariotas sobreexpresadas en Escherichia coli tienden a formar tales cuerpos de inclusión. Sarkosyl se usa a menudo para solubilizar un sedimento de cuerpos de inclusión para extraer las proteínas y permitirles replegarse en su forma nativa. El trabajo anterior consistió en solubilizar cuerpos de inclusión con desnaturalizantes, como urea o clorhidrato de guanidinio, y replegar por dilución lenta; sin embargo, la mayoría de las proteínas solubilizadas se agregan y precipitan al eliminar los detergentes fuertes. Sarkosyl es un agente solubilizante eficaz que minimiza la agregación y permite el replegamiento a concentraciones de proteínas más altas (hasta 10 veces más en comparación con el uso de clorhidrato de guanidinio [8]). Un estudio encontró que más del 95% de las proteínas de fusión de cuerpos de inclusión se solubilizaron con sarkosyl al 10%, y que las proteínas podrían recuperarse con una mezcla de otros detergentes (es decir, Triton X-100 y CHAPS) [9]. Las proteínas del extracto soluble con sarkosyl también se pueden almacenar a 4 ° C durante una semana antes de la purificación por afinidad. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el sarkosyl interfiere con el proceso cromatográfico posterior y debe eliminarse de la solución mediante dilución o diálisis.

Los detergentes no iónicos tienen grupos de cabeza hidrófilos sin carga. Se consideran tensioactivos suaves ya que rompen las asociaciones proteína-lípido y lípido-lípido, pero normalmente no son interacciones proteína-proteína y, en general, no desnaturalizan las proteínas. Por lo tanto, muchas proteínas de membrana pueden solubilizarse en su forma nativa y activa, conservando sus interacciones proteicas. Sin embargo, debido a que no todas las proteínas se comportan de la misma manera con diferentes detergentes no iónicos, puede ser necesario probar y cometer errores para encontrar el mejor detergente para las proteínas que le interesan. Además, debe tenerse en cuenta que la mayoría de los detergentes no iónicos interfieren con la espectrofotometría ultravioleta (UV). Por tanto, la determinación de proteínas a 280 nm en presencia de detergentes no iónicos suele ser imprecisa.

Todos los miembros de la familia Triton: Triton X-100, Triton X-114, Nonidet P-40 (NP-40), Igepal® CA-630, son bastante similares, difiriendo ligeramente en su número medio (n) de monómeros por micela (9,6, 8,0, 9,0 y 9,5, respectivamente) y la distribución de tamaño de su grupo de cabeza basado en polietilenglicol (PEG). Los valores de CMC de estos detergentes son bajos y, por lo tanto, no pueden eliminarse fácilmente mediante diálisis. Triton X-100, un detergente no iónico típico, se deriva del polioxietileno y contiene un grupo hidrófobo de alquilfenilo. Triton X-100 se usa comúnmente para aislar complejos de proteínas de membrana y el surfactante de elección para la mayoría, como para experimentos de co-inmunoprecipitación. Otros miembros de la familia Triton se utilizan para el aislamiento de proteínas de membrana mediante separación de fases debido a los puntos de enturbiamiento bajos (la temperatura a la que las micelas se agregan y forman una fase distinta). Mientras que el punto de enturbiamiento de Triton X-100 es de 64 ° C, el punto de enturbiamiento de Triton X-114 es de 23 ° C. Esto permite la extracción y solubilización de proteínas de membrana en Triton X-114 sin llevar las muestras a temperaturas más cálidas que pueden desnaturalizar muchas proteínas.

Brij ™ 35 es otro tensioactivo de polioxietileno no iónico, comúnmente utilizado como un componente de tampones de lisis celular o tampones de ensayo o un tensioactivo en aplicaciones de HPLC.

El n-dodecil-β-D-maltósido (DDM) es un tensioactivo glucosídico, que se utiliza cada vez más con el aislamiento de proteínas hidrófobas y de membrana cuando es necesario preservar la actividad de la proteína. Es más eficiente en la solubilización de proteínas para electroforesis 2-D que varios otros detergentes, incluidos CHAPS y NP-40 [10]. La glicocadena en su sitio lipofílico, su alto CMC de 0,17 mM y la interfase de las micelas crean un microambiente de tipo acuoso ideal para solubilizar y retener la estabilidad de la membrana y las proteínas hidrofóbicas [11]. Por ejemplo, Winkler MBL et al purificaron la proteína NCR1 con la adición de n-dodecil-β-D-maltopiranósido [12], al igual que Li Y et al para las proteínas LptB2FG y LptB2FGC [13]. Steichen JM et al mezclaron complejos de proteínas en una solución de DDM de Anatrace antes de Cryo-EM [14].

Otros maltósidos, como el beta-decil-maltósido, tienen diferentes longitudes de cadenas de alquilo hidrófobas. Los glucósidos (octil-glucósidos) son una alternativa potencial a los detergentes maltósidos para la investigación de proteínas [15].

Digitonina, un glucósido esteroide derivado de la planta dedalera púrpura (Digitalis purpurea), se utiliza para la solubilización de membranas celulares. Al igual que con otros detergentes no iónicos discutidos aquí, la digitonina se usa con frecuencia para solubilizar proteínas de membrana sin desnaturalizarlas. Por ejemplo, B de Laval et al lisaron células con 1% de digitonina para la reacción de transposasa Tn5 durante el protocolo ATAC-seq [16]. Zhao Y et al liberaron receptores AMPA sinápticos y extrasinápticos a partir de la densidad postsináptica con digitonina [17]. Además, la digitonina se usa para extraer orgánulos celulares. La digitonina interactúa con el colesterol en las membranas y, por lo tanto, puede usarse para permeabilizar la membrana plasmática rica en colesterol mientras deja intactas las membranas orgánulos pobres en colesterol.

Tween-20 y Tween-80 son tensioactivos de polisorbato con un resto de éster de ácido graso y una cadena de polioxietileno larga. Tienen CMC muy baja, son generalmente tensioactivos suaves, no afectan la actividad de las proteínas y son eficaces en la solubilización. Los preadolescentes no son ingredientes comunes de los tampones de lisis celular, sin embargo, se usan de forma rutinaria como agentes de lavado en inmunotransferencia y ELISA para minimizar la unión inespecífica de anticuerpos y eliminar restos no unidos, y se usan para permeabilizar las membranas celulares. Por ejemplo, Yang J et al inmunotinieron la etiqueta FLAG intracelular después de tratar las células HEK293 con Tween 20 al 0,2% [18].

