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¿El ARNm se produce de forma constante durante el tiempo?

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Estoy haciendo un análisis de datos estadísticos de un conjunto de datos de células de P. Furiosus expuestas a radiación gamma.

Para las muestras expuestas a radiación gamma, tengo los valores de ARNm producido a lo largo del tiempo. Para las muestras no expuestas a radiación gamma (muestras de referencia), no tengo la hora a la que se extrajo el ARNm.

Por lo tanto, me preguntaba: en condiciones normales, generalmente, ¿se produce el ARNm constante con respecto al tiempo? Pensé que tal vez el hecho de que sea constante podría ser la razón por la cual no existen los valores del tiempo.


¿El ARNm se produce de forma constante durante el tiempo? - biología

El ADN se copia en ARN en un proceso llamado transcripción genética. Para transcribir significa & # 8220 escribir algo. & # 8221 La información en el ADN se transcribe, o se reescribe, en una versión más pequeña (ARN) que puede ser utilizada por la célula.

Objetivos de aprendizaje

  • Comprender los pasos básicos en la transcripción de ADN en ARN.
  • Describir el papel de la ARN polimerasa.
  • Comprender la diferencia entre pre-ARN y ARNm
  • Describir la modificación postraduccional del ARN y su propósito.

La transcripción tiene lugar en el núcleo. Utiliza el ADN como plantilla para producir una molécula de ARN (ARNm). Durante la transcripción, se produce una hebra de ARNm que es complementaria a una hebra de ADN. La figura 1 muestra cómo ocurre esto.

Figura 1. Descripción general de la transcripción. La transcripción usa la secuencia de bases en una hebra de ADN para hacer una hebra complementaria de ARNm. Los trillizos son grupos de tres bases de nucleótidos sucesivas en el ADN. Los codones son grupos complementarios de bases en el ARNm.


Introducción

A pesar de la naturaleza ruidosa de la expresión génica 1, 2, 3, 4, 5, 6, varios aspectos de la dinámica unicelular, como el crecimiento de volumen, son efectivamente deterministas. Las recientes mediciones unicelulares muestran que el crecimiento del volumen celular es a menudo exponencial. Estos incluyen bacterias 7,8,9,10, arqueas 11, levadura en ciernes 10,12,13,14,15 y células de mamífero 10,16. Además, los números de ARNm y proteínas son a menudo proporcionales al volumen celular a lo largo del ciclo celular: la homeostasis de la concentración de ARNm y la concentración de proteínas se mantiene en un volumen celular en crecimiento exponencial con número de copias del genoma variable 17,18,19,20,21, 22. Los crecimientos exponenciales de ARNm y número de proteínas indican tasas de transcripción y traducción dinámicas proporcionales al volumen celular, en lugar del número de copias del genoma. Sin embargo, los modelos de expresión génica actuales a menudo asumen una tasa de transcripción constante por gen y una tasa de traducción constante por ARNm (modelo de tasa constante) 1,5,23,24,25. Suponiendo una tasa de degradación finita de ARNm y proteínas no degradables, estos modelos conducen a un número de ARNm constante proporcional al número de copias del gen y al crecimiento lineal del número de proteína 26,27,28, incompatible con la proporcionalidad del ARNm y el número de proteína al volumen celular en crecimiento exponencial.

Dado que el volumen celular, el número de copias de proteínas y el número de copias de ARNm crecen exponencialmente a lo largo del ciclo celular, uno puede esperar que una condición suficiente para lograr una concentración constante sea dejarlos crecer con la misma tasa de crecimiento exponencial. Sin embargo, el análisis matemático sugiere que esto es insuficiente. Consideremos el logaritmo de concentración de proteínas. C, que puede escribirse como ln (C) = ln (pag) - ln (V). Aquí pag es el número de proteína y V es el volumen celular. Si se supone que el número de proteínas y el volumen celular crecen exponencial pero independientemente, con tasas de crecimiento exponenciales dependientes del tiempo λpag(t) y λv(t) respectivamente, la derivada temporal del logaritmo de concentración obedece D enC)/dt

λpag(t) − λv(t). Incluso cuando las tasas de crecimiento promediadas en el tiempo del número de proteínas y el volumen celular son iguales, ( langle < lambda _p (t)> rangle = langle < lambda _v (t)> rangle ), cualquier fluctuación en la diferencia entre ellos se acumulará y dará lugar a un comportamiento de caminata aleatorio del logaritmo de concentración. La homeostasis de las concentraciones de proteínas y ARNm implica que debe existir un mecanismo regulador para evitar la acumulación de ruido a lo largo del tiempo.

El objetivo principal de este trabajo es identificar dicho mecanismo mediante el desarrollo de un modelo de grano grueso que tenga en cuenta explícitamente el crecimiento del volumen celular. Especialmente, solo consideramos las células en proliferación continua y no tenemos en cuenta las células que no crecen, por ejemplo, las células bacterianas en la fase estacionaria 29. La ubicuidad de la homeostasis sugiere que la maquinaria global de expresión génica, las ARN polimerasas (RNAP) y los ribosomas, deberían desempeñar un papel central dentro del modelo. Partiendo del supuesto de que el número de ribosomas es el factor limitante en la traducción, encontramos que el crecimiento exponencial del volumen celular y el número de proteínas se origina en la naturaleza autocatalítica de los ribosomas 30,31,32,33. El hecho de que los ribosomas produzcan todas las proteínas asegura que las concentraciones de proteínas no diverjan. Partiendo del supuesto de que el número de RNAP es el factor limitante en la transcripción, encontramos que el número de ARNm también crece exponencialmente y la concentración de ARNm es independiente del número de copias del genoma debido a la competencia entre genes por este recurso global 18,19, 20. También estudiamos los efectos de la replicación del genoma. Debido a la sincronización heterogénea de la replicación de genes, la tasa de transcripción de un gen tiene una dependencia del ciclo celular. Dentro de nuestro modelo, se duplica inmediatamente después de que el gen se replica y disminuye gradualmente a medida que se replican otros genes. Sin embargo, encontramos que esto conduce a un pequeño efecto sobre los niveles de proteínas. Finalmente, ampliamos nuestro modelo a situaciones más generales en las que un exceso de RNAP (ribosoma) conduce a la saturación del ADN (ARNm). Proponemos un diagrama de fases de la expresión génica y el crecimiento celular controlado por la relación proteína-ADN. Predecimos una transición del crecimiento exponencial al crecimiento lineal del volumen celular a medida que la relación proteína / ADN supera un umbral.


Y & # 8217todos realmente necesitan entender cómo el ARNm & # 8220vacunas & # 8221 están diseñados y ejecutados: No le va a gustar

Pero primero, ¿podemos estar de acuerdo con la definición de & # 8220vacuna? & # 8221 Supongamos que estamos hablando de una vacuna tradicional totalmente legítima, una que ha existido durante años y es segura y eficaz. Básicamente, ¿qué es? ¿Podemos estar de acuerdo en que una vacuna es una sustancia elaborada a partir de una versión debilitada o muerta del patógeno que se introduce en el torrente sanguíneo para inducir una respuesta inmunitaria?

Así que ahora entienda esto: ARNm & # 8220vacunas & # 8221 no son vacunas & # 8230 No. Lo que estamos tratando aquí es biotecnología y bioingeniería. En resumen, es modificación genética. Imagínese la exuberancia de los pharmas financiados por Luciferian Gates, sin mencionar al propio Gates, en su búsqueda de ser Dios.

¿Entonces, cómo funciona? Cuando las células se dividen, las hebras de ADN se replican y el ARN mensajero (ARNm) desempeña un papel vital en los procesos conocidos como transcripción y traducción. Aprenda sobre esto AQUÍ. Esta cosa que Moderna / Pfizer / Gates ha creado es una hebra sintética de ARNm, que penetra en la membrana de las células humanas sanas y secuestra el proceso de replicación normal. La célula humana previamente sana ahora se transformará para producir un fragmento del virus real, la llamada & # 8216spike protein & # 8217. Esta molécula será reconocida como un patógeno, provocando una respuesta inmune.

