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Concentración relativa de enzima frente a producto de reacción

Concentración relativa de enzima frente a producto de reacción


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Estaba leyendo un artículo en el que una proteína recombinante (marcada con His-6) se expresa en E Coli (BL21 DE3). El rendimiento de la enzima aislada del cultivo se informa como 10-30 mg por L de cultivo bacteriano. (Después de la purificación por cromatografía de afinidad de Ni)

Primero, ¿es esta una concentración razonable para una enzima? Pensé que era bastante alto.

En segundo lugar, cuando miden la concentración del producto de la reacción enzimática, se encontró que era simplemente 1-3 mg / litro de cultivo bacteriano.

¿Es esto típico o inusual que la concentración de producto sea un orden de magnitud menor que la concentración de enzima? Supuse que, dado que las enzimas estaban en cantidades catalíticas, deberían estar en concentraciones más bajas.

PD. Utilizan SDS-PAGE seguido del método de Bradford para determinar los títulos de proteínas. ¿Qué precisión tiene el método Bradford?


Recuerde que las concentraciones que informa están en unidades de masa en lugar de en unidades molares. Si la proteína tiene una masa de 40 000 Da, razonable para muchas proteínas, entonces 20 mg / litro significa $ 0.5 $ x $ 10 ^ {- 6} $ mol / litro. Un producto típico de masa pequeña de una reacción enzimática puede tener una masa de aproximadamente 200, por lo que su concentración de masa aparentemente más baja de 2 mg / litro es $ 10 $ x $ 10 ^ {- 6} $ mol / litro, 20 veces mayor que la concentración de enzima en términos de número de moléculas por litro. Las proporciones molares o moleculares son lo que debe considerar en términos de función catalítica.

Además, por lo que nos proporciona, no sabemos si la enzima se produjo en circunstancias que le permitieron expresar su actividad; puede haber limitaciones en la disponibilidad del sustrato, la presencia de inhibidores que se eliminarían en una purificación posterior, etc. En este escenario, evidentemente para obtener enzima para uso posterior, el énfasis está típicamente en obtener grandes cantidades de la enzima específica independientemente de si se forma algún producto de reacción. No encuentro la concentración de enzima particularmente alta para algo que los investigadores están tratando de sobreexpresar como en este caso.

La reacción de Bradford es un pilar de la bioquímica estándar, ya que es simple y directa. Diferentes proteínas pueden unirse al reactivo en grados algo diferentes, por lo que existe una cuestión de segundo orden sobre si la proteína utilizada para la curva estándar y la que se mide son lo suficientemente similares en ese sentido. En la práctica, lo importante es proporcionar suficiente información en los métodos que se describen para que alguien pueda repetir el trabajo para determinar la relación entre la medición de Bradford y algún otro método más preciso para esta proteína en particular.


Concentración relativa de enzima frente a producto de reacción - Biología

Efectos de concentración

Efectos de la concentración de sustrato

Examinamos la velocidad de reacción a diferentes concentraciones de sustrato. Nuestros tubos estándar contenían 1 ml de peróxido de hidrógeno, y diferentes grupos realizaron reacciones con más o menos sustrato para compararlo. Debido a que cada grupo probó diferentes volúmenes de sustrato, obtuvimos resultados extremadamente variables que resultaron difíciles de interpretar. En general, con mucho menos sustrato obtuvimos reacciones más lentas y con más, obtuvimos reacciones más rápidas. Lo que esperamos ver es que la velocidad debería estabilizarse una vez que alcance el máximo (cuando cada enzima peroxidasa tiene una molécula de peróxido de hidrógeno con la que interactuar, en ese punto, agregar más peróxido de hidrógeno no puede aumentar la velocidad de reacción porque todos los las enzimas disponibles están ocupadas).

Efectos de la concentración de enzimas

También examinamos la velocidad de reacción cuando aumentamos la cantidad de extracto de nabo en nuestros tubos. Dado que el extracto de nabo contenía nuestra enzima peroxidasa, esto aumentó la concentración de enzima en nuestras reacciones. El gráfico anterior muestra que a medida que aumentamos la cantidad de enzima en los tubos, nuestra velocidad de reacción aumentó. En algún momento, se debería alcanzar la tasa máxima de racción y deberíamos ver el nivel de la curva apagado (ver la curva de concentración de sustrato arriba para un ejemplo), pero según estos datos, se requieren más de 3 mL de extracto de nabo para alcanzar un 1 Relación: 1 de enzima a moléculas de sustrato.

Resumen de efectos de concentración

Las tasas de reacción de las enzimas han establecido límites: no pueden pasar de cero (sin reacción) y no pueden superar el 100%. Cuando hay una proporción de enzima y sustrato de 1: 1, la reacción va lo más rápido posible. Agregue más enzima y no habrá sustrato con el que reaccionar. Agregue más sustrato y no habrá enzimas libres para trabajar con él. Por lo tanto, al agregar sustrato o enzima, debe esperar ver que la curva de velocidad de reacción se nivela cuando se alcanza el máximo.


Para estudiar el efecto de aumentar la concentración de enzima sobre la velocidad de reacción, el sustrato debe estar presente en una cantidad en exceso, es decir, la reacción debe ser independiente de la concentración de sustrato. Cualquier cambio en la cantidad de producto formado durante un período de tiempo específico dependerá del nivel de enzima presente. Gráficamente esto se puede representar como:

Se dice que estas reacciones son de "orden cero" porque las velocidades son independientes de la concentración de sustrato y son iguales a alguna k constante. La formación de producto avanza a una velocidad lineal con el tiempo. La adición de más sustrato no sirve para aumentar la tasa. En cinética de orden cero, permitir que el ensayo se ejecute durante el doble de tiempo da como resultado el doble de cantidad de producto.

Tabla I: Órdenes de reacción con respecto a la concentración de sustrato
Pedido Ecuación de tasa Comentarios
cero tasa = k la tasa es independiente de la concentración de sustrato
primero tasa = k [S] La tasa es proporcional a la primera potencia de concentración de sustrato.
segundo tasa = k [S] [S] = k [S] 2 la tasa es proporcional al cuadrado de la concentración de sustrato
segundo tasa = k [S1][S2] la tasa es proporcional a la primera potencia de cada uno de los dos reactivos

La cantidad de enzima presente en una reacción se mide por la actividad que cataliza. La relación entre actividad y concentración se ve afectada por muchos factores como temperatura, pH, etc. Se debe diseñar un ensayo enzimático de modo que la actividad observada sea proporcional a la cantidad de enzima presente para que la concentración de enzima sea el único factor limitante. Solo se satisface cuando la reacción es de orden cero.

En la Figura 5, la actividad es directamente proporcional a la concentración en el área AB, pero no en BC. La actividad enzimática es generalmente máxima cuando la concentración de sustrato es ilimitada.

Cuando se representa gráficamente la concentración del producto de una reacción enzimática frente al tiempo, se obtiene una curva similar, Figura 6.

Entre A y B, la curva representa una reacción de orden cero, es decir, una en la que la velocidad es constante con el tiempo. A medida que se agota el sustrato, los sitios activos de la enzima dejan de estar saturados, la concentración de sustrato se vuelve limitante y la reacción se vuelve de primer orden entre B y C.

Para medir la actividad enzimática de manera ideal, las mediciones deben realizarse en la parte de la curva donde la reacción es de orden cero. Es más probable que una reacción sea de orden cero inicialmente, ya que la concentración de sustrato es entonces más alta. Para estar seguro de que una reacción es de orden cero, se deben realizar múltiples mediciones de la concentración de producto (o sustrato).

