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¿Por qué la beta actina se usa comúnmente como control en las transferencias Western?

¿Por qué la beta actina se usa comúnmente como control en las transferencias Western?



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Se trata de la cuestión del western blot. El documento: http: //www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1931312813001145. En el experimento de western blot de este artículo, utilizan beta actina como control. Y también vi que otro trabajo de investigación también usaba beta actina como control. Entonces, ¿por qué se usa beta actina y no otro gen? ¿Es porque se expresa en diferentes tipos de células?


La β-actina pertenece a una clase de genes llamados genes domésticos. Sus proteínas suelen realizar funciones que se requieren en prácticamente todos los tipos de células (por ejemplo, la β-actina es parte de los microfilamentos del citoesqueleto) y son supuesto * que no se vea afectado por las condiciones experimentales. En Western blot, se ejecutan como un "control de carga" para mostrar que se cargaron cantidades muy similares de proteína en cada carril. Esto es absolutamente esencial en algunos sistemas experimentales donde puede que no sea posible recolectar siempre el mismo número exacto de células para cada muestra, como cuando se trabaja con células primarias, muestras de tejido o sistemas en los que puede estar alterando la síntesis de proteínas, el tamaño de las células / número, o apoptosis.

Hay muchos controles de carga diferentes para elegir, y algunos pueden estar dictados por el tipo de célula / tejido que está examinando; por ejemplo, al trabajar con células madre, es posible que desee demostrar que sus condiciones experimentales no indujeron la diferenciación en el células, por lo que se puede elegir un marcador de pluripotencia como Oct-4A o Sox2. En otros casos, es posible que esté examinando lisados ​​fraccionados (una preparación de membrana, solo los núcleos, las mitocondrias, solo la fracción soluble, etc.) y, por lo tanto, puede elegir Na / K ATPasa, Histona H3, COX IV o GAPDH, respectivamente.

La elección del control de carga también puede verse influida por el tamaño de las proteínas que está analizando, ya que los investigadores con frecuencia eliminan las transferencias Western y las vuelven a realizar con el control de carga, o ejecutan dos especies diferentes y detectan con diferentes colores. anticuerpos secundarios al realizar westerns fluorescentes. En cualquier caso, desea que su control de carga sea de un tamaño diferente al de sus objetivos originales.

Finalmente, todo esto supone que el investigador ya ha intentado cargar cantidades iguales de proteína total por carril utilizando cualquiera de una variedad de métodos para cuantificar la concentración de proteína. Estos incluyen ensayos de tipo Bradford, Lowry y BCA, que pueden o no ser compatibles con detergentes, teñir la membrana después de la transferencia con tintes como Ponceau S, SYPRO Ruby o tinta china, o teñir el gel con Coomassie u otro tipo Western patentado. tinciones compatibles.

*En realidad, algunos científicos son cada vez más conscientes de que muchos experimentos en realidad hacer afectan a varios genes "domésticos", pero cuando la mayoría ve variaciones, por ejemplo, por Western blot o qPCR, a menudo eligen un control de carga diferente para usar.


El control de la beta-actina asegura que el efecto que ve en la expresión de proteínas no se debe a un cambio general en la síntesis de proteínas.

Por ejemplo, si estudia alguna enfermedad, puede provocar cambios en el metabolismo, pérdida de peso, pérdida de la capacidad para sintetizar diferentes proteínas o absorber aminoácidos de la dieta. Tienes que controlar eso, y algo tan universal como la actina es una opción.


Los controles de carga se utilizan comúnmente en técnicas de electroforesis en gel, como la transferencia Western, para verificar que las líneas de gel se hayan cargado uniformemente con material de muestra, y normalmente se utilizan para estandarizar los resultados de estos estudios. Dado que las proteínas en los controles de carga se expresan abundantemente, también permiten a los investigadores determinar si hay una transferencia uniforme en todo el gel. Se requiere absolutamente un control de carga cuando se preparan transferencias Western para su publicación.

