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¿Cómo se conjugan los fluorocromos con proteínas como los anticuerpos?

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¿Cómo se conjugan los fluorocromos como FITC con los anticuerpos? ¿Están unidos covalentemente? Si están unidos covalentemente, ¿la baja temperatura (-20 grados Celsius o menos) romperá los enlaces covalentes y separará la etiqueta del fluorocromo de la proteína?


Los fluorocromos se unen covalentemente a los anticuerpos para formar moléculas marcadas de forma estable. Este artículo lo describe con gran detalle, desde el resumen:

Los fluorocromos se pueden conjugar covalentemente con anticuerpos a través de reacciones con grupos tiol o amina. Normalmente, los fluorocromos que contienen grupos reactivos de isotiocianato, éster de succinimidilo o cloruro de sulfonilo se conjugan con aminas en las moléculas de anticuerpo.

Estos enlaces covalentes son estables a temperatura ambiente y también a -20 ° C. Es más probable que los ciclos repetidos de congelación-descongelación dañen el anticuerpo.


Fluoróforos y tintes

Aunque la fluorescencia del colorante se analiza con mayor frecuencia en la citometría de flujo, se puede determinar información valiosa a partir de los niveles de autofluorescencia de las células no teñidas. Las células son autofluorescentes de forma natural, especialmente en longitudes de onda más bajas del espectro visible, y la luz dispersa puede proporcionar información sobre el tamaño celular, la granularidad, la topografía de la superficie y la relación nuclear: citoplasmática. Por ejemplo, un análisis de glóbulos blancos permite la identificación de diferentes tipos de leucocitos.

Sin embargo, la gran mayoría de los experimentos de citometría de flujo implican el uso de fluorocromos. Se trata de pequeñas moléculas orgánicas o proteínas como la aloficocianina (APC) con propiedades fluorescentes. Los fluorocromos a menudo se conjugan con anticuerpos primarios o secundarios para marcar objetivos o biomarcadores. Una alternativa a la tinción de anticuerpos es utilizar células que expresan, de forma estable o transitoria, proteínas de interés fusionadas con proteínas fluorescentes como GFP, Venus o mRFP.

La elección del fluorocromo depende de la configuración experimental:

Para minimizar la superposición espectral, evite el uso de fluorocromos con espectros de excitación similares si son excitados por el mismo láser.

Algunos fluorocromos añaden un peso molecular significativo a los reactivos de marcaje; esto puede reducir su capacidad para penetrar en la membrana celular para teñir los objetivos intracelulares.

Asegúrese de manipular correctamente los tintes en tándem; evite los ciclos de congelación-descongelación y la exposición a la luz para minimizar el desacoplamiento.

Si se utilizan reactivos de fluoróforo, las células se tiñen y luego se lavan antes del análisis para eliminar el exceso de colorantes no unidos. tabla 1 muestra consejos sobre procedimientos de tinción con diferentes reactivos fluoróforos. La permeabilización es necesaria para el análisis de proteínas intracelulares utilizando anticuerpos.

Tabla 1. Tipos de reactivos fluoróforos comúnmente utilizados en citometría de flujo.

Reactivo Ejemplo Células vivas Celdas fijas Permeabilización
Tintes de viabilidad Yoduro de propidio no no
Marcadores apoptóticos Anexina V marcada con fluorescencia no no
Proteínas fluorescentes expresadas por células. GFP-LC3 No requerido
Anticuerpos marcados con fluorescencia contra proteínas extracelulares E-cadherina (ver Figura 2) No requerido
Anticuerpos marcados con fluorescencia contra proteínas intracelulares Lamin A / C (ver Figura 2) Técnicamente desafiante Requerido

Figura 2. La citometría de flujo es adecuada para analizar dianas tanto extracelulares como intracelulares.

Izquierda: Se tiñeron 1X10 ^ 6 células HepG2 con 2 µg de anticuerpo E-cadherina (20874-1-AP, rojo) y anticuerpo de control (azul). Fijado con MeOH al 90% bloqueado con BSA al 3% (30 min). IgG anti-conejo de cabra AffiniPure conjugado con Alexa Fluor ™ 488 (H + L) con dilución 1: 1000.

Derecha: Se tiñeron 1X10 ^ 6 células HEK-293T con 0,2 µg de anticuerpo Lamin A / C (10298-1-AP, rojo) y anticuerpo de control (azul). Fijado con MeOH al 90% bloqueado con BSA al 3% (30 min). IgG anti-conejo de cabra AffiniPure conjugado con Alexa Fluor ™ 488 (H + L) con dilución 1: 1000.


Anticuerpos secundarios conjugados con DyLight® Fluorochrome

Los fluorocromos DyLight® exhiben alta intensidad de fluorescencia, fotoestabilidad y solubilidad en agua y permanecen fluorescentes a partir de pH 4.0 y pH 9.0. Además, la solubilidad en agua de los fluorocromos DyLight® permite lograr una alta proporción de colorante a anticuerpo sin provocar la precipitación de conjugados.