La célula humana previamente sana ahora se transformará para producir un fragmento del virus real. Lo leíste correctamente. Lo siguiente es del primer párrafo de la entrada wiki sobre esta tecnología:

Un Vacuna de ARN o Vacuna de ARNm (ARN mensajero) es un nuevo tipo de vacuna que transfecta moléculas de ARN sintético en células humanas. Una vez dentro de las células, el ARN funciona como ARNm, reprogramando las células para producir la proteína extraña que normalmente sería producida por el patógeno (por ejemplo, un virus) & # 8230 Estas moléculas de proteína luego estimulan una respuesta inmune adaptativa que le enseña al cuerpo a destruir cualquier patógeno & # 8230 La molécula de ARNm está recubierta con un vehículo de administración de fármacos, generalmente nanopartículas de lípidos PEGilados, [2] para proteger las frágiles hebras de ARNm y ayudar a su absorción en las células humanas. [3] [4]

& # 8230 poco se sabe acerca de los efectos secundarios a mediano y largo plazo [8]

Si va a wiki AQUÍ y hace clic en Ver historial en la parte superior de la página, luego desplácese hacia abajo y haga clic en Más antiguo, este artículo se creó por primera vez el 17 de febrero de 2020. Qué nuevo. También notará que tan recientemente como enero de 2020, esta tecnología ni siquiera se consideraba experimental todavía. Se consideró teórico. Guau.

Muchas preguntas. ¿Boicoteará la multitud de orgánicos veganos no transgénicos esta biotecnología, que efectivamente convierte a cada ser humano que la toma en un OGM andante? Odio cuando la lógica se interpone en el camino de las decisiones de atención médica. ¿Qué sucede si la prisa a la velocidad de la deformación para pulir la biotecnología da como resultado que parte de la secuenciación del ARNm se desactive, solo un poco? Sigo pensando en el pobre Jeff Goldblum en La mosca.

También sigo pensando en todas las décadas infructuosas de intentar desarrollar una vacuna contra el coronavirus, con innumerables ratones, gatos y niños que murieron en los ensayos. ¿No sabías nada de eso? Sí, el problema es que estas & # 8220vacunas & # 8221 tienden a mejorar la absorción del patógeno. Este efecto se llama mejora dependiente de anticuerpos (ADE), y publiqué una larga explicación anotada de este problema AQUÍ. En pocas palabras, esta es la razón por la que nunca ha habido ningún tipo de vacuna contra el coronavirus. ¿Pero de alguna manera encontraron uno en diez meses?

¿Qué pasa con el embarazo, la lactancia y la fertilidad a largo plazo de las mamás modificadas genéticamente? Ohhh & # 8230 ellos no & # 8217t quieren ir allí. ¿Quiere saber cómo la biotecnología del ARNm podría interferir con las posibilidades de que un bebé en desarrollo, un bebé que amamanta o las probabilidades de que una madre vuelva a quedar embarazada alguna vez? Lástima, ya que deliberadamente evitaron probar nada de eso, ni siquiera en ratones. No es necesario que desaparezcan las pruebas si no se presentaron pruebas. Luego, cuando Pfizer obtuvo la aprobación del Reino Unido, emitieron DIEZ PÁGINAS de explicaciones, advertencias, renuncias, etc. AQUÍ

Bill Gates está en video explicando que quiere reducir la población mundial en un 90%, pero soy el chiflado por sugerir que una vacuna que opera a través de la genética sintética podría presentar riesgos de fertilidad. Sí.


Resultados

Detección de moléculas de ARNm individuales

Para observar directamente eventos aleatorios de activación e inactivación de genes, medimos las variaciones de célula a célula en el número de moléculas de un ARNm específico. Logramos esto integrando un gen indicador que posee una matriz en tándem de sitios de unión de sonda en células de mamíferos y utilizamos sondas marcadas con fluorescencia para visualizar el ARNm transcrito del gen por FISH. Para obtener la sensibilidad de una sola molécula, introdujimos 32 copias en tándem de una secuencia de unión de sonda de 43 pares de bases en el extremo 3 'de una secuencia codificante de una proteína fluorescente (a lo largo de este artículo, nos referimos a esta matriz de secuencia como M1). La construcción se insertó en células de ovario de hámster chino (CHO) mediante electroporación y se aisló una línea celular estable en la que se integró una única copia del gen en el genoma de las células. A continuación, estas células se fijaron y se sometieron a hibridación con una sonda de oligodesoxirribonucleótidos monocatenaria que era complementaria a las secuencias repetidas en tándem y se marcaron con cinco restos de fluoróforo bien dispersos (Figura 1A). La unión de tantos fluoróforos a cada molécula de ARNm individual dio como resultado señales tan brillantes que cada molécula era detectable como un punto limitado por difracción en un microscopio de fluorescencia de campo amplio convencional (Figura 1B). Para contar el número total de moléculas de ARNm en cada célula, se adquirieron cortes ópticos que abarcan todo el volumen celular tridimensional (Video S1). Luego, se midió el número de moléculas de ARNm en cada célula utilizando un software personalizado para identificar puntos fluorescentes individuales en tres dimensiones a partir de las pilas de imágenes (Figura 1C). Hemos demostrado previamente que cada punto corresponde a una molécula de ARNm individual y que no hay una pérdida significativa de moléculas de ARNm durante el procedimiento FISH [25], estableciendo así que el método es una forma válida de contar el número de moléculas de ARNm en células individuales. .

(A) Diagrama esquemático que representa el método de detección de ARNm. Múltiples sondas fluorescentes se unen a cada molécula de ARNm, produciendo una señal brillante y localizada.

(B) Imagen combinada de una pila tridimensional de imágenes de una célula CHO que expresa el gen 7x-tetO representado en (A), donde cada ARNm se hibrida con sondas FISH que se unen a la secuencia de unión a sonda multimérica en su 3 ' -UTR (unión de la sonda P1-TMR al multímero M1). Cada mancha corresponde a una sola molécula de ARNm.

(C) Identificación de los puntos en la pila de imágenes tridimensionales en (C). Cada partícula encontrada por el algoritmo de análisis de imágenes tiene un color diferente, lo que muestra que el algoritmo es preciso y que las moléculas individuales están identificadas de forma única. Las barras de escala tienen una longitud de 5 μm.

Medición de variaciones de célula a célula en células clonales

Para medir las variaciones de célula a célula en los números de ARNm en líneas celulares clonales, generamos líneas celulares CHO estables que expresan nuestra construcción. El gen se colocó bajo el control de un promotor cuya expresión podía controlarse en células de mamíferos (Figura 2A), y se integró de manera estable en el genoma mediante electroporación, lo que resultó en la introducción de una única copia del gen (según lo verificado por Southern borrando datos no publicados). La observación del ARNm sintetizado en estas células mostró que había variaciones marcadas en el número de moléculas de ARNm de una célula a otra (Figura 2B). Las áreas brillantes ocasionales más grandes que se observaron son sitios de transcripción activados recientemente [25, 26] causados ​​por una acumulación de ARNm naciente que aún no se había difundido. La observación de que estos sitios ocurren con poca frecuencia indica que el ARNm no se sintetiza continuamente, sino que se sintetiza durante breves períodos de tiempo en los que el gen es transcripcionalmente activo. Nos referimos a estos períodos como ráfagas transcripcionales. El resto del tiempo, el gen está en un estado transcripcionalmente inactivo, durante el cual no se sintetizan moléculas de ARNm y las que se sintetizan antes se degradan.

(A) Diagrama esquemático de los promotores controlables por doxiciclina y los genes indicadores que controlan. La doxiciclina se une a la proteína tTA, lo que evita que se una a la tet operador.

(B, C) Campos representativos de células de las líneas celulares E-YFP-M1-1x y E-YFP-M1-7x, que contienen los promotores 1x-tetO y 7x-tetO, respectivamente, donde cada ARNm se hibrida con la sonda FISH P1 -TMR y la imagen se obtuvo fusionando una pila tridimensional de imágenes.

(D) Dos células hermanas de la línea celular E-YFP-M1-7x que muestran ARNm hibridado con la sonda FISH P1-TMR (rojo) y alineado con DAPI (azul). La imagen representa un plano focal. Las barras de escala tienen una longitud de 5 μm.