Origen: célula completa / citoplasmático
Peso molecular (kD): 43
La beta actina es una de las seis isoformas de actina. La actina es una proteína globular de aproximadamente 42 kDa que se encuentra en todas las células eucariotas (excepto en los espermatozoides de nematodos) donde puede estar presente en concentraciones superiores a 100 microM. También es una de las proteínas mejor conservadas, diferenciándose no más del 20% en especies tan diversas como las algas y los seres humanos. Es la subunidad monomérica de los microfilamentos, uno de los tres componentes principales del citoesqueleto, y de los filamentos delgados, que forman parte del aparato contráctil de las células musculares. Por lo tanto, la actina participa en muchas funciones celulares importantes, incluida la contracción muscular, la motilidad celular, la división celular y la citocinesis, el movimiento de vesículas y orgánulos, la señalización celular y el establecimiento y mantenimiento de las uniones celulares y la forma celular. Este control de carga no es adecuado para muestras de músculo esquelético. Los cambios en las condiciones de crecimiento celular y las interacciones con los componentes de la matriz extracelular pueden alterar la síntesis de la proteína actina (Farmer et al, 1983).


¿Qué son los genes domésticos?

Los genes de mantenimiento se denominan así porque expresan proteínas cuyas funciones son para el mantenimiento de funciones celulares básicas. Se cree que se expresan constitutivamente con pocas alteraciones en el patrón de expresión.

Los genes domésticos comunes que se utilizan para normalizar las transferencias de Western incluyen: gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GADPH), beta-actina, tubulina o proteína de choque térmico 90 (HSP90).

Parece que deberían ser buenos controles, pero hay algunas razones importantes por las que los genes domésticos pueden causarle problemas.


¿Cuáles son los controles de carga más utilizados para Western Blotting?

Los anticuerpos de control de carga son algunos de los anticuerpos más utilizados en la investigación. Los anticuerpos contra varios objetivos diferentes se utilizan comúnmente y no siempre es obvio cuál debe elegir. Proporcionamos una guía para algunos de los tipos de anticuerpos de control de carga más utilizados.

¿Por qué necesito un control de carga para Western Blot?

  • Los controles de carga son esenciales para que los Western Blots sean dignos de publicación. Le permiten comprobar que la carga de proteínas es la misma en todo el gel, el nivel de expresión del control de carga no debe variar entre las diferentes líneas de muestra.
  • Por ejemplo, se pueden utilizar para comprobar que se ha producido una transferencia uniforme del gel a la membrana a través de todo el gel.
  • Esto ayuda a proteger contra lo que se conoce como "efecto de borde", es decir, cuando se utilizan grandes cantidades de carriles, las proteínas de los carriles exteriores se transfieren a la membrana en una posición cercana al marco. Esto puede resultar en manchas más intensas en los bordes que en el medio del gel. Los controles de carga pueden mostrar si esto ha ocurrido y permiten tener en cuenta esta variación.
  • Una vez que haya establecido que no hay grandes diferencias en los niveles de proteína, los controles de carga se pueden usar para normalizar pequeñas variaciones de niveles. Se pueden usar para cuantificar las cantidades de proteína en cada carril y normalizar los niveles de expresión de su proteína de interés para el control de carga.

¿Qué buscar en un control de carga?

¿Qué hace que un buen control de carga se pregunte? Debe buscar proteínas que exhiban un alto nivel de expresión constitutiva en el tipo de célula que está examinando, ya que esto significa que tendrá altos niveles de expresión constantes. Por esta razón, los genes "domésticos" se eligen con frecuencia como controles de carga. En segundo lugar, su proteína de control de carga debe tener un peso molecular diferente al de la proteína de interés, esto asegura que las bandas sean distintas y los niveles de expresión de su proteína sean cuantificables.

Entonces, para ayudarlo, pensamos en describir nuestros nueve controles de carga principales y brindarle enlaces a las búsquedas de estos controles de carga aquí en CiteAb para asegurarnos de que encuentre el mejor.

Proteínas citoplasmáticas y de células completas

Adecuado para & # 8211 extractos de células enteras y citoplasma

No apto para & # 8211 muestras de músculo esquelético

Breve descripción & # 8211 La actina se presenta en tres formas principales diferentes. La alfa-actina es un componente importante del aparato contráctil del músculo esquelético. Las actinas beta y gamma están presentes en la mayoría de los tipos de células, donde son responsables del tráfico, la motilidad y la estructura de las células.

