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¿Cuáles son los beneficios de dilucidar la estructura cristalina de una proteína?

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He pasado meses como estudiante trabajando para tratar de formar un cristal de proteína complicado. Pero en realidad nunca me había explicado por qué la estructura sería útil. Una vez aclarado, ¿qué podemos aprender potencialmente de la estructura en términos de significado biológico?

¿Hay ejemplos de medicamentos o tratamientos que solo han sido posibles gracias a una estructura cristalina conocida?

En términos generales, ¿por qué la gente gasta todo el dinero en sincrotrones, laboratorios, robots, etc., para una estructura de cristal?


Las estructuras de proteínas, que pueden obtenerse de cristales de proteínas o de soluciones concentradas de proteína pura a través de RMN, son posiblemente la principal fuente de conocimiento que tenemos sobre cómo los genes realizan su función a nivel molecular.

Agregué un enlace a RCSB.org arriba: escriben una historia sobre una estructura proteica importante mensualmente (?), Es una excelente manera de recoger algunas historias fascinantes.

Las posiciones atómicas precisas de la estructura de una proteína son indispensables por varias razones. Dado que los procesos biológicos son todos fundamentalmente químicos. Las posiciones específicas de los átomos revelan cómo interactúan específicamente proteínas, nucleótidos, lípidos, fármacos y otras moléculas biológicas.

Ejemplos:

  1. Las estructuras de proteínas abrieron el camino en la herencia biológica (estructura de ADN de Watson / Crick / Franklin)
  2. Las estructuras proteicas de lisozima y proteasas fueron las primeras en mostrar exactamente cómo las proteínas se unen a sus sustratos y catalizan enzimáticamente las reacciones químicas.
  3. Estructura de la proteína de la hemoglobina en formas oxi y desoxi (es decir, con y sin oxígeno unido). demostraron que las proteínas cambian su disposición espacial para modular su función.

Esta lista continúa con los avances más recientes en cómo las señales y las moléculas interactúan con la célula a través de la membrana. Literalmente, no hay ningún tema en biología celular que no se haya beneficiado sustancialmente de la revelación de la estructura de una proteína.

Las ventajas de trabajar con cristales de proteínas son que pueden ser proteínas más grandes y ciertos tipos de experimentos de diferencia se pueden realizar más fácilmente cuando se obtiene un cristal de proteínas. Por ejemplo, si tiene un cristal de una proteína de 100 kDa (~ 900 aminoácidos), a menudo puede encontrar el bolsillo de unión de la enzima sin una gran cantidad de trabajo.

La desventaja de trabajar con cristales de proteínas, como probablemente sepa bien, es que obtener cristales es a menudo un esfuerzo quijotesco de absorber meses o años, a menudo con pocos o ningún resultado. Bastante desmoralizante hasta que alcanzas el objetivo.

Si te sorprende pensar que las proteínas, que a menudo son cientos o miles de veces más grandes que una sal o un mineral que normalmente encuentras en los cristales ... estás muerto. Los cristales son a menudo muy pequeños: un cristal de tamaño decente mide aproximadamente un milímetro en un lado, pero a menudo son solo una fracción de ese tamaño. Es por eso que los cristales de proteínas a menudo se llevan a sincrotrones, aceleradores lineales u otras fuentes de rayos X de electrones libres que son millones (?) De veces más intensas que una radiografía dental. Supongo que la mayoría de las estructuras cristalinas de proteínas se obtienen utilizando líneas de luz especiales creadas especialmente para la cristalografía biológica.

Eso le indica la prioridad de financiación que la ciencia está dispuesta a poner en las estructuras cristalinas de proteínas de rayos X. La simple idea de que los cristales de proteínas podrían ser más fáciles de cultivar en microgravedad (junto con el bajo peso del experimento) justificó más de una década de experimentos de crecimiento de cristales de proteínas en la lanzadera y la ISS.

Nota interesante: The Guardian (que tiene su sede en el Reino Unido, donde se inició la cristalografía, la proteína o de otro modo) ha publicado un breve vídeo que describe los aspectos más destacados de las contribuciones de la cristalografía durante los últimos 100 años. Si observa atentamente, verá la cristalografía de proteínas surgiendo con una letanía de premios nobel.

Nuevos pensamientos: hay indicios de que las estructuras cristalinas están llegando a su fin. El uso de una micrografía electrónica para simplemente tomar una fotografía de muchos miles de proteínas individuales que se encuentran por ahí se puede promediar digitalmente para crear estructuras de baja resolución; gradualmente se están volviendo de mayor resolución y son mucho menos laboriosas que preparar y hacer un cristal de proteína, y funciona bien. en proteínas más grandes y complejos de proteínas.


Yo siempre me he preguntado esto, pero la estructura de una proteína puede llegar a ser bastante importante por varias razones. La mayoría se relaciona con el hecho de que la función de la proteína a menudo depende de dominios específicos, y aunque una proteína puede tener múltiples dominios funcionales, es importante que todos los dominios estén correctamente alineados y construidos en un espacio tridimensional. Las proteínas mal dobladas a menudo tienen fenotipos negativos, por lo que poder visualizar las áreas dobladas incorrectamente puede ser esclarecedor. Quizás más comúnmente, estas técnicas se pueden usar para validar una proteína producida artificialmente antes de aprobarla para la terapia.

Además, aunque podemos conocer la secuencia de aminoácidos en una proteína con mucha facilidad, no necesariamente sabemos cuáles son útiles. Una región orientada hacia el exterior de una proteína puede participar en una función biológica. Si un dominio de proteína específico está incrustado dentro del centro de la proteína, no está muy disponible para funcionar, ya sea para la proteína o para otros objetivos como los anticuerpos. Por ejemplo, uno de los grandes proyectos en la investigación del VIH ahora es conseguir una estructura muy buena y muy fina de las proteínas virales en la envoltura del virus; saber qué regiones son fácilmente accesibles podría ser una buena dianas para fármacos / células / anticuerpos.

Finalmente, la estructura en sí puede dar una idea de su funcionamiento. Las proteínas pueden no tener homología por secuencia de aminoácidos, pero las proteínas de estructura similar pueden tener funciones similares. Las personas más inteligentes que yo pueden reconocer esas características y pueden aprender bastante sobre una proteína solo por su forma.


Aquí hay una pequeña anécdota divertida que acabo de encontrar convenientemente. Es una cita de Tu pez interior por Neil Shubin (© 2008) sobre dos investigadores, Linda Buck y Richard Axel, quienes en 1991 descubrieron una familia de genes que nos permiten oler.

Los experimentos demostraron que los receptores de olores tienen una estructura característica con una serie de bucles moleculares que les ayudan a transmitir información a través de una célula. Esta fue una gran pista, porque Buck y Axel podrían entonces buscar en el genoma de un ratón cada gen que produzca esta estructura.


Ampliando algo que dijo Amory:

Son muy beneficiosos en el descubrimiento de fármacos. Esto se debe a que es absolutamente esencial que tenga una estructura para realizar cualquier tipo de simulación dinámica molecular. En las primeras fases del descubrimiento de fármacos, es barato y fácil realizar este tipo de experimentos en una computadora, en lugar de configurar un ensayo para diferentes terapias potenciales. Simplemente tome la estructura cristalina de la proteína y una estructura de su compuesto, y un programa simulará cómo interactuarán entre sí. A partir de esto, puede ver si el compuesto puede ingresar al sitio activo de la proteína, la orientación en la que estaría, etc. Usando una supercomputadora, puede hacer esto con cientos de compuestos en cuestión de horas. La dinámica molecular tiene otros propósitos útiles, el descubrimiento de fármacos es solo un ejemplo.