La evidencia cuantitativa de la naturaleza de la transcripción en forma de ráfaga proviene de comparar el número de ARNm en las células que contienen sitios de transcripción activos con aquellas sin sitios de transcripción activos. Encontramos que de 97 células seleccionadas al azar de la línea celular E-YFP-M1-7x (los detalles de la construcción se discuten a continuación), los 23 que contienen focos transcripcionales tenían un promedio de 244 ARNm por célula, en comparación con 33 ARNm por célula en el 74 sin ningún sitio de transcripción activo (pag & lt 10 −4). Debido a que el método FISH también proporciona la ubicación espacial del ARNm, también pudimos comparar los números relativos de ARNm en el núcleo y el citoplasma para estudiar más a fondo el comportamiento de las ráfagas transcripcionales. Si la transcripción ocurre en ráfagas, entonces uno esperaría encontrar más ARNm en el núcleo que en el citoplasma cuando el gen está activo, ya que el ARNm nuclear no se ha exportado. Sin embargo, cuando el gen está en estado inactivo, el ARNm nuclear se exportará sin reponerse, lo que dará como resultado una menor proporción del ARNm celular total que se encuentra en el núcleo. Para examinar tal comportamiento, costamos las células con DAPI después de la hibridación y determinamos si cada ARNm estaba ubicado en el citoplasma o en el núcleo. A menudo, encontramos que las células sin un foco transcripcional solo tenían ARNm citoplásmico, mientras que las células con un sitio de transcripción generalmente tenían una gran cantidad de ARNm nuclear (Figura 2D). Hablando estadísticamente, las células que contienen sitios de transcripción activos tenían un porcentaje más alto de ARNm informador en el núcleo (35%, 17 células analizadas) que las células sin sitios de transcripción activos (25%, 22 células analizadas) (pag = 0,0093). Curiosamente, las dos células representadas en la Figura 2D descienden claramente de la misma célula madre, pero parecen mostrar un comportamiento transcripcional diferente. Este comportamiento es típico e indica que las variaciones globales de factores extrínsecos, como la posición en el ciclo celular, no son la principal fuente de variación en la actividad del transgén, esto se analiza de manera más sistemática en las “Contribuciones relativas de los factores intrínsecos y extrínsecos a las variaciones en el ARNm Nivel ”sección de los resultados.

La evidencia adicional de ráfagas transcripcionales proviene de un análisis de las estadísticas de la distribución de moléculas de ARNm por célula en toda la población celular. Si el ARNm se produjera a una velocidad constante, se esperaría una distribución de Poisson de ARNm por célula, en cuyo caso el número medio de moléculas de ARNm por célula y la varianza (el cuadrado de la desviación estándar) serían iguales. Sin embargo, encontramos que la media era de aproximadamente 40 moléculas de ARNm por célula, mientras que la varianza era de aproximadamente 1.600 moléculas al cuadrado, lo que indica que el ARNm no se sintetiza a una velocidad constante, de acuerdo con la aparición de ráfagas transcripcionales.

Mecanismos que controlan las ráfagas transcripcionales

Para investigar los mecanismos que controlan las ráfagas transcripcionales, modificamos el nivel general de transcripción cambiando la cantidad de activador transcripcional presente en las células y alterando el número de sitios de unión para ese activador en el promotor. Para lograr esto, el gen se insertó aguas abajo de un promotor de citomegalovirus mínimo y una o siete copias de la proteína sensible a la tetraciclina. tet la secuencia del operador estaba presente corriente arriba del promotor (Figura 2A). La transcripción del promotor solo es posible cuando una proteína conocida como tet-transactivator (tTA) se une a la secuencia del operador. tTA es una proteína que consta de dos dominios: uno que se une al tet operador (derivado de la proteína TetR) y uno que promueve la transcripción de genes cercanos (el dominio de activación ácida VP16). La doxiciclina, un antibiótico similar a la tetraciclina, se une al dominio de unión al ADN del tTA, evitando que se una al ADN. Al variar el nivel de doxiciclina en el medio de crecimiento, pudimos controlar el nivel de tTA libre en las células [27].

Dos construcciones (1x-tetO y 7x-tetO) se integraron de manera estable en células CHO que habían sido previamente modificadas para expresar tTA, dando como resultado las líneas celulares E-YFP-M1-1x y E-YFP-M1-7x, cada una conteniendo un copia única del gen informador respectivo. En la Figura 2B y 2C se muestran instantáneas representativas de los campos de células clonales. Observamos que el tamaño de las ráfagas fue mayor en la línea celular E-YFP-M1-7x que en la línea celular E-YFP-M1-1x. Luego variamos la cantidad de doxiciclina en el medio de crecimiento y medimos la distribución del número de moléculas de ARNm por célula en varios campos de células cultivadas en cada concentración de doxiciclina (recuentos de ARNm de la Figura 3A en la Tabla S1). Como era de esperar, el aumento del nivel de doxiciclina dio como resultado una disminución en el número medio de moléculas de ARNm por célula (Figura 3B, arriba). Sin embargo, también encontramos que la variabilidad en la población (medida cuantitativamente por el "ruido", que definimos como la desviación estándar dividida por la media) permaneció constante en todas las concentraciones de doxiciclina para el constructo 1x-tetO, pero varió de forma no monotónica para el 7x -teto de construcción (Figura 3B, parte inferior). Además, encontramos que las propiedades del ruido no cambian si se considera la concentración de ARNm en lugar del número absoluto (Figura S2, compárese con la Figura 3B, abajo). Lo más probable es que esto se deba a que la principal fuente de variación es el estado de activación del propio gen, que no varía con el volumen de la célula.

(A) Histogramas que muestran la distribución de moléculas de ARNm por célula para tres concentraciones de doxiciclina para ambas líneas celulares E-YFP-M1-1x (izquierda) y E-YFP-M1-7x (derecha).

(B) Gráficos que muestran la media poblacional (arriba) y el ruido (definido como la desviación estándar dividida por la media [abajo]) en función de la concentración de doxiciclina. Las estadísticas se tomaron de los recuentos de ARNm utilizados en (A) y las barras de error se obtuvieron mediante bootstrapping.

(C) Tasa de activación (λ / δ) y número promedio de moléculas de ARNm producidas por ráfaga (μ / γ) para 1x-tetO (azul) y 7x-tetO (rojo) obtenido al ajustar los datos de recuento de ARNm al modelo de gen activación e inactivación por el método de máxima verosimilitud. Las barras de error reflejan intervalos de confianza del 95%.

Ambos resultados son incompatibles con los modelos estocásticos convencionales de expresión génica [3, 5, 15, 28] que predicen que el ruido debería aumentar de manera constante a medida que disminuye el nivel medio de transcripción. Para explicar este comportamiento, invocamos un modelo de activación e inactivación de genes [29] en el que el gen experimenta transiciones poco frecuentes entre un estado transcripcionalmente activo, durante el cual se producen muchas moléculas de ARNm, y un estado transcripcionalmente inactivo, en el que no hay moléculas de ARNm. producido (el modelo se analiza con más detalle en el Protocolo S1, donde se presenta una fórmula completa para la distribución de ARNm). Usando una evaluación numérica rápida de las distribuciones teóricas resultantes de este modelo, pudimos ajustar los datos obtenidos experimentalmente para encontrar expresiones para la tasa de activación del gen, λ (dentro de un factor de la tasa de degradación del ARNm, δ), y el promedio número de ARNm producido durante cada ráfaga, μ / γ (en adelante denominado tamaño de ráfaga promedio) (Figura 3C). La vida media del ARNm se determinó mediante RT-PCR cuantitativa en aproximadamente 4 ± 1 h (consulte la Figura S1 en Materiales y métodos para obtener más información). Los resultados del procedimiento de ajuste muestran que el aumento del número de sitios de unión del factor de transcripción o el aumento de la cantidad de factores de transcripción intracelulares aumenta el tamaño de ráfaga promedio. Según nuestro análisis, es imposible decir si esto se debe a una disminución en la tasa de inactivación de genes o un aumento en la tasa de transcripción del gen activado. Este hecho, sin embargo, apunta a una diferencia importante con el caso bacteriano, donde la activación e inactivación de genes se han asociado típicamente con la asociación y disociación de factores de transcripción [4]. Si ese fuera el caso, la disminución de la cantidad de factores de transcripción serviría para disminuir la tasa de activación y dejar las tasas de inactivación y transcripción iguales. En nuestros datos, la tasa de activación genética parece ser bastante constante hasta que la concentración de doxiciclina alcanza un nivel relativamente alto, momento en el que aumenta, lo que contradice la aplicación del modelo bacteriano a nuestro sistema. No está claro por qué la tasa de activación de genes aumenta a concentraciones mayores de doxiciclina, ya que la disminución del nivel de factores de transcripción solo debería disminuir la tasa de activación de genes. Esto podría deberse a factores no incluidos en nuestro modelo, o algún comportamiento físico por parte de la célula inducida a concentraciones más altas de doxiciclina. Sin embargo, nuestros datos generalmente indican que la modulación de la concentración de activadores transcripcionales afecta el nivel general de transcripción al alterar el tamaño de ráfaga promedio en lugar de su frecuencia.

