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¿Por qué la radiación ionizante solo causa roturas de doble hebra de ADN?

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Se sabe que las radiaciones ionizantes, como los rayos X y $ gamma $-ray, causa daño al ADN, específicamente rotura de doble hebra. ¿Por que es esto entonces? Quiero decir, ¿por qué no romper una sola hebra, por qué no dímero de pirimidina?


Radiación ionizante lo hace causan roturas de una sola hebra y otros tipos de lesiones del ADN que no son roturas de doble hebra. Sin embargo, las roturas de doble hebra son las más difíciles de reparar y, por lo tanto, son el tipo de daño del ADN más probable que resulte en mutación y / o muerte celular. Vea la Fig 1. de Vías de señalización de la respuesta al daño del ADN y objetivos para la sensibilización a la radioterapia en el cáncer:

Daño del ADN inducido por radiación ionizante. Los principales tipos de daño del ADN inducidos por la IR incluyen daño de bases y azúcares, roturas de una sola hebra, roturas de doble hebra, daño del ADN agrupado y entrecruzamiento covalente entre hebras o entre hebras.


La comparación de las respuestas a las rupturas de doble hebra entre Escherichia coli y Bacillus subtilis revela diferentes requisitos para la inducción de SOS

Las roturas de la doble hebra del ADN son lesiones particularmente perjudiciales que pueden provocar inestabilidad genómica y muerte celular. Investigamos la respuesta SOS a roturas de doble hebra tanto en Escherichia coli como en Bacillus subtilis. En E. coli, las roturas de doble hebra inducidas por radiación ionizante dieron como resultado la inducción de SOS en prácticamente todas las células. Las cepas de E. coli incapaces de inducción de SOS fueron sensibles a la radiación ionizante. En sorprendente contraste, encontramos que en B. subtilis tanto la radiación ionizante como una rotura de doble hebra específica del sitio provocan la inducción de la expresión génica del profago PBSX y SOS en solo una pequeña subpoblación de células. Estos resultados muestran que las roturas de doble hebra provocan la inducción global de SOS en E. coli pero no en B. subtilis. Sorprendentemente, la formación de focos de RecA-GFP fue casi idéntica después de la exposición a radiación ionizante tanto en E. coli como en B. subtilis, lo que demuestra que la formación de focos de RecA-GFP ocurre en respuesta a roturas de doble hebra, pero no requiere ni da como resultado la inducción de SOS en B. subtilis. Además, encontramos que las células de B. subtilis incapaces de inducir SOS tenían niveles de supervivencia cercanos al tipo salvaje en respuesta a la radiación ionizante. Además, B. subtilis RecN contribuye a mantener bajos niveles de inducción de SOS durante la reparación de roturas de doble hebra. Por lo tanto, encontramos que la contribución de la inducción de SOS a la reparación de roturas de doble hebra difiere sustancialmente entre E. coli y B. subtilis.

Cifras

La radiación ionizante induce sulA promotor…

La radiación ionizante induce sulA actividad promotora en E. coli . (A) Micrografía representativa ...

Visualización de focos RecA-GFP, SOS ...

Visualización de focos de RecA-GFP, inducción de SOS y expresión de PBSX después de la inducción de doble hebra ...

Las viabilidades de B. subtilis ...

Las viabilidades de B. subtilis y E. coli llevando el lexA (Ind -…


Reparación de roturas de doble cadena de ADN inducidas por radiación ionizante por unión de extremos no homólogos

Brandi L. Mahaney, Katheryn Meek, Susan P. Lees-Miller Reparación de roturas de doble cadena de ADN inducidas por radiación ionizante por unión de extremos no homólogos. Biochem J 1 de febrero de 2009 417 (3): 639–650. doi: https://doi.org/10.1042/BJ20080413

Los DSB del ADN (roturas de doble hebra) se consideran el tipo de lesión más citotóxica del ADN. Pueden ser introducidas por fuentes externas como IR (radiación ionizante), por fármacos quimioterapéuticos como venenos de topoisomerasa y por procesos biológicos normales como la recombinación V (D) J. Si no se repara, los DSB pueden causar la muerte celular. Si no se reparan correctamente, los DSB pueden provocar translocaciones cromosómicas e inestabilidad genómica. Una de las principales vías para la reparación de los DSB inducidos por IR en células de mamíferos es NHEJ (unión de extremos no homólogos). Las principales proteínas requeridas para NHEJ en células de mamíferos son el heterodímero Ku (heterodímero Ku70 / 80), DNA-PKcs [la subunidad catalítica de DNA-PK (proteína quinasa dependiente del ADN)], Artemis, XRCC4 (complemento de rayos X chino hámster gen 4), ADN ligasa IV y XLF (factor similar a XRCC4 también llamado Cernunnos). Otras proteínas, incluidas las ADN polimerasas μ y λ, PNK (polinucleótido quinasa) y WRN (Síndrome de Werner helicasa), también pueden desempeñar un papel. En la presente revisión, discutiremos nuestra comprensión actual del mecanismo de NHEJ en células de mamíferos y discutiremos las funciones de la fosforilación mediada por ADN-PKcs y ADN-PK en NHEJ.


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Señalización de DSB para su reparación

Señalización local y global. Una respuesta bien conocida al daño del ADN, incluidos los DSB, es la activación de los puntos de control del ciclo celular para dar tiempo a la reparación del daño del ADN inducido antes de su conversión en alteraciones genéticas irreparables o la inducción de la muerte celular apoptótica. Entre los participantes identificados más próximos en estas respuestas en células de mamíferos se encuentran tres proteínas de la familia de la fosfatidilinositol 3-quinasa de la lípido quinasa (PI3K) [también llamadas proteína quinasas similares a PI3K (PIKK)]: Atm (ataxia telangiectasia mutada), Atr (Atm - y relacionado con Rad3), y el complejo de proteína quinasa dependiente de ADN ADN-PK. Después de la exposición a IR, las actividades de Atm, Atr y DNA-PK se regulan positivamente y constituyen la señal de inicio de las respuestas celulares a los DSB. Atr también puede activarse por daño inducido por luz ultravioleta y especialmente por hidroxiurea y otros agentes que inducen estrés replicativo.