¿Cuáles son los beneficios de dilucidar la estructura cristalina de una proteína? - biología

Los experimentos de transferencia de energía de resonancia de Förster de molécula única han aclarado detalles clave del mecanismo de translocación SecA-SecY.

Los detalles estructurales de los mecanismos postraduccionales y co-traduccionales se han resuelto mediante microscopía electrónica criogénica (crio-EM), incluida la conformación del complejo cuaternario co-traduccional y un intermedio de translocación postraduccional.

Los mutantes de Sec61 en enfermedades humanas se han resuelto estructuralmente mediante crio-EM, lo que proporciona una base para comprender el papel del complejo asociado a translocon en algunos trastornos.

El análisis estructural detallado de las estructuras crio-EM de alta resolución de Tom40, un canal de translocación mitocondrial, ha llevado a un modelo mecanicista actualizado para la entrada y salida de preproteínas.

El seguimiento de una sola partícula ha revelado la dinámica de los componentes del translocón de plastidios en vivo.

Los translocones son conjuntos de proteínas que facilitan el direccionamiento y el transporte de proteínas hacia y a través de las membranas biológicas. Nuestra comprensión de estos sistemas se ha avanzado mediante el uso de la genética, la bioquímica y la biología estructural. A pesar de estos avances clásicos, hasta hace poco todavía nos faltaba en gran medida una comprensión detallada de cómo los translocones reconocen y facilitan la translocación de proteínas. Con el advenimiento y las mejoras del análisis de partículas individuales por microscopía electrónica criogénica (crio-EM) y la microscopía de fluorescencia de moléculas individuales, finalmente están emergiendo los detalles de cómo funcionan los translocones. Aquí, presentamos estos métodos y evaluamos su importancia para comprender la estructura, función y dinámica de translocon.


¿Qué podría significar DeepMind para 'resolver' el problema del plegamiento de proteínas para la investigación del cáncer?

Modelo 3D de la estructura cristalina de la proteína marcadora de tumores. Crédito: Sergunt

A principios de este mes, el biólogo Mohammed AlQuraishi se sintió impulsado a exclamar con entusiasmo que un nuevo conjunto de hallazgos constituía "un cambio sísmico y sin precedentes tan profundo que literalmente ha puesto un campo patas arriba durante la noche". No lees eso todos los días.

¿Qué lo había llevado a hacer una afirmación tan audaz? Fue la noticia que la empresa británica de inteligencia artificial propiedad de Google, DeepMind, había "descifrado" el enigma de décadas de cómo las proteínas se pliegan con una nueva versión de su sistema de aprendizaje profundo, AlphaFold.

Las proteínas son fundamentales para toda la vida y la forma misteriosa en que se pliegan en elaboradas formas tridimensionales tiene implicaciones dramáticas sobre cómo operan nuestras células y tejidos, por lo que esta fue sin duda una gran noticia y los titulares se hicieron eco de la misma. Pero, ¿qué nos dijeron los hallazgos, qué podrían significar para la investigación del cáncer? ¿Estaba justificada la hipérbole? Le preguntamos a dos de nuestros especialistas expertos en proteínas, que están tratando de comprender más acerca de cómo la forma en que las proteínas se pliegan afectan los resultados del cáncer, que dieran su veredicto sobre las noticias.

¿Qué problema ha resuelto DeepMind?

El 'problema del plegamiento de proteínas' sigue siendo un rasguño desde que se planteó por primera vez hace unos 50 años. En pocas palabras, poder predecir cómo se pliega una proteína es clave para comprender cómo funcionará, lo que a su vez podría desbloquear respuestas a grandes preguntas, incluido cómo tratar enfermedades como el cáncer.

Los investigadores han dedicado una gran cantidad de tiempo, esfuerzo y recursos a tratar de analizar la forma en que las proteínas se pliegan, lo que ha llevado a la aparición de técnicas experimentales innovadoras pero costosas para estudiar estructuras de proteínas como la cristalografía de rayos X, que crea una imagen tridimensional. estructura de una proteína usando, lo adivinaste, rayos X. También existen otras técnicas, como el uso de un microscopio electrónico para transmitir electrones a una proteína para ampliar su imagen.

Pero si bien estas se consideran técnicas óptimas, cada una tiene sus limitaciones. La cristalografía de rayos X solo funciona realmente cuando se estudian proteínas estables que pueden formar los cristales limpios necesarios para el proceso. E incluso entonces, es una tarea laboriosa y costosa. Con proteínas flexibles o "inestables", que tienen menos estructura y rigidez, es un juego completamente diferente.

Pero afortunadamente, allá por 1963, el bioquímico estadounidense Christian Anfinsen propuso que la secuencia unidimensional de aminoácidos de una proteína, algo mucho más fácil de obtener, debería revelar su estructura tridimensional completa. Este trabajo le valió un Premio Nobel en 1972. Y desde entonces, los científicos han estado explorando esta ruta utilizando métodos computacionales menos costosos y más accesibles. Pero ahí radica otro problema. Hay un número casi infinito de formas en las que una proteína puede plegarse e identificarlas a todas puede llevar toda la vida. No es tan bueno para abordar desafíos importantes como el cáncer.

Aquí es donde entra DeepMind. Su tecnología AlphaFold utiliza el aprendizaje profundo para tomar lo que ya sabemos sobre las estructuras de proteínas conocidas que se encuentran en una base de datos global y 'aprender' y, por lo tanto, predecir las estructuras de otras proteínas. El equipo probó las predicciones hechas por AlphaFold contra estructuras que se habían determinado experimentalmente, utilizando métodos como la cristalografía de rayos X. Y los resultados parecían extremadamente prometedores. AlphaFold logró predecir las estructuras de las proteínas con un nivel de precisión nunca antes visto a bajo costo y en días, no años o décadas. Y esto es lo que emocionó un poco a la comunidad científica.

Entonces, ¿qué piensan nuestros expertos en proteínas?

El profesor Richard Bayliss de la Universidad de Leeds utiliza la cristalografía para determinar la forma de las proteínas y cómo se pliegan. Este conocimiento es vital para descubrir su función en las células cancerosas y, lo que es más importante, cómo pueden ser dirigidas y tratadas. Su enfoque particular está en la proteína Myc, que está asociada con muchos cánceres diferentes, incluidas las formas agresivas de cáncer de próstata y mama.

La Dra. Patricia Muller, de nuestro Instituto de Manchester de Investigación sobre el Cáncer del Reino Unido, está investigando una proteína que desempeña un papel importante en la detención del desarrollo del cáncer, la proteína p53. Ella está particularmente interesada en cómo funciona p53 tanto en sus estados desplegado como plegado y cree que este último tiene un impacto en cómo opera en los cánceres.

¿Qué le pareció la noticia? ¿Es tan monumental como nos quieren hacer creer los titulares?