Contribuciones relativas de factores intrínsecos y extrínsecos a las variaciones en el nivel de ARNm

Si la variación en los niveles de expresión de una célula a otra se debiera realmente a eventos aleatorios de activación de genes, entonces la presencia de múltiples copias del gen que se activan independientemente daría como resultado una menor variabilidad de célula a célula en los números de ARNm (es decir, el ruido debería disminución). Intuitivamente, esto se puede ver considerando los lanzamientos de monedas simultáneos: si solo se lanza una moneda, es cara o cruz, pero si se lanzan varias monedas a la vez, las posibilidades de que el conjunto de ellas sea cercano al 50% de cara y 50 El% de colas aumenta con la cantidad de monedas utilizadas. Para probar esta posibilidad, integramos múltiples copias de nuestro gen informador en una región del genoma a través de la transfección catiónica basada en lípidos (lipofección), que integra simultáneamente decenas a cientos de copias de genes, a menudo en tándem y en el mismo locus, y aislamos línea celular L-GFP-M1-7x. En general, el número de ARNm producido en esta línea celular fue mucho mayor que en E-YFP-M1-7x (con solo una copia del gen informador), pero la línea celular aún mostraba variaciones masivas de célula a célula (Figura 4A ) con una distribución marcadamente sesgada (Figura 4B). Estadísticamente, esto se demuestra por el hecho de que las características de ruido de estas dos líneas celulares fueron similares, ya que el número medio de moléculas de ARNm por célula ha aumentado aproximadamente 10 veces (sin doxiciclina) sobre la línea celular E-YFP-M1-7x. , uno esperaría que el ruido disminuyera en un factor de √ 10 ≈ 3 si los genes se expresaban de forma independiente, pero no se observó tal disminución (Figura 4C en comparación con la Figura 3B).

(A) Campo representativo de la línea celular L-GFP-M1-7x, generado por lipofección, donde el ARNm se hibridó con la sonda FISH P1-TMR, la imagen se obtuvo fusionando una pila tridimensional de imágenes.

(B) Histograma que muestra la distribución de moléculas de ARNm por célula para la línea celular L-GFP-M1-7x cuando se cultiva en medios que no contienen doxiciclina.

(C) Gráficos que muestran la media poblacional (arriba) y el ruido (definido como la desviación estándar dividida por la media [abajo]) en función de la concentración de doxiciclina. Las barras de error se obtuvieron mediante bootstrapping.

Hay dos explicaciones alternativas para esta observación. Una posibilidad es que las fluctuaciones masivas observadas en el número de moléculas de ARNm por célula se deban a fluctuaciones en factores globales que afectan simultáneamente la expresión de todos los genes informadores (por ejemplo, fluctuaciones en los niveles de tTA o ARN polimerasa II). normalmente denominado ruido extrínseco [3,15]. Alternativamente, dado que los genes se integraron en el mismo locus genómico, es posible que los genes se expresen de manera coordinada en respuesta a un evento de activación genética local aleatorio (como la descondensación de la cromatina) que afecte a todos los genes cercanos [1]. Sin embargo, si los eventos de activación de genes locales ocurren al azar, los genes ubicados en sitios distantes se activarían y desactivarían de forma independiente. Este tipo de ruido, debido a la ocurrencia aleatoria de eventos involucrados en la expresión génica, generalmente se denomina ruido intrínseco y no depende de factores globales.

Para explorar estas dos explicaciones alternativas, construimos otro gen informador, CFP-M2, que codificaba una proteína fluorescente cian y contenía una matriz en tándem diferente de secuencias de unión a sonda en su 3'-UTR, denominado M2. Esto permitió que su ARNm se distinguiera del ARNm sintetizado a partir de genes indicadores que contienen la matriz de secuencias M1 realizando FISH con una sonda adicional que se une a la matriz M2 pero se conjuga con un fluoróforo de diferente color. En una serie de experimentos, este gen se integró en una línea celular (L-GFP-M1-7x) que ya expresaba un gen indicador que contenía la matriz M1, lo que dio como resultado que el gen indicador CFP-M2 se integrara en un locus distante del sitio de integración de GFP-M1 (Figura 5A, izquierda). En una segunda serie de experimentos, los dos genes indicadores se integraron simultáneamente mediante lipofección, lo que resultó en que ambos genes se integraran en el mismo locus (Figura 5A, derecha). Si las variaciones en la expresión de ARNm en cada célula se debieran a factores globales, es probable que se produzcan ráfagas de síntesis de ARNm de estos genes distintos simultáneamente en la misma célula independientemente de su ubicación genómica (es decir, ambas líneas celulares mostrarían una fuerte correlación entre la expresión de ambos ARNm informadores). Sin embargo, si la expresión génica está controlada por eventos de activación génica local que afectan a loci individuales de forma independiente, la primera línea celular, en la que los genes informadores distintos se integran en diferentes loci, no mostraría correlación en la expresión génica, pero la segunda línea celular, en la que los distintos genes informadores están integrados en el mismo locus, mostrarían una fuerte correlación en la expresión génica.

(A) Esquema que representa los experimentos de integración de reporteros duales, donde los dos reporteros están integrados en ubicaciones separadas en el genoma (izquierda) o en el mismo locus (derecha).

(B) Superposición de dos colores que muestra una pila tridimensional fusionada de imágenes de la línea celular en la que dos genes informadores diferentes (uno que expresa ARNm que contiene la matriz de secuencia M1 y el otro que expresa ARNm que contiene la matriz de secuencia M2) se integran en diferentes loci (línea celular L-GFP-M1-7x + L-CFP-M2-7x) el verde corresponde a la señal del ARNm de GFP-M1 y el rojo corresponde a la señal del ARNm de CFP-M2 (usando las sondas P1-TMR y P2- Alexa-594, respectivamente). Los niveles relativos de ARNm de ambos genes se cuantificaron contando el ARNm de cada color en un solo corte óptico en cada célula (recuadro).

(C) Superposición de dos colores que muestra una pila tridimensional fusionada de imágenes de la línea celular en la que los dos genes informadores distintos están integrados en el mismo locus (línea celular L-YFP-M1-CFP-M2), donde el mismo Las sondas FISH se utilizaron como en (B). Los niveles relativos de ARNm de ambos genes se cuantificaron contando el ARNm de cada color en un solo corte óptico en cada célula (recuadro). Las barras de escala tienen una longitud de 5 μm.

Cuando se integran en loci separados (como lo demuestra la presencia de dos sitios de transcripción distintos), los dos ARNm informadores muestran individualmente las grandes fluctuaciones observadas anteriormente (Figura 5B), sin embargo, la ocurrencia de esas fluctuaciones no estaban correlacionadas entre sí (R = 0.056, pag = 0,57) (Figura 5B, recuadro). Sin embargo, cuando los dos genes se integraron en el mismo locus (como lo demuestra un único sitio de transcripción de dos colores Video S2), los genes produjeron ambos tipos de ARNm en ráfagas simultáneas (Figura 5C y recuadro R = 0.89, pag = 1,2 × 10 -38). Tomados en conjunto, los resultados de estos experimentos muestran que los eventos de activación e inactivación de genes poco frecuentes controlan la variabilidad en los niveles de ARNm, y estos eventos ocurren al azar y no dependen de factores extrínsecos globales. Además, los resultados implican que estos eventos de activación de genes se extienden espacialmente, ya que afectan regiones enteras del genoma a la vez.

