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23.2: Enfoques genómicos - El microarray de ADN - Biología

23.2: Enfoques genómicos - El microarray de ADN - Biología



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Tradicionalmente, cuando se sabía que los niveles celulares de una proteína cambiaban en respuesta a un efector químico, los estudios moleculares se centraban en el control de la transcripción de su gen. Estos estudios a menudo revelaron que el control de la expresión génica estaba en el nivel de la transcripción, activando o desactivando un gen a través de las interacciones de los factores de transcripción con el ADN. Sin embargo, los niveles de proteína también se controlan postranscripcionalmente, regulando la tasa de traducción o degradación del ARNm. Los estudios de los mecanismos de regulación transcripcional y postranscripcional son fundamentales para nuestra comprensión de cómo se produce la proteína correcta en las cantidades adecuadas en el momento adecuado.

Es posible que lo hayamos sospechado, pero ahora sabemos que el control de la expresión génica y las respuestas celulares puede ser más complejo que aumentar o disminuir la transcripción de un solo gen o la traducción de una sola proteína. Las secuencias del genoma completo y las nuevas técnicas hacen posible el estudio de la expresión de prácticamente todos los genes en una célula al mismo tiempo, un campo de investigación llamado genómica. Los estudios genómicos revelan redes de genes regulados que deben entenderse para explicar más completamente los cambios fisiológicos y de desarrollo en un organismo. Cuando puede "ver" todos los ARN que se transcriben a partir de genes activos en una célula, está mirando el transcriptoma. Por analogía con la genómica, transcriptómica define estudios de "redes" de ARN interactivos. Nuevamente, por analogía con la genómica y la transcriptómica, el estudio amplio de proteínas activas e inactivas en células o tejidos, cómo se modifican (procesan) antes de su uso y cómo interactúan se denomina proteómica. Las tecnologías aplicadas a los estudios proteómicos incluyen microarrays de proteínas, técnicas inmunoquímicas y otras especialmente adecuadas para el análisis de proteínas (haga clic en Proteomics Techniques-Wikipedia para obtener más información). Microarrays de proteínas se utilizan cada vez más para identificar interacciones proteína-proteína, así como los diferentes estados de las proteínas en diferentes condiciones celulares. Lea aún más sobre estos emocionantes desarrollos y su impacto en la investigación básica y clínica en Protein Microarrays de ncbi.

Finalmente, piense en esto: crear una biblioteca proteómica análoga a una biblioteca genómica parecería una perspectiva desalentadora. Pero se están realizando esfuerzos. Consulte A stab on mapeo del proteoma humano para obtener una investigación original que conduzca al muestreo de un proteoma humano específico de tejido, y haga clic en Estrategias para abordar el proteoma para obtener más información general. Veamos algunos usos de los microarrays de ADN. Esta tecnología implica "detectar" ADN (p. Ej., ADN clonado de una biblioteca genómica o de ADNc, productos de PCR, oligonucleótidos ...) en un portaobjetos de vidrio o en un chip. En el lenguaje del análisis de microarrays, las diapositivas son las sondas. Detectar un chip es un proceso robótico. Debido a que las manchas de ADN son microscópicas, un transcriptoma específico de células (biblioteca de ADNc) puede caber en un solo chip. Un microarreglo de genoma pequeño también podría caber en un solo chip, mientras que los genomas más grandes podrían necesitar varias diapositivas. Un uso principal de los microarrays de ADN es perfil transcripcional. Una micromatriz genómica puede sondear una mezcla de ADNc diana marcados con fluorescencia elaborados a partir de ARNm, con el fin de identificar muchos (si no todos) de los genes expresados ​​en las células en un momento dado (es decir, su transcriptoma). Las sondas de microarrays de ADNc también pueden sondear diferencias cuantitativas en la expresión génica en células o tejidos durante la diferenciación normal o en respuesta a señales químicas. También son valiosos para la genotipificación (es decir, caracterizar los genes en un organismo). Los micromatrices son tan sensibles que incluso pueden distinguir entre dos genes o regiones de ADN que se diferencian por un solo nucleótido. Haga clic en Polimorfismos de nucleótido único o SNP para obtener más información. En la micromatriz a continuación, cada mancha de color (rojo, amarillo, verde) es una molécula etiquetada con fluorescencia diferente que se hibrida con las secuencias diana en la micromatriz. En el microscopio de fluorescencia, las manchas emiten fluorescencia de diferentes colores en respuesta a la luz ultravioleta.

Con los métodos de microarrays cuantitativos, se puede medir el brillo (intensidad) de la señal de cada sonda. De esta manera, podemos comparar las cantidades relativas de ADNc (y por lo tanto, diferentes ARN) en el transcriptoma de diferentes tejidos o como resultado de diferentes tratamientos de tejidos. En la página siguiente se muestra una tabla de diferentes aplicaciones de microarrays (adaptada de Wikipedia).