Los fluorocromos DyLight® tienen máximos de absorción que van desde 350 nm a 777 nm, cubriendo todo el espectro de luz visible. Tanto las propiedades de absorción como de emisión de los fluorocromos DyLight® son compatibles con las longitudes de onda de excitación y detección de la instrumentación de fluorescencia común.

Nuestro catálogo incluye anticuerpos secundarios conjugados con DyLight® 488, DyLight® 550, DyLight® 594 y DyLight® 650.

Fig 1. Espectros de emisión de DyLight®​ fluorocromos disponibles en nuestro catálogo.

Aspectos destacados del conjugado de anticuerpos

  • Amplia gama de diferentes especificidades.
  • Optimizado para el rendimiento conjugado: anticuerpos preadsorbidos o purificados por afinidad
  • Consistente y estable: estable durante 1 año a 4 ° C, lo que proporciona un rendimiento constante durante el uso

Ventajas

  • Fluorescencia brillante: la emisión intensa proporciona una alta sensibilidad
  • Espectros de emisión estrechos: el sangrado insignificante entre los canales de fluorocromo facilita la obtención de imágenes multicolores
  • Altamente fotoestable: mejor resistencia al fotoblanqueo
  • Completamente estable en tampones que varían de pH 4.0 a 9.0
  • Compatibilidad del instrumento: DyLight® se puede visualizar con ajustes comunes de láser y filtro

Propiedades del tinte DyLight®

Los fluorocromos DyLight® son adecuados para microscopía de fluorescencia y citometría de flujo.

FluorocromoColorEx / EmEspectrosTintes espectralmente equivalentes
DyLight® 488
493/518Ver gráficoFITC, Cy2®
DyLight® 550
562/576Ver gráficoCy3®, TRITC
DyLight® 594
593/618Ver gráficoTexas Red®
DyLight® 650
652/672Ver gráficoCy5®

Tabla 1. Propiedades espectrales de DyLight®​ fluorocromos.

ε: Coeficiente de extinción molar al máximo de absorción

Para obtener más información o ayuda, comuníquese con nuestro equipo de soporte científico.

DyLight®​ es una marca comercial de Thermo Fisher Scientific Inc. y sus subsidiarias. Cy®​ y CyDye® son marcas comerciales de GE Healthcare Limited.


¿Cómo se conjugan los fluorocromos con proteínas como los anticuerpos? - biología

Principios de la citometría de flujo

La citometría de flujo se utiliza normalmente para analizar la expresión de moléculas intracelulares y de superficie celular, caracterizar y definir diferentes tipos de células en una población celular heterogénea, evaluar la pureza de subpoblaciones aisladas y analizar el tamaño y el volumen de las células.

Como se muestra en la Figura 1, en el paso de preparación de la muestra, las células de interés se marcan con fluorocromos. A continuación, las células en suspensión se inyectan en una corriente fina que se centraliza hidrodinámicamente por el flujo de la vaina coinyectada y golpeada por los rayos láser. La dispersión de luz es detectada por fotodetectores frontales y laterales. La fluorescencia se clasifica en el banco óptico con espejos y filtros dicroicos y se detecta, amplificada por fotomultiplicadores. Luego, las señales se analizan mediante un software específico.

Fig.1 Principios de la citometría de flujo. (Depince-Berger, 2016)

Fluoróforos

Los fluoróforos son marcadores fluorescentes que se utilizan para detectar la expresión de ácidos nucleicos o proteínas. Aceptan funcionalmente energía luminosa a una longitud de onda determinada y la reemiten a una longitud de onda más larga. Hay dos tipos principales de fluoróforos con gran potencial de aplicación en la citometría de flujo.

Los tintes individuales como el isotiocianato de fluoresceína (FITC), la alophycocyanin (APC) y la ficoeritrina (PE) han estado disponibles durante muchos años. Los tintes en tándem comprenden un pequeño fluoróforo acoplado covalentemente a otro fluoróforo. Cuando el primer tinte se excita y alcanza su estado de singlete electrónico excitado máximo, su energía se transfiere al segundo tinte. Esto activa el segundo fluoróforo, que luego produce la emisión de fl uorescencia.

Las proteínas fluorescentes, como la proteína fluorescente verde (GFP), la proteína fluorescente amarilla (YFP), la proteína fluorescente roja (RFP) y la mCherry se han utilizado ampliamente para el análisis de citometría de flujo y la clasificación celular. Las proteínas fluorescentes a menudo se coexpresan o se expresan como una fusión con la proteína de interés.