Sin embargo, la activación de DNA-PK en respuesta a los DSB da como resultado inmediatamente la activación de NHEJ, que se reincorpora rápidamente a los DSB (2, 8, 9, 41). Por lo tanto, la señalización de DNA-PK requiere un tiempo más corto y está más localizada que la señalización de Atm y Atr, que también juegan un papel en la activación del punto de control. Por consiguiente, se pueden imaginar dos tipos de señalización DSB, local y global. Como se señaló anteriormente, un paso clave en HRR es la formación por Rad51 (con la ayuda de Brca2) de un filamento de nucleoproteína en la hebra expuesta después de la resección inicial. El mensaje de Atm a Rad51 está mediado por Abl, que por lo tanto juega un papel en HRR (42, 43).

El DD para la intensidad de la señalización DSB. Estimamos anteriormente el DD para la fosforilación inducida por radiación de la histona H2AX y su conversión en la proteína γ-H2AX. La evidencia reciente indica que cualquiera de los tres PIKK, Atm, Atr y DNA-PK, puede ser responsable de esta fosforilación (7, 44). Entonces, ¿cuál es el DD para la activación de Atm y DNA-PK (ambos buenos candidatos para el inicio de la señalización de los DSB inducidos por IR)? Si los DSB inician una vía de señalización para la reparación, se puede esperar que sus DD limiten la velocidad y, por lo tanto, sean similares a los DD para pasos importantes en las vías de reparación. Estos últimos DD se pueden calcular a partir de datos publicados (45).

En la línea celular de linfoblastos humanos normales GM0536, se observó un aumento claramente detectable en la actividad de la quinasa Atm tan pronto como 5 min después de la irradiación (5 Gy de irradiación γ), y la actividad se incrementó al máximo (≈4 veces) a 60ºC. min postirradiación (45). Si la respuesta en el rango de 1 a 5 Gy fuera lineal, la DD para la activación de Atm sería ≈1,7 Gy.

La activación de DNA-PK en respuesta a los DSB inducidos por radiación se determina mediante el reclutamiento de DNA-PKcs a un DSB mediante la unión del complejo Ku70 / Ku80 a los extremos del ADN. También se midió un nivel basal de ADN-PK activado en células linfoblastoides humanas normales antes y después de su exposición a 5 Gy de irradiación γ. La actividad de la quinasa DNA-PKcs alcanzó un máximo, ~ 3 veces, a los 120 min después de la irradiación (45), lo que indica un DD de ~ 2,5 Gy para la activación de esta proteína clave en la señalización y el procesamiento / reparación de los DSB.

La Abl se regula al alza después de la exposición a la IR o ciertos medicamentos contra el cáncer, como el cisplatino o la mitomicina C, que pueden producir DSB (43, 45-48). En líneas celulares de linfoblastos humanos normales, se detectó una regulación positiva de la actividad de la cinasa Abl en 15 min, con una activación máxima de 4 a 5 veces a los 60 min, después de la irradiación con 5 Gy de irradiación γ (45). Por tanto, la presunta DD para la activación de la cinasa Abl en estas células estaría en el rango de 1,2 a 1,7 Gy. En fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) normales, la actividad de la enzima aumenta aproximadamente 3,5 veces en las células expuestas a 5 Gy de irradiación γ, lo que sugiere una DD de 2 Gy.

Sensores putativos de EDSB. Las estimaciones de DD para la producción de DSB y para la señalización de ellos caen en un rango de 1.2 a 2.5 Gy, lo que sugiere que estas quinasas en sí mismas o proteínas que interactúan directamente con los DSB y las quinasas representan el sensor (es) de las rupturas , y que el evento inicial, el DSB, limita la velocidad de la cadena de eventos que sigue. Para la DNA-PK, existe evidencia convincente de que el heterodímero Ku es un sensor de DSB que, después de la interacción con los extremos rotos, atrae y activa las DNA-PKcs.

Sin embargo, la activación de la señalización iniciada por Atm, y probablemente también iniciada por Atr, depende no solo de la presencia de DSB, sino de una serie de otros factores cuyas cantidades / actividades podrían ser específicas del tipo de célula y depender de las condiciones de cultivo y, por supuesto, la actividad mitótica de la célula. Por ejemplo, el H2AX fosforilado recluta un mediador de la proteína 1 del punto de control del daño del ADN (MDC1) en los sitios de DSB, lo que aparentemente mejora la fosforilación de H2AX y amplifica la respuesta de ATM a los DSB de forma sinérgica (49). Por lo tanto, no esperamos que todas las células de mamíferos, cultivadas en diferentes condiciones, muestren DD idénticas para la activación de Atm y proteínas que son activadas por Atm.

Una publicación importante del laboratorio de Kastan (50) informa de la activación de Atm por daño inducido por IR, presumiblemente por DSB, basado en autofosforilación. Las observaciones sobre los mecanismos de iniciación de la señalización de DSB por Atm (ref.50 y referencias allí), combinadas con los hallazgos previamente considerados de fosforilación casi inmediata de histona H2AX en respuesta a DSB de una manera dependiente de la dosis, sugieren fuertemente un papel para la cromatina dinámica en la respuesta de las células de mamíferos a los DSB tanto espontáneos como inducidos por IR. Sin embargo, el DD para la activación de la autofosforilación de Atm por IR y de la fosforilación de diferentes sustratos por Atm podría ser diferente.