Aplicación de tecnologíaSinopsis
Perfiles de expresión genéticaEn un experimento de elaboración de perfiles de transcripción (ARNm o expresión génica), los niveles de expresión de miles de genes se controlan simultáneamente para estudiar los efectos de ciertos tratamientos, enfermedades y etapas de desarrollo en la expresión génica.
Hibridación genómica comparativaEvaluar el contenido del genoma en diferentes células u organismos estrechamente relacionados, donde el genoma de un organismo es la sonda para un genoma objetivo de una especie diferente.
GeneIDPequeños microarrays para verificar la identificación de organismos en alimentos y piensos en busca de organismos genéticamente modificados (OGM), micoplasmas en cultivo celular o patógenos para la detección de enfermedades. Estos protocolos de detección a menudo combinan tecnología de microarrays y PCR.
CHIP; Inmunoprecipitación de cromatinaLas secuencias de ADN unidas a una proteína particular pueden aislarse inmunoprecipitando la proteína. Los fragmentos se pueden hibridar a una micromatriz (como una matriz de mosaico) que permite la determinación de la ocupación del sitio de unión a proteínas en todo el genoma.
DamIDDe manera análoga a ChIP, las regiones genómicas unidas por una proteína de interés pueden aislarse y usarse para sondear una micromatriz para determinar la ocupación del sitio de unión. A diferencia de ChIP, DamID no requiere anticuerpos, pero utiliza la metilación de adenina cerca de los sitios de unión de la proteína para amplificar selectivamente esas regiones, introducidas expresando cantidades diminutas de proteína de interés fusionada con la adenina metiltransferasa de ADN bacteriano.
Detección de SNPIdentificación del polimorfismo de un solo nucleótido entre alelos dentro o entre poblaciones. Algunas aplicaciones de microarrays hacen uso de la detección de SNP, incluida la genotipificación, el análisis forense, la medición de la predisposición a la enfermedad, la identificación de candidatos a fármacos, la evaluación línea germinal mutaciones en individuos o somático mutaciones en cánceres, evaluación de la pérdida de heterocigosidad o análisis de ligamiento genético.
Protección de empalme alternativaUn diseño de matriz de unión de exón utiliza sondas específicas para los sitios de empalme esperados o potenciales de los exones predichos para un gen. Es de densidad intermedia, o cobertura, a una matriz de expresión génica típica (con 1-3 sondas por gen) y una matriz de ordenamiento genómico (con cientos o miles de sondas por gen). Se utiliza para analizar la expresión de formas de corte y empalme alternativas de un gen. Las matrices de exones tienen un diseño diferente, emplean sondas diseñadas para detectar cada exón individual para genes conocidos o predichos, y se pueden usar para detectar diferentes isoformas de empalme
Matriz de mosaicoLas matrices de ordenamiento en teselas del genoma consisten en sondas superpuestas diseñadas para representar densamente una región genómica de interés, a veces tan grande como un cromosoma humano completo. El propósito es detectar empíricamente la expresión de transcripciones o formas empalmadas alternativamente que pueden no haber sido previamente conocidas o predichas.

El poder de los microarrays. https://youtu.be/88rzbpclscM

Si te gustan los récords mundiales, echa un vistazo a la salamandra con el genoma más grande, 10 veces más grande que el nuestro: el ENORME genoma de Axolotl. ¿Qué hacen con todo ese ADN? ¿Y nuestras tecnologías actuales pueden resolverlo? Para ver el informe original, haga clic en el siguiente enlace: aquí.


Microarrays

Frederick D. Park,. Tannishtha Reya, en Métodos científicos básicos para investigadores clínicos, 2017

Sensibilidad, especificidad y dependencia de secuencias conocidas

Los microarrays son menos sensibles y menos específicos que RNA-Seq. El rango de cobertura de la sonda de microarrays depende completamente del conocimiento previo de la secuencia, mientras que RNA-Seq no está sesgado o limitado por dicha información, ya que proporciona una vista completa de todo el transcriptoma. Y así, aunque los microarrays de alta densidad están reduciendo la brecha, los microarrays aún pueden perder transcripciones novedosas o isoformas que pueden ser detectadas por RNA-Seq. Además, los SNP encontrados por RNA-Seq pueden ser novedosos y más informativos, ya que se expresan en transcripciones de ARN, mientras que los microarrays solo detectan SNP conocidos en el ADN genómico. Otra desventaja de los microarrays es que a medida que se dispone de nuevos datos de secuencia, los datos de microarrays anteriores pueden volverse obsoletos. Se necesitaría ejecutar un conjunto de muestras de nuevo con un microarreglo más nuevo que cubra la nueva secuencia, mientras que los datos más completos de RNA-Seq seguirían siendo relevantes. RNA-Seq también puede distinguir las transcripciones del huésped del parásito y examinar las transcripciones de cualquier organismo sin conocimiento previo de la secuencia. Esto es especialmente útil para las bacterias, que tienen grandes variaciones en la secuencia genómica incluso dentro de una sola cepa.

Las micromatrices también son inherentemente menos sensibles y específicas que RNA-Seq porque se basan en la hibridación de ácidos nucleicos. Aunque las secuencias de sonda se seleccionan por su buena especificidad para una secuencia diana, una sonda puede no ser completamente específica para una única diana. Además, los tintes fluorescentes pueden afectar de manera diferente a la hibridación. Dada esta diferencia fundamental, se podría decir que los datos de microarrays frente a los datos de RNA-Seq son "analógicos" frente a "digitales", respectivamente. Las micromatrices solo pueden proporcionar una expresión relativa comparando las intensidades de las sondas. No proporcionan una cuantificación absoluta de la expresión de la transcripción, como RNA-Seq. Además, los microarrays tienen un rango dinámico potencial menor debido a la cinética de hibridación no lineal en cualquier extremo de abundancia: las sondas pueden saturarse con objetivos de alta abundancia y dar poca señal por encima del ruido de fondo con objetivos de muy baja abundancia. Con una mayor profundidad de secuenciación, RNA-Seq ofrece una sensibilidad y una relación señal / ruido mucho mejores para transcripciones de baja abundancia.