La actina se encuentra en todas las células eucariotas excepto en los espermatozoides de los nematodos. Sus gametos masculinos no pueden nadar, sino que hacen movimientos amebianos para moverse hacia el huevo. Inusualmente, no usan actina para esto, que es la proteína más común utilizada para realizar movimientos amebianos en las células, usan la proteína MSP.

Adecuado para & # 8211 extractos de células enteras y citoplasma

Breve descripción & # 8211 Sirve para descomponer las moléculas de glucosa y carbono actuando como catalizador durante el sexto paso de la glucólisis. Se encuentra en la mayoría de los tipos de tejidos y células, aunque la expresión puede diferir entre tejidos.

La hipnoxia, la diabetes y algunos tipos de cáncer pueden aumentar la expresión de GAPDH.

Adecuado para & # 8211 extractos de células enteras y citoplasma

Peso molecular & # 8211 50 & # 8211 55kD

Breve descripción & # 8211 El componente principal de los microtúbulos, la tubulina, se expresa de forma elevada y constante en todas las especies. Los microtúbulos participan en el mantenimiento de la forma celular y la posición de los orgánulos. También son importantes en la división celular, incluida la formación de husos mitóticos.

Los fármacos antimicrobianos y antimitóticos pueden afectar la expresión de tubulina.

Proteínas mitocondriales

Adecuado para & # 8211 proteínas mitocondriales

Breve descripción & # 8211 La proteína 1 del canal selectivo de aniones dependiente del voltaje también se denomina porina 31 HL / HM o porina plasmalemmal. Expresadas en los tejidos y conservadas en todas las especies, las VDAC1 son proteínas de barril beta que atraviesan la membrana celular y actúan como un poro a través del cual las moléculas pueden difundirse.

Adecuado para & # 8211 proteínas mitocondriales

Breve descripción & # 8211 El anticuerpo COX IV (dicho "Cox 4") es reactivo con la proteína COX IV, generalmente expresada en un nivel alto constante, este anticuerpo hace un control de carga eficaz para las mitocondrias. Sin embargo, tenga en cuenta que muchas proteínas tienen el mismo peso molecular que la COX IV, VDAC1 constituye un buen control de carga mitocondrial alternativo para proteínas de este tamaño.

Proteínas de la envoltura nuclear

Adecuado para & # 8211 proteínas de envoltura nuclear

Breve descripción & # 8211 La familia de proteínas de las láminas forma la lámina nuclear, una matriz bidimensional de proteínas que se encuentra junto a la membrana nuclear interna. Altamente conservadas en todas las especies, se cree que las proteínas laminares están involucradas en la estabilidad nuclear, la estructura de la cromatina y la expresión génica. Este control de carga no es adecuado para experimentos en los que se ha eliminado la envoltura nuclear.

Adecuado para & # 8211 proteínas nucleares

Breve descripción & # 8211 La proteína de unión TATA, (TBP) es un factor de transcripción que se une específicamente a la caja TATA, una secuencia de ADN que se encuentra en la región promotora de los genes arqueales y eucariotas. Ayuda a colocar la ARN polimerasa II sobre el sitio de transcripción al comienzo del gen, pero solo se encuentra en el 10-20% de los promotores humanos que tienen cajas TATA, por lo que probablemente no sea la única proteína involucrada en el posicionamiento de la ARN polimerasa II.

Adecuado para & # 8211 proteínas nucleares

Breve descripción & # 8211 Una histona básica involucrada en la estructura del nucleosoma de la cromatina en eucariotas, Histone H2B tiene un dominio globular principal y una cola N terminal larga.

Adecuado para & # 8211 proteínas nucleares

Breve descripción & # 8211 Una proteína altamente conservada, PCNA ayuda a aumentar la procesividad de la síntesis de la cadena principal durante la replicación del ADN. El PCNA se degrada rápidamente cuando se activan las vías de daño del ADN.

Entonces, eso es todo de nuestra parte & # 8211 por favor deje un comentario si hay algún control de carga que recomiende encarecidamente.