Richard: Ciertamente es un avance impresionante y emocionante, pero en un sentido más limitado y específico de lo que algunos de los titulares te hacen creer. Ser capaz de predecir con precisión la estructura de una proteína a partir de su secuencia de aminoácidos ha sido una especie de santo grial para los biólogos estructurales. El trabajo de DeepMind es la primera vez que esto se logra con un nivel de confiabilidad que puede competir con los métodos experimentales. Es suficiente para darle la confianza necesaria para realizar una inversión sustancial en las predicciones que surgen de la estructura.

Tiene varias limitaciones, pero quizás la más importante es que no puede predecir con precisión la estructura de las proteínas que trabajan íntimamente con otras proteínas y cuya estructura depende, por tanto, de la presencia de estas otras proteínas. Este tipo de problema es un foco importante de los biólogos estructurales, y las estructuras predichas por DeepMind serán útiles para ayudarnos a interpretar y usar datos experimentales.

Patricia: Nuestra comprensión del plegamiento de proteínas proviene principalmente de estudios que utilizan técnicas que requieren mucho tiempo y mucha paciencia. Si AlphaFold es tan preciso como sugieren los artículos, realmente marcaría una gran diferencia y aceleraría muchas líneas de investigación diferentes.

¿Qué podría significar esto para la investigación del cáncer?

Richard: A pesar de los recientes avances tecnológicos en técnicas experimentales, como la microscopía electrónica criogénica y la cristalografía de alto rendimiento, determinar la estructura de una proteína es un desafío que puede llevar muchos años resolver. Algunos proyectos se retrasan en el primer paso porque la proteína de interés no se puede producir en cantidad o pureza suficiente para que los métodos funcionen, o resultan ser proteínas inestables. Aquí es donde tener un método computacional confiable podría proporcionar suficiente información para avanzar en un proyecto. Por ejemplo, si queremos mapear la ubicación de las mutaciones del cáncer en la estructura de la proteína para predecir cómo podrían afectar su función, podríamos hacerlo mucho más rápidamente con el método computacional DeepMind que con los métodos experimentales.

Es difícil decir cuán útil será para el descubrimiento de fármacos, que es una aplicación importante de la biología estructural en la investigación del cáncer, porque dependemos de modelos precisos generados por cristalografía de rayos X. Pero a veces tenemos que usar modelos computacionales para proteínas con estructuras desconocidas y tener modelos más confiables nos ayudará a desarrollar fármacos de manera más eficiente.

Patricia: Podría ayudar de muchas maneras, como desarrollar medicamentos o simplemente comprender más sobre cómo funcionan las proteínas. Por ejemplo, algunos medicamentos actúan impidiendo que las proteínas se unan a otras proteínas. Si conocemos su estructura, podemos predecir cómo se unirán entre sí y luego podemos diseñar medicamentos que eviten la unión entre estas proteínas. Para las proteínas de las que conocemos la estructura, se ha demostrado que esta es una estrategia exitosa. Sin embargo, las técnicas que tenemos para dilucidar la estructura de las proteínas no funcionan para todas las proteínas. Las predicciones de AlphaFold podrían ser muy útiles para determinar las estructuras de proteínas para las que otras técnicas aún no han funcionado.

¿Cómo utilizará esta nueva información para avanzar en su trabajo?

Richard: Estudio la proteína Myc, que está asociada con muchos cánceres humanos, pero la mayoría de los investigadores la consideran "indisoluble" porque no tiene una estructura fija. El enfoque DeepMind no será de mucha ayuda para Myc en sí mismo porque solo adopta una estructura cuando se une a otras proteínas.

Pero podría ser muy útil estudiar las proteínas de unión que se asocian con Myc, algunas de las cuales son proteínas muy difíciles de trabajar. No esperamos que Myc afecte las estructuras de sus socios de unión, por lo que es probable que las predicciones hechas por AlphaFold sobre estas otras proteínas sean precisas y útiles.

Estas estructuras, junto con nuestros datos experimentales, nos permitirían generar modelos de las interacciones entre Myc y estas proteínas asociadas. Y esta información podría usarse para desarrollar moléculas que bloqueen las interacciones, lo que vemos como una ruta para desarrollar nuevos tratamientos contra el cáncer.

Patricia: Mi trabajo está en la proteína p53. Todavía no conocemos la estructura completa de p53 y es muy difícil determinar su forma con técnicas convencionales. Actualmente, confiamos en los anticuerpos para ayudarnos a detectar la estructura, pero solo pueden detectar dos estados: plegado y desplegado. Pero creo que hay más en la historia que eso y que en realidad hay varios estados diferentes de p53 plegado. Me encantaría ver si AlphaFold podría ayudarme a descubrir estos estados porque en el cáncer hay cientos de formas diferentes en las que p53 muta. Creo que la tecnología podría ayudarme a revelar por qué este es el caso y arrojar luz sobre cómo estos mutantes son diferentes entre sí.

Así que, ¿qué hemos aprendido?

Parece que, si bien el avance de AlphaFold puede llevar algún tiempo para beneficiar directamente a nuestros investigadores en su trabajo para abordar el cáncer, la noticia tiene algunas ventajas claras. ¿DeepMind ha 'resuelto' completamente el plegamiento de proteínas? Según nuestros expertos, el jurado aún está deliberando, pero ciertamente nos alienta su potencial para determinar de manera más rápida, precisa y económica la estructura de las proteínas para comprender mejor cómo funcionan y cómo pueden ser atacadas en cánceres humanos.


Materiales y métodos

Clonación, expresión de proteínas, purificación y cristalización.

El gen MTH1491 (número de acceso de GenBank <"type": "entrez-nucleotide", "attrs": <"text": "G69065", "term_id": "14327330", "term_text": "G69065" >> G69065) se clonó a partir de ADN genómico de MTH y su producto génico se expresó de forma recombinante, se marcó con selenometionina y se purificó como se describe en otra parte para otras proteínas de MTH (Christendat et al. 2000b). El cribado de las condiciones de cristalización también se realizó como se describe en otra parte para otras proteínas MTH (Christendat et al. 2000b). La condición de cristalización final consiste en metil-pentanodiol (MPD) como precipitante. Los cristales elegidos para la recogida de datos de rayos X se congelaron rápidamente en este tampón, que también actuó como crioprotector.

Estudios cristalográficos

Los monocristales crecen como varillas con dimensiones máximas de 0,30 mm por 0,10 mm por 0,4 mm. Los cristales seleccionados para la recopilación de datos de MAD se cultivaron en MPD al 30% y HEPES 100 mM a pH 7,5 a 20 ° C. Los cristales pertenecían al grupo espacial hexagonal P63, con los siguientes parámetros de celda unitaria: a = b = 82,4 y c = 37,0 & # x0212b. El coeficiente de Matthew, VMETRO, se determinó que era 2,9 & # x0212b 3 Da & # x022121, lo que implica un contenido de disolvente del 57,3% con una sola molécula de MTH1491 en cada unidad asimétrica (Matthews 1968 Westbrook 1985). Estos valores están dentro del rango que normalmente se encuentra para los cristales de proteína. Los datos de difracción de la longitud de onda remota tienen una Rsym de 7,1% y una completitud del 99,4% a 2,3 & # x0212b. Las estadísticas de recopilación de datos se resumen en la Tabla 1 & # x200B 1.