¿Para qué se utiliza una micromatriz de ADN?

Cuando se introdujeron por primera vez, los microarrays de ADN se utilizaron solo como una herramienta de investigación. En la actualidad, los científicos continúan realizando estudios de población a gran escala, por ejemplo, para determinar con qué frecuencia los individuos con una mutación en particular desarrollan realmente cáncer de mama, o para identificar los cambios en las secuencias de genes que se asocian con mayor frecuencia con enfermedades particulares. Esto ha sido posible porque, al igual que en el caso de los chips de computadora, se pueden colocar un gran número de "características" en los chips de microarrays, que representan una gran parte del genoma humano.

Las micromatrices también se pueden utilizar para estudiar el grado en que ciertos genes se activan o desactivan en células y tejidos. En este caso, en lugar de aislar el ADN de las muestras, se aísla y mide el ARN (que es una transcripción del ADN).

Hoy en día, los microarrays de ADN se utilizan en pruebas de diagnóstico clínico para algunas enfermedades. A veces, también se utilizan para determinar qué medicamentos se pueden prescribir mejor para individuos en particular, porque los genes determinan cómo nuestro cuerpo maneja la química relacionada con esos medicamentos. el pasado ahora usa la secuenciación de ADN en su lugar. Pero las pruebas de microarrays todavía tienden a ser menos costosas que la secuenciación, por lo que pueden usarse para estudios muy grandes, así como para algunas pruebas clínicas.

Cuando se introdujeron por primera vez, los microarrays de ADN se utilizaron solo como una herramienta de investigación. En la actualidad, los científicos continúan realizando estudios de población a gran escala, por ejemplo, para determinar con qué frecuencia los individuos con una mutación en particular desarrollan realmente cáncer de mama, o para identificar los cambios en las secuencias de genes que se asocian con mayor frecuencia con enfermedades particulares. Esto ha sido posible porque, al igual que en el caso de los chips de computadora, se pueden colocar un gran número de "características" en los chips de microarrays, que representan una gran parte del genoma humano.

Los microarrays también se pueden usar para estudiar el grado en que ciertos genes se activan o desactivan en células y tejidos. En este caso, en lugar de aislar el ADN de las muestras, se aísla y mide el ARN (que es una transcripción del ADN).

Hoy en día, los microarrays de ADN se utilizan en pruebas de diagnóstico clínico para algunas enfermedades. A veces, también se utilizan para determinar qué medicamentos se pueden recetar mejor para individuos en particular, porque los genes determinan cómo nuestro cuerpo maneja la química relacionada con esos medicamentos. el pasado ahora usa la secuenciación de ADN en su lugar. Pero las pruebas de microarrays todavía tienden a ser menos costosas que la secuenciación, por lo que pueden usarse para estudios muy grandes, así como para algunas pruebas clínicas.


Inmunoprecipitación de cromatina y análisis de ubicación de proteínas basado en microarrays

El análisis de ubicación de todo el genoma, también conocido como ChIP-Chip, combina la inmunoprecipitación de cromatina y el análisis de microarrays de ADN para identificar las interacciones proteína-ADN que ocurren en las células vivas. Las interacciones proteína-ADN se capturan in vivo mediante reticulación química. La lisis celular, la fragmentación del ADN y la purificación por inmunoafinidad de la proteína deseada co-purificarán los fragmentos de ADN que están asociados con esa proteína. Luego, la población de ADN enriquecida se marca, se combina con una muestra de referencia marcada de forma diferencial y se aplica a los microarrays de ADN para detectar señales enriquecidas. Luego se aplican varios enfoques computacionales y bioinformáticos para normalizar los canales enriquecidos y de referencia, para conectar señales a las porciones del genoma que están representadas en los microarrays de ADN, para proporcionar métricas de confianza y para generar mapas de ocupación de genoma de proteína. Aquí, describimos los protocolos experimentales que utilizamos desde la reticulación de células hasta la hibridación de material marcado, junto con información sobre los aspectos de estos protocolos que influyen en los resultados. Estos protocolos requieren aproximadamente 1 semana para completarse una vez que se ha obtenido un número suficiente de células, y se han utilizado para producir resultados de chips de chip de alta calidad robustos en muchos tipos diferentes de células y tejidos.

Cifras

Una cronología de muestra para…

Una línea de tiempo de muestra para el protocolo ChIP-Chip. Los pasos individuales se muestran en blanco ...

Resultados de diversos grados de…

Resultados de diversos grados de sonicación sobre el tamaño del fragmento. Un total de 2…

Gel de agarosa al 2% que muestra un ejemplo de ADN de entrada, ADN después de la amplificación LMPCR ...

Muestras de matrices hibridadas y ...

Muestras de matrices hibridadas y diagramas de dispersión. ( a ) Una porción de…

Ejemplos de datos de una matriz que se procesan para identificar regiones genómicas ...


Contenido del genoma y secuenciación de genes

- pero el genoma humano tiene 20.000 genes. la levadura tiene 6.000 genes. así que no hay mucha diferencia en los genes de un organismo de una sola célula.