RESULTADOS

Validación de PCR competitivo

La valoración de cada competidor de genes de mantenimiento contra alícuotas constantes de ADNc de células de fluido BAL en experimentos de proporción cambiante mostró que, en cada caso, las proporciones seguían la línea predicha para las proporciones de salida mayores de aproximadamente 0,1 (figura 1). De manera similar, la titulación en serie del ARNc pAW109 del competidor de IL-2 contra ARN de PBMC estimulado por PHA seguido de RT-PCR posterior produjo relaciones de salida que cambiaron en proporción a las relaciones de entrada. Por tanto, los productos de PCR de GAPDH, β-actina e IL-2 compitieron por igual con sus respectivos moldes competidores, lo que permitió calcular las copias de entrada de ARNm.

Prueba de igual eficiencia de amplificación de la PCR competitiva por titulación del competidor. (A) PÁGINA de la RT-PCR competitiva de IL-2 de la serie de relaciones de entrada cambiantes con una cantidad creciente de competidor de izquierda a derecha. (B) - (D) Las proporciones de producción nativa / competidor de cada serie se grafican contra las proporciones de entrada relativas a una o dos proporciones de salida más cercanas a 1. Los datos reales se encuentran cerca de la línea de predicción donde las proporciones de producción son iguales a las proporciones de entrada. La línea de predicción está indicada por una línea discontinua con una pendiente de 1. (B) Se realizaron RT-PCR de IL-2 duplicadas durante 35 y 40 ciclos. Las valoraciones de β-actina (C) y GAPDH (D) se replicaron (objetos abiertos y cerrados) a 40 ciclos.

Expresión de genes GAPDH y β-actina

Los niveles de ARNm de GAPDH y β-actina se correlacionaron significativamente en ambos tejidos de biopsia (r 2 = 0,48, n = 85, p = 0,0001) y células de líquido BAL (r 2 = 0,51, n = 97, p = 0,0001 fig. 2A y B). Los coeficientes de correlación indican que solo la mitad de la variabilidad de uno se explica por el otro, lo que sugiere que en la resolución de esta metodología los niveles de ARNm de GAPDH y β-actina no son equivalentes. Además, la expresión del gen GAPDH fue más variable en las muestras de biopsia y fue aproximadamente cinco veces menor en las células del líquido BAL que la expresión de la β-actina.

Correlaciones de Pearson entre la expresión génica de GAPDH y β-actina en el ARN de (A) células de líquido BAL y (B) tejido de biopsia.

Comparaciones transversales de expresión génica

Se comparó la expresión génica de β-actina y GAPDH con respecto al estado atópico, estado asmático y uso de CSI. La expresión del gen GAPDH en muestras de biopsia de sujetos asmáticos que no usaban ICS (media de mínimos cuadrados (EE) 8,1 (1,3) × 105 copias de ARNm / μg de ARN) fue significativamente menor que en las muestras de biopsia de controles normales (1,1 (0,1) × 10 7 copias de ARNm / μg ARN, mediana de la diferencia 1.0 × 10 7, intervalo de confianza (IC) del 95% 0,68 a 1,4 × 10 7, p = 0,0001) y de sujetos asmáticos que utilizan ICS (1,2 (0,2) × 10 7 copias de ARNm / μg ARN , diferencia de la mediana 1,1 × 10 7, IC del 95%: 0,71 a 1,5 × 10 7, p = 0,0001, figura 3A). Los sujetos asmáticos como grupo, tanto si tomaban CSI como si no, eran significativamente diferentes de los controles (7,1 (1,9) × 10 6 copias de ARNm / μg de ARN, mediana de diferencia 3,9 × 10 6, IC del 95%: 1,9 a 5,9 × 10 6, p = 0,0003). Los niveles de células BAL de β-actina y ARNm de GAPDH mostraron diferencias similares entre los grupos que los niveles de ARNm de GAPDH de biopsia, con los valores p correspondientes (fig. 3B y D). Estas diferencias en la expresión génica contrastan con el perfil de los tipos de células en el líquido BAL, que no difirió significativamente entre los grupos de pacientes (tabla 2).