La Figura 7 ilustra tres tipos de reacciones que se pueden encontrar en los ensayos enzimáticos y muestra los problemas que podrían resolverse si solo se realizan mediciones individuales.

B es una línea recta que representa una reacción de orden cero que permite la determinación precisa de la actividad enzimática durante parte o todo el tiempo de reacción. A representa el tipo de reacción que se muestra en la Figura 6. Esta reacción es de orden cero inicialmente y luego se ralentiza, presumiblemente debido al agotamiento del sustrato o la inhibición del producto. Este tipo de reacción a veces se denomina reacción principal. La verdadera actividad "potencial" está representada por la línea de puntos. La curva C representa una reacción con una fase inicial de retardo. Nuevamente, la línea de puntos representa la actividad potencialmente medible. Múltiples determinaciones de la concentración de producto permiten trazar cada curva y determinar la actividad real. Una determinación de punto final único en E llevaría a la falsa conclusión de que las tres muestras tenían una concentración de enzima idéntica.


Laboratorio de cinética de enzimas & # 8211 La relación entre las concentraciones de enzimas y sustratos y las velocidades de reacción

Las enzimas son catalizadores que reducen la activación de reacciones químicas, haciendo que sucedan más rápidamente. En este experimento, se colocaron diferentes cantidades de enzima y sustrato en un tubo de ensayo, luego se observaron usando un espectrofotómetro para ver qué tan rápido reaccionaban para producir el producto. Se encontró que a medida que aumentaba la concentración de enzima, aumentaba la velocidad de reacción. Asimismo, se encontró que a medida que aumentaba la concentración de sustrato, aumentaba la velocidad de reacción. Como hay más enzima, puede reaccionar con más sustrato a la vez, aumentando así la velocidad de reacción. Cuando hay más sustrato, habrá la misma cantidad de enzima, lo que también aumentará la velocidad de la reacción. Por lo tanto, niveles más altos de enzima o sustrato significan que habrá una mayor tasa de rotación de producto.

Introducción

Un catalizador es una sustancia que reduce la energía de activación de una reacción química (Zubay et al., 1995). En otras palabras, esto significa que un catalizador hace que las reacciones químicas sucedan más rápido de lo normal. Las enzimas son catalizadores que aceleran las reacciones en las células vivas. Por ejemplo, la enzima anhidrasa carbónica hace que la reacción química CO2 + H2O & # 8212 & gt H2CO3 suceden 10 7 veces más rápido de lo normal. En este ejemplo, la enzima reaccionó con CO2. La sustancia que cataliza una enzima se llama sustrato. Las enzimas se unen a los sustratos para acelerar la reacción de convertir el sustrato en un producto. Cuando hay una pequeña cantidad de sustrato, habrá una pequeña cantidad de enzima, pero a medida que aumenta el nivel de sustrato, aumenta el nivel de enzima. En este experimento, se observó la velocidad a la que reaccionan las enzimas y los sustratos.

Materiales y métodos

Para el primer experimento, se probaron diferentes concentraciones de enzimas para ver qué tan rápido reaccionaban. Primero se encendió un espectrofotómetro Spec20 y se ajustó a una longitud de onda de 340 nm. A continuación, se puso en el tubo de ensayo una mezcla de reacción que consistía en 0,850 ml de agua destilada, 1.000 ml de solución tampón, 0,100 ml de NAD + 15 mM y 1.000 ml de etanol utilizando una micropipeta. Esta mezcla se agitó para mezclarla y luego se calibró el espectrofotómetro usando este tubo de ensayo. Una vez calibrada, se añadieron 0,050 ml de enzima ADH a la mezcla del tubo de ensayo y se agitó. A continuación, se colocó rápidamente el tubo de ensayo en el espectrofotómetro y se registraron sus lecturas de absorbancia. Las lecturas se registraron cada 15 segundos durante 3 minutos. Este proceso se repitió para 2 mezclas de reacción más con ajustes en la cantidad de agua destilada y enzima AHD incluidos. La segunda mezcla de reacción tenía 0,100 ml de enzima ADH y 0,800 ml de agua destilada, y la tercera tenía 0,025 ml de enzima ADH y 0,875 ml de agua destilada.

Para el segundo experimento, se probaron diferentes concentraciones de sustrato para ver sus velocidades de reacción. Una vez más, se encendió un espectrofotómetro Spec20 y se ajustó a una longitud de onda de 340 nm. Una mezcla de reacción que constaba de 1,85 ml de agua destilada, 1,0 ml de solución tampón, 100 µl de NAD + y 0 µl de etanol se puso en un tubo de ensayo usando una micropipeta. La mezcla se agitó, luego se puso en el espectrofotómetro y se calibró el espectrofotómetro. Una vez que se agregaron 50 ul de ADH a la mezcla de reacción, se agitó el tubo de ensayo y se colocó rápidamente en el espectrofotómetro. A continuación, se registraron las lecturas de absorbancia cada 15 segundos durante 2 minutos. Se preparó, observó y registró otra mezcla de reacción con las mismas cantidades de cada sustancia. Este proceso se repitió para cinco mezclas de reacción más con diferencias en la cantidad de agua destilada y stock de etanol utilizado. Las cantidades de stock de agua destilada y etanol para estas mezclas de reacción fueron 1,80 ml de agua destilada y 50 ul de stock de etanol, 1,75 ml de agua destilada y 100 ul de stock de etanol, 1,65 ml de agua destilada y 200 ul de stock de etanol, 1,35 ml de agua destilada y 500 ul. stock de etanol y 0,85 ml de agua destilada y stock de etanol.

Resultados

Tiempo (min: seg) Absorbancia (50 ul de enzima) Absorbancia (100 ul de enzima) Absorbancia (25 ul de enzima)
0:00 n / A n / A n / A
0:15 n / A n / A n / A
0:30 n / A .15 .035
0:45 .14 .22 .07
1:00 .175 .28 .095
1:15 .21 .3325 .12
1:30 .24 .38 .145
1:45 .27 .42 .1675
2:00 .2975 .455 .19
2:15 .32 .485 .2125
2:30 .3425 .505 .235
2:45 .36 .525 .255
3:00 .3825 .55 .2725
3:15 .4 .57 .29
Cantidad de enzima (ul) [E] (ug / ml) Pendiente inicial (A / min) Velocidad (umol / min)
50 0.00333 1.60 0.772
100 0.00667 2.29 1.10
25 0.00167 0.889 0.429

La concentración de enzima influyó en la velocidad de reacción. A medida que aumentaba la concentración de la enzima, la velocidad aumentaba (Tabla II, Figura 2). La pendiente inicial también se hizo más pronunciada a medida que aumentaba la concentración de la enzima (Tabla II, Figura 1).

La concentración de sustrato afectó la velocidad de reacción. A medida que aumentaba la concentración de sustrato, la velocidad se incrementaba abruptamente y luego se nivelaba (Figura 4). De la Figura 4 (v vs. [S]), la Vmax estimada es 0.0620 umol / min y la Km estimada es 0.0140 mM. De la Figura 3 (1 / v vs. 1 / [S]), la Vmax estimada es 0.0568 umol / min y la Km estimada es 10 mM. Las Vmax y Km reales registradas en SigmaPlot fueron 0,06566 umol / min y 0,01522 mM. Las Vmax obtenidas de cada gráfico son bastante cercanas, pero las Km no lo son en absoluto. La Vmax y Km del gráfico v vs. [S] son ​​muy similares a las Vmax y Km reales obtenidas de SigmaPlot.