- Gran parte de nuestro ADN en nuestro genoma no codifica proteínas = ADN basura acumulado por transposición y evolución

- algunos de estos genomas más pequeños deben replicarse de manera más eficiente, no es un problema para nosotros. nuestro genoma es más tolerante a tener estos trozos adicionales de adn, no completamente claros

- el tamaño del genoma no siempre se corresponde con la complejidad del organismo

- las 500 bases que obtienes se denominan lectura. Una salida de una sola reacción de secuencia de ADN

La Fed es la primera.
- 1er método: utilizó en secuencia el primer genoma humano, se basó en la clonación de ADN en células microbianas y empleó la técnica de secuenciación didesoxi de Sanger. WGS tradicional.

- 2º método: sin células, alto rendimiento.

-1, Generar biblioteca genómica: colección de
fragmentos de ADN genómico (de restricción
digestión enzimática) clonado en vectores
(plásmidos, cromosomas artificiales)
representando colectivamente el genoma completo

aquí estamos generando una biblioteca genómica (obtener adn, cortarlo y clonarlo en un vector). El vector va a ser como un plásmido, adn que puede replicarse por sí mismo de forma autónoma, pero también ponerlo en una bacteria y replicarse. ADN clonado en vectores (solo plásmidos de 6 o 7 kb) y los cromosomas artificiales pueden contener piezas más largas de ADN). por lo que genera una biblioteca que representaría todas las secuencias de ADN de un organismo.

- ir sobre clones individuales seq

- tomar insertos y secuenciar los extremos de ellos. simplemente determine la secuencia final. porque si tu objetivo es determinar la superposición, entonces la mayor parte de la secuencia son los fines. una vez que haya determinado cuáles se superponen. y luego retroceda y séquelos completamente. pero si eres capaz de determinar los fines. luego ha ordenado patrones, para combinarlos en su totalidad.

- use lecturas finales emparejadas. puede tener varias inserciones.
conoces la secuencia de este vector en rojo. por lo que es fácil diseñar este vector basado en la secuencia del vector. para que pueda diseñar estos imprimadores. entonces puedes ganar algo de secuencia nueva, en verde, azul, verde claro, naranja.

- para euk, hay repeticiones, la repetición en tándem es más larga que la lectura de secuencia máxima. no hay forma de salvar la brecha a veces se alinean con lecturas incorrectas.

- soln fue hacer uso de pares de lecturas de secuencia de extremos opuestos de las inserciones genómicas en el mismo clon, lecturas de extremos emparejados.

- tratando de encontrar el espacio entre los dos contigs. dado que se conoce la distancia de los clones, entonces se sabe cuánto tiempo falta el espacio.

en última instancia, con la esperanza de generar un patrón ordenado único de fragmento de ADN con la comprensión de dónde hay espacios entre su fragmento. Haga esto para una gran cantidad de fragmentos de ADN y podrá acumular muchos. pero no se puede acumular todo el millón de bases de un cromosoma con solo hacer esto. tendrá algunas lagunas a lo largo del camino, parte del adn no se representará en la biblioteca o la secuenciación de rxn funcionaba perfectamente.

una de las formas de retroceder entonces es tomar seq contigs. estas son las secuencias ligeramente más largas (contigs). mira los extremos. digamos que hay una brecha entre ellos. estos extremos no se superponen. genere otra lib de adn o mire lib de nuevo. algo de adn que abarcaría esa región.
si encontrara eso, algún fragmento de ADN en lib. si pudieras secuenciar que podrías llenar el vacío
El patrón ordenado de los huecos y contigs de fragmentos de ADN se denomina andamio. los andamios son mapas que usted genera, no tanto una cosa física como un pedido.

por ejemplo, contig a está en el cromosoma 1 y contig b también está allí y sabes que hay una brecha de 2 kb = andamio.

- una alternativa para salvar las brechas de secuencia mediante el uso de bibliotecas genómicas

- tome cdna, y solo seq los extremos. luego genere etiquetas. no estás interesado en la seq. solo quiero saber qué genes se transcriben. La información de los extremos es suficiente para saber si se trata del gen x o gal4 o w / e.

- Se busca en una base de datos de secuencias nt o AA secuencias similares a una secuencia de "consulta" (p. Ej., Gen putativo)

- La idea es que existen bases de datos que se han generado de dna seq y protein seq. si tiene adn y realiza una traducción conceptual (tome trozos de seq en grupos de tres (codones), considere los aminoácidos traducidos y los aminoácidos en cadena juntos y busque en una base de datos con secuencias de proteínas conocidas).

- Podrías ver si hay coincidencia con el tramo de adn, si en realidad se trata de una codificación de proteínas. Blast es una herramienta de alineación que le ayuda a realizar el análisis. Herramienta computacional, le permite identificar nt o AA seq.

- puede tomar nt y compararlo con otras secuencias de adn. mucho más poderoso para hacer análisis en un no. menos opciones con aminoácidos, por lo que más poder de alineación. mucho más fácil de comparar la proteína seq.