Perfiles de los principales tipos de células en muestras de células de líquido BAL *

Comparaciones transversales de la expresión génica de GAPDH y β-actina. Expresión del gen GAPDH en (A) tejido de biopsia y (B) células de líquido BAL. Niveles de ARNm de β-actina en (C) tejido de biopsia y (D) células de líquido BAL. Los niveles de ARNm en tejido de biopsia se han corregido por contaminación con secuencias de pseudogenes. Las pequeñas diferencias entre el número de puntos de datos en las figuras y el número de muestras en la tabla 1 se deben al pequeño porcentaje de reacciones fallidas esperadas. Las reacciones fallidas no se repitieron para reducir el potencial de sesgo sistemático.

La expresión de ARNm de β-actina en tejido de biopsia difería en que los asmáticos que tomaban ICS eran similares a los que no tomaban ICS (p = 0,26, figura 3C). Sin embargo, al igual que las otras comparaciones, los controles normales (1,5 (0,1) × 10 7 copias de ARNm / μg de ARN) tenían niveles más altos de ARNm de β-actina que los sujetos asmáticos que no tomaban ICS (8,1 (1,4) × 10 6 copias de ARNm / μg ARN, mediana de diferencia 6,9 × 10 6, IC del 95% 3,4 a 10 × 10 6, p = 0,001) y niveles más altos que todos los asmáticos (9,3 (1,5) × 10 6 copias de ARNm / μg de ARN, mediana de diferencia 5,7 × 10 6, IC del 95%: 1,4 a 10 × 10 6, p = 0,013).

Efecto de usar genes domésticos como denominadores

Para demostrar el efecto de usar β-actina y GAPDH como denominadores de expresión de ARNm para genes de interés, se realizó una PCR competitiva con IL-2 en ARN de células BAL usando la misma reacción de ADNc que para β-actina y GAPDH. Los niveles de ARNm de IL-2 en las células BAL no difirieron entre los controles normales (4,6 (0,9) × 104 copias / μg de ARN), los asmáticos que no usaban ICS (4,8 (1,2) × 104 copias / μg de ARN) y los asmáticos que tomaban ICS (3,0 (0,7) x 104 copias / μg de ARN, figura 4). Sin embargo, cuando los niveles de ARNm de IL-2 se expresaron como una proporción con β-actina, hubo diferencias significativas, y los asmáticos que no usaron ICS tuvieron una proporción más alta (1.2 (0.4) × 10-3) que los controles normales (6.2 (1.8) × 10–4, diferencia de la mediana 9,24 × 10 –4, IC del 95%: 0,95 a 21,0 × 10 –4, p = 0,03) y asmáticos que utilizan CSI (4,5 (0,9) × 10 –4, diferencia de la mediana 1,1 × 10 –3, 95 % IC 0,3 a 2,1 × 10 –3, p = 0,003). Por tanto, las diferencias aparentes en las proporciones de IL-2 / β-actina se confunden por las diferencias en los niveles de ARNm de β-actina entre los grupos (figura 4).

Efecto del uso de β-actina como denominador de los niveles de ARNm de células líquidas de IL-2 BAL. Para comparar los niveles de ARNm de IL-2 y β-actina y sus proporciones, las medias de los mínimos cuadrados de los grupos de sujetos se presentan como porcentajes de la media de los mínimos cuadrados de los controles normales respectivos. Las barras de error se dan como porcentaje SE. * Se observaron diferencias significativas para la β-actina (como en la figura 3D), y las proporciones IL-2 / β-actina en sujetos asmáticos que no usan corticosteroides inhalados (ICS) son significativamente diferentes de los controles normales (p = 0.03) y los sujetos asmáticos que usan ICS (p = 0,003).


Dos bandas de actina? - (22 / Feb / 2008)

Me gustaría saber si es normal tener dos bandas de actina. He probado con 2 anticuerpos. Había probado en cultivos primarios de astrocitos y muestras de conducto deferente de rata y obtuve solo una banda con un anticuerpo (que no es mío) pero con mi anticuerpo obtuve dos bandas para astrocitos y una para conducto deferente de rata. Las dos bandas son tan similares en forma e intensidad y tan cerca en peso molecular que parecen ser 2 isoformas de la proteína, sin embargo, nunca había visto eso en los artículos. No pueden ser muestras danificadas porque yo había analizado las mismas muestras con los dos anticuerpos y los resultados fueron los descritos. Y no parece ser una banda no específica, porque cuando diluyo la primaria, ambas bandas desaparecen. hay alguien ahí que pueda ayudarme?
Gracias.