Discusión

Shono y colaboradores (1995) observaron la velocidad de reacción frente a la concentración de un sustrato diferente al utilizado en este experimento. Sus gráficos resultantes de su experimento son muy similares al gráfico resultante de este experimento. Los gráficos de "velocidad frente a concentración de sustrato" siguen la misma curva casi exacta, pero los niveles de concentración fueron más altos en el experimento de Shono, lo que resultó en tasas de reacción más altas. En los gráficos "1 / v vs. 1 / [S]", la línea de Shono parece tener aproximadamente la misma pendiente, pero cruza el eje x en un valor mucho más bajo que en los gráficos de este experimento.

Esto puede atribuirse a un error en el procedimiento del experimento, que provocó que los valores atípicos de la línea se sesgaran. No se sabía que estos valores atípicos deberían haberse ignorado hasta que se calcularon los cálculos de Km y Vmax utilizando el gráfico “1 / v vs. 1 / [S]” y comparándolo con otros gráficos similares. La Vmax registrada en la Figura 3 fue bastante cercana a la Vmax encontrada en la Figura 4. Sin embargo, la Km de la Figura 3, 10 mM, no es muy cercana. Ese valor es mucho mayor que el Km encontrado en la Figura 4, 0.0140 mM, y el Km real calculado por SigmaPlot, 0.01522 mM.

A partir del experimento, los resultados mostraron que con una mayor concentración de enzima, mayor velocidad de reacción. Al catalizar una reacción, la enzima se une al sustrato (Bolsover et al., 1997). Si hay una concentración más alta de enzima, esto significa que habrá más enzima para unirse al sustrato a la vez, lo que aumentará la tasa de rotación del sustrato al producto. Es por eso que una mayor concentración de enzima produce una mayor tasa de rotación. La tasa de rotación comienza a disminuir y se detiene a medida que se agota la cantidad de sustrato, y es por eso que las tasas de absorbancia comenzaron a nivelarse en la Figura 1. Había una cantidad limitada de sustrato que podía convertirse en producto.

Como había una mayor concentración de sustrato, la velocidad de reacción aumentó y luego se niveló, como se muestra en la Figura 4. El gráfico de Michaelis-Menten asume que la enzima y el sustrato están en equilibrio (Zubay et al., 1995). Por lo tanto, como hay una mayor concentración de sustrato, habrá una concentración igualmente alta de enzima para reaccionar con el sustrato. A medida que hay una mayor concentración de cada uno, aumenta la velocidad de reacción. Sin embargo, la curva se nivela. Esto se debe a que cada sustrato tiene una velocidad máxima a la que se puede convertir de sustrato a producto. La enzima no puede catalizar el sustrato para que se renueve más rápido que esto.

La afinidad por la enzima y el sustrato en este experimento fue bastante alta. El Km, 0,01522 mM, es un número bajo. Esto significa que la enzima y el sustrato reaccionaron muy rápidamente para producir el producto.

Literatura citada

Bolsover, S.R., J.S. Hyams, S. Jones, E.A. Shepard y H.A. Blanco. 1997. From Genes to Cells. (Wiley-Liss, Nueva York). 424 p.

Shono, M., M. Wada, T. Fujii, 1995. Purificación parcial de una Na + -ATPasa de la membrana plasmática del alga marina Heterosigma akashiwo. Plant Physiol 108: 1615-1615.

Zubay, Geoffrey, William M. Parson y Dennis E. Vance. 1995. Principios de bioquímica. (Wm. C. Brown, Dubuque, Iowa) 863 p.


La actividad enzimática cambia a medida que disminuye la concentración de la enzima

Las enzimas son una clase muy importante de biocatalizadores. Debido a la acción de la enzima, la reacción química en el cuerpo vivo se puede llevar a cabo de manera eficiente y específica en condiciones extremadamente suaves. Los procesos de vida de todas las criaturas de la tierra, desde pequeñas hasta grandes, proliferantes, vivas y moribundas, y el metabolismo, están todas relacionadas con las enzimas. Sin la catálisis enzimática, la digestión más básica de los alimentos, no se puede llevar a cabo la respiración de oxígeno, y mucho menos otras actividades de la vida. De hecho, casi todos los tipos de reacciones que ocurren en los organismos vivos se llevan a cabo mediante catálisis enzimática.

Las enzimas son muy importantes para la vida. La razón de esto es que la velocidad de catálisis enzimática es muy rápida, que es miles de veces más rápida que la velocidad de reacción catalizada por un catalizador químico. Por ejemplo, la glucosa en los alimentos reacciona con el oxígeno para convertirse en dióxido de carbono y agua, y la energía liberada es la energía que mantiene la temperatura corporal del cuerpo y todas las actividades de la vida. Si no hay catalizador, el proceso catalítico tarda varios años o más en condiciones normales de temperatura y presión. Para acelerar la reacción, se debe realizar por encima de los trescientos grados centígrados, quemando y oxidando para liberar energía. En el cuerpo vivo, bajo la catálisis de una serie de enzimas, se puede completar instantáneamente a temperatura y presión normales a una velocidad inimaginable.

Las enzimas ayudan en las reacciones químicas al permitir que las moléculas reduzcan la energía requerida para iniciar la reacción. Esta energía, llamada energía de activación, es proporcionada por el medio ambiente. Por ejemplo, la energía térmica ambiental asociada con la temperatura ambiente se puede utilizar como energía de activación. La velocidad de las reacciones químicas en un entorno biológico suele estar limitada por una cantidad limitada de energía ambiental, pero las enzimas superan esta limitación porque permiten que una cantidad menor de energía active más reacciones.

En la mayoría de los casos, la reducción de la concentración de enzima tiene un efecto directo sobre la actividad de la enzima. Una enzima solo cataliza una reacción de una sustancia, o la misma reacción de una sustancia químicamente similar, y nunca catalizará otras sustancias y reacciones. La mayoría de las enzimas catalizan solo una reacción de una sustancia, incluso si la estructura es muy similar. Esta propiedad se denomina especificidad de la catálisis enzimática. La molécula unida a la enzima se llama sustrato. Normalmente, una enzima se combina con un sustrato para reducir la energía de activación de una reacción química. Si todas las enzimas del sistema se unen al sustrato, las moléculas de sustrato adicionales deben esperar a que la enzima esté disponible después de que se complete la reacción. Esto significa que a medida que disminuye la concentración de enzima, la velocidad de reacción disminuirá.

En la mayoría de los entornos biológicos, la concentración de la enzima es menor que la concentración del sustrato. La relación entre la concentración de enzima y la actividad de la enzima es directamente proporcional. En un gráfico que muestra la velocidad de reacción frente a la concentración de enzima, esta relación proporcional directa parece una línea recta con una pendiente de uno. En otras palabras, una enzima adicional aumenta la velocidad en una reacción por unidad de tiempo, y una enzima eliminada reduce la velocidad en una reacción por unidad de tiempo. Una excepción a la relación proporcional directa es que si la concentración de sustrato está por debajo de la concentración de enzima, la reducción de la concentración de enzima no da como resultado una disminución de la actividad enzimática. En este caso, la enzima eliminada no tiene ningún efecto porque el sistema todavía tiene suficiente enzima para unirse a todos los sustratos disponibles. Por tanto, a medida que la concentración de enzima aumenta a un nivel similar a la concentración de sustrato, el mapa de actividad de la enzima frente a la concentración de la enzima finalmente se estabilizará en una línea plana.