Una pregunta común con respecto a los detergentes de la familia Tween es la diferencia entre Tween 20 y Tween 80, los dos miembros más utilizados. Tween 20 tiene ácido láurico, mientras que Tween 80 tiene ácido oleico (Figura 3). La Tabla 2 resume varios aspectos entre ellos. Estos detergentes a menudo se pueden usar indistintamente, sin embargo, la diferencia entre ellos es a veces importante, como en en vivo estudios que pueden estar influenciados por los diferentes niveles de efecto hemolítico de Tween 20 y Tween 80 [19]. Greenwood DJ et al, por ejemplo, crecieron Tuberculosis micobacteriana en un medio complementado con Tween 80 al 0,05% [20]. Ouadah Y et al inyectaron una solución de dibenzazepina con Tween 80 al 0,1% v / v en ratones para inhibir la señalización de Notch [21].

Sinónimos Fórmula química Peso molecular Densidad (g / mL) Apariencia Aplicaciones
Tween 20polisorbato 20, monolaurato de polioxietilensorbitán, monolaurato de sorbitán PEG (20)C 58 H 114 O 26 12281.1Líquido viscoso transparente, amarillo a amarillo verdosouna amplia gama de aplicaciones: como agente bloqueante en tampones de lavado PBS o TBS para ELISA, Western blot y otros métodos de inmunoensayo para lisar células de mamíferos y como agente solubilizante para proteínas de membrana.
Tween 80polisorbato 80, monooleato de polioxietilensorbitán, monooleato de sorbitán PEG (80)C 64 H 124 O 26 13101.06-1.09líquido viscoso de color ámbarcomo agente estabilizador de proteínas utilizadas en pruebas para la identificación del fenotipo de algunas micobacterias utilizadas en preparaciones de vacunas [22]

Aunque los detergentes no iónicos son generalmente relativamente suaves, muchas proteínas se desnaturalizan o se agregan en presencia de estos detergentes. Para mejorar este problema, se han desarrollado nuevos anfifilos de gluco-litocolato no iónicos (GLC-1, GLC-2 y GLC-3) y anfifilo de gluco-diosgenina (GDN) [23]. La GDN se utilizó para extraer ATP sintasa dimérica mitocondrial de levadura para comprender mejor cómo funciona la proteína [24]. Pluronic F-68 se utiliza comúnmente en cultivos de células en suspensión al 0,1% para reducir la fuerza de corte del agua [25].

Los grupos de cabeza de los detergentes de ion híbrido son hidrófilos y contienen cargas tanto positivas como negativas en igual número, lo que da como resultado una carga neta cero. Son tensioactivos más agresivos que los detergentes no iónicos. Un detergente de ion híbrido típico es el 3- & # 91 (3-colamidopropil) dimetilamonio & # 93-1-propanosulfonato, mejor conocido como CHAPS. CHAPS alto CMC (6 mM a temperatura ambiente) permite una eliminación eficiente mediante diálisis. Es muy común en la preparación de muestras a concentraciones de 2-4% para enfoque isoeléctrico y electroforesis 2D. CHAPSO se diferencia de CHAPS en que contiene un grupo de cabeza más polar, lo que lo hace más capaz de solubilizar moléculas hidrófobas. Por tanto, CHAPSO se utiliza principalmente para la solubilización de proteínas integrales de membrana.

Los agentes caotrópicos son sustancias similares a los tensioactivos en que rompen interacciones no covalentes (enlaces de hidrógeno, interacciones dipolo-dipolo, interacciones hidrofóbicas) facilitando la desnaturalización de las proteínas, que en este caso suele ser reversible. La urea es un agente caotrópico común que se usa solo o en combinación con tiourea u otros detergentes, en aplicaciones como la electroforesis en gel 2D y la digestión enzimática de proteínas en solución para su preparación durante los flujos de trabajo proteómicos. Cuando se utiliza urea, se debe tener especial cuidado de no calentar la muestra por encima de 37 ° C, ya que esto conducirá a la carbamilación de las proteínas [26].

Para la solubilidad de las proteínas de la membrana, generalmente se debe elegir un detergente con alto contenido de CMC, y el volumen y la concentración del tampón también son cruciales, ya que debe haber suficiente detergente para solubilizar todas las proteínas de la membrana en la muestra. En la mayoría de los casos, la concentración de detergente debe estar muy cerca del nivel de CMC (al menos 2 veces la CMC) para asegurar una concentración de micelas suficiente para solubilizar las proteínas de la membrana. Según Linke [3], se necesita al menos una micela por molécula de proteína de membrana para imitar suficientemente el entorno lipídico de una membrana (Fig. 1B, D).

La separación de fases se puede utilizar para purificar aún más las proteínas. Esto requiere ajustar la temperatura y las concentraciones de sales y detergente en el tampón para hacer que las micelas del detergente se agreguen y se separen de la capa acuosa. En este caso, las proteínas de membrana, rodeadas por las micelas, se agregan con el detergente. La temperatura a la que la solución de detergente se separa en dos fases, el punto de enturbiamiento, se ve afectada por el glicerol o las sales en el tampón (p. Ej., Triton X-114 tiene un punto de enturbiamiento de 23 ° C, pero en presencia de glicerol al 20%, el punto de enturbiamiento desciende a 4 ° C). Esto es muy importante ya que la estabilidad de una proteína se ve afectada por las altas temperaturas.

Un buen detergente debe poder lisar células, solubilizar proteínas y ser adecuado para sus aplicaciones posteriores. Además, debe considerarse la proteína solubilizada en forma nativa o desnaturalizada. No existe un detergente ideal para todas las aplicaciones, e incluso en la misma aplicación, el resultado varía (Tabla 3). Por lo tanto, después de considerar las opciones, a menudo es necesario probar y equivocar para encontrar el mejor detergente, y una mezcla de detergentes puede ser óptima. Además, la preparación fresca de la solución de trabajo de detergente suele ser la mejor práctica para evitar la hidrólisis y la oxidación.

DetergenteMonómero MW (Da)MW (Da) micelaCMC (mM) 25 o CAgregación No.Punto de nube (o C)Promedio Peso micelarFuerzaDializableAplicaciones
SDS28918,0007-1062>10018,000DuroLisis celular, electroforesis, WB, hibridación
Triton X-10062590,0000.2-0.9100-1556580,000LeveNoInmunoensayos enzimáticos, IP, Solubilización de membranas
CHAPS6156,150610>1006,150LeveIEF, IP
NP-4068090,0000.059 45-50 LeveNoIEF
n-dodecil-β-D-maltósido511 0.1598 50,000 Cristalización de proteínas
Tween-201228 0.06 76 LeveNoWB, ELISA, inmunoensayos enzimáticos
Digitonina122970,000<0.560 70,000LeveNoSolubilización de membranas

Las aplicaciones posteriores a menudo requieren que las concentraciones de detergente se reduzcan o se eliminen por completo. Para tales propósitos, se puede usar la cromatografía de exclusión por tamaño o la diálisis si el tamaño de la micela es sustancialmente diferente al de la proteína de interés o si las micelas son lo suficientemente pequeñas (es decir, alto CMC) para pasar a través del tubo de diálisis [3]. Otros métodos emplean el uso de perlas o resinas no polares que se unen a detergentes, compuestos de inclusión de ciclodextrina [27], cromatografía de intercambio iónico o precipitación de proteínas. Sin embargo, el tampón utilizado después de la eliminación del detergente debe seleccionarse con cuidado para evitar la precipitación o agregación de proteínas.