Tabla 1.

Resumen de las estadísticas de recopilación y refinamiento de datos

Datos de rayos XCimaBordeRemotoDatos de refinamiento
Grupo espacialP63P63P63Rllorar mi 20.2
Celda unitaria (& # x0212b 3)82,5 y # x000d7 82,5 y # x000d7 37,182,5 y # x000d7 82,5 y # x000d7 37,182,5 y # x000d7 82,5 y # x000d7 37,1Rgratis F 22.6
Resolución (& # x0212b)50 & # x020132.3050 & # x020132.3050 & # x020132.30átomos de proteína (no.)862
Longitud de onda (& # x0212b)0.979480.979640.93927moléculas de agua (no.) 19
No. de sitios Se333r.m.s.d. longitudes de enlace (& # x0212b) 0.007
No. de observaciones77,39077,28177,199r.m.s.d. ángulos de enlace (& # x000b0) 1.1
No. de reflejos únicos649265006566r.m.s.d. diedros (& # x000b0) 23.2
Intensidad (I / & # x003c3 & # x02264I & # x0003e)34 (12,3) a 38 (11.1)32 (7.4)factor B promedio (& # x000b0) 26.4
Completitud (%)98.4 (99.8)97.9 (88.6)99.4 (99.8)
Rsym B 0.071 (0.183)0.064 (0.192)0.071 (0.313)
FOMENOJADO C 0.77FOMSF D 0.87

a Los números entre paréntesis representan valores en el shell de resolución más alta 2.38 & # x020132.30 & # x0212b.

b Rsym = & # x02211 & # x0007cI - & # x02329I & # x0232a & # x0007c / & # x02211I, donde I es la intensidad integrada observada, & # x02329I & # x0232a es la intensidad integrada promedio obtenida de múltiples mediciones, y la suma es sobre todas las reflexiones observadas .

c FOMENOJADO = Cifra de mérito después de la eliminación gradual de MAD.

d FOMSF = Figura de mérito después de voltear el solvente.

f Rgratis se calculó utilizando reflejos seleccionados al azar (5%).

Difracción de rayos X y determinación de estructuras.

Haciendo uso de la dispersión anómala de los átomos de Se, se recopilaron datos MAD de tres longitudes de onda a 100K en la línea de luz 19ID del Centro de Biología Estructural en la Fuente de Fotones Avanzados, Laboratorio Nacional Argonne. Los datos de difracción se recolectaron en el SBC-2, un detector CCD de 3 por 3 construido en APS, a una resolución de 2.3 & # x0212b de un monocristal que contiene proteína marcada con SeMet en tres longitudes de onda de rayos X diferentes cerca del borde Se (Tabla 1 y # x200B 1). ). Los datos de MAD se procesaron utilizando el conjunto de programas HKL2000 (Otwinowski y Minor 1997). Las estadísticas de recopilación de datos se presentan en la Tabla 1 & # x200B 1.. El componente de fase MAD del SNC se utilizó para localizar los tres sitios de selenio, calcular las fases y modificar la densidad (Brunger et al. 1998). La visualización de la densidad de electrones y la construcción de modelos se realizaron con O (Jones et al. 1991). El cuerpo rígido y el refinamiento del ángulo de torsión de recocido simulado fueron seguidos por un refinamiento del factor B individual y se realizaron utilizando CNS 1.0 (Brunger et al. 1998). Varias rondas de refinamiento se combinaron con la reconstrucción del modelo en O después de la inspección de ambos 2Fo& # x02013FC y Fo& # x02013FC mapas. Las moléculas de agua se recogieron inicialmente utilizando CNS y luego se verificaron manualmente en O utilizando los siguientes criterios: un pico de al menos 2.5 & # x003c3 en un Fo& # x02013FC map, un pico de al menos 1.0 & # x003c3 en 2Fo& # x02013FC mapa e interacciones intermoleculares razonables. Las estadísticas de refinamiento se encuentran en la Tabla 1 & # x200B 1.. Los programas MOLSCRIPT (Kraulis 1991), RASTER 3D (Merrit y Murphy 1991) y SPOCK (Christopher 1998) se utilizaron en la producción de las figuras.

Número de acceso

Las coordenadas atómicas se han depositado en el Protein Data Bank como PDB ID 1L1S.


Laboratorio de lografía de cristales de proteínas

Las proteínas son macromoléculas biológicas importantes, ya que desempeñan funciones clave en casi todos los procesos biológicos de un organismo vivo. Las moléculas de proteína funcionan como enzimas, transportadores, potenciadores de la fuerza mecánica, sistemas inmunes protectores, transductores de señales, etc. La estructura tridimensional de una proteína dicta sus propiedades funcionales. Por lo tanto, la determinación y comprensión de la estructura tridimensional de una proteína es esencial para descifrar los detalles mecánicos sobre cómo una proteína realiza sus actividades. Nuestro grupo de investigación en IIT Bombay se centra en dilucidar la relación estructura-función de las proteínas, el diseño racional de enzimas y el desarrollo de fármacos basado en la estructura. Determinamos las estructuras cristalinas de las proteínas. Realizamos extensos estudios bioquímicos y biofísicos sobre proteínas, lo que nos permite obtener información complementaria a la obtenida a partir del análisis de estructuras. Recientemente, hemos determinado varias estructuras cristalinas de proteínas que incluyen una estructura cristalina de muy alta resolución (1,25 & # 8491) de una proteína de unión a azúcar complejada con glucosa. Las estructuras cristalinas de las plasmepsinas (PM) de P. falciparum complejadas con compuestos KNI resueltas en nuestro grupo proporcionan información molecular detallada para el desarrollo de fármacos antipalúdicos. También realizamos simulaciones de dinámica molecular con el fin de capturar diferentes movimientos dinámicos e interacciones en proteínas y sus complejos.

Hemos realizado extensos estudios estructurales sobre la glutamato deshidrogenasa (GDH) para descifrar el mecanismo catalítico y para comprender la base molecular del reconocimiento de cofactores de esta enzima. La siguiente película presenta algunas de las interesantes características estructurales de Aspergillus niger GDH (AnGDH) complejado con sustrato alfa-cetoglutarato (AKG) y cofactor NADP.

Nuestros estudios estructurales y biofísicos indican un nuevo mecanismo de activación de plasmepsinas vacuolares. Los siguientes videos muestran los cambios estructurales durante la activación de la proteasa histoaspártica (HAP), una PM vacuolar.

Un artículo de revisión que presenta los avances en el campo de la cristalografía de proteínas o la cristalografía macromolecular (MX). El documento proporciona una breve historia sobre MX y presenta los desarrollos en métodos y tecnologías en MX. Con muchas técnicas actuales interesantes como los láseres de electrones libres de rayos X (XFEL) y más desarrollos que aguardan en los próximos años, MX tiene el potencial de contribuir significativamente al crecimiento de la biología moderna.

Cuatro plasmepsinas (PM) en la vacuola alimentaria de Plasmodium falciparum son objetivos farmacológicos atractivos. Basándonos en nuestros estudios estructurales y bioquímicos, proponemos un mecanismo único de autoactivación de zimógenos de plasmepsina vacuolar que, en condiciones ácidas, pueden formar un sitio activo catalíticamente competente. Un monómero escinde el proceso del otro a través de un proceso de trans-activación, lo que da como resultado la formación de una enzima madura.