Variaciones de célula a célula en el ARNm que codifica la subunidad grande de la ARN polimerasa II

Para examinar más a fondo el papel de los factores extrínsecos globales, verificamos las fluctuaciones en un factor extrínseco putativo, la ARN polimerasa II, para ver si el nivel de expresión de su ARNm se correlacionaba con el nivel de expresión del ARNm de un gen informador. Pudimos obtener imágenes de moléculas individuales del ARNm natural que codifica la subunidad grande de la ARN polimerasa II aprovechando la presencia de una secuencia natural de 21 nucleótidos de longitud que se repite 52 veces en el ARNm. Usamos una sonda FISH para la secuencia repetida que se marcó con un fluoróforo de color distintivo y contamos manchas fluorescentes similares a las observadas anteriormente (Figura 6A). Encontramos que este ARNm también mostraba ráfagas de síntesis de ARNm y que su distribución a través de un campo de células era similar a las observadas para los genes informadores, con una variación de más de 50 veces la media (Figura 6B, arriba). Para comprobar la correlación entre el nivel de este ARNm y el de un gen indicador (en la línea celular E-YFP-M1-7x), también cuantificamos el nivel de expresión del ARNm del gen indicador en las mismas células. No se encontró correlación significativa (R = 0.083, pag = 0,41) (Figura 6B, parte inferior). Al utilizar el modelo de activación e inactivación de genes, pudimos estimar las tasas de activación, inactivación y transcripción de genes dentro de un factor de la vida media del ARNm (ver Figura 6B para valores de parámetros e intervalos de confianza), lo que indica que el La activación fue de hecho infrecuente y parecida a un estallido. Estos resultados muestran dos cosas: (a) la síntesis del ARNm a partir de genes naturales también puede ser similar a una explosión y (b) las fluctuaciones en el número de moléculas de ARNm que codifican la subunidad grande de la ARN polimerasa II no son una fuente de ruido en la expresión de otros genes.

(A) Campo representativo de la línea celular E-YFP-M1-7x al realizar FISH con sondas de diferentes colores para el ARNm de YFP-M1 y el ARNm que codifica la subunidad grande de la ARN polimerasa II. La imagen es una superposición de dos colores, donde el verde corresponde a la señal del ARNm de YFP-M1 (un corte óptico) y el rojo corresponde a la señal del ARNm de la ARN polimerasa (pila de imágenes tridimensionales fusionadas). Las sondas utilizadas fueron P1-Cy5.5 y P3-TMR.

(B) Histograma que muestra la distribución de moléculas de ARNm de ARN polimerasa por célula (arriba) y un diagrama de dispersión (abajo) que muestra los niveles de ARNm informador (cuantificados contando el ARNm en un solo corte óptico) y los niveles de ARNm de ARN polimerasa (cuantificados contando todo el ARNm) en cada celda. La activación génica (λ / δ), la inactivación (γ / δ) y las tasas de transcripción (μ / δ) (normalizadas por la tasa de desintegración del ARNm δ) se dan con intervalos de confianza del 95% como se indica. La barra de escala tiene una longitud de 5 μm.

Propagación de la variabilidad del ARNm a niveles de proteínas

Para investigar los efectos que tuvo la transcripción en ráfaga de ARNm sobre los niveles de proteínas intracelulares, cuantificamos simultáneamente el número de ARNm y las proteínas fluorescentes que codificaban en células individuales. Para evaluar los efectos que tuvo la tasa de degradación de la proteína sobre la variabilidad de la proteína, realizamos este análisis en una línea celular que expresa una proteína fluorescente que se degrada activamente y otra línea celular que expresa una proteína fluorescente sin degradación activa.

Para el caso de degradación activa, utilizamos una línea celular que expresa de manera estable el gen indicador GFP-M1, que codifica una proteína verde fluorescente (GFP) que se había marcado en el extremo C-terminal con una secuencia corta de aminoácidos rica en prolina, glutámico. ácido, serina y treonina (d2EGFP) que se dirige a la proteína para la degradación activa (con una vida media de aproximadamente 2 h) y examinó las correlaciones entre el ARNm y los niveles de proteína (Figura 7A). Encontramos que los niveles se correlacionaron bastante bien, con coeficientes de correlación superiores a 0,78 (pag & lt 2,6 × 10 −22) en un rango de fuerza transcripcional. Además, la distribución de los niveles de proteína total parecía bastante similar a la del ARNm (Figura 7A, histogramas marginales en la parte superior, ARNm y derecha, proteína).

(A) Diagrama de dispersión del número total de GFP y mRNA en células individuales de la línea celular L-GFP-M1-7x cultivadas en condiciones de no doxiciclina (azul), doxiciclina 0,08 ng / ml (rojo) y doxiciclina 0,16 ng / ml (verde ). Los histogramas marginales indican la distribución de ARNm informador por célula (arriba) o GFP total (derecha) para todas las condiciones de crecimiento.

(B) Diagrama de dispersión de los niveles totales de CFP y ARNm (obtenido de un solo corte óptico) en células individuales de la línea celular L-GFP-M1-7x + L-CFP-M2-7x cultivada en condiciones sin doxiciclina. Los histogramas marginales indican la distribución de ARNm informador por célula (arriba) o GFP total (derecha) para todas las condiciones de crecimiento.

(C) Histograma de YFP total por célula de la línea celular E-YFP-M1-7x. YFP se cuantificó en células vivas para minimizar la pérdida de fluorescencia debido a la fijación y permeabilización.

(D) Diagramas de dispersión e histogramas marginales asociados que muestran los resultados de las simulaciones estocásticas del modelo de dinámica de proteínas y ARNm presentado en el Protocolo S1. La dinámica del ARNm fue la misma para todos los casos, pero la tasa de degradación de la proteína se incrementó como se indica. Los detalles de los procedimientos de simulación y los valores exactos de los parámetros utilizados se dan en la sección Materiales y métodos.

Para el caso de no degradación de la proteína activa, utilizamos otra línea celular, esta vez expresando el gen indicador CFP-M2, en el que la proteína fluorescente no contenía etiquetas de degradación. Encontramos que la correlación entre el ARNm y los niveles de proteína era significativamente menor que antes (R = 0.35, pag = 1,9 × 10 −4) (Figura 7B). Además, aunque la distribución de ARNm todavía estaba muy sesgada con colas largas, la distribución de proteínas estaba algo menos sesgada. También examinamos la distribución de proteínas en células vivas de la línea celular E-YFP-M1-7x, cuyo gen indicador también codifica una proteína fluorescente que no se degrada activamente. En este caso, la integración de copia única produjo muy pocas proteínas para que las detectamos después del procedimiento de fijación, lo que nos impidió medir simultáneamente los niveles de ARNm, pero descubrimos que los niveles de proteína fluorescente en células vivas también mostraban una distribución mucho menos sesgada como en comparación con las proteínas activamente degradadas (Figura 7C).

Para explicar las diferencias en las distribuciones de proteínas y la correlación entre los casos activamente degradados y no degradados, agregamos dinámica de proteínas al modelo de dinámica de ARNm y examinamos el comportamiento de este modelo mediante el uso del algoritmo de simulación estocástica de Gillespie [30]. (Los parámetros utilizados para las simulaciones fueron los obtenidos de la línea celular E-YFP-M1-7x en condiciones de ausencia de doxiciclina, aunque las características cualitativas observadas no dependen en gran medida de los parámetros específicos utilizados). Estas simulaciones muestran que la disminución de la tasa de la degradación de proteínas da como resultado una fuerte disminución en la correlación entre el ARNm y los niveles de proteína (Figura 7D). Además, la distribución de proteínas cambió de ser muy sesgada a ser de naturaleza más gaussiana (Figura 7D, histogramas marginales derechos), aunque la distribución del ARNm permaneció muy sesgada en todos los casos (Figura 7D, histograma marginal superior). De manera intuitiva, esto se debe a que las proteínas con tasas de degradación de proteínas rápidas serán abundantes solo cuando el ARNm que las codifica sea abundante, lo que da como resultado una alta correlación y distribuciones similares. Sin embargo, si las proteínas se degradan muy lentamente, entonces las proteínas de ráfagas transcripcionales anteriores aún pueden estar presentes cuando ocurren nuevas ráfagas. En este caso, las ráfagas transcripcionales simplemente sirven para "completar" ocasionalmente la cantidad de proteínas fluorescentes de vez en cuando, lo que da como resultado distribuciones menos sesgadas y una correlación más baja entre el ARNm y el número de proteínas. Cualitativamente, estas predicciones se corresponden bien con nuestras observaciones experimentales.


Cuantificando ARNm en el espacio y el tiempo

Cuantificación de ARNm en espacio y tiempo. J Cell Sci 15 de mayo de 2010 123 (10): e1002. doi:

Figura 1. El empalme de pre-ARNm implica la eliminación precisa de intrones del transcrito de ARN primario. El proceso de empalme es catalizado por complejos de proteínas llamados espliceosomas que están compuestos por proteínas y moléculas de ARN llamadas snRNA. Los empaliceosomas reconocen secuencias en el extremo 5 & # 8242 y 3 & # 8242 del intrón.