Anticuerpos conjugados en citometría de flujo: marcaje de fluoróforo directo o indirecto

Normalmente, los fluoróforos utilizados como lecturas en un experimento de citometría de flujo se unen covalentemente a un anticuerpo. Cuando se usa un anticuerpo conjugado en un ensayo basado en células, la luz emitida por el fluoróforo sirve como un indicador directo de la cantidad de anticuerpo presente en o sobre la célula. Mediante el uso de conjugados que se unen específicamente a una proteína, un investigador puede cuantificar directamente el objetivo de interés en cada célula, basándose en el nivel de fluorescencia emitida por esa célula. Este proceso se conoce como detección directa o citometría de flujo directa.

El enfoque alternativo, la citometría de flujo indirecta, utiliza un anticuerpo secundario dirigido contra inmunoglobulinas (Igs) del huésped en el que se generó el anticuerpo primario. En este método, el anticuerpo secundario se conjuga con el fluoróforo, dejando el anticuerpo primario sin modificar.

Fig.2 Inmunofluorescencia directa e indirecta.

Tinción directa versus indirecta para citometría de flujo

  • Es posible la multiplexación directa de anticuerpos del mismo anfitrión
  • Protocolo más rápido debido a menos pasos de incubación y lavado
  • Capaz de usar muchos anticuerpos diferentes en un ensayo, lo que permite la lectura de un gran número de puntos finales simultáneamente
  • Sin amplificación de señal del anticuerpo secundario
  • Puede mejorar la detección de objetivos presentes en poca abundancia, ya que proporciona una mayor sensibilidad debido a la amplificación secundaria.
  • Útil para la validación inicial de un anticuerpo primario cuando aún no está disponible un conjugado directo
  • El número limitado de anticuerpos que se pueden combinar en un experimento.
  • Tinción de dos pasos
  • Los anticuerpos secundarios pueden reaccionar de forma cruzada con especies distintas de la diana.
  • Puede preferirse la citometría de flujo indirecta a la citometría de flujo directa cuando la conjugación del anticuerpo primario puede causar cambios estéricos que afectan la especificidad y la función.
  • También se puede preferir la citometría de flujo indirecta cuando se desea un aumento de la señal. Más de un anticuerpo secundario puede unirse a un anticuerpo primario, amplificando así la señal derivada de cada molécula antigénica unida por el anticuerpo primario.

Análisis de los datos

El análisis de datos de citometría de flujo se basa fundamentalmente en el principio de activación. Las puertas y regiones se colocan alrededor de poblaciones de células con características comunes, generalmente dispersión directa (FSC), dispersión lateral (SSC) y expresión de marcadores. El tamaño y la granularidad de las células se pueden identificar sobre la base de sus características FSC y SSC. Distinguir poblaciones de células puede ser relativamente sencillo para líneas celulares donde solo hay un tipo de célula, pero puede ser más complejo para muestras donde hay múltiples tipos de células.

Los escombros y las células muertas a menudo tienen un nivel más bajo de FSC y se encuentran en la esquina inferior izquierda de la gráfica de densidad. Los eventos también se pueden mostrar como un diagrama de puntos donde no se muestra información de densidad o como un mapa de contorno para mostrar la intensidad relativa de los patrones de dispersión. Depende de la preferencia del usuario qué visualización se prefiere, pero a veces es más fácil visualizar poblaciones discretas de celdas en diagramas de contorno.

Fig.3 Medición de FSC y SSC.

Aplicaciones Comunes

El uso más común de la citometría de flujo es la identificación de marcadores en las células. La inmunofenotipificación puede consistir simplemente en identificar una célula mediante un único marcador o una identificación más compleja de células, utilizando el perfil de localización, los estados de activación y la liberación de citocinas, todo en un solo panel. Como consecuencia, los protocolos experimentales son a menudo una combinación de tinción superficial e intracelular.

Una de las características más comunes de la apoptosis que se puede medir mediante citometría de flujo es la externalización de la fosfatidilserina (PS), un fosfolípido que se encuentra en la membrana interna de las células sanas. La anexina V se une a la fosfatidil serina y, por lo tanto, la anexina V marcada con fluoróforos permite evaluar la apoptosis, generalmente en combinación con un colorante de viabilidad como el yoduro de propidio (PI) para distinguir las células apoptóticas de las necróticas.

La fragmentación del ADN, que se produce durante las últimas etapas de la apoptosis, también se puede medir mediante citometría de flujo utilizando el ensayo sub-G1. Los pequeños fragmentos de ADN generados durante la apoptosis se escapan de las células, disminuyendo el contenido total de ADN de las células apoptóticas. Al teñir el ADN con PI, las células apoptóticas hipodiploides pueden contarse en el pico sub-G1 del histograma de PI. Además, la apoptosis temprana también se puede medir mediante colorantes potenciómicos que evalúan el potencial mitocondrial reducido de las células, como JC-1, éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE) y éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM). Estos tintes se agregan en las mitocondrias de las células no apoptóticas y tienen una fluorescencia brillante. Cuando el potencial de la membrana mitocondrial colapsa, el tinte se dispersa en el citoplasma en su forma monomérica, lo que produce una reducción de la fluorescencia o un cambio de color.