¿Ambos anticuerpos reconocen la misma isoforma de actina? Normalmente utilizo beta actina como control de carga para las transferencias Western.

Bueno, en ambas hojas de datos dice que los anticuerpos reconocen una amplia gama de isoformas, pero no especifica qué isoformas. De hecho, ambos son anticuerpos policlonales, pero las transferencias presentes en las hojas de datos muestran solo una banda para ambos. Estaba convencido de que este tipo de técnica no permitía distinguir las isoformas (estoy ejecutando un gel de poliacrilamida al 12%) y sería necesario ejecutar una PÁGINA 2D (IEF + Página SDS).

Bueno, en ambas hojas de datos dice que los anticuerpos reconocen una amplia gama de isoformas, pero no especifica qué isoformas. De hecho, ambos son anticuerpos policlonales, pero las transferencias presentes en las hojas de datos muestran solo una banda para ambos. Estaba convencido de que este tipo de técnica no permitía distinguir las isoformas (estoy ejecutando un gel de poliacrilamida al 12%) y sería necesario ejecutar una PÁGINA 2D (IEF + Página SDS).

Los anticuerpos policlonales pueden ser notorios por unirse a proteínas no relacionadas. Si hay un anticuerpo monoclonal que pueda conseguir, debería ayudar. Tengo un conejo policlonal anti HIF-1a que se une a los marcadores Igg & # 39s, así como al marcador de escalera de 50kda pre-teñido de Fisher. Entonces, no importa lo que haga, obtengo bandas no específicas en lugares que sé que no debería haber rastros de HIF-1a, y es más que este anticuerpo policlonal de conejo tiene una alta afinidad con algunos igg y BSA. Entonces, si bloqueo la membrana con BSA en lugar de leche, obtengo una mancha negra ya que el primario se adhiere a todo.


¿Los Western blots son & # 39semi & # 39 cuantitativos? - (29 / Nov / 2011)

¿Qué significa el "SEMI" cuantitativo? que no cuantifica completamente las proteínas?

Con los softwares para analizar las intensidades y los volúmenes de las bandas, ¿sería totalmente cuantitativo?

¿Qué tan común es usar westerns para cuantificar la expresión de proteínas?

Significa que necesita una curva estándar con cantidades conocidas para comparar sus incógnitas con algo. Por eso es semicuantitativo. En los métodos cuantitativos se mide o cuantifica una cantidad directamente, p. Ej. Pesar o medir el tiempo. Ningún software puede ayudarte. Es lo que es.
Es bastante común usar western para cuantificar la expresión de proteínas siempre que conozca las deficiencias.

BioMiha el martes 29 de noviembre 18:37:25 2011 dijo:

¿Necesitaría siempre una 'curva estándar' para el análisis de WB? ¿O simplemente puede usar suficiente control apropiado: proporción de proteína de mantenimiento y control internalizado? El software que utilizo mide el volumen / intensidad de la banda.

Hola, las respuestas anteriores son para conocer la concentración de proteína frente a la intensidad de la banda, y probablemente sea mejor que tenga una curva estándar, pero en otros casos como tasa de fosforilación de proteínas, que imagino que es su campo, por otra de sus preguntas en el foro, aquí comparamos la intensidad de la banda de proteína fosforilada con la banda desfosforilada y viendo de esta manera la tasa de inhibición de cualquier molécula, para mayor precisión, podría relacionar esto con la banda de actina como control de carga, pero no es necesario, para mí. , si la cantidad de proteína cargada es similar

Puede intentarlo, pero encontrará que los resultados son muy variables. Debe poder cargar la misma cantidad de proteína total en cada carril, transferirlo todo de manera uniforme y luego obtener exposiciones agradables que no estén sobreexpuestas o subexpuestas de manera constante para cada membrana que ejecute. He descubierto que es casi imposible obtener exactamente los mismos (o incluso similares) resultados para los mismos lisados ​​ejecutados al mismo tiempo en diferentes geles, transferidos al mismo tiempo en el mismo aparato de transferencia y probados en las mismas soluciones. con todas las condiciones idénticas.

bob1 el martes 6 de diciembre a las 03:11:06 2011 dijo:

¿Qué pasa con el uso de un gen doméstico como control? P.ej. actina, tubulina, GAPDH.