Los errores en el empalme están implicados en cánceres y otras enfermedades humanas. ¿Qué tipo de mutaciones pueden provocar errores de empalme?

Tenga en cuenta que pueden estar presentes más de 70 intrones individuales, y cada uno debe someterse al proceso de empalme, además de la protección 5 ′ y la adición de una cola poli-A, solo para generar una única molécula de ARNm traducible.

Vea cómo se eliminan los intrones durante el empalme de ARN en este sitio web.

Edición de ARN en tripanosomas

Figura 2. Trypanosoma brucei es el agente causante de la enfermedad del sueño en los seres humanos. Los ARNm de este patógeno deben modificarse mediante la adición de nucleótidos antes de que pueda producirse la síntesis de proteínas. (crédito: modificación del trabajo de Torsten Ochsenreiter)

Los tripanosomas son un grupo de protozoos que incluyen al patógeno Trypanosoma brucei, que causa la enfermedad del sueño en los seres humanos (Figura 2). Los tripanosomas, y prácticamente todos los demás eucariotas, tienen orgánulos llamados mitocondrias que suministran energía química a la célula. Las mitocondrias son orgánulos que expresan su propio ADN y se cree que son los restos de una relación simbiótica entre un eucariota y un procariota envuelto. El ADN mitocondrial de los tripanosomas exhibe una interesante excepción a The Central Dogma: sus pre-ARNm no tienen la información correcta para especificar una proteína funcional. Por lo general, esto se debe a que al ARNm le faltan varios nucleótidos U. La célula realiza un paso de procesamiento de ARN adicional llamado edición de ARN para remediar esto.

Otros genes del genoma mitocondrial codifican ARN guía de 40 a 80 nucleótidos. Una o más de estas moléculas interactúa mediante el apareamiento de bases complementarias con algunos de los nucleótidos en la transcripción de pre-ARNm. Sin embargo, el ARN guía tiene más nucleótidos A que el pre-ARNm tiene nucleótidos U para unirse. En estas regiones, el ARN guía forma un bucle. Los extremos 3 'de los ARN guía tienen una cola poli-U larga, y estas bases U se insertan en regiones del transcrito de pre-ARNm en las que se enlazan los ARN guía. Este proceso está completamente mediado por moléculas de ARN. Es decir, los ARN guía, en lugar de las proteínas, sirven como catalizadores en la edición del ARN.

La edición de ARN no es solo un fenómeno de los tripanosomas. En las mitocondrias de algunas plantas, se editan casi todos los pre-ARNm. La edición de ARN también se ha identificado en mamíferos como ratas, conejos e incluso humanos. ¿Cuál podría ser la razón evolutiva de este paso adicional en el procesamiento de pre-ARNm? Una posibilidad es que las mitocondrias, que son restos de antiguos procariotas, tengan un método igualmente antiguo basado en ARN para regular la expresión génica. En apoyo de esta hipótesis, las ediciones realizadas en los pre-ARNm difieren según las condiciones celulares. Aunque especulativo, el proceso de edición de ARN puede ser un vestigio de una época primordial cuando las moléculas de ARN, en lugar de las proteínas, eran las responsables de catalizar las reacciones.


Información de soporte

Figura S1. Determinación de la tasa de degradación del ARNm informador

El gráfico muestra la diferencia en el ciclo umbral entre las PCR realizadas en el gen indicador de GFP y el mantenimiento de EF1 de un experimento de RT-PCR en tiempo real realizado en el ARNm total extraído de la línea celular L-GFP-M1-7x. En el momento 0, el medio celular se reemplazó por medio que contenía 10 ng / ml de doxiciclina, interrumpiendo eficazmente la transcripción del gen indicador, lo que permitió determinar el tiempo de degradación del ARNm. Al determinar la vida media, solo consideramos los tres puntos más a la derecha, ya que los puntos de tiempo tempranos pueden mostrar una degradación que no es de primer orden debido a los efectos transitorios del procesamiento y la exportación del ARNm.

Figura S2. Efectos del volumen celular sobre el ruido del ARNm

El gráfico muestra el ruido (definido como la desviación estándar dividida por la media) de las concentraciones de ARNm para la construcción 1x-tetO (rojo) y la construcción 7x-tetO (azul) en un rango de concentraciones de doxiciclina. La concentración de ARNm se determinó dividiendo el número de ARNm por el volumen total de la célula, determinado por microscopía. Compare con la Figura 3B, abajo.

Figura S3. Correlación lineal utilizada para proporcionar estimaciones precisas del número de moléculas de ARNm que se encuentran en células de expresión intensa al analizar los niveles de ARNm en la línea celular L-GFP-M1-7x

El gráfico muestra la correlación entre el número de moléculas de ARNm y la fluorescencia total integrada sobre el volumen celular (sustracción de fondo). Se tomaron células de campos aleatorios de la línea celular L-GFP-M1-7x y se eligieron las células para niveles razonables de ARNm para permitir la segmentación y la falta de características fluorescentes brillantes que podrían influir potencialmente en la calibración. El ajuste lineal indicó un valor de aproximadamente 53.500 unidades de fluorescencia por molécula de ARNm.

Protocolo S1. Modelo de activación e inactivación de genes, estimación de parámetros y comparación con estudios anteriores

Modelo mecanicista de ráfagas en síntesis de ARNm, modelo básico de activación e inactivación de genes, ajuste de parámetros a distribuciones experimentales, determinación de medias y varianzas de proteínas y relación entre modelo y estudios previos de ruido intrínseco versus extrínseco.

Cuadro S1. Número de ARNm informadores (YFP-M1) por célula utilizados en el estudio de las líneas celulares E-YFP-M1-1x y E-YFP-M1-7x, y número de ARNm de subunidades grandes de RNAPII en la línea celular E-YFP-M1- 7 veces

Video S1. Flythrough tridimensional de un par de células hermanas recientemente divididas de la línea celular E-YFP-M1-7x

Cada mancha blanca representa una molécula de ARNm. La mancha blanca densa en una de las células es un sitio de transcripción activo.

Video S2. Flythrough tridimensional de un par de células hermanas recientemente divididas de la línea celular que poseen dos genes informadores integrados en el mismo locus (L-YFP-M1-CFP-M2)

El verde corresponde a la señal del ARNm de YFP-M1 y el rojo corresponde a la señal del ARNm de CFP-M2. La densa mancha amarilla en ambas células es un sitio activo de transcripción, lo que indica que ambos ARNm se están transcribiendo en el mismo locus genómico.


¿De qué está hecho el ARNm?

Cada secuencia de ADN que eventualmente termina como proteína es una ejemplo de ARNm. Cada secuencia de ADN que eventualmente termina como proteína es una ejemplo de ARNm. los ARN mensajero o ARNm es simplemente un portador transitorio de información sobre qué sintetizar desde el núcleo hasta los ribosomas.

¿Qué significa ARNm? ARN mensajero

En consecuencia, ¿dónde se produce el ARNm?

El proceso de hacer ARNm del ADN se llama transcripción y ocurre en el núcleo. los ARNm dirige la síntesis de proteínas, que se produce en el citoplasma. ARNm formada en el núcleo se transporta fuera del núcleo y en el citoplasma donde se adhiere a los ribosomas.

ADN a la transcripción de ARN. El ARN al que se transcribe la información es el ARN mensajero (ARNm). El proceso asociado con la ARN polimerasa es desenrollar el ADN y construir una hebra de ARNm colocando en el crecimiento ARNm molécula la base complementaria a la de la hebra plantilla de la ADN.


La revolución de la vacuna de ARNm apenas está comenzando

NADIE ESPERA la primera vacuna Covid-19 que es tan buena como era. "Esperábamos alrededor del 70 por ciento, eso es un éxito", dice la Dra. Ann Falsey, profesora de medicina en la Universidad de Rochester, Nueva York, que dirigió un sitio de prueba de 150 personas para la vacuna Pfizer-BioNTech en 2020.