Labome examina la literatura sobre la aplicación de detergentes. La siguiente tabla enumera los principales proveedores y el número de artículos, indicando que la mayoría de los detergentes son suministrados por MilliporeSigma.

detergente proveedores
Triton X-100Thermo Fisher [28, 29], Ciencias de microscopía electrónica [30], Amresco, JT Baker
Tween-20Bio-Rad [31], MilliporeSigma [29], Thermo Fisher
SDSAmresco, Bio-Rad, Q.BIOgene, MilliporeSigma
NP-40Roche, MilliporeSigma [32]
CHAPSMilliporeSigma, JT Baker
digitoninMilliporeSigma, Wako
DDMGeneron [33], Anatrace [15]

Thermo Fisher Pierce Triton X-100, por ejemplo, BP151 [29] o 85111 [28], se usó para lisar muestras de células y tejidos para inmunohistoquimia [29] e inmunocitoquímica [28]. MilliporeSigma Triton X-100 se utilizó para lisar células [34], o permeabilizar células en inmunocitoquímica [35] y en tampón de bloqueo para inmunohistoquímica [36, 37] y ensayo de protección con proteinasa K [38].

Tween-20 se usa comúnmente en tampones de lavado, como TBS-Tween (TBS-T) o PBS-Tween (PBT-T), en varios inmunoensayos. MilliporeSigma Tween-20, por ejemplo, P1379 [29], se utilizó en transferencias de lavado [29], en experimentos de IHC (P1379) [39], en inmunoprecipitación [40] y en PCR multiplex de matriz de microfluidos [41] y otros [ 42]. MilliporeSigma Tween-80, se utilizó para disolver erlotinib (un fármaco de quimioterapia) [43] y como suplemento para crecer M. tuberculosis cepas [44].

Lonza SDS (número de catálogo 51213) se utilizó en preparaciones de cromatina [39]. Amresco SDS se utilizó en SDS-PAGE [45]. Se utilizó dodecilsulfato de sodio Bio-Rad para preparar un tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación [46]. MilliporeSigma-Aldrich SDS se utilizó para preparar tampones para, entre otros, ensayos de octanoilación in vitro, tampón de muestra de Laemmli, experimentos 2D-DIGE [47].

Roche NP-40 se utilizó en la lisis celular [48, 49]. Se utilizó MilliporeSigma NP-40 para preparar tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación [46], tampones de lisis / homogeneización celular [50, 51] y tampón RIPA de ensayo de inmunoprecipitación [52].

MilliporeSigma CHAPS se utilizó en tampones para la cristalización de proteínas [53]. JT Baker CHAPS se utilizó para lisar células para estudiar la interacción viral con la proteína ASF1 humana [54].

MilliporeSigma se utilizó en un experimento de inmunocitoquímica para estudiar PI4P [55] y se utilizó para realizar ensayos de protección con proteinasa K [38] y para extraer ARN [56]. Wako digitonin se utilizó para lisar células [57] y realizar experimentos de inmunoprecipitación [58].

Y Lee et al solubilizaron una proteína GPCR con dodecilmaltósido / DDM de Generon [33]. Se utilizó n-decil-beta-D-maltopiranósido de Anatrace para la purificación de proteínas [59, 60], al igual que su n-dodecil-beta-D-maltósido [61] y n-undecil-beta-D-maltósido [62, 63] . También se utilizaron glicona beta-dodecil-maltósido y beta-decil-maltósido en la purificación de proteínas [64]. Se utilizó n-octil-beta-glucósido de Anatrace para solubilizar proteínas AQP4 [15].

Silva MC et al utilizaron Brij-35 como detergente para el ensayo de biosensor de interferometría de biocapa [65]. Para las purificaciones de proteínas, se utilizaron Affymetrix octil glucosa neopentilglicol (OGNPG) al 1% [66] y hemisuccinato de colesterilo MilliporeSigma al 0,1% o al 0,05% (p / v) [11, 67]. Para los ensayos relacionados con la cromatina, se utilizaron desoxicolato de sodio MilliporeSigma-Aldrich (número de catálogo D6750) e Igepal (número de catálogo I8896) y TEKnova N-lauroilsarcosina (número de catálogo S3379) [39].


Western blot: técnica, teoría y resolución de problemas

La transferencia Western es una técnica importante utilizada en biología celular y molecular. Mediante el uso de una transferencia Western, los investigadores pueden identificar proteínas específicas a partir de una mezcla compleja de proteínas extraídas de las células. La técnica utiliza tres elementos para realizar esta tarea: (1) separación por tamaño, (2) transferencia a un soporte sólido y (3) marcación de la proteína diana usando un anticuerpo primario y secundario adecuado para visualizar. Este artículo intentará explicar la técnica y la teoría detrás del western blot y ofrecerá algunas formas de solucionar problemas.

Palabras clave: Western blot de proteína de investigación biomédica.

Declaracion de conflicto de interes

Conflicto de intereses: Ninguno declarado.

Cifras

Gradilla ensamblada para solidificación de gel

Gradilla ensamblada para solidificación de gel

Agregue la solución de gel con una pipeta de transferencia.

Agregar búfer en ejecución a…

Agregue tampón de funcionamiento al electroforador

Agregue muestras y marcador molecular…

Agregue muestras y marcador molecular al gel, después de quitar los peines.

(a) Muestras que pasan por ...

(a) Muestras que atraviesan el gel de apilamiento (voltaje más bajo). (b): Muestras pasando por…


Contenido

Triton X-100 sin diluir es un fluido viscoso transparente (menos viscoso que el glicerol sin diluir). Triton X-100 sin diluir tiene una viscosidad de aproximadamente 270 centipoise a 25 ° C, que se reduce a aproximadamente 80 centipoise a 50 ° C. Triton X-100 es soluble a 25 ° C en agua, tolueno, xileno, tricloroetileno, etilenglicol, éter etílico, alcohol etílico, alcohol isopropílico y dicloruro de etileno. Triton X-100 es insoluble en queroseno, alcoholes minerales y nafta, a menos que se utilice un agente de acoplamiento como el ácido oleico. [5]

Triton X-100 es un detergente de uso común en laboratorios. [6] Triton X-100 se usa ampliamente para lisar células para extraer proteínas u orgánulos, o para permeabilizar las membranas de las células vivas. [7]