También me dijeron que ejecutara carriles de control que son comunes a todas las membranas (por ejemplo, usar un control positivo) para controlar cualquier diferencia de manejo entre los geles.

Mi otra pregunta es: al ejecutar múltiples cámaras de transferencia, ¿cuál es la configuración a tener en cuenta (es decir, corriente constante o voltaje constante?)?

Pruébelo y vea: mi experiencia personal (10 años) es que no funciona entre geles, no importa lo bueno que sea en los westerns, incluso con las amas de llaves, a menos que pueda descontar las variaciones en las transferencias, exposiciones, pasos de anticuerpos, lavados etc.

bob1 el viernes 9 de diciembre 02:42:38 2011 dijo:

Gracias por el consejo, bob1 & # 33 10ish años haciendo western blots te convierte en un profesional & # 33

Entonces, ¿no usaría westerns para cuantificar la proteína, sino simplemente usarla como un indicador cualitativo si la expresión de la proteína está regulada hacia arriba o hacia abajo en función de la intensidad de la banda? Entonces, digamos que si tengo n = 10, ¿ejecutaría n = 1 como una "mancha representativa"? o ejecutar todo n = 10?

Sí, cualitativo es lo que yo llamaría. Definitivamente funciona para tendencias generales, pero no obtendrá concentraciones absolutas, simplemente hay demasiadas variables con las que trabajar. Supongo que podría funcionar si pudieras agregar cantidades conocidas de una determinada proteína al gel y comparar, como lo harías con la qPCR.

bob1 el viernes 9 de diciembre 23:29:15 2011 dijo:

Algo parecido a una curva estándar con, por ejemplo, BSA.

El único método para cuantificar la expresión de proteínas que se me ocurre es ELISA. Definitivamente será completamente cuantitativo. Los biólogos celulares dudan en utilizar la citometría de flujo porque la condición de las células es algo diferente cuando se analizan (en suspensión). La inmunotinción también es cualitativa (a menos que tenga un buen software para contar las células teñidas frente a las no teñidas). Sin embargo, si ambas células están teñidas, no crea que pueda distinguir la intensidad de la tinción (expresión excesiva / insuficiente) entre ellas.


Concentración de antígeno

La resolución de SDS-PAGE está limitada a 50-100 bandas. Si la concentración relativa del antígeno de interés es demasiado baja (menos del 0,2% de la proteína total), puede ser difícil de detectar (por ejemplo, sinaptobrevina / VAMP comigra con histonas en homogeneizados de células que interfieren con su detección). La mejora de la señal puede dar lugar a la aparición de bandas artificiales. Debe considerarse el enriquecimiento del antígeno mediante fraccionamiento o inmunoprecipitación.

Por otro lado, demasiada abundancia de antígeno o demasiado anticuerpo primario puede producir una señal demasiado robusta.


Tinción de actina y tubulina & # 8211 de WB a Live Cell Imaging

Fig. 1: Imágenes de inmunofluorescencia de células Swiss 3T3 de ratón teñidas con anticuerpo anti-actina (027AAN01).

La actina y la tubulina, como las principales estructuras del citoesqueleto, son componentes cruciales de una plétora de procesos en biología celular. Ambos están muy involucrados en la estabilización de la forma celular, y especialmente en los movimientos celulares (por ejemplo, la migración celular) y los movimientos intracelulares y los mecanismos de transporte.

Por lo tanto, visualizar actina y tubulina en células fijas o vivas y detectarlas en muestras biológicas (por ejemplo, en Western Blots) pertenece a las configuraciones experimentales básicas en biología celular.

Hay una amplia gama de herramientas disponible para todo tipo de niveles experimentales. En esta publicación, echaremos un vistazo a algunas de estas que puede utilizar, desde Western Blot hasta Live Cell Imaging.