La proliferación celular se puede medir mediante citometría de flujo usando varios métodos. Un enfoque es teñir con un anticuerpo contra un marcador de proliferación como Ki67 o MCM2. Además, puede incubar sus células con BrdU, que se incorpora al ADN durante la fase S del ciclo celular. La BrdU incorporada se puede detectar utilizando anticuerpos anti-BrdU marcados con fl uorescencia. Cuando se combina con una tinción de ADN como PI, se puede determinar la proporción relativa de células en la fase S.

Otras aplicaciones

  • Explosión oxidativa de monocitos
  • Explosión oxidativa de neutrófilos
  • Fagocitosis de monocitos
  • Fagocitosis de neutrófilos
  • Análisis microbiológico
  • Tráfico celular
  • Citotoxicidad celular y mediada por anticuerpos o complemento
  • Clasificación según la morfología (FSC o SSC) y / o características fl uorescentes

Secciones relacionadas con la citometría de flujo

Creative Biolabs presenta una presentación que será invaluable para los principiantes en citometría de flujo y actuará como una sinopsis repleta de datos para aquellos de ustedes interesados ​​en enseñar a otros sobre las virtudes de esta poderosa aplicación. Para ayudar aún más en el aprendizaje, hemos introducido las siguientes secciones para que las vea. El protocolo y la guía de resolución de problemas se proporcionan bajo cada enfoque experimental. Consulte la sección correspondiente para obtener más detalles.


Anticuerpos conjugados a enzimas, fluorocromos y más

Los anticuerpos conjugados son una herramienta de investigación útil en una variedad de aplicaciones, desde Western blot hasta citometría de flujo. En Novus Biologicals ofrecemos muchos anticuerpos primarios conjugados con enzimas como HRP, fluorocromos como FITC y otros, incluidos tintes de biotina y cianina.

Nuestro laboratorio de anticuerpos siempre está ocupado con proyectos personalizados de conjugación de anticuerpos. La semana pasada, el laboratorio llevó a cabo numerosas conjugaciones, incluido un anticuerpo receptor de LDL contra biotina, un anticuerpo HMGB1 contra HRP, un anticuerpo actina contra DyLight 488 y un anticuerpo CD133 contra DyLight 549.

Cuando se le preguntó sobre la diferencia entre conjugar un anticuerpo contra HRP, biotina y tintes DyLight, uno de los técnicos de laboratorio de Novus, David Kuroki, explicó solo una de las variaciones:

"La diálisis se utiliza para eliminar las aminas primarias y cualquier azida de sodio que pueda estar presente. Para HRP y Biotina, el tampón de diálisis es PBS, pH 7,4. Para los flúores DyLight, el tampón de diálisis es borato de sodio 50 mM, pH 8,5. También hay un diferencia en los tiempos de incubación, 30 minutos para la biotina, 1 hora para los flúores DyLight y 3 horas para el HRP ".

Kuroki también mencionó que las conjugaciones de anticuerpos pueden tardar entre 3 y 6 horas, dependiendo del conjugado específico. Primero se cuantifica el anticuerpo para un punto de referencia, luego se dializa en el tampón apropiado. A continuación, el anticuerpo se concentra, si es necesario, y luego se vuelve a cuantificar para determinar la eficacia de recuperación. Después de completar estos pasos, tiene lugar la conjugación real.

Explore los anticuerpos conjugados que ofrecemos visitando nuestra página de anticuerpos primarios y usando el filtro conjugado en la parte inferior izquierda de la pantalla. Además, etiquete fácilmente cualquier anticuerpo con solo 30 segundos de tiempo de intervención utilizando nuestros kits de etiquetado de anticuerpos Lightning-Link.


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Inmunohistoquímica (IHC)

La inmunohistoquímica (IHC) es una técnica poderosa que utiliza la unión específica entre el antígeno y el anticuerpo para detectar y localizar antígenos específicos en células y tejidos, a menudo visualizados por microscopía óptica. La IHC se utiliza ampliamente en el diagnóstico clínico en patología anatómica con el advenimiento de los métodos de recuperación de antígenos que permiten realizarla cómodamente en tejido fijado en formalina incluido en parafina (FFPE) y métodos automatizados para el procesamiento de gran volumen con reproducibilidad. Además, la IHC se utiliza con frecuencia para ayudar en la clasificación de neoplasias, la determinación del sitio de origen de un tumor metastásico y la detección de pequeños focos de células tumorales que no se notan en la tinción de rutina con hematoxilina y eosina (H & ampE). Además, la IHC se utiliza cada vez más para proporcionar información predictiva y de pronóstico.

Pasos generales

Los pasos en IHC se pueden resumir de la siguiente manera: fijación de tejido, inclusión y corte, recuperación de antígeno, permeabilización, bloqueo, incubación de anticuerpos e inmunotinción.