La cristalografía de rayos X es actualmente el método más favorecido para la determinación estructural de proteínas y otras macromoléculas. El requisito para una aplicación cristalográfica de rayos X exitosa es obtener monocristales de la proteína diana. Luego, los datos se recopilan difractando rayos X del monocristal que tiene un patrón ordenado de orientación atómica. El ensamblaje de átomos y moléculas en el cristal se puede deducir de la medición de la dispersión de rayos X.

En la actualidad, más de 120.000 estructuras de proteínas resueltas mediante experimentos de cristalografía de rayos X se han depositado en el banco de datos de proteínas, lo que representa casi el 90% de las proteínas resueltas, lo que sugiere la popularidad predominante de la cristalografía de rayos X en la determinación estructural.

Bioestructura creativa proporciona servicios de cristalografía de rayos X en nuestras instalaciones de vanguardia y ha desarrollado una línea de cristalografía de rayos X que cubre todas las etapas técnicas, desde la síntesis de genes hasta la determinación de la estructura. Nuestros científicos experimentados trabajan en estrecha colaboración con los clientes para garantizar una respuesta rápida y resultados fiables.

Ventajas de la cristalografía de rayos X

  • Obtener una estructura tridimensional de proteína / complejo proteína-proteína / complejo proteína-molécula pequeña con alta resolución atómica y proporcionar información estructural es útil para comprender la función de la proteína y acelera el proceso de diseño racional de fármacos.
  • No está limitado por el peso molecular de la muestra.
  • Ayuda a reducir la barrera técnica de obtener monocristales de proteínas específicas, como la proteína de membrana, que son difíciles de procesar por métodos convencionales.
  • El algoritmo de análisis de la estructura de las proteínas está bien desarrollado y el modelo establecido tiene una alta confianza.

Qué hacemos: servicios integrados de genes para estructurar

Nuestros servicios vienen con metodologías e instrumentos bien definidos, pero ofrecen una gran flexibilidad según los requisitos del cliente. Podemos preparar proteínas de grado de cristalización desde cero u obtenerlas de los clientes. Además, Bioestructura creativa tiene múltiples proteínas y estructuras cristalinas de alta pureza listas para usar desarrolladas internamente que se pueden usar para cocristalización y remojo de compuestos.

Bioestructura creativa puede proporcionar varias estrategias de cristalización, particularmente para la cristalización de proteínas de membrana. Los servicios detallados se resumen a continuación.

Servicios de cristalización destacadosCaracterística
Cocristalización La cocristalización conserva las estructuras cristalinas únicas con sus múltiples componentes (por ejemplo, proteínas, ADN / ARN, compuestos químicos, iones metálicos).
Cristalización de proteína bicela Proporcionar un entorno más bicapa para las proteínas de membrana que en las micelas de detergente, lo que permite el uso de una metodología de cribado de cristalización estándar para las proteínas de membrana.
Cristalización en fase cúbica lipídica (LCP) LCP tiene una matriz mimética de membrana adecuada para la estabilización y cristalización de proteínas de membrana en un entorno lipídico.
Revisado En Meso Cristalización de fase (CIMP) CIMP estabiliza las proteínas de la membrana en meso fase y permite el seguimiento directo de los eventos de cristalización y transformación de fase.
Rastreo de cristalización de etiquetado fluorescente Excelente para la detección e identificación de cristales marcando covalentemente una sonda fluorescente en la proteína.
Estrategias de la chaperona de cristalización Cocristalización de dianas de proteínas de membrana desafiantes con chaperonas de proteínas solubles.
Cristalización con enfoques de bibliotecas mutantes Mejora de la solubilidad y cristalización de proteínas asistida por la construcción y selección de bibliotecas de mutantes.

Sus tipos de muestras específicos para cristalización

Proteína de membrana Complejo anticuerpo-antígeno Discuta los detalles con nuestros expertos

Metodos experimentales

Preparación del complejo PSII

El complejo proteico de membrana de cianobacterias PSII se purificó a partir de una cianobacteria termófila Thermosynechococcus vulcanus, como se describió anteriormente. 28, 29 Además, se añadieron ácido 6-aminocaproico 1 mM y benzamidina a los tampones de preparación de muestras para evitar la degradación inesperada de proteínas por enzimas endógenas. El complejo de proteína de membrana purificado se suspendió en un tampón que contenía Mes 30 mM (pH 6,0), NaCl 20 mM y CaCl 3 mM.2 y expuestos bajo saturación de la iluminación de luz blanca durante 0, 15, 60, 180 y 300 min a 4 ° C, respectivamente.

Estado estacionario O2Se midió la actividad evolutiva del complejo de proteína de membrana purificada usando un electrodo de oxígeno de tipo Clark a 25 ° C bajo iluminación saturada de luz roja. 28, 29 El complejo PSII correspondiente a 5 μg de clorofila / ml se dispersó en un tampón que contenía 2,6-diclorobenzoquinona recristalizada 0,60 mM y CaCl 10 mM2, y la O2-la tasa de evolución se midió a través de cambios en O2 concentración.

Reticulación del complejo PSII

Las muestras del complejo PSII se suspendieron en 50 mM norte-2-hidroxietilpiperazina-norte-2′-ethanesulfonic acid (HEPES pH 7.4) buffer and diluted to 1 μg/μL. For chemical cross-linking, the samples were incubated with a cross-linker bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3 1:1, w/w) at room temperature for 1 h before 20 mM NH4HCO3 was added to terminate the reaction. All protein samples were precipitated with five volumes of ice-cold precipitation solution (ethanol/acetone/acetic acid = 50:50:0.1) at −20 °C overnight. The precipitated protein samples were resuspended in denaturing buffer (pH 8.0) containing 6 M guanidine and 50 mM Tris. After reduction with 5 mM tris(2-chloroethyl)phosphate (TCEP a thiol-free reducing agent) for 20 min and alkylation with 10 mM iodoacetamide (IAA) for 15 min in the dark, the protein samples were diluted to 2 M guanidine with 50 mM Tris (pH 8.0) and digested using chymotrypsin for 16 h at 37 °C with an enzyme to substrate ratio of 1/25 (w/w). The digested peptide mixtures were purified using a C18 solid-phase extraction (SPE) column before liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis.

Online SCX-RPLC-MS/MS analysis

For the online strong cation exchange (SCX)-reversed-phase LC (RPLC)-MS/MS analysis, a 10 cm SCX column (200 μm i.d.) was prepared as previously described 30 and used as a trapping column as well as the first-dimension LC separation column. A series of stepwise elution with salt concentrations of 150, 250, 350, 450, and 1000 mM NH4AC was used to elute peptides from the SCX column into the second-dimensional capillary column (75 μm, i.d., 15 cm length) packed with C18 particles (3 μm, 120 Å). Each elution lasted 10 min and was followed by equilibrium with 0.1% formic acid (FA) for an additional 15 min. Each elution step was followed by a subsequent RPLC-MS/MS analysis with a 100 min gradient from 5% to 35% acetonitrile (ACN). The flow rate was 300 nL/min. Solutions of 0.1% FA in water and ACN were used as mobile phases A and B, respectively.

An LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer (Thermo, San Jose, CA) was used to perform the CX-MS analyses of proteolytic protein samples. The MS parameters were set as follows: ion transfer capillary 250 °C, spray voltage 2.0 kV, full MS scan from metro/z 350 to 1800 with a resolution of 30,000 in centroid mode. Data-dependent MS/MS scans at R = 7500 were performed by selecting the 10 most intense ions in the full MS scan for higher-energy collisional dissociation (HCD) with 35% normalized collision energy. The ions carrying +1, +2, or unknown-charges were excluded from the MS2 scans. The dynamic exclusion was set as follows: repeat count 1, repeat duration 30 s, and exclusion duration 120 s.

Top-down LC-MS/MS analysis

For top-down analysis, the PSII membrane protein complex samples with different photodamage levels were initially precipitated with ice-cold precipitation solution at −20 °C overnight. The precipitated protein samples were redissolved in 70% FA, which was precooled at −20 °C, 31 followed by incubation at −20 °C for 2 min and diluted with six sample volumes of ice-cold water, and injected immediately into LC-MS/MS instrument for analysis. Briefly, 3 μg intact protein samples were loaded on a C5 capillary trap column (200 μm, i.d., 5 cm length) and separated using a C5 capillary column (75 μm, i.d., 20 cm length) at a flow rate of 300 nL/min. A solution of 0.1% FA in water and 80% ACN/0.1% FA were utilized as mobile phases A and B. The column was eluted by a gradient of 20–100% phase B in 150 min, followed by isocratic elution at 100% phase B for 10 min.

Q-Exactive hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer (Thermo) was utilized for the top-down MS analyses. The MS parameters were set as follows: ion transfer capillary 320 °C, spray voltage 2.0 kV, full MS scan from metro/z 500 to 2500 with a resolution of 120,000. Data-dependent MS/MS scans were performed by selecting the five most intense ions in the full MS scan for HCD with a normalized collision energy of 25%. The MS/MS scans were also acquired by the Orbitrap mass analyzer with a resolution of 60,000, and the automatic gain control (AGC) target was set to 1 × 10 6 with a max injection time of 500 ms. The ions carrying charge <+2 were excluded, and the dynamic exclusion time was set as 180 s.

CX-MS data analysis

The sequences of protein subunits within the cyanobacterial PSII complex were obtained from UniProt ( http://www.uniprot.org/). Cross-linked peptides were identified using the pLink 2.0 software, 32 with its search parameters set as follows: instrument, HCD precursor mass tolerance, 20 ppm fragment mass tolerance, 20 ppm cross-linker BS3 (cross-linking sites K and protein N-terminus, cross-link mass-shift 138.068 Da, monolink mass-shift 156.079 Da) fixed modification carbamidomethyl cysteine (+57.02146 Da) variable modification oxidation of methionine (+15.99492 Da) peptide length, minimum six amino acids and maximum 60 amino acids per chain peptide mass, minimum 600 and maximum 6000 Da per chain enzyme, chymotrypsin, with up to five missed cleavage sites per cross-link. The results were filtered, requiring a false discovery rate (FDR) < 5% and an scoring of matches (SVM) score of ≥1. The MS2 spectra were annotated using pLabel, requiring a mass deviation of ≤20 ppm.

Mapping of the cross-links on structural models was performed using Pymol, and schematic visualizations of cross-links were generated with xiNET. 33

Top-down data analysis

RAW LC-MS/MS data files were searched against ProSightPC (version 4.0.2.1 Thermo) using a Thrash algorithm. Intact precursor and fragment ion masses were searched using a logic tree that submitted all data to an absolute mass search, followed by a biomarker search for all data that did not yield an ID with an expected hit (mi) value less than 1E-4 in the absolute mass search. The precursors with a mass >750 and more than five fragments were searched. The precursor and fragment mass tolerances were set at 10 and 15 ppm, respectively. FDR < 1% was controlled with an mi value below 1E-4 in the biomarker search.

To identify oxidized amino acid residues, the files from the top-down analysis were searched against MSPathFinder (version 1.0.6510). 34 Mass error tolerance was set to 10 ppm for the precursors and fragments. A maximum of seven types of dynamic modifications was allowed on each sequence. The dynamic modifications included were methionine/tryptophan/phenylalanine/leucine/aspartate/glutamate oxidation, cysteine dehydrogen, and protein N-terminal formylation. Other search parameters were set as follows: minimum–maximum (min–max) sequence lengths 21–300, min–max precursor ion charges 2–30, min–max fragment ion charges 1–15, min–max sequence masses 3000–50,000. The results were filtered, requiring a score of ≤1E-4 and a Q-value of ≤0.01.

The MS proteomics data have been deposited on the ProteomeXchange Consortium via the PRIDE 35 partner repository with the dataset identifier PXD021369.


What are the benefits of elucidating the crystal structure of a protein? - biología

Instantánea de datos experimentales

  • Método: & nbspDIFRACCIÓN DE RAYOS X
  • Resolución: & nbsp3.00 Å
  • Sin valor R: & nbsp0.284 
  • Trabajo con valor R: & nbsp0.210 
  • Valor R observado: & nbsp0.210 

Validación de wwPDB& nbsp & nbspInforme 3D & nbspInforme completo

Mutual Conformational Adaptations in Antigen and Antibody Upon Complex Formation between an Fab and HIV-1 Capsid Protein P24

(2000) Structure 8: 1069

  • PubMed: 11080628  Search on PubMed
  • DOI: & nbsp10.1016/s0969-2126(00)00507-4
  • Cita principal de estructuras relacionadas: & nbsp
    1E6O, 1E6J
  • Resumen de PubMed: & nbsp

Elucidating the structural basis of antigen-antibody recognition ideally requires a structural comparison of free and complexed components. To this end we have studied a mouse monoclonal antibody, denoted 13B5, raised against p24, the capsid protein of HIV-1 .

Elucidating the structural basis of antigen-antibody recognition ideally requires a structural comparison of free and complexed components. To this end we have studied a mouse monoclonal antibody, denoted 13B5, raised against p24, the capsid protein of HIV-1. We have previously described the first crystal structure of intact p24 as visualized in the Fab13B5-p24 complex. Here we report the structure of the uncomplexed Fab13B5 at 1.8 A resolution and analyze the Fab-p24 interface and the conformational changes occurring upon complex formation.


SPring-8, the large synchrotron radiation facility

A research team consisting of assistant professor Ken Kitano, research scientist Sun-Yong Kim, and professor Toshio Hakoshima of Nara Institute of Science and Technology has succeeded for the first time in elucidating the function of the Werner helicase, the protein responsible for premature aging syndrome, three dimensionally.

In cell division, the double helix structure of DNA, namely, two DNA strands twisted around each other, should be cleanly separated and each strand should be copied. In this process, a group of protein enzymes called helicases *2 play an important role in separating (unwinding) the DNA helix. One of them, the Werner helicase, is known to cause Werner's syndrome, *1 a type of premature aging syndrome that has a relatively high incidence among Japanese people, when it mutates.

The research team investigated the function of the Werner helicase in a healthy person using the facilities of SPring-8. As a result, they elucidated that a knifelike structure protruding from the surface of the Werner helicase separates the two strands of DNA by prizing them apart. Also, they found that this knifelike structure has the most suitable shape for unwinding tangled DNA, which causes the aging process. These findings are expected to provide new information for researchers seeking a treatment for premature aging syndromes as well as other aging-related diseases, particularly types of cancer.