- para que tome la base de datos, ingrese alguna secuencia desconocida. hacer la traducción automáticamente y buscar contra i. Puede tomar nt y compararlo con otras secuencias de adn. mucho más poderoso para hacer análisis en un no. menos opciones con aminoácidos, por lo que más poder de alineación. mucho más fácil de comparar la proteína seq. devuelve un número, con la expectativa de que la coincidencia que obtuviste se produzca al azar.
- el gen putatitivo es similar al gen conocido en otros organismos = ortólogo.
digamos que haces una búsqueda rápida, encuentras una coincidencia sólida. la secuencia de adn que encuentra es que se conserva el problema. El gen putativo en su secuencia es similar a la secuencia conocida en otro organismo, se llama ortólogo. encontró un gen que es similar / mismo en el mismo organismo (eventos de duplicación) - eso se llama parálogo, no ortólogo.

la razón por la que su diablillo es que si encuentra un ortólogo, infiera algo sobre la función de las secuencias, las proteínas codificadas deberían funcionar de manera similar
Si encuentra que seq traduce proteínas en el mismo organismo, no puede inferir nada sobre la función; puede tener la misma función, puede que no. uno de ellos acumula mutación (funcionalmente útil). así es como la proteína tiene una función diferente. La célula tiene una función de proteína, pero con cambios duplicados, tal vez alguna misma función, pero la proteína codificada también tendrá una función de diferencia.


La selección a largo plazo de microorganismos o poblaciones en condiciones de laboratorio para modelar escenarios evolutivos simples.

La identificación de una variante genómica, cuyo estado real no se conoce hasta un análisis posterior.

En el contexto de los microarrays, la sonda de ADN se refiere al oligonucleótido de ADN, el producto de PCR o el clon genómico que se une a un microarreglo para sondear una muestra de ADN genómico marcada que se agrega en solución. En el contexto de la transferencia Southern, sonda de ADN se refiere al oligonucleótido de ADN marcado que se agrega en solución para sondar la muestra de ADN genómico que está inmovilizada en una membrana.

El uso de máscaras para desproteger selectivamente oligonucleótidos nacientes usando luz, permitiendo la síntesis paralela de millones de sondas.

El uso de cabezales de cartuchos de impresión para depositar una de las cuatro bases de ADN en un sitio de sonda en el microarray.

Fluorescente en el lugar hibridación

(PEZ). Técnica en la que se utiliza una sonda de ADN marcada con fluorescencia para detectar un cromosoma o gen en particular mediante microscopía de fluorescencia.

Procedimiento en el que se miden los productos de una reacción de PCR mediante el seguimiento de la señal que produce un tinte fluorescente, que se acumula durante cada ciclo de PCR.

La tmetro (temperatura de fusión) de un oligonucleótido es la temperatura a la que se separan el 50% de las cadenas dúplex.

Mutaciones que suprimen o alivian el efecto fenotípico de otra mutación.

El número de diferentes secuencias de ADN en un genoma, originalmente medido por la tasa de reasociación de ADN desnaturalizado por calor.

Determinación de la secuencia en ambos extremos de un fragmento de ADN de tamaño conocido.

La determinación de la secuencia de ADN exacta por comparación con una referencia conocida.

Pruebas estadísticas que asumen una distribución subyacente, que suele ser gaussiana. El término gaussiano describe una distribución de probabilidad continua que es simétrica alrededor de un valor medio definido, cuya forma está determinada por la varianza.

(Chip). Fraccionamiento de ADN que se une a una proteína de interés mediante un anticuerpo.

El uso de métodos que incluyan una referencia interna para que la relación entre muestra y control sea la métrica de interés.


MicroRNómica EN ENFERMEDAD CARDIOVASCULAR

La hipertrofia cardíaca es una respuesta patológica común a una serie de enfermedades cardiovasculares como la hipertensión, la cardiopatía isquémica, las valvulopatías y los trastornos endocrinos. La hipertrofia cardíaca a menudo conduce a insuficiencia cardíaca en humanos y es un determinante importante de la mortalidad y morbilidad en las enfermedades cardiovasculares. Los miARN son reguladores importantes para la diferenciación y el crecimiento de las células cardíacas y, por lo tanto, es razonable plantear la hipótesis de que los miARN desempeñan funciones importantes en la hipertrofia cardíaca y la insuficiencia cardíaca.

Casi simultáneamente, tres grupos independientes (incluido el autor actual) informaron resultados dramáticos en la firma de expresión de miARN de corazones de ratón que se hicieron hipertróficos por unión aórtica o expresión de calcineurina activada (24, 101, 115) (Tabla 1). Cabe señalar que los miARN se expresan de manera aberrante en corazones hipertróficos en ambos modelos animales, y estos resultados fueron confirmados por estudios in vitro de miocitos cardíacos con hipertrofia (24, 101, 111, 115). Además, la sobreexpresión de algunos miARN que están regulados al alza en corazones hipertróficos induce hipertrofia de miocitos cardíacos, mientras que la sobreexpresión de algunos miARN que están regulados a la baja en corazones hipertróficos previene la hipertrofia de miocitos cardíacos. Por otro lado, la inhibición de miR-21, un miARN que se regula al alza en los corazones hipertróficos de animales y humanos, inhibe los corazones hipertróficos in vitro (24). Otro grupo confirmó además el papel del miR-21 (111). In vivo, la sobreexpresión de miR-195, un miARN que se regula al alza en corazones hipertróficos, es suficiente para inducir hipertrofia cardíaca (115), mientras que una mutación genética o enfoque de "señuelo" ha confirmado el papel de miR-208 y miR-133 en hipertrofia de cardiomiocitos (20, 114). Tomados en conjunto, estos hallazgos demuestran que múltiples miARN están involucrados en la hipertrofia cardíaca y que modular un miARN expresado de manera aberrante es suficiente para modular la hipertrofia. Sin embargo, los mecanismos moleculares responsables de los efectos individuales mediados por miARN sobre la hipertrofia cardíaca no están claros.