El concepto de monitorización de EDSB anticipa inmediatamente, de acuerdo con datos previos (34, 35, 51, 52), la presencia de al menos algunas proteínas de señalización de DSB en la cromatina durante la fase S. En este contexto, los EDSB pueden denominarse DSB fisiológicos (con respecto a la señalización). Estos EDSB proporcionan un fondo "ruidoso" contra el cual los DSB inducidos pueden reconocerse mediante rutas de señalización. Para la detección de estímulos en sistemas biológicos, el reconocimiento de una señal es más efectivo en presencia de un fondo relativamente bajo, pero no demasiado bajo, como se discutió (1). Por lo tanto, está surgiendo un principio general: la detección y la respuesta al daño del ADN inducido exógenamente de diferentes formas es un proceso comparativo (1). La señalización fisiológica de los EDSB es ciertamente bastante diferente de la inducida por la IR aguda de alta tasa de dosis, que se utiliza habitualmente en estudios radiobiológicos y de "señalización celular". Sin embargo, como se estimó anteriormente, si se administrara IR a una tasa de dosis de ~ 0,5 cGy / min, la magnitud de la señalización sería comparable con la del DSB endógeno producido durante la replicación del ADN. Debería haber una clara dependencia de la señalización DSB de la velocidad de su inducción.


Resultados

& # x3b3Focos H2AX y 53BP1 en células epiteliales mamarias MCF10A

Para investigar el DDR en nuestro modelo de cultivo celular, primero monitoreamos & # x3b3Formación de focos de H2AX y 53BP1 en células MCF10A hasta 48 h después de la exposición a los rayos X (2 Gy y una sola aplicación de TC). Para la implementación de la TC, utilizamos un maniquí desarrollado específicamente para una estimación precisa de una dosis clínicamente comparable que se aplicará a los cultivos celulares. Como se esperaba para la irradiación con 2 Gy, el número promedio de & # x3b3Los focos de H2AX y 53BP1 fueron más altos a las 0.5 h después del tratamiento (Tabla complementaria 1) con una disminución notable (similar a las células no tratadas) dentro de las 48 h posteriores a la irradiación (Figura 1) con casi el 100% de eliminación de focos para & # x3b3H2AX y 53BP1 respectivamente (Tabla complementaria 2). Después de una dosis única de & # x226420 mGy para el tratamiento con CT, se observó una tendencia comparable a la del experimento de 2 Gy con un pico de 0,5 hy un curso de tiempo similar (Figura 1 y Tablas complementarias 1, 2). Las células MCF10A mostraron niveles significativamente inducidos de & # x3b3Focos de H2AX y 53BP1 a las 0,5 h del tratamiento con TC, con reducción a las 24 h. 48 h después de los estímulos, el número de focos disminuyó aún más y fue casi comparable a los niveles no tratados para & # x3b3H2AX (p = 0.19) (Figura 1 y Tablas complementarias 1, 2) con casi el 90% de eliminación de focos para & # x3b3H2AX, aunque los niveles de 53BP1 con aproximadamente el 25% de focos residuales (Tabla complementaria 2) estaban algo elevados. Luego examinamos si el curso de DDR se alteraría si las células fueran tratadas por múltiples rondas de CT. Al principio, la línea celular de referencia, MCF10A, se examinó en tres rondas de tomografías computarizadas posteriores con intervalos de 6 semanas. Después de cada ronda de TC, se evaluó el número de focos a las 0,1, 0,5, 1, 24 y 48 h después del tratamiento (Figura 2). Las células MCF10A mostraron niveles significativamente elevados de & # x3b3Focos de H2AX y 53BP1 después de cada tratamiento con TC, con un máximo a las 0,5 h en cada ronda (p & lt 0,0001 para ambos tipos de focos), con una reducción a las 24 h (alrededor del 80 & # x201390% para ambos tipos de focos) y una disminución adicional a los 48 h con un curso de tiempo similar en las tres rondas de TC (Figura 2, Tablas complementarias 1, 2). Sin embargo, las células que se habían sometido a CT exhibieron un número elevado de focos de fondo persistentes al comienzo de la siguiente ronda de CT, lo que sugiere una acumulación de daño en el ADN (Figuras 2 y 3, panel superior, Tabla complementaria 3). Esta diferencia fue notablemente significativa para & # x3b3Focos de H2AX en cada ronda individual (CT1: p & lt 0,003 y CT2: p & lt 0,001) y menos significativos para los focos 53BP1 (CT1: p & lt 0,05 y CT2: p & lt 0,04). Además, a partir de la segunda ronda de CT, los niveles de focos restantes aparentemente estaban elevados en contraste con el estado no tratado (Tabla complementaria 3). En general, el tratamiento con TC provocó aproximadamente el 20 & # x201325% del nivel de & # x3b3Focos de H2AX y 53BP1 en comparación con el tratamiento de 2 Gy. Por lo tanto, parecía que la dosis de 2 Gy era más eficiente en la inducción de focos (mayor tasa de aparición de focos a las 0.5 h), mientras que los focos de aplicación de TC eran más lentos en su tasa de desaparición (Figura 1, Tablas complementarias 1, 2, 4) hasta 48 h después de estímulos. Hubo una correlación muy significativa entre & # x3b3Focos H2AX y 53BP1 (Figura complementaria 3, panel derecho). Posteriormente, repetimos el experimento para las células MCF10A con cultivos celulares nuevos utilizados. El análisis se limitó a tres puntos de tiempo (0, 0,5 y 48 h). Además, las células se sometieron a intervalos prolongados de 12 semanas entre tomografías computarizadas, y se volvieron a ver números elevados de focos persistentes después de cada ronda de tomografía computarizada con intervalos de 6 y / o 12 semanas en el estudio de replicación (Figura 3A, panel superior). La diferencia entre las células no tratadas y las células pretratadas en CT2 fue significativa para & # x3b3Focos de H2AX después de intervalos de 6 y 12 semanas, mientras que, para los focos de 53BP1, solo fue nominalmente significativo (Figura 3, panel superior). Tanto los procedimientos automáticos como los manuales de recuento de focos no fueron estadísticamente diferentes (Figura complementaria 2).