Algunas aplicaciones incluyen:

    de virus envueltos en lípidos (por ejemplo, VIH, VHB, VHC) en la fabricación de productos biofarmacéuticos
  • Uso industrial (enchapado de metal), incluido Fluzone
  • Permeabilizar membranas de células eucariotas no fijadas (o ligeramente fijadas) [7]
  • Solubilización de proteínas de membrana en su estado nativo junto con detergentes de ion híbrido como CHAPS
  • Parte del tampón de lisis (generalmente en una solución al 5% en tampón de lisis alcalino) en la extracción de ADN
  • Reducir la tensión superficial de las soluciones acuosas durante la inmunotinción (generalmente a una concentración de 0,1-0,5% en tampón TBS o PBS)
  • Dispersión de materiales de carbono para materiales compuestos blandos
  • Restringir la expansión de colonias en Aspergillus nidulans en microbiología
  • Descelularización de tejidos derivados de animales
  • Eliminación de SDS de geles SDS-PAGE antes de renaturalizar las proteínas dentro del gel
  • Interrupción de monocapas celulares como control positivo para las mediciones de TEER
  • Catalizador micelar

Además del uso en laboratorio, Triton X-100 se puede encontrar en varios tipos de compuestos de limpieza, [8] que van desde productos industriales de alta resistencia hasta detergentes suaves. It is also a popular ingredient in homemade vinyl record cleaning fluids together with distilled water and isopropyl alcohol. [9]

In December 2012, the European Chemicals Agency (ECHA) included the substance group “4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol, ethoxylated” – which includes Triton X-100 – in the Candidate List of substances of very high concern [10] of the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH) Regulation which addresses the production, import and use of chemical substances and their potential impacts on human health and the environment. [11] A Triton X-100 degradation product has indeed turned out to be ecotoxic as it possesses hormone-like (estrogeno-mimetic) activity that may act on wildlife. [12] The ECHA finally included the substance group in the Authorisation List (Annex XIV), [13] mandating the pharmaceutical and other industries to replace this detergent by the “sunset date” January 4, 2021, thereby affecting EU manufacturers, importers, and downstream users, as well as non-European manufacturers exporting their products into the EU.

Alternatives for viral inactivation Edit

Since the inclusion of Triton X-100 in the candidate list of substances of very high concern for authorization, pharmaceutical companies, as well as bioprocessing research groups, are in need of an alternative detergent which must at the same time be eco-friendly and effective. Ideally, a Triton X-100 replacement should generate minimal manufacturing process change, because only then the necessary updates of regulatory filings for medicines could be realized without additional animal experiments or even clinical studies. Therefore, an alternative virus-inactivating detergent should have physico-chemical properties similar to Triton X-100, should be soluble, easy to remove, eco-friendly, but not degrade to toxic metabolites. In a recent study, [14] two alternatives for antiviral treatment in biopharmaceutical manufacturing have been identified: Triton X-100 reduced, as well as a novel compound which was named Nereid (after the mermaids in Greek mythology). As reflected by the name, Nereid can be seen as just another relative of the Triton X-100 family, however, due to a small molecular difference, it does not degrade into phenolic compounds the way that Triton X-100 does. The virus inactivation studies comprised experiments with several relevant viruses under various conditions. It turned out that at room temperature, where most virus inactivation steps in biopharmaceutical manufacturing are conducted, both Triton X-100 reduced and Nereid showed similar virus inactivating performances as Triton X-100. In contrast, for some processes that are conducted at cold temperatures, Nereid and Triton X-100 gave better results than Triton X-100 reduced. To date, Nereid can be produced at kilogram-scale using a three-step synthesis, and a patent has been applied for. [15] Nereid is scalable and compatible with existing processes and has not shown any impact on product activity so far. In terms of performance, Nereid would be a robust “all-in-one” replacement for Triton X-100. Thus, it is currently tested in ecotoxicology and biodegradation studies to confirm that it is environmentally safe.


Chapter 13 - Co-IP assays for measuring GPCR–arrestin interactions

βarrestin1 and -2 (also known as arrestin2 and -3, respectively) are G protein-coupled receptor (GPCR) adapter proteins, performing three major functions in the cell: functional desensitization, i.e., G protein uncoupling from the receptor, GPCR internalization via clathrin-coated pits, and formation of signalosomes. The βarrestins elicit a large part of the G protein-independent signaling emanating from GPCRs. Several methodologies have been developed over the past 15 years or so to quantify the GPCR–arrestin interaction/binding, especially since the latter's roles in signal transduction were discovered. One of the simplest and most traditional of these methodologies is the assay of co-immunoprecipitation (co-IP), followed by western blotting. This assay is also one of the most reliable ones, since it does not require any chemical modification of either component in the complex (i.e., neither of the receptor nor of the arrestin). Therefore, it is the only assay that can detect and semi-quantify interactions between native GPCRs and native arrestins. The caveat of this assay is of course that its reliability depends on the quality (specificity and sensitivity) of the utilized antibodies. Here, we describe a simple protocol for performing this co-IP assay to get a measurement of the steady-state levels of agonist-elicited GPCR–arrestin interaction in cells.


Interpretation and Use of the Western Blot Assay for Serodiagnosis of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Infections

Reported by: Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors and AIDS Program, Center for Infectious Diseases, Public Health Practice Program Office, Centers for Disease Control* The Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors (ASTPHLD) and CDC have collaborated in preparing this report. It includes a description of various interpretive criteria associated with the Western blot test for HIV-1, evaluates the sensitivity and specificity of these criteria as tools for public health practice, and provides recommendations for use of the Western blot and the manner in which to report results in order to provide clinicians and public health policy officials with useful information in their efforts to reach an accurate diagnosis for persons tested for HIV-1 infection. INTRODUCCIÓN

The development of sensitive and specific tests for antibody to human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) progressed rapidly after this retrovirus was identified as the cause of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). These tests have been used for various purposes, including clinical diagnosis of HIV-1 infection--for symptomatic and asymptomatic patients in counseling and testing programs--for seroprevalence surveys, and for blood-donor screening.

Enzyme immunoassay (EIA) is the most widely used serologic test for detecting antibody to HIV-1. Serum samples that are repeatedly reactive in the EIA for HIV-1 antibody are then retested with a supplemental and more specific test, the most common of which is the Western blot (1-3). To date, only one commercial Western blot test (Du PontœPr) has been licensed by the Food and Drug Administration (FDA). The purpose of this report is to provide guidance for interpreting Western blot test results and their use in diagnosing HIV-1 infection. THE WESTERN BLOT ASSAY

The Western blot assay is a method in which individual proteins of an HIV-1 lysate are separated according to size by polyacrylamide gel electrophoresis. The viral proteins are then transferred onto nitrocellulose paper and reacted with the patient's serum. Any HIV antibody from the patient's serum is detected by an antihuman immunoglobulin G (IgG) antibody conjugated with an enzyme that in the presence of substrate will produce a colored band. Positive and negative control serum specimens are run simultaneously to allow identification of viral proteins.