    Fijación, incrustación y seccionamiento de tejidos

La fijación de la muestra de tejido es vital para mantener la morfología de las células y los tejidos durante el experimento y el almacenamiento de IHC. Previene la autólisis y necrosis de los tejidos extirpados, conserva la antigenicidad y mejora el índice de refracción de los componentes del tejido. El fijador utilizado está influenciado por el antígeno diana, así como por la técnica de detección deseada (fluorescente o cromogénica). Luego, la muestra de tejido se incrusta en parafina o se congela. La incrustación es importante para preservar la morfología del tejido y brindar soporte al tejido durante el corte. Es posible que algunos epítopos no sobrevivan a una fuerte fijación o incrustación. Normalmente, el tejido se corta en secciones delgadas o en piezas más pequeñas para facilitar el estudio adicional.

Pautas para elegir un fijador

  • Células / preparaciones citológicas: formaldehído al 4%
  • Secciones de tejido: 10% de formalina tamponada neutra (NBF)

El proceso de fijación de la muestra puede conducir al entrecruzamiento de proteínas, que enmascara los antígenos y puede restringir la unión del antígeno-anticuerpo. La recuperación de antígenos permite que un anticuerpo acceda a la proteína diana dentro del tejido. Los epítopos enmascarados podrían recuperarse utilizando métodos de recuperación de antígenos enzimáticos / proteolíticos o de recuperación de antígenos inducidos por calor. La técnica de recuperación de antígeno óptima depende del antígeno, el tejido, el método de fijación y / o el anticuerpo primario. Algunos antígenos requieren una combinación de calentamiento y digestión enzimática.

  • En el método enzimático se utilizan proteasas como proteinasa K, tripsina y pepsina.
  • El método inducido por calor utiliza calor y una selección de amortiguadores.
Tampones para la recuperación de antígenos inducida por calor Formulación enzimática para la recuperación de antígenos enzimáticos
Tampón de citrato pH 6,0 Pepsina
Tampón EDTA pH 8.0 Proteinasa K
Tampón Tris pH 10.0 Tripsina
Tampón Tris-EDTA pH 9.0

La permeabilización es necesaria cuando el anticuerpo necesita acceder al interior de las células para detectar el antígeno diana, como las proteínas intracelulares y los epítopos citoplasmáticos de las proteínas transmembrana. Los disolventes o detergentes se utilizan normalmente para la permeabilización.

Directrices sobre disolventes y detergentes

Disolventes Acetona La fijación de acetona también permeabilizará
Metanol La fijación con metanol se puede utilizar para permeabilizar, pero no siempre es eficaz.
Detergentes Triton X-100 o NP-40 Use 0.1 a 0.2% en PBS durante 10 minutos solamente
Tween 20, saponina, digitonina y leucoperma Utilice de 0,2 a 0,5% durante 10 a 30 minutos

La IHC suele contener uno o más pasos de bloqueo para reducir la señal de fondo y los falsos positivos. Estos pasos incluyen: bloqueo de proteínas, bloqueo de biotina, bloqueo de enzimas endógenas.

El bloqueo con sueros o un reactivo de bloqueo de proteínas evita la unión inespecífica de anticuerpos a tejidos o receptores Fc. El suero es un agente bloqueante común, ya que contiene anticuerpos que se unen a sitios no específicos. Se recomienda utilizar un suero que coincida con la especie del anticuerpo secundario. También se pueden usar proteínas como BSA o caseína para bloquear la unión no específica del anticuerpo, y con estas no hay necesidad de hacer coincidir el reactivo con la especie del anticuerpo secundario.

Si se utiliza un sistema de detección basado en biotina, se recomienda bloquear la biotina endógena. La biotina está presente en muchos tejidos, particularmente en riñón, hígado y cerebro. Se bloquea mediante la preincubación del tejido con avidina, seguida de la incubación con biotina para bloquear los sitios de unión de biotina adicionales en la molécula de avidina.

Los métodos de detección cromogénica suelen utilizar una enzima ligada a un anticuerpo secundario para visualizar la localización del anticuerpo. Si la enzima está presente de forma natural en el tejido que se está estudiando, su actividad debe bloquearse antes del paso de detección. Para comprobar la actividad de peroxidasa endógena, los tejidos se pueden incubar con sustrato DAB antes de la incubación del anticuerpo primario. Si los tejidos se vuelven marrones, hay peroxidasa endógena y se requiere un paso de bloqueo. Una incubación de 10 a 15 minutos en peróxido de hidrógeno al 0,3% suele ser un bloqueo suficiente. Se puede analizar el tejido para determinar la fosfatasa alcalina (AP) endógena incubando con BCIP / NBT. Si se observa un color azul, hay presencia de PA endógena y es necesario el bloqueo. El levamisol se usa para bloquear y se agrega con el sustrato cromogénico. La AP intestinal se bloquea con un ácido débil antes de agregar el anticuerpo primario.