Una de las propiedades de las enzimas que las hace tan importantes como herramientas de diagnóstico e investigación es la especificidad que exhiben en relación con las reacciones que catalizan. Algunas enzimas exhiben una especificidad absoluta, es decir, catalizarán solo una reacción en particular. Otras enzimas serán específicas para un tipo particular de enlace químico o grupo funcional. En general, hay cuatro tipos distintos de especificidad:

  • Especificidad absoluta: la enzima catalizará solo una reacción.
  • Especificidad de grupo: la enzima actuará solo sobre moléculas que tengan grupos funcionales específicos, como grupos amino, fosfato y metilo.
  • Especificidad de enlace: la enzima actuará sobre un tipo particular de enlace químico independientemente del resto de la estructura molecular.
  • Especificidad estereoquímica: la enzima actuará sobre un isómero estérico u óptico particular.

Aunque las enzimas exhiben un gran grado de especificidad, los cofactores pueden servir para muchas apoenzimas. Por ejemplo, el dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD) es una coenzima de un gran número de reacciones deshidrogenasas en las que actúa como aceptor de hidrógeno. Entre ellos se encuentran las reacciones de alcohol deshidrogenasa, malato deshidrogenasa y lactato deshidrogenasa.


Resultados

Coevolución empleando un sustrato común.

Las enzimas CL1 y DSL (Fig. 1) se desafiaron primero a experimentar una coevolución continua dentro de una mezcla de reacción común, empleando cantidades limitadas de un solo sustrato oligonucleotídico. Este proceso condujo rápidamente a la extinción de una u otra enzima, según el sustrato que se utilizara. Un sustrato similar al usado en el desarrollo evolutivo de la enzima CL1 fue usado de manera más eficiente por esa enzima, y ​​también para la enzima DSL y su sustrato preferido. Esta ventaja no pudo superarse mediante la evolución antes de que se produjera la extinción de la enzima desfavorecida. Al escalonar la concentración inicial de las 2 enzimas, fue posible retrasar el inicio de la extinción. Sin embargo, quedó claro que se necesitarían restricciones adicionales para evitar el crecimiento descontrolado de las especies más ventajosas.

Secuencia y estructura secundaria de la CL1 evolucionada (A) y DSL (B) enzimas, que se muestran con los sustratos S4 y S5, respectivamente. Los rectángulos abiertos indican los sitios de unión del cebador en el extremo 5 'del sustrato y en el extremo 3' de la enzima. La flecha curva indica el sitio de la ligadura. Los círculos rellenos resaltan las mutaciones presentes en los clones típicos aislados después de 50 transferencias de coevolución (con 5 sustratos) en relación con las enzimas de partida.

Se inició un experimento de transferencia en serie, durante el cual se usó un oligodesoxinucleótido antisentido de 14 mer para inhibir el crecimiento de la ligasa dominante. Se diseñaron oligos antisentido para que se hibridaran con una región crítica de cada una de las 2 enzimas de ARN, lo que perjudicaba su actividad catalítica. Comenzando con una población de 1 pmol de cada una de las variantes aleatorias de las enzimas CL1 y DSL, se llevaron a cabo 40 transferencias seriadas de coevolución continua, monitoreando la concentración de cada ligasa (basada en cDNA) antes y después de cada transferencia [información de apoyo (SI) Fig. S1]. Para mantener la diversidad dentro de la población en evolución, se realizó una PCR propensa a errores en ambas enzimas después de las transferencias 10, 20 y 30. La extinción se evitó por poco durante este proceso coevolutivo mediante el empleo de oligos antisentido, pero requirió el conocimiento por parte del experimentador de qué secuencia para apuntar y manipular las condiciones de reacción en base a qué enzima requirió inhibición antisentido. Además, las enzimas comenzaron a desarrollar resistencia a los oligos antisentido adquiriendo mutaciones de escape que desestabilizaron las interacciones de emparejamiento de bases relevantes. El uso prolongado de este enfoque requeriría que los oligos se rediseñen para mantener el efecto deseado.

Coevolución empleando 5 sustratos diferentes.

Se inició un segundo experimento de coevolución continua, empleando una mezcla de 5 sustratos diferentes (Tabla S1). Cada sustrato (S1-S5) contenía un solo cambio de nucleótido dentro de la secuencia del promotor en comparación con el sustrato que se utilizó anteriormente (S0). Este cambio redujo la eficiencia del promotor a un 9% -63% en relación con la del promotor de tipo salvaje y creó un desajuste de un solo nucleótido para cada combinación de enzima y sustrato.

La coevolución continua se inició con 10 pmol de CL1 y 1 pmol de las enzimas DSL, que se transcribieron a partir de moldes que habían sido sometidos a PCR mutagénica. La concentración de cada ligasa se midió antes y después de cada transferencia (Fig. 2), y el tiempo entre transferencias se ajustó periódicamente para permitir que las enzimas agotaran el suministro de sus sustratos correspondientes (Fig. S2). Las concentraciones de las enzimas CL1 y DSL se escalonaron nuevamente después de las transferencias 30, 32, 37, 42 y 46 para compensar sus tasas de crecimiento diferenciales. La diversidad se mantuvo dentro de la población en evolución mediante la realización de PCR mutagénica después de las transferencias 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 32, 37, 42 y 46.

Evolución temporal de 50 transferencias de coevolución continua en presencia de 5 sustratos diferentes. La concentración de las enzimas CL1 (naranja) y DSL (azul) se determinó (basándose en sus respectivos ADNc) antes y después de cada transferencia. Gráfico de barras emparejado en el Cima indica la preferencia de sustrato de cada enzima (CL1 en Izquierda, DSL en Derecha) después de varias transferencias cuando se proporciona 1 μM S1 (rojo), S2 (verde), S3 (violeta), S4 (naranja) o S5 (azul). Gráfico escalonado en el Fondo indica la concentración de S5 presente durante el experimento de coevolución, todos los demás sustratos estaban presentes a una concentración de 1 µM en todo momento.

La mezcla de reacción inicial contenía 1 µM de cada uno de los 5 sustratos. Los ensayos se realizaron antes del inicio del experimento y periódicamente a partir de entonces para medir la capacidad de cada enzima para amplificar en presencia de 1 µM de cada sustrato, probado individualmente (Fig. 2). Ambas enzimas mostraron una fuerte tendencia a adaptarse a la utilización de S5 y, en consecuencia, la concentración de S5 se redujo a 0,1 µM o se eliminó completamente por intervalos durante el curso del experimento para proporcionar una ventaja selectiva que favoreciera el uso de uno de los otros sustratos.

Después de 50 transferencias de coevolución continua, con una amplificación global de ~ 10 100 veces, se clonaron moléculas individuales de CL1 y DSL de la población y se secuenciaron. Se eligió un clon típico de cada enzima para un análisis más detallado (Fig. 1). La enzima CL1 evolucionada contenía 5 mutaciones en relación con la enzima de partida, mientras que la enzima DSL evolucionada contenía 11 mutaciones. Estas mutaciones incluyeron cambios compensatorios dentro de la porción de la enzima que se une al sustrato: A13 → G para CL1 y U22 → A para DSL, proporcionando una perfecta complementariedad con los sustratos S4 y S5, respectivamente. Se obtuvieron perfiles de amplificación para cada una de las enzimas desarrolladas, lo que demuestra el uso mutuamente excluyente de S4 por CL1 y de S5 por DSL. La tasa de crecimiento exponencial de DSL excedió apreciablemente la de CL1 cuando se permitió que cada enzima operara en presencia de su sustrato preferido. Después de 30 min de incubación, la enzima DSL exhibió una amplificación de 150 veces, mientras que la enzima CL1 exhibió solo una amplificación de 13 veces. Además, DSL logró un grado máximo de crecimiento que fue aproximadamente 3 veces mayor que el de CL1 (Fig. 3).