Figura 1 Análisis inmunocitoquímico de focos de reparación después de una dosis única en células MCF10A. Evaluación de & # x3b3Focos de H2AX (izquierda) o focos de 53BP1 (derecha) después de la irradiación con 20 mGy (CT) o 2 Gy, respectivamente, utilizando microscopía de fluorescencia convencional (Leica DMI6000B). Los datos se presentan como gráficos de barras con el número de focos promedio (+ / & # x2212 SEM) por celda por experimento de al menos tres experimentos independientes (UNT, valores no tratados con controles incluidos & # x201cage-emparejados & # x201d Los valores p en el gráfico representan una comparación a UNT ns, SEM no significativo, error estándar de la media). *** P & # x22640.001, **** P & lt0.0001.

Figura 2 Análisis inmunocitoquímico de focos de reparación después de exploraciones por TC repetidas en células MCF10A. Evaluación de & # x3b3Focos H2AX (arriba) y focos 53BP1 (abajo) después de tomografías computarizadas de diagnóstico sistemáticas con

20 mGy por ronda (en total tres rondas) utilizando microscopía de fluorescencia convencional (Leica DMI6000B). Data are presented as bar plots of average foci number (+/− SEM) per cell per experiment from at least three independent experiments (UNT, untreated values with included 𠇊ge-matched” controls CT1, 1st round of computed tomography CT2, second subsequent diagnostic CT CT3, third subsequent diagnostic CT p values on graph represent comparison to UNT SEM, standard error of the mean). *P𢙀.05 , **P𢙀.01, ***P𢙀.001.

figura 3 Immunocytochemical analysis of background persisting foci number after repeated CT scans in MCF10A cells (replication study). Upper Panel: Evaluation of γH2AX foci (left) and 53P1 foci (right) from repeated experimental settings in 6 and 12 weeks intervals after systematic diagnostic CT scans with 20 mGy per round (in total three rounds) using conventional fluorescence microscopy (Leica DMI6000B). Data are presented as bar plots of average number of foci (+/− SEM) per cell. Each data point represents randomized counting area of slide from two independent experiments (biological replicates) and two technical replicates (UNT, untreated values with included 𠇊ge-matched” controls CT 1, cells, which went once through the CT and were further cultured for 6 or 12 weeks, respectively CT 2, cells, which went twice through the CT after 6 or 12 weeks ns, not significant SEM, standard error of the mean). Lower panel: Example of H2AX foci (green) and 53BP1 foci (red) double immunostaining. DNA is counterstained with DAPI (UNT, untreated value 𠇊ge-matched” to UNT_CT 2 UNT_CT 1, cells were cultured 6 weeks after the 1st round of computed tomography UNT_CT 2, cells were further cultured for 6 weeks after the second subsequent diagnostic CT and went through two CT rounds). *P𢙀.05 , **P𢙀.01, ***P𢙀.001.

γH2AX and 53BP1 Foci in Breast Cancer Cell Lines

We then tested whether these observations can also be extended to commonly used breast cancer cell models that have gathered DDR deficiencies. Therefore, HCC1395 and HCC1937 TNBC cell lines were additionally investigated. Both cell lines are BRCA1-mutant BC lines with HCC1395 carrying an additional mutation in NBN that impairs γH2AX accumulation (42) among other mutations that possibly could modify the DDR response. As expected for irradiation with 2 Gy, there were clear differences between the cell lines with different mutational backgrounds, especially in contrast to the reference MCF10A cells (Supplementary Figure 4, Supplementary Tables 1, 2, 5). However, HCC1395 had a higher ratio of 53BP1/H2AX foci which was consistent with its known NBN deficiency (42). After CT application, a trend comparable to the 2 Gy experiment was observed with a 0.5 h peak and similar time course for both breast cancer cell lines exposed to a single dose of � mGy (Supplementary Figure 4, Supplementary Tables 1, 2). As expected, HCC1395 cells displayed reduced yield of both γH2AX and 53BP1 foci in comparison to MCF10A at 0.5h after CT (Supplementary Table 5), but these foci remained elevated at 24h (p = 0.01 for γH2AX and p=0.03 for 53BP1, respectively) and 48h (p = 0.04 for γH2AX and p=0.01 for 53BP1 foci,) after stimuli in comparison to the untreated condition (Supplementary Figure 4). The HCC1937 cell line exhibited an increase in γH2AX and 53BP1 foci at 0.5 h after CT and also showed increased residual levels of foci at 24 h after treatment (p < 0.001 for both types of foci in comparison to the untreated condition (Supplementary Figure 4, Supplementary Tables 1, 2). Similar to MCF10A, γH2AX and 53BP1 foci numbers in comparison to the untreated condition were reduced at 48 h after CT (p = 0.52 for γH2AX and p = 0.20 for 53BP1 foci) in HCC1937 cells. Overall, the CT treatment evoked about 30�% the level of γH2AX and 53BP1 foci compared with the 2 Gy treatment (Supplementary Table 1). Similar to MCF10A, relative to the untreated state, foci levels remained elevated 48 h after CT application with some increment across the rounds for both cell lines (Supplementary Table 3), more prominently in HCC1395. There was a highly significant correlation between induced γH2AX and 53BP1 foci for both cell lines (Supplementary Figure 3, right panel). The higher ratio of 53BP1/γH2AX foci in HCC1395 observed with 2 Gy was similarly observed with diagnostic CT scans. Additionally, an analysis of our BC cell lines restricted to three time-points (0, 0.5, and 48 h) showed similar trends towards elevated background levels of foci after subsequent CT treatments (Supplementary Figure 5, Supplementary Table 3). This difference was significant in HCC1395 and HCC1937 cells after each round of CT for γH2AX (CT1: p < 0.05 and p < 0.05, respectively, CT2: p < 0.001 and p < 0.05, respectively), and for 53BP1 some trend was observed in the first CT round for HCC1395 (CT1 p = 0.07) and in the second round for HCC1937 (CT2 p =਀.05), respectively.