Table 1 lists the major structural proteins coded for by the HIV genome. Antibodies to the HIV-1 major group-specific antigen (GAG) protein p24, and its precursor p55, are the earliest detected after infection by Western blot and tend to decrease or become undetectable with onset or progression of clinical symptoms (4-9). In contrast, antibodies to the envelope (ENV) precursor protein gp160 and the final ENV proteins (gp120 and gp41) can be detected in specimens from virtually all HIV-infected persons regardless of clinical stage (4-9). Antibodies to the polymerase (POL) gene products (p31, p51, and p66) are also commonly detected if these antigens are present on the Western blot strips. However, in a recent study, the protein with a mobility of 160 kilodaltons (kd) present in commercially available Western blots and in viral lysate antigen preparations was identified as a multimer of the gp41 protein (10,11). Furthermore, this study presented evidence that the reaction observed against the gp120 on certain Western blots may have resulted in part from a reaction with a multimeric form of the gp41. In fact, the true gp120 was shown to be absent from some commercial Western blot antigens. When these reagents were used, serum specimens with only gp41 antibodies produced bands at the 41-, 120-, and 160-kd positions. Interpretive Criteria

Although the overall sensitivity and specificity of the Western blot for detection of antibodies to the various viral proteins are high, there has been substantial debate regarding the interpretive criteria. The currently licensed Du Pont Western blot test specifies that the test result should be interpreted as positive only when the detected bands include p24 and p31, and gp41 or gp120/160 (12) (see Table 2). Conversely, a negative Du Pont Western blot test result requires the absence of any and all bands--not just viral-bands. All other patterns are regarded as indeterminate. This interpretation scheme maximizes the specificity of the assay and is mainly intended for use with samples from persons, such as blood donors, for whom there is usually little clinical or virologic information available. (Donated units of blood that are repeatedly reactive by EIA are discarded Western blot results are used to guide donor notification and deferral.) These criteria are not ideal for all situations, especially the testing of persons at increased risk for HIV infection, or with symptoms suggestive of this infection.

Alternative criteria have been proposed by various groups. ASTPHLD has proposed that a positive test result be defined by the presence of any two of the following bands: p24, gp41, and gp120/160 (13). The Consortium for Retrovirus Serology Standardization (CRSS) has defined a positive test result as the presence of either p24 or p31, plus a diffuse envelope band (i.e., gp41 or gp120/160) (14). The American Red Cross has defined a positive test result as greater than or equal to 1 band from each of the GAG, POL, and ENV gene-product groups (15). These three groups and DuPont all agree that an indeterminate result is the presence of any other band or bands that fail to meet the positive criteria, and that a negative result is the absence of all bands.

The criteria for a negative Western blot interpretation specify "no bands." This interpretation is essential because some observed bands may reflect the presence of antibodies to HIV regulatory proteins or may indicate partially processed or degraded viral structural proteins. Furthermore, different Western blots (commercial, as well as "in-house" preparations) and different virus-antigen preparations used to prepare Western blots may contain different numbers and concentrations of both viral-specific and contaminating cellular proteins that may have unpredictable molecular weights. Evaluation of Criteria

To compare the four sets of criteria for Western blot interpretation, CDC selected 424 serum samples on the basis of the patients' clinical status and EIA results only, and analyzed them using the licensed Du Pont Western blot test (CDC unpublished data). The samples were scored according to each of the criteria (Table 3). For all three categories with repeatedly reactive EIA test results, the Western blot results demonstrate that the ASTPHLD definition gives the highest percentage of positive and the lowest percentage of indeterminate results. The interpretive standards that require the identification of bands from each of the three groups of gene products tend to have indeterminate results for some AIDS and other symptomatic patients due to absence of antibodies to p24 (n=5) or to p31 (n=14) or absence of both types of antibodies (n=2). Since these patients clearly are infected with HIV, the three-gene-product approach to Western blot interpretation is not sensitive enough for public health or clinical practice.

The ASTPHLD/CDC criteria for a positive Western blot differ from the CRSS criteria in two ways: first, ASTPHLD/CDC deletes p31, a change that does not affect the sensitivity or specificity of the criteria (Table 3), and second, ASTPHLD/CDC adds "gp41 and gp120/160," a combination not interpreted as positive with the CRSS criteria. This latter combination of bands represents antibody to envelope glycoproteins only. In practice, this is a rare finding for asymptomatically infected persons, but it has been reported to be specific for HIV-infected persons and should be included in the positive criteria (9). However, when a Western blot test has only the multimeric form of gp41 and no true gp120 present, a serum sample would be scored as positive on the basis of the presence of antibody to a single envelope glycoprotein, gp41. HIV-1-infected persons with this profile have lost their antibodies to the GAG proteins and are usually symptomatic and do not present a diagnostic problem.

The ASTPHLD/CDC interpretive criteria for a negative result are identical to the FDA recommendation for blood-donor reentry or the Western blot interpretive criteria that are specified in the licensed Western blot kit package insert. Recomendaciones

On the basis of the results described above, CDC concurred with the ASTPHLD criteria and recommends their use in public health and clinical practice.

Laboratories should report test results as positive, indeterminate, or negative. The Public Health Service recommends that no positive test results be given to clients/patients until a screening test has been repeatedly reactive (i.e., greater than or equal to two tests) on the same specimen and a supplemental, more specific test such as the Western blot has been used to validate those results (3). Upon request, laboratory reports may also contain a list of the bands detected and reference to the interpretive criteria the laboratory uses. Because of the variability of unlicensed reagents, laboratories using non-FDA-licensed Western blots should compare, on a routine basis, their tests with the FDA-licensed Western blot kit using well-characterized serum specimens.

Clinical diagnosis and follow-up of patients is the responsibility of the clinical practitioner. Serologic test results are but one contribution to a patient's data base, which contains medical history (including high-risk behavior or exposure to HIV), results of physical examination, and other clinical findings. Clinicians must consider the total profile for a client when attempting to make a diagnosis after indeterminate Western blot results have been obtained. Accurate diagnosis for such persons can be challenging--and the challenge can be complicated by the tendency of some clients to become distressed by the apparent "uncertainty" of their test results.

Clinical follow-up of patients with indeterminate Western blot results may require many months of observation, interviewing, and testing. Most indeterminate patterns involve p18 (also referred to as p17), p24, or p55, or any combination of these three proteins (16-18). In one study of 390 "atypical" or indeterminate samples, 53% reacted against p24, with or without p18 or p55 47% reacted against p18 (but not p24), with or without p55 (18).

Some indeterminate results may be obtained with serum samples from persons who are in the process of seroconverting. A compilation of 209 volunteer blood donors with GAG-only indeterminate Western blot results were followed for as long as 2 years (17-21). During that time, only five of 134 persons who had initially reacted to p24 developed additional bands on the Western blot test. None of the 75 persons who initially reacted against p18 (but not p24) developed additional bands. The five persons who did seroconvert had positive results when their first follow-up samples were tested. The intervals between initial and follow-up tests were 8 weeks (two persons), 20 weeks (two persons), and 32 weeks (one person). The three longest intervals reflected delays in follow-up testing and not the actual time to seroconversion. These results do not refute earlier findings that seroconversion typically occurs within 3 months of infection (5,22). The importance of careful risk assessment for persons with indeterminate Western blot patterns was reemphasized when in one study (18) two of three people who initially had indeterminate results (but later seroconverted) disclosed histories of risk behavior when they were reinterviewed during follow-up.