These research achievements were published in the American scientific journal Estructura on 10 February 2010 and were introduced in the Preview as a highlight of the issue.

1. Background of research
Premature aging syndromes are rare diseases in which overall aging accelerates when the patients are still young. Recently, Hutchinson-Gilford syndrome (also called progeria, in which children begin to age rapidly immediately after birth) has become known to the public because overseas patients suffering from this syndrome were the subject of documentary programs. However, another genetic disease called Werner's syndrome is more prevalent in Japanese people. While it is estimated that there are only several thousand patients with Werner's syndrome worldwide, 70% of those patients are Japanese. In Werner's syndrome, patients age at double the normal rate because of an abnormality in a protein called the Werner helicase. The Werner helicase is known to unwind DNA having unique structures (four-stranded intermediates called Holliday junctions and telomeres located at the ends of chromosomes, *3 which regulate the cell lifetime Fig. 2A) that cannot be unwound by ordinary helicases. However, the mechanism of unwinding by the Werner helicase had not been elucidated.

2. Experimental methods and results
To elucidate the relationship between proteins and premature aging syndromes, the researchers examined the effect of the Werner helicase on the DNA in a healthy person by X-ray crystal structure analysis. *4 The shapes of molecules were observed by crystallizing the central part (RecQ domain) of the Werner helicase bound to double-stranded DNA and exposing the obtained crystals to the high-brilliance X-ray of the Structural Biology I Beamline (BL41XU) and the Macromolecular Assemblies Beamline (BL44XU) in SPring-8.

As a result, the state of the Werner helicase as it begins to unwind the DNA was elucidated three dimensionally (Fig. 1). The Werner helicase has a protruding structure named a "DNA-unwinding knife" and unwinds the double helix of the DNA while rotating around it, similarly to the peeling of an apple with a knife. Moreover, this unwinding knife has an elongated shape protruding from the molecular surface, which is the most suitable shape for unwinding DNA with a complicated structure (Fig. 2B). It is considered that the Werner helicase prevents the occurrence of premature aging syndromes by unwinding DNA structures such as Holliday junctions and telomeres with the DNA-unwinding knife.

3. Future expectations
Even in a healthy person, genes are damaged in daily life and such damaged genes cause aging and may cause cancer. In particular, telomeres are important parts of chromosomes that regulate the cell lifetime. Because telomeres have a complicated loop structure, it is considered to be difficult to maintain their length by the function of ordinary proteins alone. In patients with Werner's syndrome, the telomeres tend to become shorter because of mutation of the Werner helicase, resulting in the accelerated aging of the body. There is still no technique for curing patients with shortened telomeres. However, the continued examination of the shapes of proteins may lead to the discovery of a means of maintaining the original length of telomeres, namely, a means of keeping cells young. Also, it has been reported that inhibition of the Werner helicase activity suppresses the growth of cancer. These research achievements are expected to be applied to the development of anticancer drugs for the general public.

Fig. 1 DNA-unwinding knife of Werner helicase observed in this study
It has the shape of a knife being held by a hand.

(A) The DNA-unwinding knife of the Werner helicase is so fine that it can be inserted into narrow gaps in the DNA structure, which ordinary helicases cannot enter. Owing to this feature, the DNA-unwinding knife appears to be used for unwinding complicated DNA structures.
(B) The Werner helicase unwinding a Holliday junction (simulation model on the basis of this study). The RecQ domains (blue) consisting of two molecules insert the DNA-unwinding knife into the narrow branch points of the Holliday junction, and each domain starts to unwind the DNA structures on the left and right.

*1 Werner's syndrome
This is a premature aging syndrome named after its discoverer Otto Werner. While the symptoms of progeria appear immediately after birth, in the case of Werner's syndrome, overall aging starts to accelerate rapidly when the patients are in their mid-teens. The mean life expectancy of a patient with Werner's syndrome is 46 years, and no treatment for this disease has yet been discovered. It is estimated that one out of several hundred Japanese people is a latent carrier of Werner's syndrome, namely, a carrier of the mutation of the Werner gene, even if he/she does not develop the disease.

*2 DNA helicases
DNA helicases are proteins that separate the double helix of DNA into single strands. They can be classified into various types. The amino-acid sequence of the Werner helicase is similar to that of the Bloom helicase, which causes Bloom syndrome (a rare disease in which the patients frequently develop cancer in their childhood) and that of the RECQL4 helicase, which causes Rothmund-Thomson syndrome. These helicases are generally called RecQ family helicases. The results of this study indicated that the Bloom helicase also has a similar DNA-unwinding knife.

*3 Telomeres
Telomeres are the regions of DNA at the ends of chromosomes that shorten every time a cell divides. They are sometimes described as an "aging clock." Telomeres were the subject of the research awarded the 2009 Nobel Prize in Physiology or Medicine.

*4 X-ray crystal structure analysis
This is a method of determining the three-dimensional structure of a protein or DNA molecule by crystallizing the molecules and exposing the crystals to an X-ray beam.

For more information, please contact:
Dr. Ken KITANO (Nara Institute of Science and Technology)
Correo electrónico:


Contenido

Kinesins were discovered in 1985, based on their motility in cytoplasm extruded from the giant axon of the squid. [2]

They turned out as MT-based anterograde intracellular transport motors. [3] The founding member of this superfamily, kinesin-1, was isolated as a heterotetrameric fast axonal organelle transport motor consisting of 2 identical motor subunits (KHC) and 2 "light chains" (KLC) via microtubule affinity purification from neuronal cell extracts. [4] Subsequently, a different, heterotrimeric plus-end-directed MT-based motor named kinesin-2, consisting of 2 distinct KHC-related motor subunits and an accessory "KAP" subunit, was purified from echinoderm egg/embryo extracts [5] and is best known for its role in transporting protein complexes (IFT particles) along axonemes during cilium biogenesis. [6] Molecular genetic and genomic approaches have led to the recognition that the kinesins form a diverse superfamily of motors that are responsible for multiple intracellular motility events in eukaryotic cells. [7] [8] [9] [10] For example, the genomes of mammals encode more than 40 kinesin proteins, [11] organized into at least 14 families named kinesin-1 through kinesin-14. [12]

Overall structure Edit

Members of the kinesin superfamily vary in shape but the prototypical kinesin-1 motor consists of two Kinesin Heavy Chain (KHC) molecules which form a protein dimer (molecule pair) that binds two light chains (KLCs), which are unique for different cargos.

The heavy chain of kinesin-1 comprises a globular cabeza (the motor domain) at the amino terminal end connected via a short, flexible neck linker to the stalk – a long, central alpha-helical coiled coil domain – that ends in a carboxy terminal cola domain which associates with the light-chains. The stalks of two KHCs intertwine to form a coiled coil that directs dimerization of the two KHCs. In most cases transported cargo binds to the kinesin light chains, at the TPR motif sequence of the KLC, but in some cases cargo binds to the C-terminal domains of the heavy chains. [13]

Kinesin motor domain Edit

The head is the signature of kinesin and its amino acid sequence is well conserved among various kinesins. Each head has two separate binding sites: one for the microtubule and the other for ATP. ATP binding and hydrolysis as well as ADP release change the conformation of the microtubule-binding domains and the orientation of the neck linker with respect to the head this results in the motion of the kinesin. Several structural elements in the Head, including a central beta-sheet domain and the Switch I and II domains, have been implicated as mediating the interactions between the two binding sites and the neck domain. Kinesins are structurally related to G proteins, which hydrolyze GTP instead of ATP. Several structural elements are shared between the two families, notably the Switch I and Switch II domain.