Incluso Uğur Şahin, cofundador y director ejecutivo de BioNTech, que había guiado la droga desde sus primeras etapas, tenía algunas dudas. Todas las pruebas de laboratorio preliminares se veían bien desde que las vio en junio, solía decirle a la gente que "inmunológicamente, esta es una vacuna casi perfecta". Pero eso no siempre significa que funcionará en contra de "la bestia, la cosa que está ahí afuera" en el mundo real. No fue hasta el 9 de noviembre de 2020, tres meses después del ensayo clínico final, que finalmente recibió la buena noticia. “Más del 90 por ciento de efectividad”, dice. “Sabía que esto era un cambio de juego. Tenemos una vacuna ".

“Estábamos encantados”, dice Falsey. “Parecía demasiado bueno para ser verdad. Ninguna vacuna respiratoria ha tenido jamás ese tipo de eficacia ".

La llegada de una vacuna antes de fin de año supuso un giro inesperado de los acontecimientos. Al principio de la pandemia, la sabiduría convencional era que, incluso con todos los obstáculos retirados, una vacuna tardaría al menos un año y medio en desarrollarse. Talking heads a menudo hacía referencia a que la vacuna anterior más rápida jamás desarrollada, para las paperas en 1967, tomó cuatro años. Las vacunas modernas a menudo se extienden más allá de una década de desarrollo. BioNTech, y Moderna, con sede en EE. UU., Que anunció resultados similares más tarde la misma semana, rompieron esa línea de tiempo convencional.

Ninguna empresa era conocida antes de la pandemia. De hecho, ninguno de los dos había recibido la aprobación de un solo fármaco antes. Pero ambos habían creído durante mucho tiempo que su tecnología de ARNm, que utiliza instrucciones genéticas simples como carga útil, podría superar a las vacunas tradicionales, que se basan en el ensamblaje, a menudo meticuloso, de virus vivos o sus partes aisladas. El ARNm resultó ser algo extremadamente raro en el mundo de la ciencia y la medicina: una tecnología prometedora y potencialmente transformadora que no solo sobrevivió a su primera gran prueba, sino que superó las expectativas más salvajes de la mayoría de la gente.

Pero su próximo paso podría ser aún mayor. El alcance de las vacunas de ARNm siempre fue más allá de cualquier enfermedad. Como pasar de un tubo de vacío a un microchip, la tecnología promete realizar la misma tarea que las vacunas tradicionales, pero exponencialmente más rápido y por una fracción del costo. “Puede tener una idea por la mañana y un prototipo de vacuna por la noche. La velocidad es asombrosa ”, dice Daniel Anderson, investigador de terapia de ARNm del MIT. Antes de la pandemia, organizaciones benéficas como la Fundación Bill & amp Melinda Gates y la Coalición para las Innovaciones en la Preparación ante Epidemias (CEPI) esperaban convertir el ARNm en enfermedades mortales que la industria farmacéutica ha ignorado en gran medida, como el dengue o la fiebre de Lassa, mientras que la industria vio la oportunidad de Acelere la búsqueda de sueños científicos de larga data: una vacuna mejorada contra la gripe o la primera vacuna eficaz contra el VIH.

Amesh Adalja, experto en enfermedades emergentes en el Centro Johns Hopkins para la Seguridad de la Salud, en Maryland, dice que el ARNm podría "hacer que todas estas aplicaciones que esperábamos, presionar, se conviertan en parte de la vida cotidiana".

“Cuando escriban la historia de las vacunas, esto probablemente será un punto de inflexión”, agrega.

Si bien el mundo sigue centrado en el lanzamiento de las vacunas Covid-19, la carrera por la próxima generación de vacunas de ARNm, dirigidas a una variedad de otras enfermedades, ya está en auge. Moderna y BioNTech tienen cada uno nueve candidatos en desarrollo o ensayos clínicos iniciales. Hay al menos seis vacunas de ARNm contra la gripe en proceso, y una cantidad similar contra el VIH. Se han anunciado Nipah, Zika, herpes, dengue, hepatitis y malaria. El campo a veces se asemeja a la etapa inicial de una fiebre del oro, ya que los gigantes farmacéuticos contratan a investigadores prometedores para grandes contratos: Sanofi pagó recientemente $ 425 millones (£ 307 millones) para asociarse con una pequeña biotecnología de ARNm estadounidense llamada Translate Bio, mientras que GSK pagó $ 294 millones ( 212 millones de libras esterlinas) para trabajar con CureVac de Alemania.

“La biotecnología generalmente no tiene tanta disrupción como la industria de la tecnología informática; los tiempos de desarrollo son largos y está muy regulada. Por lo tanto, normalmente se puede ver el cambio que se avecina ”, dice Hartaj Singh, analista de la industria de Oppenheimer & amp Co.“ Covid dio la vuelta a eso. Las vacunas de ARNm rápidamente se convirtieron en el gran ganador. Muchas de las plataformas de vacunas más antiguas desaparecerán, se reemplazarán, en unos pocos años, o al menos se reducirán en gran medida ".

Şahin iría más lejos. “Será transformador, no hay duda. Será absolutamente transformador. Muchas plataformas de vacunas más antiguas no sobrevivirán ". Pero, dice, el impacto irá más allá de lo que ya sabemos. “Hay muchas más cosas que podemos hacer. Esto no es solo un reemplazo, estaremos presentando otras innovaciones médicas nuevas que de otra manera no serían posibles ".

Ugur Sahin, director ejecutivo de BioNTech

NO TODOS FUE tan sorprendido que las vacunas de ARNm pasaron su primera prueba con gran éxito. Katalin Karikó, una bioquímica húngara, comenzó a trabajar con ARNm ya en 1989, su investigación en la Universidad de Pensilvania a mediados de la década de 2000 sentó las bases para las vacunas BioNTech y Moderna (Karikó ahora supervisa productos farmacéuticos de ARN para BioNTech como vicepresidenta senior ). Cuando le pregunto sobre su opinión sobre el año pasado, es característicamente franca. “No hubo morderse las uñas. Esperaba que las vacunas fueran muy potentes ”, dice.

Incluso en el encierro, Karikó es uno de los centros nerviosos del mundo del ARNm. Desde su casa en las afueras de Filadelfia, asesora a los científicos de BioNTech en Alemania y todavía trabaja con antiguos colegas académicos en la cercana Penn State. Ella es una científica empedernida, salpicando conversaciones con referencias en formato académico - nombre, experimento, año - y constantemente mirando hacia la próxima frontera. Ella está profundamente impresionada con la escala del lanzamiento de la vacuna ("la fabricación, escala increíble, 200 millones de personas ya inyectadas"). Pero parece casi impaciente por el tiempo que le tomó a la gente darse cuenta de su fascinación por el ARNm. La ciencia siempre dijo que “funcionaría como un encanto”, dice, recitando estudios a pequeña escala de las últimas dos décadas.

El concepto detrás del ARNm como fármaco es sorprendentemente simple: es la molécula que sus propias células usan para llevar instrucciones de sus genes, escritas en un lenguaje químico simple de cuatro letras. Si puede sintetizarlo en un laboratorio y entregarlo a las células, teóricamente puede decirles que fabriquen una herramienta específica: un antígeno viral, una molécula que bloquea el cáncer o más tejido cardíaco, todo en su propio idioma. Moderna ha comenzado a llamar a las terapias de ARNm el "software de la vida", o un "sistema operativo" para la medicina.

Pero, como tantas otras propuestas científicas teóricamente atractivas, estaba repleta de problemas prácticos. El cuerpo rechaza violentamente el ARN de fuentes externas, probablemente para evitar ser secuestrado por virus y otros patógenos, y a menudo el ARN resultó tan tóxico que mató a los animales de laboratorio en los que se probó. "No podríamos soñar con usarlo en humanos", dice Karikó. Durante años, este fue un obstáculo tan importante que pocos científicos incluso consideraron usarlo para vacunas. “Era tan teórico en ese momento que nadie estaba realmente haciendo estas cosas”, dice el Dr. David Scales, profesor asistente de medicina en la Universidad de Cornell que trabajó con Karikó como estudiante.

Trabajando con el inmunólogo Drew Weissman en la Universidad de Pensilvania a principios de la década de 2000, Karikó diseñó moléculas de ARNm sintético que podrían evitar las defensas del cuerpo. Fue un proceso minucioso que, dice Weissman, mató a muchos ratones antes de que finalmente encontraran la fórmula exitosa. Pero en 2004, uno de sus constructos funcionó. En efecto, esto abrió las líneas de comunicación entre nuestras células y los mensajes de ARNm creados por los científicos.