γH2AX and 53BP1 Foci After Single-Dose Irradiation And Multiple CT Treatments in Lymphoblastoid Cells and Lymphocytes

We tested and confirmed the robustness of our findings in lymphoblastoid cells, including one LCL from an A-T patient expected to display a radiosensitivity phenotype. Foci in the LCLs were evaluated and counted using confocal microscopy. After 2 Gy IR treatment, the ATM-deficient LCL (HA56) showed significant differences in γH2AX and 53BP1 foci induction at 0.5h when compared to the wild-type control line (HA325), as well as a significantly elevated number of residual γH2AX and 53BP1 foci up to 48 h (Supplementary Figure 6 upper panel, Supplementary Tables 1, 2, 5). Upon CT treatment, the A-T cells were able to accumulate γH2AX and 53BP1 foci to a similar extent as the control LCL at 0.5h after irradiation (Supplementary Table 1) but showed evidence for an attenuated repair at 24 h however, the number of γH2AX and򠔻P1 foci remained significantly increased until 48h post treatment (Supplementary Figure 6, upper panel, Supplementary Table 2). Upon the multiple CT treatment both LCLs exhibited similar foci kinetics as by single-dose (Supplementary Figure 7). The trend with elevated background levels of γH2AX and 53BP1 foci in successive CT rounds was visible for LCLs HA325 and HA56 (Supplementary Figure 7, Supplementary Table 3) as well, though with statistical significance only in HA56 cells (γH2AX: p = 0.003 for CT1 and p = 0.0003 for CT2, respectively and 53BP1: p = 0.044 for CT1 and p = 0.047 for CT2, respectively). Foci levels in contrast to the untreated state remained elevated 48 h after CT application with some increment across the rounds for LCLs, especially in A-T cells (Supplementary Table 3). This was consistent for both markers which again were highly correlated in the LCLs (Supplementary Figure 3, left panel). We additionally included native PBLs for each experimental condition to verify that the CT effects can be observed through quantitative evaluation of γH2AX and 53BP1 foci in primary lymphocytes. PBLs behaved in a similar manner to wild-type LCLs in 53BP1 monitoring, though the average yield of γH2AX foci appeared somewhat lower after CT treatment (Supplementary Figure 6 lower panel, Supplementary Tables 1, 2, 4). Overall, the CT treatment evoked around 20% (in lymphocytes) and 𭰰% (in lymphoblastoid cells) of γH2AX and 53BP1 foci compared to the 2 Gy treatment (Supplementary Table 1), which was similar to the effect seen in breast epithelial cells. γH2AX and 53BP1 foci from CT application showed slower resolution in PBLs 24 h after stimuli (Supplementary Figure 6 lower panel, Supplementary Tables 2, 4).

Persisting DSBs and Senescence in MCF10A Cells

We tested whether higher background levels of persistent foci after subsequent CT treatments are the cause of senescence or aging in the long-term cell culture, and therefore measured β-galactosidase activity and EdU incorporation in MCF10A cells which had undergone diagnostic CT scans and were further cultured for 6 or 12 weeks intervals between subsequent CT rounds. Senescence was assessed in MCF10A cells by means of β-galactosidase activity. We observed no elevation in the numbers of senescent cells and no reduction in EdU incorporation after diagnostic CT scans along with elevated number of persisting 53BP1 background foci (Figure 4 and Supplementary Figure 8). Furthermore, cells showing SA-ß-gal activity did not show more 53BP1 foci in comparison to ß-gal negative cells as assessed by ICC (Supplementary Figure 8). These results excluded senescence or proliferative exhaustion as the main mechanism behind the accumulation of foci after repeated CT scans. EdU incorporation analysis, along with 53BP1 foci staining and 53BP1 foci evaluation after β-galactosidase stain, was performed in age-matched untreated and pre-treated at CT2 MCF10A cells after 6 weeks intervals, since the difference for this time point was significant in the main and following experiment (Figures 2, 3).

Figura 4 Cell proliferation and senescence-associated beta-galactosidase (SA-βgal) activity analysis in MCF10A cells. Evaluation of SA-βgal staining (A, B) and EdU incorporation (CD) in cells, which went through diagnostic CT scans and were further cultured for 6 weeks, using either inverse microscopy (Nikon Eclipse TS100)—(A), or conventional fluorescence microscopy (Leica DMI6000B) — (B𠄽). Data are presented as bar plots +/− SEM. (A) Percentage of SA-βgal positive cells in untreated (12 weeks 𠇊ged”) and pre-treated at different CT rounds MCF10A cells in 6 and 12 weeks intervals. (B) Percentage of SA-βgal positive cells with or without 53BP1 foci. (C) Percentage of EdU positive cells. (D) Average 53BP1 foci number per cell, assessed after EdU labeling. Data from two independent experiments includes one technical duplicate. Each dot in (C) represents counting area (UNT, untreated age-matched to UNT_CT2_6 weeks control CT1, cells after the 1st round of computed tomography CT2, cells after the second subsequent diagnostic CT, HU, 0.5 mM hydroxyurea treatment for 96 h prior to fixation in MCF10A cells as a control for senescence-like state and replicative stress SEM, standard error of the mean).


DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection

To ensure the high-fidelity transmission of genetic information, cells have evolved mechanisms to monitor genome integrity. Cells respond to DNA damage by activating a complex DNA-damage-response pathway that includes cell-cycle arrest, the transcriptional and post-transcriptional activation of a subset of genes including those associated with DNA repair, and, under some circumstances, the triggering of programmed cell death. An inability to respond properly to, or to repair, DNA damage leads to genetic instability, which in turn may enhance the rate of cancer development. Indeed, it is becoming increasingly clear that deficiencies in DNA-damage signaling and repair pathways are fundamental to the etiology of most, if not all, human cancers. Here we describe recent progress in our understanding of how cells detect and signal the presence and repair of one particularly important form of DNA damage induced by ionizing radiation—the DNA double-strand break (DSB). Moreover, we discuss how tumor suppressor proteins such as p53, ATM, Brca1 and Brca2 have been linked to such pathways, and how accumulating evidence is connecting deficiencies in cellular responses to DNA DSBs with tumorigenesis.