Detección de actina y tubulina con anticuerpos

Fig. 2: Western blot de actina purificada y extractos de células probados con anticuerpo anti-actina (027AAN01).

Los anticuerpos se pueden usar en diversos métodos, como Western Blots, ELISA e inmunocitoquímica. Solo se pueden obtener buenos resultados en diferentes métodos con unos pocos anticuerpos.

Anti pan Actin se ha probado exhaustivamente en estas aplicaciones y ha obtenido resultados brillantes (consulte las figuras 1 y 2).

Fig. 3: Imagen de inmunofluorescencia de células en metafase de Arabidopsis thaliana teñidas con anticuerpo policlonal Anti-Tubulina (027ATN02).

Fig.4: Western blot de extractos celulares sondados con anticuerpo policlonal anti-tubulina (027ATN02)

Además, aquí puede navegar por una selección de otros anticuerpos anti Actina.

La tubulina anti-alfa / beta se ha probado positivamente en las mismas aplicaciones y, además, se puede utilizar para experimentos de inmunoprecipitación. Los resultados se presentan en la figura 3 y la figura 4.

Aquí & # 8217s una descripción completa de una gama de anticuerpos anti Tubulina.

Tinción de actina de células fijadas

Fig. 5: Fibroblastos Swiss 3T3 teñidos con ActiStain 488 (verde), Dapi (azul) y Anti Vinuclin (naranja).

En células fijadas, la actina se puede teñir con anticuerpos (ver más arriba) pero a menudo se utilizan faloidinas fluorescentes. La faloidina pertenece al grupo de falotoxinas producidas por el hongo. Amanita phalloides (hongo del casquete de la muerte). La toxicidad natural de la faloidina se debe a su efecto estabilizador sobre la actina F en las células. En función de su afinidad por la actina F y acoplada a un tinte fluorescente, se puede utilizar para visualizar la actina F.

Cytoskeleton Inc. ofrece un conjunto de tinciones a base de faloidina (Acti-Stains) junto con varios fluoróforos diferentes compatibles con conjuntos de filtros populares como FITC, TRITC y Cy5. Los tintes son excepcionalmente brillantes y estables y, de hecho, se ofrecen a precios muy económicos en comparación con otros tintes a base de faloidina acoplados a fluoróforos de estabilidad similar. Los resultados de la tinción de células Swiss 3T3 con ActiStain 488 se muestran en la Fig. 5.

Imágenes de células vivas de actina y tubulina

Fig. 6: Imagen de microscopía 3D-SIM de microtúbulos en el cuerpo de la neurona de la corteza de rata primaria marcado con SiR-tubulina.

Finalmente, me gustaría presentar nuevas herramientas para teñir actina y tubulina en células vivas sin la necesidad de transfectarlas con vectores que lleven la información de actina / tubulina marcada con fluorescencia o proteínas de unión. Spirochrome lanzó recientemente tintes fluorescentes únicos para monitorear fácilmente los dos componentes principales del citoesqueleto en las células vivas. Estas tinciones fluorescentes (SiR-Actina y SiR-Tubulina) son compuestos permeables a las células que tiñen la F-actina (y los microtúbulos, respectivamente, ver Fig. 6 y Fig. 7).

Fig. 7: Imagen de microscopía 3D-SIM de fibras de estrés de actina en fibroblastos dérmicos primarios humanos marcados con SiR-actina.

Para obtener más información sobre estas emocionantes tinciones, eche un vistazo a mi publicación reciente 2 nuevas tinciones para imágenes de células vivas de actina y tubulina, ¡sin transfección!

¿Interesado en teñir actina y / o tubulina? ¡Ponte en contacto dejando tus preguntas o comentarios a continuación!


Autores & # x02019 contribuciones

LWT diseñó y realizó experimentos, analizó datos y coescribió el manuscrito. JS y CE diseñaron y realizaron experimentos, analizaron datos. ASHC y CF realizaron experimentos de metabolómica. TSB y GS asistieron con análisis de imágenes NAD / NADH. MA proporcionó el concepto para el estudio, diseñó experimentos, analizó datos, coescribió el manuscrito y obtuvo fondos. Todos los autores revisaron y editaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.


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