Perfiles de amplificación de las enzimas CL1 (círculos) y DSL (cuadrados) que operan en presencia de 1 μM de S4 o S5. Los símbolos llenos indican comportamiento en presencia del sustrato afín (CL1 con S4, DSL con S5) los símbolos abiertos indican comportamiento en presencia del sustrato no afín. La concentración de la enzima ARN se determinó en varios momentos y los datos se ajustaron a la ecuación logística: [enzima] = a/(1 + Be -Ct), donde a es el grado máximo de amplificación y C es la tasa de crecimiento exponencial. Los coeficientes de regresión curvilínea fueron 0,995 para CL1 con S4 y 0,998 para DSL con S5. Recuadro muestra comportamiento durante la fase lineal de crecimiento.

Las mutaciones compensatorias solas se instalaron en las enzimas CL1 y DSL. Para CL1, el emparejamiento emparejado entre la enzima y el sustrato dio como resultado características de crecimiento similares a las de la enzima completamente evolucionada, lo que sugiere que las otras 4 mutaciones en la enzima evolucionada son casi neutrales con respecto a la aptitud. Para DSL, por el contrario, la mutación compensatoria por sí sola no proporcionó la tasa de crecimiento completa de la enzima desarrollada. DSL es una enzima más joven en comparación con CL1, que ha estado sujeta a muchas menos rondas de evolución in vitro y, por lo tanto, es más probable que adquiera mutaciones que mejoren su aptitud en el contexto de la evolución in vitro continua.

Es posible equilibrar las tasas de crecimiento dispares de las enzimas CL1 y DSL evolucionadas ajustando las concentraciones de sus respectivos sustratos (Fig. S3). La enzima CL1 que opera en presencia de S4 1 μM tiene una tasa de crecimiento casi idéntica y un grado máximo de crecimiento en comparación con la enzima DSL que opera en presencia de S5 0.02 μM. En estas condiciones, es posible llevar a cabo la coevolución sostenida de CL1 y DSL dentro de una mezcla de reacción común en el transcurso de un experimento de transferencia en serie (Fig. 4). En ausencia de más cambios evolutivos, este comportamiento podría mantenerse indefinidamente, demostrando la ocupación de distintos nichos por las 2 diferentes enzimas de ARN.

Coevolución sostenida de las enzimas CL1 (círculos) y DSL (cuadrados). Se realizaron cinco rondas sucesivas de amplificación y dilución de 100 veces durante un período de 2,5 h. La concentración de cada enzima se determinó basándose en la incorporación de [α-32 P] ATP en los ARN recién sintetizados. Las concentraciones de S4 y S5 fueron de 1 y 0,02 μM, respectivamente.

Análisis cinético y transcripcional.

La actividad catalítica de las enzimas CL1 y DSL evolucionadas con sus sustratos preferidos se examinó en condiciones de evolución continua (Fig.5 A y B). CL1 demostró un kgato de 290 ± 30 min −1 y KMETRO de 17 ± 4 µM. Esta tasa catalítica se encuentra entre las más rápidas jamás medidas para una enzima de ARN. En contraste, DSL exhibió un kgato de 0,17 ± 0,01 min −1 y KMETRO de 0,24 ± 0,04 µM. Por lo tanto, las 2 enzimas exhiben parámetros cinéticos marcadamente diferentes, con una diferencia de aproximadamente 100 veces en las tasas observadas en presencia de 1 µM de sus respectivos sustratos. Sin embargo, ambas enzimas son viables dentro del sistema de evolución continua.

Actividad catalítica y velocidad de transcripción de las enzimas CL1 (círculos) y DSL (cuadrados) evolucionadas. (A) Reacción de CL1 con S4. (B) Reacción de DSL con S5. Data were fit to the Michaelis–Menten equation curvilinear regression coefficients were 0.984 and 0.981 for CL1 and DSL, respectively. (C) Transcription rates were measured by using various concentrations of RNA/cDNA heteroduplex templates. Linear regression coefficients were 0.994 and 0.983 for CL1 and DSL, respectively.

Interestingly, the slower DSL enzyme amplified more efficiently in the continuous evolution mixture, warranting investigation into other factors that might affect amplification rate. The rates of reverse transcription of the 2 ligated enzymes were measured and found to be 0.2 and 0.3 min −1 for CL1 and DSL, respectively. However, the rates of forward transcription (starting from cDNA) were more disparate, with DSL exhibiting a 2.2-fold faster rate of transcription over a range of cDNA concentrations equivalent to those present during continuous evolution. Synthetic DNA templates were prepared to validate the observed difference in transcription rates. The rate of transcription was linear over a range of DNA template concentrations, with a rate constant of 0.40 and 1.0 min −1 for the CL1 and DSL enzymes, respectively (Fig. 5C). This 2.5-fold difference is consistent with the measurements obtained starting from cDNAs that had been generated in the continuous evolution mixture.


Relative concentration of enzyme vs reaction product - Biology

KINETICS OF MONOMERIC ENZYMES

Enzyme kinetics is a high-yield topic that can score us several points on Test Day. Just as the relief our student derives from squeezing a stress ball depends on a number of factors, such as size and shape of the ball and his or her baseline level of stress, enzyme kinetics are dependent on factors like environmental conditions and concentrations of substrate and enzyme.

The concentrations of the substrate, [S], and enzyme, [E], greatly affect how quickly a reaction will occur. Let's say that we have 100 stress balls (enzymes) and only 10 frustrated students (substrates) to derive stress relief from them (high enzyme concentration relative to substrate). Because there are many active sites available, we will quickly form products (students letting go and feeling relaxed) in a chemical sense, we would reach equilibrium quickly. As we slowly add more substrate (students), the rate of the reaction will increase that is, more people will relax in the same amount of time because we have plenty of available stress balls for them to squeeze. However, as we add more and more people (and start approaching 100 students), we begin to level off and reach a maximal rate of relaxation. There are fewer and fewer available stress balls until finally all active sites are occupied. Unlike before, inviting more students into the room will not change the rate of the reaction. It cannot go any faster once it has reached saturation. At this rate, the enzyme is working at maximum velocity, denoted by vmax. The only way to increase vmax is by increasing the enzyme concentration. In the cell, this can be accomplished by inducing the expression of the gene encoding the enzyme. These concepts are represented graphically in Figure 2.4.

Figura 2.4. Michaelis–Menten Plot of Enzyme Kinetics As the amount of substrate increases, the enzyme is able to increase its rate of reaction until it reaches a maximum enzymatic reaction rate (vmax) once vmax is reached, adding more substrate will not increase the rate of reaction.

For most enzymes, the Michaelis–Menten equation describes how the rate of the reaction, v, depends on the concentration of both the enzyme, [E], and the substrate, [S], which forms product, [P]. Enzyme–substrate complexes form at a rate k1. The ES complex can either dissociate at a ratek2 or turn into E + P at a rate k3:

Equation 2.1

Note that in either case, the enzyme is again available. On Test Day, the concentration of enzyme will be kept constant. Under these conditions, we can relate the velocity of the enzyme to substrate concentration using the Michaelis–Menten equation:

Equation 2.2

Some important and Test Day-relevant math can be derived from this equation. When the reaction rate is equal to half of vmax, Kmetro = [S]:

Kmetro can therefore be understood to be the substrate concentration at which half of the enzyme's active sites are full (half the stress balls are in use). Kmetro es el Michaelis constant, and is often used to compare enzymes. Under certain conditions, Kmetro is a measure of the affinity of the enzyme for its substrate. When comparing two enzymes, the one with the higher Kmetro has the lower affinity for its substrate because it requires a higher substrate concentration to be half-saturated. los Kmetro value is an intrinsic property of the enzyme–substrate system and cannot be altered by changing the concentration of substrate or enzyme.