Detección directa vs indirecta en IHC

En los métodos de detección directa, el anticuerpo primario se conjuga directamente con un marcador. Para la detección indirecta, el anticuerpo primario se une a un anticuerpo secundario marcado que se ha producido contra la especie huésped del anticuerpo primario. Los métodos indirectos también pueden incluir pasos de amplificación para aumentar la intensidad de la señal. La elección de la detección directa o indirecta suele estar prescrita por el nivel de expresión del antígeno diana.

Fig.1 Comparación de métodos de detección directos e indirectos. (Buchwalow, 2010)

  • Más rápido en general, ya que hay menos pasos.
  • Menos posibilidades de señales inespecíficas.
  • A menudo da una señal más fuerte porque múltiples anticuerpos secundarios se unen a cada anticuerpo primario.
  • Fácil de cambiar el tipo de etiqueta o los métodos de detección para un nuevo experimento mediante el intercambio de secundarios.
  • Ahorra tiempo y dinero en el etiquetado, especialmente cuando todos los anticuerpos primarios se producen en la misma especie.
  • Proporciona acceso a una gama más amplia de etiquetas.
  • El acoplamiento del marcador al anticuerpo primario puede afectar la capacidad del anticuerpo para unirse a la proteína diana.
  • Etiquetar cada anticuerpo primario agrega tiempo y costo.
  • Puede surgir una señal más inespecífica de la unión del anticuerpo secundario a otras proteínas en la transferencia.
  • Los pasos adicionales de incubación y lavado añaden tiempo al experimento.

Detección cromogénica frente a detección fluorescente en IHC

  • Multiplexación más sencilla: más colores y espectros de emisión más estrechos que los tintes cromogénicos.
  • Mejor co-localización de objetivos: los tintes fluorescentes permiten la identificación separada de objetivos co-localizados.
  • Mayor rango dinámico: es más fácil visualizar objetivos raros y muy abundantes en la misma diapositiva.
  • Menos pasos: ningún paso para la adición de sustrato.
  • Menor sensibilidad: los anticuerpos conjugados con enzimas pueden amplificarse vía detección indirecta para aumentar la sensibilidad.
  • Susceptible al fotoblanqueo: la exposición a la luz puede disminuir la señal fluorescente con el tiempo.
  • Mayor sensibilidad: amplificación de señal vía La detección cromogénica indirecta aumenta la intensidad de la señal.
  • Señal de mayor duración: las manchas cromogénicas son más resistentes al fotoblanqueo que los fluorocromos.
  • Co-localización de objetivos difíciles: es difícil distinguir un color mezclado de un color único cuando los objetivos se localizan conjuntamente.
  • Rango dinámico más estrecho: es difícil visualizar objetivos raros y muy abundantes en la misma diapositiva.
  • Multiplexación difícil: Menos colores y espectros de emisión más amplios que los tintes fluorescentes.

Resumen de los métodos de amplificación de señales

  • Mayor sensibilidad que la detección indirecta tradicional.
  • El tamaño del complejo más pequeño en comparación con ABC facilita una mayor penetración en los tejidos.
  • Mayor sensibilidad que ABC y LSAB.
  • Menos pasos que ABC y LSAB.

IHC es un experimento complejo con múltiples parámetros que deben considerarse y optimizarse. Nuestra solución de problemas de inmunohistoquímica (IHC) ilustra las posibles fuentes de problemas comunes y cómo combatirlos. Consulte la siguiente sección correspondiente para obtener más detalles.


Fluoróforos para citometría de flujo

No todos los fluoróforos son adecuados para todas las aplicaciones basadas en anticuerpos. Por ejemplo, aunque el PE es brillante, se decolora fácilmente y, por lo tanto, no es adecuado para imágenes de fluorescencia.

Debido al aumento en el tamaño de los paneles de citometría de flujo, la citometría de flujo convencional requiere fluoróforos brillantes que tengan una excitación específica y una longitud de onda de emisión de un láser. Sin embargo, la citometría de flujo espectral requiere perfiles espectrales únicos para permitir la desmezcla en paneles. Estos fluoróforos deben ser compatibles entre sí en el panel e idealmente deben ser fotoestables y no mostrar pérdida de fluorescencia cuando se fijan.

Visite nuestra página de fluoróforos de citometría de flujo para obtener información más detallada sobre los fluoróforos compatibles con la citometría de flujo, incluidos nuestros nuevos tintes patentados StarBright.