Más recientemente, las funciones de los miARN en la hipertrofia cardíaca y la insuficiencia cardíaca humanas se han dilucidado en varios estudios clínicos (76, 115, 126). El análisis de transferencia Northern de los miARN regulados por hipertrofia en corazones humanos idiopáticos, en etapa terminal y con insuficiencia muestra que la expresión de miR-24, miR-125b, miR-195, miR-199a y miR-214 aumenta significativamente en comparación con el control. corazones (115). Cuarenta y tres de los 87 miARN detectados se expresan de manera aberrante en corazones con miocardiopatía isquémica, miocardiopatía dilatada o estenosis aórtica (87), lo que indica que los miARN están involucrados en la fisiopatología de la hipertrofia cardíaca humana y la insuficiencia cardíaca.

La formación de lesiones neointimales es una lesión patológica común que se encuentra en diversas enfermedades cardiovasculares como aterosclerosis, enfermedades coronarias, reestenosis postangioplastia y arteriopatía de trasplante. Utilizando análisis de microarrays y un modelo de formación de neoíntima bien establecido, determinamos el perfil de expresión de miARN en la pared vascular con formación de lesión de neoíntima (24). En comparación con las arterias normales no lesionadas, el análisis de microarrays demostró que la expresión de miARN aberrante es una característica de las paredes vasculares después de la angioplastia. Aquellos miARN que están altamente expresados ​​en la arteria carótida de rata y están regulados al alza o al 50% después de la angioplastia se verificaron adicionalmente mediante qRT-PCR y / o análisis de transferencia Northern (24). La modulación de un miARN sobreexpresado de forma aberrante, miR-21, a través de la eliminación mediada por antisentido tiene un efecto significativamente negativo sobre la formación de la lesión neointimal en la arteria de la rata después de la angioplastia (Fig. 2). Estos resultados indican que los miARN son reguladores importantes en el desarrollo de enfermedades vasculares proliferativas (Tabla 1).

Figura 2.La regulación a la baja de miR-21 disminuye la formación de lesiones neointimales en la arteria carótida de rata después de la angioplastia. Microfotografías representativas teñidas con hematoxilina-eosina de arterias carótidas de rata de grupos tratados con vehículo, oligonucleótido antisentido miR-21 (2'OMe-miR-21) y oligonucleótido de control (2'OMe-EGFP) a los 14 días después de la angioplastia. Reproducido con permiso de Cir Res (56).

Las arritmias cardíacas en el contexto de una cardiopatía isquémica siguen siendo un problema de salud grave debido a su naturaleza repentina e impredecible y sus consecuencias potencialmente graves. En un modelo de rata de infarto de miocardio y en un corazón humano con enfermedad coronaria, el miARN específico del músculo, miR-1, se incrementó significativamente en el tejido cardíaco isquémico (126). Para determinar aún más el papel de miR-1 en la arritmogénesis, se aplicaron enfoques tanto de ganancia de función como de pérdida de función para mejorar o inhibir la expresión de miR-1 en el miocardio infartado. Los resultados muestran que la inyección de miR-1 maduro exacerba la arritmogénesis, mientras que la eliminación de miR-1 por un inhibidor antisentido suprime las arritmias. Los resultados indican que miR-1 tiene efectos proarrítmicos y arritmogénicos (126). El silenciamiento de los genes de los canales iónicos GJA1 y KCNJ2 verificó que estas proteínas son actores importantes en el efecto arritmogénico mediado por miR-1 (126) (Tabla 1).

La expresión de miR-133 está regulada al alza (123) en el corazón de conejo diabético. El gen relacionado con ether-a-go-go (ERG), un gen del síndrome de QT largo que codifica un canal de K + clave (IKr) en células cardíacas, se confirmó que es un objetivo para miR-133 (123). El suministro de miR-133 exógeno en los miocitos y líneas celulares de conejo produce la represión postranscripcional de ERG, regulando así a la baja los niveles de proteína ERG sin alterar su nivel de transcripción, lo que posteriormente causa una depresión sustancial de IKr, un efecto que es anulado por el inhibidor antisentido de miR-133 (123). Por lo tanto, la depresión de IKr a través de la represión de ERG por miR-133 puede contribuir a la desaceleración de la repolarización de los miocitos y, por lo tanto, a la prolongación del QT y las arritmias asociadas en los corazones diabéticos (Tabla 1).

En las células cardíacas, KCNQ1 se ensambla con KCNE1 y forma un complejo de canales que constituye la corriente rectificadora retardada lenta IKansas. La expresión de KCNQ1 y KCNE1 es regionalmente heterogénea y cambia con los estados patológicos del corazón; sin embargo, los mecanismos moleculares responsables de estos cambios no están claros. Recientemente, un estudio ha caracterizado a KCNQ1 y KCNE1 como objetivos de los miARN específicos de músculo, miR-133 y miR-1, respectivamente (124). La expresión heterogénea de miR-1 y miR-133 ofrece una explicación de las diferencias regionales bien reconocidas en la expresión de KCNQ1 y KCNE1 y de la disparidad entre los niveles de su ARNm y proteína en cada región (124).