CONCEPTO CLAVE

We can assess an enzyme's affinity for a substrate by noting the Kmetro. Un bajo Kmetro reflects a high affinity for the substrate (low [S] required for 50% enzyme saturation). Conversely, a high Kmetro reflects a low affinity of the enzyme for the substrate.

For a given concentration of enzyme, the Michaelis–Menten relationship generally graphs as a hyperbola, as seen in the Michaelis–Menten plot in Figure 2.4. When substrate concentration is less than Kmetro, changes in substrate concentration will greatly affect the reaction rate. At high substrate concentrations exceeding Kmetro, the reaction rate increases much more slowly as it approaches vmax, where it becomes independent of substrate concentration.

The Lineweaver–Burk plot is a double reciprocal graph of the Michaelis–Menten equation. The same data graphed in this way yield a straight line as shown in Figure 2.5. The actual data are represented by the portion of the graph to the right of the y-axis, but the line is extrapolated into the upper left quadrant to determine its intercept with the X-eje. The intercept of the line with the X-axis gives the value of . The intercept of the line with the y-axis gives the value of . The Lineweaver–Burk plot is especially useful when determining the type of inhibition that an enzyme is experiencing because vmax y Kmetro can be compared without estimation.

Figura 2.5. Experimentally Determined Lineweaver–Burk (Double Reciprocal) Plot Used to Calculate the Values of Kmetro y vmax

Certain enzymes do not show the normal hyperbola when graphed on a Michaelis–Menten plot (v vs. [S]), but rather show sigmoidal (S-shaped) kinetics owing to cooperativity among substrate binding sites, as shown in Figure 2.6. Cooperative enzymes have multiple subunits and multiple active sites. Subunits and enzymes may exist in one of two states: a low-affinity tense state (T) or a high-affinity relaxed state (R). Binding of the substrate encourages the transition of other subunits from the T state to the R state, which increases the likelihood of substrate binding by these other subunits. Conversely, loss of substrate can encourage the transition from the R state to the T state, and promote dissociation of substrate from the remaining subunits. Think of cooperative enzyme kinetics like a party. As more people start arriving, the atmosphere becomes more relaxed and the party seems more appealing, but as people start going home the party dies down and more people are encouraged to leave so the tense hosts can clean up. Enzymes showing cooperative kinetics are often regulatory enzymes in pathways, like phosphofructokinase-1 in glycolysis. Cooperative enzymes are also subject to activation and inhibition, both competitively and through allosteric sites.

Figura 2.6. Cooperative Enzyme Kinetics

MCAT EXPERTISE

This cooperative binding of hemoglobin, which acts as a transport protein rather than an enzyme, results in a characteristic sigmoidal binding curve that is an MCAT favorite.

MCAT Concept Check 2.3:

Antes de continuar, evalúe su comprensión del material con estas preguntas.

1. What are the effects of increasing [S] on enzyme kinetics? What about increasing [E]?

2. How are the Michaelis–Menten and Lineweaver–Burk plots similar? ¿En qué se diferencian?

3. What does Kmetro represent? What would an increase in Kmetro signify?

4. What do the X- y y-intercepts in a Lineweaver–Burk plot represent?


The Effect of Concentration, Ph and Temperature on Enzyme Activity Essay Example

Many important processes in the body involve the work of enzymes, including the digestion of nutrients such as carbohydrates, proteins and fats (Raven 45). Enzymes are also organic catalysts. A catalyst is a chemical that controls the rate of a reaction, but is itself not used up in the process. Reactions that are accelerated due to the presence of enzymes are known as enzyme-catalyzed reactions (Raven 112). The substrate is the reactant within the reaction that fits with the enzyme. Once the substrate enters the enzyme’s active site, the enzyme’s shape changes to form an enzyme-substrate complex.

The substrate is then metabolized or broken down, resulting in a product, which can be utilized to energize cells. Once the product is released from the active site, the enzyme returns to its original shape (Raven 117). The three factors that can affect the activity of an enzyme include temperature, pH, and concentration. The temperature effects enzyme activity. As the temperature increases, enzyme stability decreases. Therefore there are more collisions of the substrate with the active site and the formation of activated complex’s and product (Raven 52). The rate of reaction is increasing.

The optimal temperature is the highest rate of reaction. Greater temperature raises the kinetic energy of the enzyme atoms, resulting in the breakdown of bonds, and an alteration of shape of the active site. Most enzymes present in living tissue have their secondary protein structure denatured, at the temperature 40°C or above (Raven 53). Effects of enzyme concentration on enzyme activity were evident with the level of substrate concentration increased, so did enzyme activity. Conversely, this activity had a stop point where activity ceased suddenly (Raven 114).

Without enzymes, reactions may take place very slowly, but with enzymes the rate was directly proportional to the amount of enzyme that was present. Cells control the production of these enzymes, and if the breakdown of these enzymes exceeds synthesis, the rate slows down. But, if the synthesis exceeds the breakdown, the reaction rate increases (Silverthorn 91). Low substrate concentration is the least productive (Silverthorn 98). In the effects of pH on enzyme activity, the way a protein folds can be changed in the presence of various.

The pH also affects the rate of reaction of an enzyme catalyzed reaction at about or below the optimal pH the rate decreases (Raven 116). The change in rate is because bonds are made and broken, which changes the shape of the active site and therefore decreases the rate of reaction. As the substrate concentration is increased, the rate of reaction increases. Further increases in substrate also increase the rate, but proportionately the rate is constant (Raven 117). Enzyme activity can be changed by enzyme concentration, pH, and temperature changes. Materials and Methods There are three parts to test concentration, pH, and temperature.

To begin, concentration is tested by collecting five test tubes and labeling each one 1-5 and placing them in a test tube rack. Next, a beaker is filled half way full of water and placed on a hotplate until it begins to boil. Afterward, different solutions are filled in each test tube: Test Tube 1: 2 ml of 1% sucrose and then add 2ml of pH buffer 4. 4. Test Tube 2: 2 ml of 1% sucrose and then add 2 ml of pH buffer 4. 4. Test Tube 3: 2 ml of 1% sucrose and then add 2 ml of pH buffer 4. 4. Test Tube 4: 2 ml of 1% sucrose and then add 2 ml of pH buffer 4. 4. Test Tube 5: 2 ml of 1% sucrose and then add 2 ml of pH buffer 4.

Consequently, predetermined amounts of enzyme and distilled water are added to each tube at room temperature: Test Tube 1: 0 ml sucrase and then add 3ml of water. Test Tube 2: 0. 5 ml sucrase and then add 2. 5 ml of water. Test Tube 3: 1 ml of sucrase and then add 2 ml of water. Test Tube 4: 1. 5 ml of 1% sucrase and then add 1. 5ml of water. Test Tube 5: 3 ml of sucrase and 0 ml of water. Each test tube is allowed to sit for five minutes. This stage is imperative to allow the sucrose to act upon the sucrose. Afterwards, 3 mL of Benedict’s reagent is added to each tube.