Basic kinesin regulation Edit

Kinesins tend to have low basal enzymatic activity which becomes significant when microtubule-activated. [16] In addition, many members of the kinesin superfamily can be self-inhibited by the binding of tail domain to the motor domain. [17] Such self-inhibition can then be relieved via additional regulation such as binding to cargo or cargo adapters. [18] [19]

In the cell, small molecules, such as gases and glucose, diffuse to where they are needed. Large molecules synthesised in the cell body, intracellular components such as vesicles and organelles such as mitochondria are too large (and the cytosol too crowded) to be able to diffuse to their destinations. Motor proteins fulfill the role of transporting large cargo about the cell to their required destinations. Kinesins are motor proteins that transport such cargo by walking unidirectionally along microtubule tracks hydrolysing one molecule of adenosine triphosphate (ATP) at each step. [20] It was thought that ATP hydrolysis powered each step, the energy released propelling the head forwards to the next binding site. [21] However, it has been proposed that the head diffuses forward and the force of binding to the microtubule is what pulls the cargo along. [22] In addition viruses, HIV for example, exploit kinesins to allow virus particle shuttling after assembly. [23]

There is significant evidence that cargoes in-vivo are transported by multiple motors. [24] [25] [26] [27]

Motor proteins travel in a specific direction along a microtubule. Microtubules are polar meaning, the heads only bind to the microtubule in one orientation, while ATP binding gives each step its direction through a process known as neck linker zippering. [28]

It has been previously known that kinesin move cargo towards the plus (+) end of a microtubule, also known as anterograde transport/orthograde transport. [29] However, it has been recently discovered that in budding yeast cells kinesin Cin8 (a member of the Kinesin-5 family) can move toward the minus end as well, or retrograde transport. This means, these unique yeast kinesin homotetramers have the novel ability to move bi-directionally. [30] [31] [32] Kinesin, so far, has only been shown to move toward the minus end when in a group, with motors sliding in the antiparallel direction in an attempt to separate microtubules. [33] This dual directionality has been observed in identical conditions where free Cin8 molecules move towards the minus end, but cross-linking Cin8 move toward the plus ends of each cross-linked microtubule. One specific study tested the speed at which Cin8 motors moved, their results yielded a range of about 25-55 nm/s, in the direction of the spindle poles. [34] On an individual basis it has been found that by varying ionic conditions Cin8 motors can become as fast as 380 nm/s. [34] It is suggested that the bidirectionality of yeast kinesin-5 motors such as Cin8 and Cut7 is a result of coupling with other Cin8 motors and helps to fulfill the role of dynein in budding yeast, as opposed to the human homologue of these motors, the plus directed Eg5. [35] This discovery in kinesin-14 family proteins (such as Drosophila melanogaster NCD, budding yeast KAR3, and Arabidopsis thaliana ATK5) allows kinesin to walk in the opposite direction, toward microtubule minus end. [36] This is not typical of kinesin, rather, an exception to the normal direction of movement.

Another type of motor protein, known as dyneins, move towards the minus end of the microtubule. Thus, they transport cargo from the periphery of the cell towards the center. An example of this would be transport occurring from the terminal boutons of a neuronal axon to the cell body (soma). Esto se conoce como transporte retrógrado.

Kinesin accomplishes transport by "walking" along a microtubule. Two mechanisms have been proposed to account for this movement.

  • In the "hand-over-hand" mechanism, the kinesin heads step past one another, alternating the lead position.
  • In the "inchworm" mechanism, one kinesin head always leads, moving forward a step before the trailing head catches up.

Despite some remaining controversy, mounting experimental evidence points towards the hand-over-hand mechanism as being more likely. [37] [38]

ATP binding and hydrolysis cause kinesin to travel via a "seesaw mechanism" about a pivot point. [39] [40] This seesaw mechanism accounts for observations that the binding of the ATP to the no-nucleotide, microtubule-bound state results in a tilting of the kinesin motor domain relative to the microtubule. Critically, prior to this tilting the neck linker is unable to adopt its motor-head docked, forward-facing conformation. The ATP-induced tilting provides the opportunity for the neck linker to dock in this forward-facing conformation. This model is based on CRYO-EM models of the microtubule-bound kinesin structure which represent the beginning and end states of the process, but cannot resolve the precise details of the transition between the structures.

A number of theoretical models of the molecular motor protein kinesin have been proposed. [41] [42] [43] Many challenges are encountered in theoretical investigations given the remaining uncertainties about the roles of protein structures, the precise way energy from ATP is transformed into mechanical work, and the roles played by thermal fluctuations. This is a rather active area of research. There is a need especially for approaches which better make a link with the molecular architecture of the protein and data obtained from experimental investigations.

The single-molecule dynamics are already well described [44] but it seems that these nano scale machines typically work in large teams.

Single-molecule dynamics are based on the distinct chemical states of the motor and observations about its mechanical steps. [45] For small concentrations of adenosine diphosphate, the motor’s behaviour is governed by the competition of two chemomechanical motor cycles which determine the motor’s stall force. A third cycle becomes important for large ADP concentrations. [45] Models with a single cycle have been discussed too. Seiferth et al. demonstrated how quantities such as the velocity or the entropy production of a motor change when adjacent states are merged in a multi-cyclic model until eventually the number of cycles is reduced. [46]

Recent experimental research has shown that kinesins, while moving along microtubules, interact with each other, [47] [48] the interactions being short range and weak attractive (1.6±0.5 KBT). One model that has been developed takes into account these particle interactions, [44] where the dynamic rates change accordingly with the energy of interaction. If the energy is positive the rate of creating bonds (q) will be higher while the rate of breaking bonds (r) will be lower. One can understand that the rates of entrance and exit in the microtubule will be changed as well by the energy (See figure 1 in reference 30). If the second site is occupied the rate of entrance will be α*q and if the last but one site is occupied the rate of exit will be β*r. This theoretical approach agrees with the results of Monte Carlo simulations for this model, especially for the limiting case of very large negative energy. The normal totally asymmetric simple exclusion process for (or TASEP) results can be recovered from this model making the energy equal to zero.

In recent years, it has been found that microtubule-based molecular motors (including a number of kinesins) have a role in mitosis (cell division). Kinesins are important for proper spindle length and are involved in sliding microtubules apart within the spindle during prometaphase and metaphase, as well as depolymerizing microtubule minus ends at centrosomes during anaphase. [49] Specifically, Kinesin-5 family proteins act within the spindle to slide microtubules apart, while the Kinesin 13 family act to depolymerize microtubules.

Human kinesin superfamily members include the following proteins, which in the standardized nomenclature developed by the community of kinesin researchers, are organized into 14 families named kinesin-1 through kinesin-14: [12]


Ver el vídeo: TestLab: Qué es la desnaturalización de las proteínas? (Mayo 2022).