HCN2 y HCN4 son dos proteínas importantes del canal del marcapasos cardíaco que controlan la actividad rítmica del corazón. Un estudio reciente ha demostrado que el ARNm de HCN2 es un objetivo de miR-1 y miR-133 y que el ARNm de HCN4 es un objetivo de miR-1 (122). Para explorar la posibilidad de usar miARN de una manera específica de un gen, los autores de este estudio desarrollaron dos nuevos enfoques terapéuticos, que eran el mimetizador de miARN específico del gen y los enfoques antisentido de enmascaramiento de miARN. Sus resultados demuestran que los imitadores de miARN específicos de genes, que son ARN de 22 nt diseñados para apuntar a las 3'-UTR de HCN2 y HCN4, son eficientes para anular la expresión y función de HCN2 y HCN4. Mientras tanto, el antisentido de enmascaramiento de microARN, basado en los sitios diana miR-1 y miR-133 en las 3'-UTR de HCN2 y HCN4, mejora notablemente la expresión y función de HCN2 y HCN4. Por lo tanto, estos dos enfoques terapéuticos basados ​​en los principios de acción de los miARN podrían proporcionar nuevas estrategias de terapia génica para las arritmias cardíacas (122).


Hitos de microarrays

Edwin Southern presenta solicitudes de patente en el Reino Unido para microarrays de oligonucleótidos sintetizados in situ

Stephen Fodor y sus colegas publican el método de fabricación de matrices fotolitográficas

Sin inmutarse por los detractores de los NIH, Patrick Brown desarrolla matrices manchadas

Affymax engendra Affymetrix

Mark Schena publica el primer uso de microarrays para análisis de expresión génica

Edwin Southern funda Oxford Gene Technologies

Se publica el primer estudio de microarrays de expresión génica humana

Affymetrix lanza su primer catálogo de microarrays GeneChip, para el VIH, en abril

Los investigadores de Stanford publican el primer estudio de microarrays de genoma completo de levadura

Brown's lab develops CLUSTER, a statistical tool for microarray data analysis red and green "thermal plots" start popping up everywhere

Todd Golub and colleagues use microarrays to classify cancers, sparking widespread interest in clinical applications

Affymetrix spins off Perlegen, to sequence multiple human genomes and identify genetic variation using arrays

The Microarray Gene Expression Data Society develops MIAME standard for the collection and reporting of microarray data

Joseph DeRisi uses a microarray to identify the SARS virus

Affymetrix, Applied Biosystems, and Agilent Technologies individually array human genome on a single chip

Roche releases Amplichip CYP450, the first FDA-approved microarray for diagnostic purposes


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Discusión

Determination of procaryotic species and the degree of their relationship is a great challenge for microbiologists. In the last 50 years, many different molecular methods, including whole-genome DNA–DNA hybridization, SSU rRNA sequencing, multiple locus sequencing of protein encoding genes (for example, gyrB, recA) and average nucleotide identity, have been proposed for delineating bacterial species. Although the SSU rRNA gene-based method is a valuable, convenient and rapid tool for the determination of the phylogenetic relationships among different microorganisms, it provides poor resolution at the species and subspecies levels (Yamamoto and Harayama, 1998). Also, many procaryotic species have virtually identical SSU rRNA gene sequences but only have 25% DNA similarity (Stackebrandt and Goebel, 1994). Thus, the SSU rRNA analysis method is not a valid approach for determining species/strain relationships. Protein-coding genes could provide high resolution for species/strain determination, but the difficulty in using sets of protein coding genes for phylogenetic evaluation lies in selecting appropriate gene targets and designing amplification primers useful for large sets of microorganisms (Harayama and Kasai, 2006). In addition, phylogenetic analyses based on complete microbial genome sequences are possible, but the likelihood that all the sequenced genomes needed for comparison will be available is not feasible (Brutlag, 1998). Finally, whole-genome sequence analysis is a powerful approach for resolving the major problems of evolution, phylogeny and systematics of living organisms, but its use in general taxonomic studies is not currently practical (Tourova, 2000). Such analyses will require larger genomic data sets and more carefully designed sampling of natural populations (Konstantinidis and Tiedje, 2007). The average nucleotide identity of the shared genes between two strains was proposed to be a robust approach to determine genetic relatedness among different strains (Konstantinidis and Tiedje, 2004). The average nucleotide identity value of 94% corresponded to the traditional 70% DNA–DNA reassociation standard of the current species definition. Although the average nucleotide identity approach is simple, it still relies on the availability of whole-genome sequences and hence it will have a limited use. Nevertheless, whole-genome DNA–DNA hybridization is still considered to be the cornerstone for bacterial species determination and will have to be used to circumscribe procaryotic species (Rossello-Mora, 2006).

The development and application of microarray-based genomic technology for microbial detection and community analysis have received a great deal of attention. Because of its high-density and high-throughput capacity, it is expected that microarray-based genomic technologies will revolutionize the detection, identification and characterization of microorganisms. Therefore, in this study, we have developed the CGA-based hybridization approach for determining species relationships. Experimental comparisons of the CGA hybridization-based results with available traditional DNA–DNA hybridization data, SSU rRNA and gyrB gene sequences and genome fingerprinting methods indicate that the CGA-based hybridization could be a useful alternative to the traditional whole-genome DNA–DNA hybridization approaches for determining procaryotic species relationships.