Conclusión

This is a personal view of the early days of DNA repair studies. I have thought it useful to trace the development of our ideas about (mainly) excision repair to emphasize the importance of the double-stranded structure of DNA in the maintenance of genetic integrity. I have said nothing about the mutagenic SOS pathways studied so imaginatively by Evelyn Witkin and Miroslav Radman.

Without the existence of an active repair mechanism early in the history of life on earth and given the radiation flux in the prebiotic and early biotic environments, it would have been impossible for a molecule like DNA to have survived, let alone to have served as a stable repository of genetic information. Both single- and double-strand breaks in a polynucleotide chain would be necessarily lethal without repair, but the pathway(s) of restoration without introducing error is based on finding an undamaged homologous strand. It might therefore be argued that the double-stranded DNA structure was so successful in the evolution of living systems precisely because it provided a way to conserve genetic information as well as furnishing a mechanism for its copying.

It is hardly a surprise that students of a biological process should argue for the fundamental importance of the subject of their investigations. And it is therefore not surprising that many of us working on DNA repair should have felt that, although our studies seemed to us of vital interest, they were largely ignored by the molecular biologists we were trying to impress (see Friedberg 1997). Two questions can be posed: first, can anything of general interest can be learned from this history? Second, does the history itself actually matter?

This second question is easier to answer. The general “vote” on what is important in science has material consequences. Where should we put the money, what young person in what field should we hire? Once molecular biology was established as a scientific discipline in its own right, the opinions of the pioneers were hard to ignore. It is clear, as illustrated above, that many of them did think the mechanisms for correcting errors were mere details. Luckily, all of this happened in a period when support for science was (in retrospect) relatively lavish and the different fields were not in serious financial conflict, so the field of DNA repair could develop in part because of the link to cancer research and its funding provided by Cleaver’s discovery (Cleaver 1968).

The history of the studies on mismatch repair illustrates another, possibly related, difficulty. Reading the studies on gene conversion and the articles of Whitehouse and Holliday with all the benefit of hindsight, it would seem that their connection to the newly described excision repair mechanisms would have been obvious. Yet it took at least a decade for mismatch repair as a separate process to be described. This must partly reflect the lag in discovering the enzymes that synthesized and glued together DNA chains. But it seems clear that both biochemists and (many of) the new molecular biologists were unable to take the genetic evidence seriously. I have copied some appropriate comments from James Watson, but the biochemists were equally parochial in their reluctance to accept a phenomenon as established without demonstrated mechanistic (enzymatic) detail (Kornberg 2000). There was just no mutual understanding. It would be pleasant to believe that things are different today and that the emphasis on multi-disciplinary teams of investigators ensures that all avenues of potential interest will be explored. Quizás.

Practical application of discovery follows unexpected paths. One of the most useful new biological technologies is the use of CRISPR-Cas9 and its modifications. The technology depends on the ability to make double-strand breaks at specific locations. What follows depends on the investigators making clever use of the various mechanisms for the repair of double-strand breaks along with mismatch repair. A Danish proverb attributed to Niels Bohr (and also to Yogi Berra) may be appropriate: “prediction is difficult, especially about the future.” Modesty about the relative importance of different approaches might be a desirable quality to cultivate at all times.


The alkaline comet assay involves measurement of DNA damage in SSB and DSB. This method is fast and cheap. It provides important information about the risk of diseases related to oxidative stress ( Alapetite , 1999 Alapetite C, Thirion P, De la Rochefordie A, Cosset JM and Moustacchi E (1999) Analysis by alkaline comet assay of cancer patients with severe reactions to radiotherapy: Defective rejoining of radioinduced dna strand breaks in lymphocytes of breast cancer patients. Int J Cancer 90:83-90. Dusinska and Collins, 2008 Dusinska M and Collins AR (2008) The comet assay in human biomonitoring: Gene-environment interactions. Mutagenesis 23:191-205. ). In this assay, cells are embedded in a thin layer of agarose on a thin glass slide, cells are lysed in a solution containing detergent and NaCl, releasing the DNA from the proteins bound to it, but leaving DNA fragments still attached to the nuclear membrane. Then, the plate is incubated in an alkaline solution, an electrophoresis is run and DNA is stained with ethidium bromide. DNA fragments travel to the anode forming a comet-like image when viewed by fluorescence microscopy ( Fikrová , 2011 Fikrová P, Stetina R, Hronek M, Hyspler R, Tichá A and Zadák Z (2011) Application of the comet assay method in clinical studies. Wien Klin Wochenschr 123:693-699. , Baumgartner , 2012 Baumgartner A, Kurzawa-Zegota M, Laubenthal J, Cemeli E and Anderson D (2012) Comet-assay parameters as rapid biomarkers of exposure to dietary/environmental compounds an in vitro feasibility study on spermatozoa and lymphocytes. Mutat Res 743:25-35. ). The image of the comet head denotes the DNA content and the tail the frequency of DNA breaks ( Figure 2B). Software programs designed to analyze the comet image allow measurement of DNA content and tail length. The length of the comet tail correlates with the level of DNA damage.

Hair (2010) Hair JM, Terzoudi GI, Hatzi VI, Lehockey KA, Srivastava D, Wang W, Pantelias GE and Georgakilas AG (2010) BRCA1 role in the mitigation of radiotoxicity and chromosomal instability through repair of clustered DNA lesions. Chem Biol Interact 188:350-358. used a modified comet assay method in which slides with cells embedded in agarose were incubated with three different treatments: 1) alkaline electrophoresis to detect SSB induced radiation and alkaline-labile sites 2) electrophoresis of cells treated with formamidopyrimidine [Fapy] -DNA glycosylase (Fpg) this releases the damaged purines, leaving apurinic sites (AP sites) that are subsequently cleaved with the cellular AP lyase, producing single strand fragments which can be visualized in the comet assay, and 3) electrophoresis after treatment of the cells with bacterial endonuclease EndoIII, which cleaves the damage strands at sites presenting oxidized pyrimidines, thus increasing the sensitivity of the comet assay by leaving gaps in mutated bases ( Hair , 2010 Hair JM, Terzoudi GI, Hatzi VI, Lehockey KA, Srivastava D, Wang W, Pantelias GE and Georgakilas AG (2010) BRCA1 role in the mitigation of radiotoxicity and chromosomal instability through repair of clustered DNA lesions. Chem Biol Interact 188:350-358. ).