Each tube is placed in the boiling water for three minutes, and each tube is observed for color changes which are compared to the provided Benedict’s test for simple sugars, with results recorded. The second part of the experiment was targeted to determine the effects of temperature on the rate of enzyme activity. Four test tubes are labeled 1A-4A along with four additional tubes labeled 1B-4B. A beaker is filled ? full with water and brought to a boil. Test tubes 1A-4A is filled with 2 mL of both sucrose and a pH buffer. These four tubes are placed in the boiling water for fifteen minutes. Test Tube 1A: 0 C

Test Tube 2A: 30 C Test Tube 3A: 30 C Test Tube 4A: 100 C Measure and fill test tubes 1B-4B with 3 mL of enzyme. Test tube 1B-4B placed to water for 15 minutes. Test Tube 1B: 0 C Test Tube 2B: 30 C Test Tube 3B: 30 C Test Tube 4B: 100 C Put enzyme from B tubes into A tubes after fifteen minutes and place back into water for 5 minutes. Remove each tube from the water and add 3 mL of Benedict’s solution to each tube. Return each tube back into water and boil for 3 minutes. Results calculated and recorded. Lastly, part three of this experiment strives to understand the effects of pH on the rate of enzyme activity.


Pregunta: Describe The Definitions Of Substrate, Enzyme Active Site And Its General Characteristics, And Apoand Holo-enzymes. · Describe The Fact That Enzyme Catalysis Is Specific In Terms Of The Type Of Reaction And The Exact Substrate Structure. · Explain The Difference In The “lock-and-key’ Model And The Induced Fit Model Of Enzyme Substrate Interaction. .

· describe that reaction rate constant thus reaction rate is dependent on the activation energy.

· describe the relationship between the energy of the transition state and the activation energy.

· describe the relative binding affinity of a substrate and its transition state to the enzyme.

· Explain how enzymes speed up reaction rate, i.e., how do enzymes lower the activation

energía. Note: Factors other than preferential stabilization of transition state also contribute to increased

reaction rate. They include 1) enzymes placing one substrate (reactant) next to the other substrate (reactant)

so that the reaction is no longer dependent on the collision rate of the two substrates 2) enzymes sequester the

substrate(s), minimizing solvent competition thus speeding up the reaction 3) in enzyme complexes with each

enzyme catalyzing one step in a multi-step reaction sequence, the product of one reaction is fed to the active site

of another enzyme for the next step without the product diffusing away from the enzyme complex thereby

· describe the Michaelis-Menten equation relating the initial velocity to total substrate

· describe the assumptions that went into the derivation of the Michaelis-Menten equation. ([E]

is constant, steady state assumption, etc)

· describe the relationship between Vmax and kcat and the fact that kcat is a constant for a given

enzyme and substrate at a given temperature and solution condition whereas Vmax can differ

for a given enzyme and substrate at a given temperature and solution condition, depending

on the enzyme concentration.

· describe the definition of Kd (equilibrium dissociation constant for ES into E and S).

· describe the relationship between Kd and the affinity of substrate for the enzyme, i.e., the

higher the Kd, the weaker the binding between E and S.

· describe the relationship between Kd and Km, i.e., in general, the higher the Kd, the higher theKm.

· Use the Michaelis-Menten equation and the relationship between Vmax and kcat to do

· describe the other names for the catalytic rate constant, kcat (i.e., the turn over number also

called krelease) and why it is so called (kcat reports on per unit time per enzyme molecule the

number of product molecules formed/released, thus the name turnover number or krelease).

· Determine Vmax and Km using both the Michaelis-Menten plot (initial velocity versus [S]) and

the Lineweaver-Burk Plot (the double reciprocal plot), given the data of initial velocity and

· Draw the Michaelis-Menten plot AND the double reciprocal plot (Lineweaver Burk), given

· describe the fact that the term kcat/Km is the best parameter for measuring the catalytic

capability (efficiency) of an enzyme.

· describe the existence of irreversible enzyme inhibition and the general mechanisms of

· describe the different types of reversible inhibitions, namely the competitive, uncompetitive,

and mixed inhibitions (noncompetitive inhibition is a special case in which the inhibitor

binds E and ES with equal affinity therefore α is equal to α’ – Km is not affected).

· Describe each type of inhibition in terms of inhibitor binding site (active site or other than

the active site), how the inhibitor affects vmax and Km and the quantitative relationship of

each parameter with and without the inhibitor present and their relationship with [I] and KI

· Show the characteristics of each type of inhibition on a Michaelis-Menten plot (initial

velocity versus total substrate concentration), i.e. draw the curves with and without the

· Show the characteristics of each type of inhibition on a double reciprocal plot (LineweaverBurk

Plot) by drawing the lines with and without the competitive inhibitor.

· Given the Michaelis-Menten or double reciprocal plot with and without the inhibitor,

determine the type of inhibitor.

· describe the fact that transition state analogs are potent inhibitors.

· Explain why transition state analogs are potent inhibitors.

· describe that not all enzymes obey Michaelis-Menten kinetics.

· describe situations when an enzyme will not obey Michaelis-Menten kinetics (when the enzyme

catalyzes reactions with multiple substrates or when the enzyme is allosteric, i.e. binding of

the substrate at one active site affects the other active site(s) for the same substrate).

· Name the four types of catalytic mechanisms. (electrostatic catalysis, general/specific acid

base catalysis, metal ion catalysis, covalent catalysis)

· Contrast acid/base catalysis to general acid/base catalysis, i.e., comment on their similarity

· Name the eight common general acid/base pairs in proteins and write the formula of the

acid and base form for each pair (hint: consider the eight amino acids that have ionizable

· describe the meaning of covalent catalysis.

· describe the reaction catalyzed by chymotrypsin and the three catalytic residues in

· Draw the interactions among the three catalytic residues (catalytic triad).

· State the catalytic role of each of the catalytic residues and how they accomplish that.

· describe the steps in the formation of the acyl-enzyme intermediate, and the substrate and

products in this first part of the chymotrypsin mechanism.

· Draw the transition state structure for the formation of the acyl-enzyme intermediate and

indicate by drawing how it is preferentially stabilized.

· describe the steps in the regeneration of chymotrypsin (deacylation), the substrates and

product of this second part of the chymotrypsin mechanism.

· Draw the transition state for deacylation and explain how it is preferentially bound to or

· Explain what general acid and base catalysis refers to and what groups act as the general acid

and base in the chymotrypsin mechanism.

· Explain what covalent catalysis refers to in the chymotrypsin mechanism.

· Explain the basis for the substrate specificity of chymotrypsin (consider the composition of

the active site – chymotrypsin specifically cleaves peptide bonds adjacent to aromatic

· Explain the term “serine protease”. Answer: these are proteases (enzymes that

hydrolyze peptide bonds) that have serine as a catalytic residue (that acts as a

nucleophile, which can attack the carbonyl carbon of the peptide bond).

· Key features of Hexokinase, enolase and lysozyme mechanisms that were discussed in class

(specific methods of catalysis utilized by these enzymes general description of overall

· describe the four regulatory strategies of enzyme catalysis

· describe the definition of feedback inhibition (mechanism of cellular regulation that regards an

enzyme that catalyzes the production of a given substance that then inhibits the cell when

concentration of that substance has reached an appropriate level – this balances/regulates

amount of product provided with amount needed)

· describe the most common type of covalent modification and the types of enzymes

responsible for the addition and removal of the chemical group in this covalent

· Explain the general mechanism of phosphorylation in regulating enzyme activity.

· describe the general naming scheme for active and inactive proteases.

· describe that protease inhibitors exist to inhibit protease.

· describe that enzymes are regulated through covalent and non-covalent processes.

o Describe noncovalent modification in general terms. Elaborate on the relation

among enzyme activity, allostery, effector molecules (small molecules) and control

o Concerning allosteric regulation, some enzymes have multiple active sites for the

same substrate and the binding of the substrate increases the activity of the enzyme

by stabilizing the R (more active) state over the T (relatively inactive) state. (Lecture

13: “Noncovalent Modification: Allosteric Regulators”)

ß Draw a curve for the initial reaction velocity versus substrate concentration.