Overall, DNA similarities from the CGA-based hybridizations were comparable to those from various conventional whole-genome DNA–DNA hybridization approaches. When the actual values for genome relatedness were compared between different methods, the results from the CGA-based hybridization were more consistent to those from the S1 method than the membrane filter method (Goris et al., 1998), as indicated by smaller average differences (<15%) between the similarity values derived from CGA-based hybridization and S1 methods for A. tolulyticus son. DNA similarities from the CGA-based hybridizations for reference strain P. stutzeri ATCC 17587 also matched well with the ΔTmetro values of the P. stuzeri strains by hydroxyapatite and/or dot filter method with the reference strain P. stutzeri ATCC 17591 (identical to 17587). However, DNA similarities from CGA-based hybridizations with multiple Pseudomonas strains were significantly lower than those from membrane filter methods, although strong linear relationships were observed. One possible explanation might be related to differences in hybridization stringency. Higher similarity values are expected if the hybridization is carried out at relatively low stringent conditions. The hybridization conditions may need to be optimized for different target microbial groups by considering GC content and genome size. It is also important to point out that DNA similarities determined by the traditional hybridization methods vary significantly among different methods (Goris et al., 1998).

Although significant relationships between the CGA hybridization-based similarities and those from SSU rRNA genes, gyrB genes or genomic fingerprinting were observed, the degree of correlations is considerably different. The correlations of the CGA hybridization-derived similarities to gyrB sequences are stronger than those to SSU rRNA sequences and genomic fingerprinting. It appears that the taxonomic resolution of the CGA-based hybridization is similar to or slightly higher than gyrB sequence analysis. While SSU rRNA sequence analysis can provide reliable information about species relationships at higher taxonomic levels (for example, genus or above), whole-genome DNA–DNA hybridizations are useful in providing insight into phylogenetic relationships at the species/strain levels. For example, the SSU rRNA gene sequence similarities among the A. tolulyticus strains tested in this study are all over 98%–100% however, the DNA similarities determined by both the CGA-based method and S1 method varied across a wide range (15.2%–93.9% for the CGA method, 18%–99% for S1 method) (Song et al., 1999). Owing to differences in resolving phylogenetic relationships, integrating CGA-based hybridization with SSU rRNA and gyrB gene sequence analysis could provide a reliable, rapid approach for delineating procaryotic species relationships.

Genome fingerprinting analysis is suitable for the elucidation of strain-level relationships (Versalovic et al., 1994), and was shown to be highly correlated to DNA–DNA reassociation values for xanthomonads (Rademaker et al., 2000). In this study, strong correlations between CGA hybridization-based similarities and the similarities derived from fingerprinting approaches were observed among closely related strains of P. stutzeri y A. tolulyticus, but not among distantly related species from Pseudomonas, Azoarcus o Shewanella genera. The genomic fingerprinting similarity values above 60% correlated well with CGA hybridization values for the tested PAG. stutzeri y A. tolulyticus son. These results indicated that CGAs could provide meaningful insight into relationships between closely related strains. But the power of phylogeny to resolve relationships at the strain level will be lower using CGA-based hybridization than genome fingerprinting approaches. For instance, based on the CGA hybridization results, A. tolulyticus Td-3 was not separated from Td-19, and P. stutzeri DNSP21 (genetic group IV) could not be separated from P. stutzeri ATCC 11256 (genetic group I) (Figure 1), but they were well separated based on genome fingerprinting methods. Lower resolution was also observed for some Shewanella species (data not shown).

Compared to the traditional DNA–DNA reassociation approach, CGAs have several advantages for the determination of species relatedness, including high-throughput capacity, parallel analyses and quantitation. CGA hybridization differs from membrane filter-based hybridization approaches in that the non-porous surface has advantages of miniaturization, hybridization kinetics, sample volume, reagent absorption, signal detection approaches and reproducibility (Schena and Davis, 2000). The capability of accurate and precise miniaturization with robots on non-porous substrates with the use of fluorescence-based detection offers significant advantages. In addition, multiple pairwise comparisons can be done with smaller amounts of genomic DNA (that is, 1 μg). This is important for determining the relationships between procaryotic species that are difficult to cultivate. CGAs could provide a high-throughput means for rapid identification of microbial species/strains. Because of its high capacity, one can construct a CGA containing bacterial type strains plus appropriately related strains. By hybridizing genomic DNA from unknown strains with this type of microarray, one should be able to quickly and reliably identify unknown strains, provided a suitably related probe is on the array. Generally, SNRs for hybridizations with perfect match DNAs are significantly higher than those with mismatch DNAs from other strains of the same species (Wu et al., 2004). Thus, species identification can be achieved based on the differences in hybridization intensity. However, as a low level of cross-hybridization could occur among different strains, establishing appropriate SNR thresholds to differentiate self-hybridization, cross-hybridization and background hybridization among different strains should be useful. In addition, when using CGAs for species identification, lower stringent hybridization conditions (for example, 42 °C and 50% formamide) should be used first to ensure that good hybridization signals can be obtained for distantly related target species.

Microbial diversity is extremely high and the majority of microorganisms are as-yet uncultivable. This could be a limitation in using CGA-based hybridization to determine species relatedness of uncultured microorganisms. However, the CGA-based hybridization itself does not require culturing. With the recent advances in environmental genomics, high-molecular-weight DNA from uncultivated microorganisms could be accessed through bacterial artificial chromosomes or fosmid cloning. High-molecular-weight bacterial artificial chromosomes/fosmid clones could also be used to fabricate CGAs, thus allowing the determination of relationships of target strain/clones to the uncultivated components of a complex microbial community. Because the size of bacterial artificial chromosomes/fosmid clones is generally 50- to 200-fold less than that for an entire genome, it is expected that microarrays fabricated with high-molecular-weight bacterial artificial chromosomes/fosmid clones should have similar performance characteristics as CGAs.


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