Plataforma de desarrollo de anticuerpos IVD

Creative Biolabs ofrece un servicio completo de anticuerpos personalizados que cubre cada paso del desarrollo monoclonal y policlonal. Producimos y validamos anticuerpos contra una serie de proteínas biomarcadores. Las áreas de investigación incluyen cáncer, apoptosis, neurobiología, inmunología, enfermedades cardiovasculares y enfermedades infecciosas. Brindamos servicios de desarrollo de anticuerpos personalizados que incluyen:

  • Diseño, síntesis y conjugación de péptidos apropiados para generar anticuerpos con la afinidad y especificidad esperadas.
  • Los anticuerpos monoclonales se pueden generar en un ratón, rata, hámster u otra especie, para cumplir con los requisitos particulares de nuestro huésped.
  • Los servicios de anticuerpos policlonales permiten la producción de anticuerpos de una amplia variedad de especies hospedadoras.
  • Pares de anticuerpos mAb-mAb, mAb-pAb y pAb-pAb emparejados para el ensayo ELISA.
  • Tanto las tecnologías de presentación de hibridomas como de fagos están disponibles para el desarrollo de anticuerpos personalizados.
  • Anticuerpos recombinantes tanto de longitud completa (cambio de especie e isotipo) como de longitud parcial (scFv, Fab, F (ab)2, BsAb).
  • Clonación y secuenciación de regiones variables de anticuerpos, humanización de anticuerpos y optimización de anticuerpos.
  • Servicio completo de purificación de péptidos y anticuerpos utilizando metodología de afinidad tradicional y personalizada.

Los científicos de Creative Biolabs son expertos en conjugación de anticuerpos / proteínas. Ya sea que esté buscando un conjugado diferente de nuestro anticuerpo o necesite una conjugación personalizada de su propio anticuerpo, podemos proporcionar un servicio de conjugación de anticuerpos personalizado asequible y de alta calidad con tiempos de respuesta rápidos inmejorables. Las características de nuestros servicios de conjugación de anticuerpos / proteínas / péptidos incluyen:

  • Conjugación personalizada de su péptido, anticuerpo u otras proteínas a haptenos, portadores, etiquetas y enzimas efectoras.
  • Amplia selección de conjugados y marcadores, como conjugados proteína-proteína, conjugados de partículas, biotina, fluorocromos y marcadores especiales.
  • Incluye etiquetado, purificación y caracterización del producto final.
  • Asesoramiento integral sobre posibilidades de etiquetado y diseño de reacción.

Como desarrolladores líderes de inmunoensayos de alta calidad, Biolabs creativos tiene años de experiencia en el uso de anticuerpos para el desarrollo de ensayos y kits de inmunodiagnóstico. Podemos producir ensayos de diagnóstico en formatos ELISA, flujo lateral, perla de látex, western blot, inmunohistoquímica y citometría de flujo. Con experiencia combinada en química de proteínas, inmunología y biología molecular, nuestro equipo científico puede ayudarlo en cada paso del proceso de desarrollo, desde el diseño hasta la validación.

El flujo de trabajo típico para el desarrollo de inmunoensayos IVD en Creative Biolabs se puede dividir en tres fases: alcance del proyecto, desarrollo del ensayo y producción y fabricación del amplificador.

Características de los servicios de desarrollo de anticuerpos IVD

  • Calidad respaldada por equipos técnicos y de atención al cliente experimentados, así como por instalaciones de última generación.
  • Especializado en el desarrollo de kits y anticuerpos IVD con la realización de numerosos proyectos relacionados con IVD.
  • Tiempo de respuesta rápido y precios competitivos.
  • Entregue de forma rápida y económica ensayos personalizados para cualquier biomarcador y lleve al mercado nuevos productos IVD.

Para obtener más información sobre cualquiera de estos servicios, no dude en ponerse en contacto con nosotros.


    ¿En qué especie se desarrolló el anticuerpo primario?
    Los anticuerpos secundarios se dirigen contra la especie del anticuerpo primario. Por lo tanto, necesitará un anticuerpo secundario que se genere en una especie diferente a la especie huésped del anticuerpo primario. Por ejemplo, si su anticuerpo primario se genera en un ratón, necesitará un anticuerpo secundario anti-ratón generado en cabra, conejo, etc.

¿Cuál es la clase (isotipo) y / o subclase del anticuerpo primario?
Esta pregunta es principalmente importante cuando se trabaja con anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos policlonales, sin embargo, son típicamente inmunoglobulinas de clase IgG. Por esta razón, los anticuerpos secundarios serán principalmente un anticuerpo anti-IgG.

Los anticuerpos monoclonales se desarrollan con mayor frecuencia en ratones y ocasionalmente en ratas, hámsteres o conejos. Por ejemplo, si el anticuerpo monoclonal primario es IgM de ratón, uno querría un anticuerpo secundario que reaccione con IgM de ratón (anti-IgM de ratón).

Si el monoclonal primario es una de las subclases de IgG de ratón, casi cualquier anticuerpo secundario de IgG anti-ratón debería unirse a él. Si no se conoce la subclase del anticuerpo primario, entonces se pueden usar anticuerpos secundarios anti-IgG de ratón F (ab) ya que reconocen la mayoría de las subclases de inmunoglobulina de ratón.