Some disadvantages of the comet assay are the variability between different protocols and between laboratories, which makes it difficult to define ionizing radiation toxicities, so this issue will require adoption of standardized and comparable protocols ( Forchhammer , 2010 Forchhammer L, Johansson C, Loft S, Godschalk RWL, Sabine A, Langie S, Jones GDD, Kwok RWL, Collins AR, Azqueta A, et al. (2010) Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG y inter-laboratory validation trial. Mutagenesis 25:113-123. Henríquez-Hernández , 2012 Henríquez-Hernández LA, Bordón E, Pinar B, Lloret M, Rodríguez-Gallego C and Lara PC (2012) Prediction of normal tissue toxicity as part of the individualized treatment with radiotherapy in oncology patients. Surg Oncol 21:201-206. Azqueta , 2014 Azqueta A, Slyskova J, Langie SAS, Gaivão ION and Collins A (2014) Comet assay to measure DNA repair: Approach and applications. Front Genet 5:1-8. ). Sirota (2014) Sirota NP, Zhanataev AK, Kuznetsova EA, Khizhnyak EP, Anisina EA and Durnev AD (2014) Some causes of inter-laboratory variation in the results of comet assay. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen 770:16-22. studied inter-laboratory variation of comet assay factors, like slide brands, duration of alkali treatment and electrophoresis conditions, and they found that laboratory differences were associated with electrophoresis conditions, especially the temperature during alkaline electrophoresis, which affects the rate of conversion of alkali labile sites to single stranded breaks ( Sirota , 2014 Sirota NP, Zhanataev AK, Kuznetsova EA, Khizhnyak EP, Anisina EA and Durnev AD (2014) Some causes of inter-laboratory variation in the results of comet assay. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen 770:16-22. ). Additionally, it has been suggested that implementation of a standard software will be required for comet assay interpretation ( Fikrová , 2011 Fikrová P, Stetina R, Hronek M, Hyspler R, Tichá A and Zadák Z (2011) Application of the comet assay method in clinical studies. Wien Klin Wochenschr 123:693-699. ).


Why does ionizing radiation cause only DNA double strand breaks? - biología

Emeritus Professor, Radiation Oncology (Radiation Biology)
Stanford University School of Medicine
800 Blossom Hill Road, Unit R169, Los Gatos, CA 95032
[email protected]
web.stanford.edu/

DNA double-strand breaks (DSB) and single-strand breaks are NO formed as a consequence of the direct absorption of UV radiation by DNA. Rather, they are formed as the consequence of the attempted repair of UV radiation-induced base damage in DNA.

Single-strand breaks are produced enzymatically during the incision step of the nucleotide excision repair of pyrimidine dimers, but these breaks are easily repaired by the action of DNA polymerase I and DNA ligase.

DSB are formed as the consequence of the production of excision repair breaks opposite each other on the two strands of DNA (Figure 1), and by the production of an excision repair break opposite a DNA daughter-strand gap (see module on Recombinational DNA Repair).

Formation of DNA Double-Strand Breaks

DSB appear in wild-type and polA1 strains of Escherichia coli after UV irradiation, and incubation in minimal growth medium. los uvrA6 strain, which is deficient in the incision step of nucleotide excision repair, showed no evidence of DSB under the same conditions. These results indicate that uvr + cells, which are proficient in the incision step of nucleotide excision repair, accumulate DSB as a result of the excision repair process. Además, el polA strain, which is deficient in DNA polymerase I, and is therefore deficient in excision repair subsequent to the incision step, showed more DSB than did the wild-type strain (Bonura and Smith, 1975a).

Normal human cells also show the formation of DSB after UV irradiation, but human cells deficient in excision repair (i.e., Xeroderma pigmentosum) do not show the formation of DSB (Bradley, 1981).

Unrepaired DNA DSB appear to be the major cause of lethality in UV-irradiated wild-type E. coli (Bonura and Smith, 1975a, b). Reducing the number of lesions in DNA after UV irradiation by the photoreactivation of pyrimidine dimers (see module on Photoreactivation), reduced the number of DSB observed (Bonura and Smith, 1975b).

Fluence fractionation also results in an increase in survival and a decrease in the yield of DSB (Bonura and Smith, 1975b). This result is consistent with the concept (Harm, 1968) that dose fractionation increases survival by decreasing the probability for the production of opposed excision gaps by distributing the production of the UV radiation damage over a longer time period during which DNA repair is operating.

Furthermore, for wild-type E. coli, the region of the UV radiation survival curve at which killing approaches exponential, corresponds to the fluence at which DSB accumulate linearly (Figure 2).

Therefore, the type of DNA damage that ultimately results in cell death may be quite different from the initial radiation-induced lesion. In the present case, excisable pyrimidine dimers were converted to DNA single-strand breaks by repair enzymes, and subsequently to lethal DSB by the overlap of two DNA single-strand breaks, or by the overlap of DNA single-strand breaks with DNA daughter-strand gaps.

The repair of metabolically-produced DSB after UV irradiation constitutes a second type of recombination repair that is distinct from the repair of DNA daughter-strand gaps, i.e., the repair of DSB is RecBC-dependent, but the repair of DNA daughter-strand gaps is RecF-dependent (Wang and Smith,1983). (see module on Recombinational DNA Repair).


Repair of DNA Double-Strand Breaks

X-rays produce both DNA single-strand breaks and DSB as the consequence of the direct action of radiation on DNA. Therefore, most of what we know about the repair of DSB comes from work using ionizing radiation.

The precise steps in the repair of DSB are not well known, but a number of genes in E. coli are known to be involved in this type of repair
(Tabla 1).