A person whose Western blot test results continue to be consistently indeterminate for at least 6 months--in the absence of any known risk factors, clinical symptoms, or other findings--may be considered to be negative for antibodies to HIV-1. Such persons should be reassured that they are almost certainly not infected with HIV-1. However, no large-scale studies have been done to provide virologic data to confirm independently the serologic findings from the studies of clients whose Western blot test results are consistently indeterminate. In contrast, an asymptomatic person who has an indeterminate Western blot test result and a history of possible exposure to or symptoms compatible with HIV infection requires additional diagnostic follow-up. This should include conducting serial Western blot testing, assessing the function of the individual's immune system, and eliciting the cooperation of the person's sexual and needle-sharing partners to determine whether they are infected. Individuals with a pattern of indeterminate Western blot test results should not donate blood or plasma for either transfusion or use in manufactured blood products.

As the HIV/AIDS epidemic continues, additional tests of higher specificity will be needed to decrease the number of false-positive reactions and to permit correct diagnosis of HIV infection in a larger spectrum of clinical situations in which an indeterminate antibody profile exists. The use of new antibody tests based on antigens derived by recombinant deoxyribonucleic acid (DNA) technology or the application of DNA probe technology--particularly DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR)--already shows promise in this area (23).

Referencias

Centers for Disease Control. Provisional public health service

inter-agency recommendations for screening donated blood and plasma for antibody to the virus causing acquired immunodeficiency syndrome. MMWR 198534:1-5.

2. Centers for Disease Control. Public health service guidelines for counseling and antibody testing to prevent HIV infection and AIDS. MMWR 198736:509-15.

3. Centers for Disease Control. Update: Serologic testing for antibody to human immunodeficiency virus. MMWR 198836:833-40, 845.

4. Lange JMA, Coutinho RA, Krone WJA, et al. Distinct IgG recognition patterns during progression of subclinical and clinical infection with lymphadenopathy associated virus/human T lymphotropic virus. Brit Med J 1986292:228-30.

5. Esteban JI, Shih JW, Tai CC, et al. Importance of Western blot analysis in predicting infectivity of anti-HTLV-III/LAV positive blood. Lancet 19852:1083-6.

6. Goudsmit J, Lange JMA, Paul DA, et al. 1987. Antigenemia and antibody titers to core and envelope antigens in AIDS, AIDS-related complex, and subclinical human immunodeficiency virus infection. J Infect Dis 1987155:558-60.

7. Lange JDA, Paul DA, Huisman HG, et al. Persistent HIV antigenemia and decline of HIV core antibodies associated with transition to AIDS. Brit Med J 1986293:1459-62.

8. Weber JN, Clapham PR, Weiss RA, et al. Human immunodeficiency virus infection in two cohorts of homosexual men: neutralizing sera and association of anti-gag antibody with prognosis. Lancet 1987i:119-21.


Maintain some integrity with NP-40 or Triton X-100 lysis buffer

NP-40 (Nonidet P-40) and Triton X-100 are milder, nonionic detergents. They are good at solubilizing membrane proteins and for isolating cytoplasmic proteins. Proteins retain their native state in the presence of these detergents and protein-protein interactions can be preserved. These buffers can be used for co-IPs.

NP-40 and Triton X-100 will not lyse nuclear membranes. After lysis, pellet the nuclei by centrifugation and transfer the supernatant to a new tube. If you wish to isolate both the nuclear and soluble fractions, resuspend the nuclear pellet in RIPA buffer.

NP-40 is also marketed under the name Igepal CA-630.

NP-40/Triton X-100 lysis buffer : 50 mM Tris•HCl, pH 8.5, 150 mM NaCl*, 1% detergent*

*The concentrations of salts and detergents can be altered to optimize protein recovery.


Primary antibodies and determining specificity

The principle of the WB is the detection of protein(s) through the binding and recognition of antibodies (Ab) to one or more targets this interaction should be highly specific between a portion of the antigen (protein) or epitope and the specific recognition sites found on the fragment antigen-binding (Fab) region of the antibody termed a paratope (Kurien et al., 2011 ) (Fig. 1). The 1°Ab should be thoroughly assessed and validated to be specific and sensitive enough to detect the intended target protein. It is important to check that the antibody is specific toward the native or denatured protein, as the denaturing treatment of protein samples prior to SDS-PAGE may alter the exposure and availability of the epitope, affecting antibody binding affinity. In some cases, it may be necessary to use “native-specific” monoclonal antibodies (Tino et al., 2000 ). The targeted peptide sequence may be available from the supplier to allow confirmation of specificity and region of binding however, occasionally this may be unavailable proprietary information. Traditionally 1°Ab are produced through immunization of the host using purified target proteins, whereas modern approaches utilize synthetic peptides, often producing Ab toward short denatured 8–10 amino acid sequences. Isolation and purification is generally achieved through affinity chromatography isolating antibodies and small proteins and/or anion-exchange filtration depending on the class (i.e., IgG, IgM) (Clezardin et al., 1986 ). Predicted and confirmed species cross-reactivity information is often only available through the vendor however, binding will entirely depend on the antigen region. When choosing a 1°Ab, there may be multiple forms available from different vendors, ideally each would bind to a unique antigen upon the protein of interest, allowing accurate assessment of the protein's abundance. However, this is often not the case, and assessment of the previous literature utilizing that antibody is strongly advised. Some proteins may be orthologous and contain the same or similar sequence to other species. Thus, if a 1°Ab is specific to an epitope with this sequence, it may be used to probe other species (i.e., GAPDH 1°Ab may be used on human, rat, and mouse tissue). Depending on the protein of interest, extensive testing of multiple antibodies may have already been undertaken, allowing the most suitable antibody to be selected. For example, the VDR has low expression within skeletal muscle, and in order to find a 1°Ab capable of detecting it by WB and immunofluorescence, extensive validation of a panel of multiple 1°Abs was required (Wang et al., 2010 ). The identification of a highly specific VDR 1°Ab (D-6 Santa Cruz Biotechnology, Cambridge, UK) was confirmed and is believed to be the most representative. Assessment of new antibodies for a target antigen requires even more careful testing, including the use of a variety of appropriate positive and negative controls (discussed below).