Hay muchas clases y subclases de IgG (s) humana y de ratón. Elegir una secundaria puede resultar complicado. Sin embargo, un factor común entre estos IgG son las cadenas ligeras (kappa y lambda). En otras palabras, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE tienen cadenas ligeras kappa o lambda. Sin embargo, la cadena pesada es específica de la clase.

Resumen de clases y subclases de inmunoglobulinas:
Clases de inmunoglobulinas: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD
Subclases de inmunoglobulinas humanas: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2
Subclases de inmunoglobulinas de ratón: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3
Cadenas de luz: Kappa, Lambda
Cadenas pesadas: IgG (gamma), IgM (mu), IgA (alfa), IgD (delta), IgE (épsilon)

Información adicional sobre reactividades de anticuerpos:
Polivalente: reaccionar con todas las clases
Específico para anti-Fc y cadenas pesadas: reaccionan solo con cadenas pesadas, por lo tanto, son específicas de la clase.
Anti-Fab y específico de molécula completa: reaccionan con cadenas ligeras y pesadas. Debido a la reactividad de las cadenas ligeras, pueden reaccionar con todas las clases.
Específico de cadenas ligeras (kappa, lambda): reacciona con todas las clases, ya que todas las clases usan las mismas cadenas ligeras kappa o lambda.

¿Utilizo un anticuerpo purificado por afinidad o una fracción de IgG?
La mayoría de las personas prefieren los anticuerpos secundarios aislados por afinidad porque proporcionan la menor cantidad de unión no específica. Sin embargo, en ciertos casos, se pueden considerar las fracciones de IgG, es decir, cuando el antígeno de interés es raro o está presente en poca abundancia. En estas situaciones, se requieren anticuerpos de alta afinidad. Por ejemplo, durante el aislamiento por afinidad, algunos de los anticuerpos de muy alta afinidad pueden eliminarse porque se unen tan estrechamente a la matriz de afinidad que no pueden eluirse.

¿Qué tipo de etiqueta elijo?
La etiqueta depende mucho de la aplicación. For immunoblotting and ELISA, enzyme-labeled secondary antibodies are the most popular. Peroxidase is economical and a more stable enzyme, in general, than alkaline phosphatase. It has also become very popular for use in chemiluminescent detection systems. Alkaline phosphatase, on the other hand, is considered more sensitive than peroxidase particularly when colorimetric detection is used.

For cell or tissue staining, alkaline phosphatase, peroxidase, or secondary antibodies conjugated to a fluorochrome may be used. Common fluorochromes are FITC, phycoerythrin, CF™ Dyes, Atto Dyes, and Quantum Red. Associated applications are immunocytochemistry/immunofluorescence, flow cytometry, or immunohistochemistry.

To generate increased amplification, a two-step biotin/avidin system may be used. Biotin binds with very high affinity to avidin, resulting in an essentially irreversible interaction. A biotinylated secondary antibody is applied first, then avidin, ExtrAvidin, or streptavidin conjugated to an enzyme or fluorochrome binds to multiple sites on the biotinylated secondary antibody, thus amplifying the signal and resulting in greater sensitivity than that achieved with an antibody-enzyme or antibody-fluorochrome conjugate alone.

When should I use a pre-adsorbed secondary antibody?
Using pre-adsorbed antibodies will reduce non-specific background when working with tissues and cells. The process involves passing the secondary antibody over immobilized serum proteins from potentially cross reactive species. Therefore, if you are working with human tissues, choose a secondary antibody that has been adsorbed with human serum or human IgG.

When is a F(ab) or F(ab')2 fragment antibody necessary?
If working with tissues or cells that have Fc receptors, choose a F(ab) or F(ab')2 fragment when possible to eliminate non-specific binding. In more detail, F(ab')2 antibody fragments are used in assay systems where the presence of the Fc region may cause problems. Samples such as lymph nodes, spleen, and peripheral blood preparations contain cells with Fc receptors (macrophages, B lymphocytes, and natural killer cells), which could bind the Fc region of intact antibodies, causing high background staining. Use of F(ab')2 fragments ensures that any antibody binding observed is not due to Fc receptors.


Be prepared to validate on your own

Even the best characterized antibody that is beloved by the scientific literature and has enriched many a publication isn’t guaranteed to perform in your settings and your hands flawlessly. And you would limit your resources severely if you only consider antibodies validated exactly for your needs. You should always plan to validate an antibody on your own to some extent. Include the appropriate controls in your experiment to analyze the specificity of an antibody in your precise circumstances. A useful guide for very thorough antibody validation has been compiled by Bordeaux and colleagues. An increasing number of journals not only requires detailed information on the antibodies used in a study (such as name, clone, supplier, catalogue and even lot number), but is also encouraging proof of validation. It is in the interest of us all that scientific data generated with the help of antibodies is reliable and reproducible, but ultimately it is the researcher’s responsibility to use proven experimental tools.


Ver el vídeo: Recombinación e inmunología (Julio 2022).


Comentarios:

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