Much of our knowledge about the repair of DSB comes from studies on X-ray-induced mutagenesis, especially the production of long deletion mutations.

Experiments designed to determine the association between the repair of gamma-radiation-induced DSB and the induction of 700-1000 bp long deletions (Lac - --> Lac + ), base substitutions (leuBl9 --> Leu + ), and frameshifts (trpE9777 --> Trp + ) en E. coli K-12, showed that over the range of 2.5-20 krad, deletions were induced with linear kinetics, as has been observed for the induction of DSB, while the induction kinetics for base substitutions and frameshifts were curvilinear.

Both the repair of DSB, and the induction of deletion mutations showed an absolute requirement for an intact recB gene, as well as a dependency on the type of preirradiation growth medium used (i.e., rich medium vs. minimal medium). These requirements were not seen for base substitutions or frameshifts (Sargentini and Smith, 1992). (see module on UV Radiation and Spontaneous Mutagenesis)

This dependency on rich growth medium for enhanced survival is thought to result from the greater number of sister-DNA duplexes present, and the more rapid synthesis of RecA protein in cells grown in rich medium versus minimal medium (Sargentini et al., 1983).

It has been proposed that the RecBCD enzyme attaches to the end of the DSB, and unwinds (and rewinds) the DNA duplexes until a Chi site in encountered. Chi sites are a sequence of bases (5'-GCTGGTGG-3') positioned about every 5 Kb throughout the DNA, and are recombination hot spots. Chi is a recognition site for the RecBCD enzyme (Exonuclease V), which nicks DNA near Chi as it unwinds DNA (GR Smith and Stahl, 2005).

Since the unwinding action is more rapid than the rewinding action, single-stranded DNA loops are formed. Cutting of the single-stranded DNA loop near the Chi site allows the invasion of the 3' end into a sister-DNA duplex, where it can search for a homologous DNA sequence. The proper alignment of the invading strand with its complementary homologue can lead to the accurate repair of DSB. However, misalignment of the invading strand at another locus would lead to a loop of non-homologous single-stranded DNA that could be lost by excision, or through bypass replication, thus producing a deletion (Sargentini and Smith, 1992).

The repair of DSB in E. coli requires recombinational repair systems, i.e., two DNA duplexes are required, and strand replacement occurs by homologous recombination (see Friedberg et al., 2006 p. 579). However, in mammalian cells, some DSB are repaired by non-homologous end joining (Ferguson et al., 2000).

Summary and Conclusions

This module concentrated on the fact that UV radiation-induced DNA DSB are no formed as the consequence of the direct absorption of UV radiation by DNA, but are formed AFTER UV irradiation by the attempted nucleotide excision repair of UV radiation-induced pyrimidine dimers. It should be noted that DNA DSB are also formed during the repair of other types of DNA damage, e.g., mismatch repair (Nowosielska and Marinus, 2008), and replication arrest (Michel et al., 1997).

Bonura T, Smith KC. 1975a. Enzymatic production of deoxyribonucleic acid double-strand breaks after ultraviolet irradiation of Escherichia coli K-12. J Bacteriol 121:511-517.

Bonura T, Smith KC. 1975b. Quantitative evidence for enzymatically-induced DNA double-strand breaks as lethal lesions in UV-irradiated pol + and polA1 strains of E. coli K-12. Photochem Photobiol 22:243-248.

Bradley, MO. 1981. Double-strand breaks in DNA caused by repair of damage due to ulatraviolet light. J Supramolec Struct Cell Biochem 16:337-343.

Ferguson, DO, Sekiguchi, JM, Chang, S, Frank, KM, Gao, Y, DePinho, RA, Alt, FW. 2000. The nonhomologous end-joining pathway of DNA repair is required for genomic stability and the suppression of translocations. PNAS 97: 6630-6633.

Friedberg, EC, Walker, GC, Siede, W, Wood, RD, Schultz, RA, Ellenberger, T. 2006. Recombinational Repair, Replication Fork Repair, and DNA Damage Tolerance, Chapter 16, pp. 569-612, DNA Repair and Mutagenesis (2nd ed.), ASM Press, Washington, D.C.

Harm, W. 1968. Effects of dose fractionation on ultraviolet survival of Escherichia coli. Photochem. Photobiol. 7:73-86.

Lovett, ST. 2006. Replication arrest-stimulated recombination: Dependence on the RecA paralog, RadA/Sms and translesion polymerase, DinB. DNA Repair (Amst). 5:1421-1427.

Michel, B, Ehrlich, SD, Uzest, M. 1997. DNA double-strand breaks caused by replication arrest. The EMBO Journal 16:430-438.

Nowosielska, A, Marinus, MG. 2008. DNA mismatch repair-induced double-strand breaks. DNA Repair 7:48-56.

Sargentini, NJ, Diver, WP, Smith KC. 1983. The effect of growth conditions on inducible recA-dependent resistance to X rays in Escherichia coli. Radiat. Res. 93:364-380.

Sargentini, NJ, Smith KC. 1986. Quantitation of the involvement of the recA, recB, recC, recF, recJ, recN, lexA, radA, radB, and umuC genes in the repair of X-ray-induced DNA double-strand breaks in Escherichia coli. Radiat. Res. 107:58-72.

Sargentini, NJ, Smith, KC. 1992. Involvement of RecB-mediated (but not RecF-mediated) repair of DNA double-strand breaks in the gamma-radiation production of long deletions in Escherichia coli. Mutat. Res. 265:83-101.

Smith, GR, 1998. DNA double-strand break repair and recombination in Escherichia coli. In DNA Damage and Repair: DNA Repair in Prokaryotes and Lower Eukaryotes. Nickoloff, JA, Hoekstra, MF, (eds), Humana Press, pp. 135-162.

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Wang, TV, Smith KC. 1983. Mechanisms for recF-dependent and recB-dependent pathways of postreplication repair in UV-irradiated Escherichia coli uvrB. J Bacteriol 156:1093-1098.

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10/09/08
06/02/11
03/19/14