Specificity and performance of the 1°Ab antibody is also dependent on whether it is monoclonal (mAb) or polyclonal (pAb). Both have disadvantage/advantage pAb are produced from differing B-cell lineages, recognizing multiple epitope regions on an antigen. They are generally more cost-effective (Lipman et al., 2005 ) and provide more antibody molecules that can target the protein of interest, producing potentially a greater level of sensitivity upon analysis (MacPhee, 2010 ). However, their specificity can also be compromised, due to greater possibility of non-specific binding (MacPhee, 2010 ). In contrast, mAb provide highly consistent and specific binding to a specific and known epitope on an antigen, as they are produced from a single cell lineage, raised against a single specific epitope (Lipman et al., 2005 MacPhee, 2010 ). Yet binding affinities of mAb can suffer if the epitope structure is affected in any way through denaturing or electrophoresis for example (Lipman et al., 2005 ).

Depending on the primary amino acid sequence of the target protein, similar epitopes may be present within degradation products or alternate isoforms, potentially presenting additional bands. Degradation products will migrate ahead of the band of interest, due to the decreased molecular weight. 1°Ab affinities toward alternative isoforms may not interfere with data interpretation if the bands are sufficiently separated (i.e., have different molecular weights). For example, certain antibodies toward P70 S6K1 (70 kDa), a critical protein in the mRNA translational initiation pathway and one of the most probed of all in the muscle and exercise field, may bind to the isoform P80 S6K (80 kDa). P80 S6K encodes a nuclear localization signal and contains an additional 23 amino acids and would be present above P70 S6K1 when blotted (Thomas, 1993 ). Nonetheless, sufficient electrophoretic separation between the two isoforms and appropriate controls may allow correct identification. For example, insulin-treated L6 myotubes increased P70 S6K1 phosphorylation (Somwar et al., 1998 ) but not P85 S6K allowing, in this instance, identification of the correct band nonetheless, this does not guarantee specificity. However, the assessment of a bands molecular weight may not always be suitable, as some proteins may migrate to a non-predictable region. For instance, the mTOR regulator REDD1 has a predicted molecular weight of 25 kDa however, it is detectable at 35 kDa due to multiple lysine residues (increased positively charged residues) (Chang et al., 2009 ). This highlights the importance of knowing the migrating properties of the target protein, and if unexpected bands occur, literature investigation may be required.

In order to validate the specificity of a new 1°Ab, it should be tested against a positive lysate or purified protein control, giving a detectable band at the correct molecular weight and a negative sample from a tissue known not to express the intended target [The Human Atlas provides reliable protein expression data (http://www.proteinatlas.org)], resulting in no detectable band. Sometimes, it may be appropriate to include a specific knock-in/out (e.g., via shRNA or siRNA) sample to allow confirmation of a target within the same tissue type. For example, overexpression of AKT isoforms (an essential signaling protein for muscle hypertrophy/atrophy) within rat skeletal muscle following shRNA produced detectable bands at the predicted molecular weight (

40 kDa) compared with control samples (Cleasby et al., 2007 ). Conversely, knockdown of AKT, again within skeletal muscle, demonstrated a reduction in band intensity at the same molecular weight compared with control samples. Similarly protein inhibitors (e.g., LY294002, rapamycin, etc.) known to block specific phosphorylation pathways can be used. For example, the addition of LY294002 to cultured cells inhibits PI(3)K, resulting in decreased phosphorylation of down-stream intermediates (i.e., AKT/P70 S6K1) (Rommel et al., 2001 ). Thus, if probing for phosphorylated P70 S6K1, cultured L6 cells treated with/without insulin and LY294002 will provide a robust positive (greater band intensity) and negative control (reduced intensity), respectively, compared with untreated samples. In this instance, the inclusion of an untreated sample alongside an inhibited negative control will confirm the reduction in band intensity is in fact due to decreased expression, rather than a loss of detection. Despite rigorous testing of antibodies with appropriate positive/negative controls, additional bands may still be present or insufficiently separated making identification and quantitation of the correct band (if present) unreliable. Absolute confirmation of the presence of a protein in a given band may be achieved by mass spectrometry via determination of the peptide sequence (Trauger et al., 2002 ). Briefly, the band of interest is excised and the mixture of proteins digested by trypsin into small peptide sequences capable of being sequenced by liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS/MS). Utilizing this approach, however, requires access to highly specific and costly equipment and technical expertise, but can provide validation of antibody specificity. Ultimately, positive and negative controls will help establish the degree of non-specific binding and potential false-positive bands, along with the confirmation of increased/decreased protein expression, giving confidence that the highlighted band is indeed the correct one.


Western blot protocol

Reviewed December 14 2020

Western blotting is a technique that uses specific antibodies to identify proteins that have been separated based on size by gel electrophoresis. The immunoassay uses a membrane made of nitrocellulose or PVDF (polyvinylidene fluoride). The gel is placed next to the membrane and the application of an electrical current induces the proteins to migrate from the gel to the membrane. The membrane can then be further processed with antibodies specific for the target of interest and visualized using secondary antibodies and detection reagents.

Contenido

View our western blot protocol video below.

For other video protocols please visit our video protocols library here.

​​If you are looking to build up your skills in western blot analysis, check out our free on-demand western blot training.

​Solutions and reagents: lysis buffers

These buffers may be stored at 4°C for several weeks or aliquoted and stored at -20°C for up to a year.

NP-40 buffer

  • 150 mM NaCl
  • 1.0% NP-40 (possible to substitute with 0.1% Triton X-100)
  • 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
  • Inhibidores de la proteasa

RIPA buffer (radioimmunoprecipitation assay buffer)

  • 150 mM NaCl
  • 1% IGEPAL CA-630
  • 0.5% sodium deoxycholate
  • 0.1% SDS (sodium dodecyl sulphate)
  • 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
  • Inhibidores de la proteasa

Tris-HCl

​ Solutions and reagents: running, transfer, and blocking buffers

​Laemmli 2X buffer/loading buffer

  • 4% SDS
  • 10% 2-mercaptoethanol
  • 20% glycerol
  • 0.004% bromophenol blue
  • 0.125 M Tris-HCl

Check the pH and adjust to 6.8

Running buffer (Tris-Glycine/SDS)

Check the pH and adjust to 8.3

Transfer buffer (wet)

  • 25 mM Tris base
  • 190 mM glycine
  • 20% methanol
  • Check the pH and adjust to 8.3

For proteins larger than 80 kDa, we recommend that SDS is included at a final concentration of 0.1%.

Transfer buffer (semi-dry)

  • 48 mM Tris
  • 39 mM glycine
  • 20% methanol
  • 0.04% SDS

Blocking buffer

3–5% milk or BSA (bovine serum albumin)

Add to TBST buffer. Mix well and filter. Failure to filter can lead to spotting, where tiny dark grains will contaminate the blot during color development.