ß describe and explain the specific shape of the v0 vs. [S] plot.

ß Draw on the same graph above a v0 vs. [S] curve for the enzyme in the

absence of allostery. and how th i.e., in the absence of conformational change

upon substrate binding. Comment on the shape of this curve.

ß Comment on the benefit of allosteric activation.

ß When an inhibitor is present for such an allosteric enzyme, the v0 versus [S]

plot will shift. Draw a v0 vs. [S] curve with and without the inhibitor.

ß When an activator is present for such an allosteric enzyme, the v0 versus [S]

plot will shift. Draw a v0 vs. [S] curve with and without the inhibitor.

ß When an activator is present for such an allosteric enzyme, the v0 versus.

ß describe the relationship between feedback inhibition and allosteric regulation

and the reason behind the term “feedback inhibition”.

o describe the most common covalent modification, the enzymes that catalyze the

modification and the removal of that modification, respectively and the amino acid

residues that tend to be the site of this modification.

o Write the structure of the added group bonded to those residues and the reaction for

this covalent modification.

o Rationalize the effectiveness of phosphorylation on altering the activity of an

o describe the mechanism of chymotrypsinogen activation to chymotrypsin (cleavage of


Relative concentration of enzyme vs reaction product - Biology

The Discussion should be written after the Results section so that you have a good idea of what the experiment has demonstrated. The discussion section should definitely have a statement of your expected findings. (Pechenik, 86) This should include your hypothesis and a brief statement about why these types of results are expected. There should also be a comparison of how your actual results related to your expected findings. (Pechenik, 86) Here, you should state whether or not your results supported or didn't support your hypothesis. In addition, the degree to which the evidence supported your hypothesis should be stated. For example, were the results completely supportive, or were there variances?

There should be an explanation of unexpected results. (Pechenik, 86) When looking for possible explanations, consider the following:

una. Was the equipment used adequate for the task? B. Was the experimental design valid? C. Were the working assumptions made correct?

A common mistake that many writers make is to blame themselves for the unexpected results. Unless you actually made a mistake following the methods of the experiment, and could not go back and correct it, do not make up such errors to explain the variances you observe. Think about and analyze the methods and equipment you used. Could something different have been done to obtain better results? Another possibility to consider is if the experiment was conducted under factors that were considerably different from those described in the manual. Be sure to include ideas on how to test these explanations. (Pechenik, p.86) Briefly explain a way to test these possible reasons for unexpected results. For example, if there is a problem with the methods, maybe the experiment should be reproduced with an added step. Also mention what kinds of experiments still need to be conducted in order to obtain more information.

Sample 1 : The results of the first experiment supported the hypothesis that the rate of conversion of the substrate would increase with increased amounts of enzyme. We observed that Tube 2, which had the highest concentration of enzyme, catecholase, also had the highest absorbance level. Since absorbance is used as a measure of reaction, the greatest rate of conversion of catechol and oxygen to benzoquinone was seen in Tube 2. The high ratio of enzyme to substrate caused the absorbance to grow rapidly and then level off (see Figure 1). The tubes with lower concentrations of enzyme had lower rates of conversion, as expected. However, there were some unexpected results in Tube 2. Between the time of around 6 minutes to 8 minutes there was decrease in the absorbance. One explanation of this observation is that the settling of the substrate to the bottom of the test tube caused the enzyme to become less efficient since it could not attack the substrate as well. The settling reduced the surface area of the substrate that could be attacked by the enzyme. The tube was inverted and the substrate was stirred up, which caused a rise in the absorbance. Further experiments, involving the constant stirring of the solution, could be performed to test this possibility.

The folding and combination of polypeptide chains forms the specific, three dimensional shape of an enzyme. This shape is extremely important to the enzyme's catalyzing efficiency and many environmental conditions can affect the shape of enzymes and thus their efficiency. A range of pH values exists for all enzymes, between which they reach their maximum catalyzing action. This range is usually between a pH of 6-8. pH levels outside this range can denature the enzyme, thereby decreasing its catalyzing ability. The results we obtained supported this assumption for the catecholase enzyme. The catecholase samples in tubes 3 and 4 had similar absorbance rates and, therefore, similar enzyme activities. However, the pH of 4 in tube 2 corresponded to low absorbance and low activity of the enzyme in that tube. This is due to the fact that the acidic environment is harmful to the enzyme, and denatures it. Catecholase, an enzyme found in fruits in nature, is well adapted for efficiency in nature. Its range of optimal pH levels, 6-8, allows it to function in the varying pH levels of soil and those caused by acid rain.

Sample 2: Enzymes catalyze reactions by lowering the activation energy of the reaction. Catecholase, an enzyme found in potatoes, converts catechol to benzoquinone in the presence of oxygen. It would be expected that more benzoquinone would be formed in the presence of a greater amount of catecholase. This hypothesis was supported by the results obtained. The most enzyme was placed in tube 2. The absorbance was also highest for this tube. This means that the most product was formed in this test tube. In accordance with this, tube four, which had the least amount enzyme, also had the least amount of absorption. There were some unexpected results, but this is most probably due to human error the absorbance levels were probably read wrong.

Enzymes are affected by the environment. The pH level of the environment is one factor that can alter enzymes. The rate at which the enzyme form product is slowed or sped up depends on how close to the norm the environment is. In the second experiment, the pH of the medium was different in each of the test tubes. The general trend seen in these reactions was that the more acid added to the test tubes, the less product formed. The more acidic solution caused the enzyme to work less efficiently.

Results : This author does a good job of answering the questions that should be addressed in a discussion. For example, in the very first sentence he stated what he expected to find and also whether or not the results he obtained supported or failed to support his hypothesis. This is a good, strong way to start a discussion section. It starts off with the facts of the experiment and then later on, the author can move on to his opinions. (return to Sample 1)

Absorbance : A good discussion includes good ideas and also exact and detailed support of these ideas. In addition to starting off well, the author also goes on to explain the specific results of the experiment that support his hypothesis. This is what defines the strength of his discussion section. (return to Sample 1)

Explanation : After his explanation he presents the unexpected results and discusses possible reasons for this data. The author's explanation of possible reasons for unexpected results is good because it shows that he thought about the problems. He does not blame himself for the unexpected. Instead, he considers the methods used, presents a possible explanation, and then justifies his ideas. (return to Sample 1)

Catalyze : This author does a good job outlining his discussion, however he is lacking the specifics to make a good discussion. The first two sentences are better placed in the introduction. However, he does state his expectations and whether or not his results supported these expectation. He could have made this part better by stating this more authoritatively, for example: "It was expected," and not, "It would be expected that." (return to Sample 2)

Unexpected results : The biggest problem this author had was explaining the unexpected results. He blamed himself, saying he read the equipment wrong and passed off the unexpected results as human error. (return to Sample 2)

Enzymes : This author does not develop his argument enough. One example of this, is the affects harsh environmental factors have on enzymes. He could have stated how the acidity caused the enzymes to denature, thus creating less efficiency. (return to Sample 2)

All citations from Pechenik, Jan A. A short guide to writing about Biology. pp. 54-102, Tufts University: Harper Collins College Publishers . 1993.



Comentarios:

  1. Dimitur

    En lugar de la crítica, escriba las variantes.

  2. Victoro

    Perdón por interferir ... tengo una situación similar. Vamos a discutir.

  3. Lindberg

    una buena respuesta

  4. Kearne

    En lugar de criticar, escriba sus opciones.

  5. Bowyn

    Gracias por su información, ahora lo sé.

  6. Tora

    Es la buena idea. Lo guardo.



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