​Sample lysis

​Preparation of lysate from cell culture

  1. Place the cell culture dish on ice and wash the cells with ice-cold PBS.
  2. Aspirate the PBS, then add ice-cold lysis buffer (1 mL per 10 7 cells/100 mm dish/150 cm 2 flask 0.5 mL per 5x10 6 cells/60 mm dish/75 cm 2 flask).
  3. Scrape adherent cells off the dish using a cold plastic cell scraper, then gently transfer the cell suspension into a pre-cooled microcentrifuge tube. Alternatively, cells can be trypsinized and washed with PBS prior to resuspension in lysis buffer in a microcentrifuge tube.
  4. Maintain constant agitation for 30 min at 4°C.
  5. Centrifuge in a microcentrifuge at 4°C. You may have to vary the centrifugation force and time depending on the cell type a guideline is 20 min at 12,000 rpm but this must be determined for your experiment (leukocytes need very light centrifugation).
  6. Gently remove the tubes from the centrifuge and place on ice, aspirate the supernatant and place in a fresh tube kept on ice, and discard the pellet.

​Preparation of lysate from tissues

  1. Diseccionar el tejido de interés con herramientas limpias, preferiblemente en hielo, y lo más rápido posible para evitar la degradación por proteasas.
  2. Place the tissue in round-bottom microcentrifuge tubes or Eppendorf tubes and immerse in liquid nitrogen to snap freeze. Almacene las muestras a -80 ° C para su uso posterior o manténgalas en hielo para una homogeneización inmediata. Para

Sample preparation

  1. Remove a small volume of lysate to perform a protein quantification assay. Determine the protein concentration for each cell lysate.
  2. Determine how much protein to load and add an equal volume 2X Laemmli sample buffer.​

​Loading and running the gel

  1. Load equal amounts of protein into the wells of the SDS-PAGE gel, along with a molecular weight marker. Load 20–30 μg of total protein from cell lysate or tissue homogenate, or 10–100 ng of purified protein.
  2. Run the gel for 1–2 h at 100 V.

The time and voltage may require optimization. We recommend following the manufacturer’s instructions. A reducing gel should be used unless non-reducing conditions are recommended on the antibody datasheet.

The gel percentage required is dependent on the size of your protein of interest:

Protein size

Gel percentage

Gradient gels can also be used.

​Transferring the protein from the gel to the membrane

The membrane can be either nitrocellulose or PVDF. Activate PVDF with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer before preparing the stack. The time and voltage of transfer may require some optimization. We recommend following the manufacturer’s instructions. Transfer of proteins to the membrane can be checked using Ponceau S staining before the blocking step.

Prepare the stack as follows:

Figure 1. Example of prepared stack.

Tinción de anticuerpos

  1. Block the membrane for 1 h at room temperature or overnight at 4°C using blocking buffer.
  2. Incubate the membrane with appropriate dilutions of primary antibody in blocking buffer. We recommend overnight incubation at 4°C other conditions can be optimized.
  3. Wash the membrane in three washes of TBST, 5 min each.
  4. Incubate the membrane with the recommended dilution of conjugated secondary antibody in blocking buffer at room temperature for 1 h.
  5. Wash the membrane in three washes of TBST, 5 min each.
  6. For signal development, follow the kit manufacturer’s recommendations. Remove excess reagent and cover the membrane in transparent plastic wrap.
  7. Acquire image using darkroom development techniques for chemiluminescence, or normal image scanning methods for colorimetric detection.

Useful links

All lanes: beta Actin antibody - loading control (ab8227) at 1/5000 dilution

Lane 1: HeLa whole cell extract
Lane 2: Yeast cell extract
Lane 3: Mouse brain tissue lysate

Protocols are provided by Abcam “AS-IS” based on experimentation in Abcam’s labs using Abcam’s reagents and products your results from using protocols outside of these conditions may vary.

Webinar transcript​

The purpose of western blotting is to separate proteins on a gel according to the molecular weight. The proteins are then transferred onto a membrane where they can be detected using antibodies. Heat the samples and 95 degrees C for five to 10 minutes in a sample buffer containing a reducing agent such as beta-mercaptoethanol. This results in linearized proteins with a negative charge proportional to their size.

Place a gel into the electrophoresis tank and add in buffer, ensuring the tops of the wells are covered. Acrylamide percentage of the gel being used depends on the molecular weight of the target protein. Node a molecular weight market into the first lane then load the samples into adjacent wells. All the samples which contained equal amounts of protein. Once all the samples are loaded, ad running buffer, place the lid onto the electrophoresis tank. Turn on the power supply and set the voltage recommended by the manufacturer of the gels in the gel tank. You should be able to see bubbles rising through the tank. Run the gel until the die front has moved sufficiently down the gel.

The next stage is to transfer the proteins from the gel onto a membrane. Membranes are usually made from nitrocellulose or PVDF. Remove the gel from the tank and carefully release it from its plastic case. Cut up the wells and the gel foot and place the gel into transfer buffer. Prepare the transfer stack by sandwiching the membrane and gel between filter paper and sponges. The membrane should be traced to the positive electrode and the gel closest to the negative electrode. Use a small roller to remove any bubbles between the gel and the membrane. Cap the transfer case closed and submerge into a transfer tank containing transfer buffer. Add water to the outer chamber to keep the system cool and put on the lid. Turn on the power supply to begin protein transfer. Time and voltage require optimization, so check the manufacturer's instructions for guidance.

Now that the proteins have migrated from the gel onto the nitro cellulose membrane, the protein of interest can be detected as an antibody. The membrane can be removed from the cassette and the molecular weight market should now be visible. If required, the transfer of proteins can be confirmed by staining the membrane with [inaudible 00:04:40] solution. To prevent nonspecific binding of the antibody, the membrane needs to be blocked. Pour blocking buffer onto the membrane and agitate gently on a rocker. Typically, this is done using a solution of five percent milk or bovine serum albumin, BSA, for two hours at room temperature or overnight at four degrees. The time and type of blocking buffer should be optimized, so check the data sheet of the primary antibody you intend to use for details.

After the membrane is blocked, remove the blocking buffer and add the diluted primary antibody in the same solution. Incubate on the rocker as before. Typically primary antibody incubations are for one hour at room temperature or overnight at four degrees C. Antibody concentration and incubation time will need to be optimized. Refer to the antibody datasheet for guidance. Pour off the primary antibody and rinse the membrane twice in wash buffer. Follow with one 15 minute wash and three 10 minute washes on a rocker. The wash buffer is usually Trys buffered saline, TBS, or phosphate buffered, saline, PBS, with 0.1 percent tween 20.

Pour off the wash buffer and incubate the membrane in conjugating secondary antibody which has been diluted in blocking buffer. Usually this is done for one hour at room temperature, but antibody concentration and incubation time will need to be optimized. Pull off the secondary antibody and wash the membrane has shown previously.

There are several different systems for detection. If the secondary antibodies conjugate into an enzyme, incubate the membrane in the appropriate substrate before imaging. If the secondary antibodies are fluorescent counjugates then you can move directly onto the imaging step. Imaging can be carried out with x Ray film or with a digital imaging system. Place the membrane into an imaging tray. Place the imaging tray into imaging system. Exposure times will most likely need to be optimized in order to clearly detect the bands relating to the proteins of interest.


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