Karikó siempre creyó que el ARNm podía hacer cualquier cosa. “Durante años asistí a reuniones científicas y me acerqué a la gente para decir: '¿En qué estás trabajando? Quizás esta tecnología de ARN podría ayudar ”, sea lo que sea, una enfermedad, incluso la calvicie. Probablemente todos pensaron que estaba loca ”, dice riendo.

“Le apasionaban las cosas que podía hacer el ARN”, dice Scales. “Ella era evangelista y traductora. Ella te ayudó a pensar en todas las posibilidades ".

Casi 20 años después, las vacunas habilitadas por su trabajo han convertido a Karikó en una celebridad científica. Eso, dice, "me pone nerviosa". Tanto el cofundador de Moderna, Derrick Rossi, como el biólogo británico Richard Dawkins han sugerido que debería ser considerada para el Premio Nobel. Esto es agradable, dice, aunque las constantes solicitudes de entrevistas invaden su trabajo. Y más importante que cualquier aplauso es el hecho de que miles de científicos han llegado a su forma de pensar.

A diferencia de los primeros días de la investigación del ARNm, no estaremos esperando décadas para su próxima gran prueba. La pandemia lo ha puesto en el centro de atención y los científicos están ansiosos por descubrir si su éxito contra el coronavirus puede replicarse.

Norbert Pardi, profesor asistente de investigación de la Universidad de Pensilvania

EL PRÓXIMO GRANDE El avance de la vacuna de ARNm probablemente no será contra otra nueva enfermedad exótica, sino una muy familiar. "La gripe es el objetivo número uno", dice Falsey. Una enfermedad que la mayoría de la gente considera bajo control, la influenza todavía mata a más de 300.000 personas en todo el mundo la mayoría de los años. Esto es a pesar de más de mil millones de vacunas contra la gripe al año."Las vacunas no son tan efectivas como queremos", dice.

Eso puede ser por decirlo suavemente. Según los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), que rastrean la eficacia de la vacuna en los EE. UU. Cada año, rara vez logran una protección del 50 por ciento. Para la temporada de gripe 2018-2019 fue solo del 29 por ciento, algunos años es tan bajo como el diez por ciento. Los artículos científicos, que no suelen ser propensos al lenguaje expresivo, a menudo se refieren a una vacuna mejorada contra la gripe como el “santo grial” del campo.

Un científico que persigue ese sueño es Norbert Pardi, que trabaja en el antiguo departamento de Katalin Karikó en la Universidad de Pensilvania, donde fue reclutado por Karikó en 2011 (también es de Hungría y me muestra con orgullo una foto en blanco y negro de su abuelo junto al padre de Karikó en una carnicería de un pequeño pueblo). Desde los resultados de BioNTech en noviembre, el teléfono del laboratorio ha estado sonando sin parar. “Empresas, académicos, querían hablar. Quería saber todo sobre estas vacunas de ARN ”, dice Pardi. Pero su proyecto principal, que se remonta a antes de la pandemia de coronavirus, se centra en la gripe. "La vacuna de temporada simplemente no es muy buena, podemos hacer una mejor".

El problema con las vacunas actuales contra la influenza radica en el desajuste entre la naturaleza elusiva del virus de la influenza y el método bastante anticuado y lento que usamos para hacer una vacuna contra él: un ARNm de proceso parece hecho a la medida para reemplazarlo. La enfermedad que llamamos gripe es causada por varias especies diferentes del virus de la influenza, y cada especie es altamente mutable (lo que significa que puede cambiar muy rápidamente). Esto significa que se requiere una nueva vacuna cada año contra las cepas más letales, e incluso mientras se fabrica la vacuna, el virus continúa mutando. El ex jefe de vacunación de los CDC, Bruce Gellin, lo llama un "objetivo móvil" y dice que una vacuna que sea una buena combinación a principios de año podría evadirse unos meses más tarde.

Esto parecería requerir una vacuna rápidamente adaptable y cambiante, y la vacuna contra la gripe estacional no es eso. La primera vacuna comercial contra la gripe se autorizó en los EE. UU. En 1945, y hoy la fabricamos casi de la misma manera. La vacuna se elabora cultivando las cepas diana del virus de la gripe en huevos de gallina fertilizados y luego purificándola de la clara, un proceso tan complicado como parece. Luego, los virus se inactivan químicamente y se inyectan en los brazos de los pacientes. Todo es lento, toma varios meses desde la identificación de las cepas objetivo hasta el cultivo de los huevos y la recolección de la vacuna.

No todas las vacunas se fabrican de esta manera; las llamadas vacunas de "virus muertos" son las más antiguas de la vieja escuela. Para la mayoría de los patógenos, este enfoque ha sido reemplazado desde hace mucho tiempo por una tecnología llamada vacunas de proteínas recombinantes, donde una sola pieza del virus, una proteína viral, se cultiva en un laboratorio. Esto es lo que utilizan las vacunas Novavax recientemente aprobadas. Si se elige el objetivo correcto, solo esa pieza puede cebar el sistema inmunológico con la misma eficacia que un virus completo, con mucho menos desorden.

Pero tienen sus propias desventajas. Las proteínas son moléculas complejas y pueden ser difíciles de cultivar en un laboratorio. “Pasé mucho tiempo como bioquímico purificando proteínas, pueden ser muy complicadas, muy particulares”, dice Pardi.

El ARNm elimina todo esto. A veces se ha descrito en la prensa como "convertir su cuerpo en una fábrica de vacunas", pero eso sugiere una especie de poder coercitivo. Tu cuerpo ya es una maravillosa fábrica de proteínas. Un millón de veces más eficiente que cualquier laboratorio en la Tierra, sus células producen billones de proteínas para el funcionamiento normal del cuerpo todos los días. Una vacuna de ARNm es solo una pequeña instrucción genética en el idioma nativo de la fábrica: una orden de trabajo para agregar algunas pequeñas proteínas virales a la cola. “Tus células están haciendo esto constantemente de todos modos. Simplemente estamos secuestrando un poco este proceso para producir la proteína viral que queremos que reconozca el sistema inmunológico ”, explica Anna Blakney, investigadora de ARN de la Universidad de Columbia Británica.

Esto le da al ARNm una enorme ventaja de velocidad sobre los métodos tradicionales, lo que significa que el virus de la gripe tendría menos tiempo para mutar antes de que llegue una vacuna. “El tiempo de espera para hacer la vacuna es mucho más corto. Podrías hacer un lote enorme en dos semanas. Incluso podría tener varias vacunas contra la influenza diferentes durante el invierno si cambia en tiempo real ”, dice Blakney.

“Podemos enfrentarlo cada temporada”, dice Şahin, quien espera tener la vacuna contra la gripe de BioNTech en ensayos en humanos a finales de este año.

Una vacuna contra la gripe más eficaz ya sería un gran paso, pero Pardi y su grupo están yendo más allá, intentando crear una vacuna que se dirija a las estructuras fundamentales e inmutables del virus de la gripe. “Una vacuna universal, una sola inyección que duraría años”, dice. Décadas de investigación sugieren muchos objetivos probables en el virus de la influenza para dicha vacuna, pero apuntar a múltiples sitios a través de múltiples cepas de influenza aumenta rápidamente la complejidad y los costos del enfoque tradicional. No es así con el ARNm, dice Pardi: “Podemos tener fácilmente 12 o 14 objetivos en un solo disparo. Cuatro proteínas, y sus variantes, en múltiples cepas ".

El grupo de Pardi y sus colaboradores ya demostraron buenos resultados para una vacuna en ratones. Los hurones son los siguientes en la escala de las pruebas con animales, "con suerte este año", dice. Es posible que si su vacuna universal funciona en unos pocos años, no competirá con las vacunas tradicionales contra la gripe, sino con las vacunas estacionales basadas en ARNm que BioNTech y Moderna están a punto de probar ahora. “Durante muchos años tuvimos que convencer a la gente de que esta tecnología era viable; el mundo ha cambiado totalmente en ese sentido”, dice. Al igual que Karikó, está feliz de ver que se acumulan más científicos. “Nos gusta ver eso. En los próximos años aprenderemos mucho sobre cómo funciona la tecnología ".

Un trabajador de laboratorio en las instalaciones de Mainz de BioNTech

LA INFLUENZA ES UNA objetivo obvio para el ARNm, dice la Dra. Lynda Stuart, subdirectora de vacunas de la Fundación Gates. Ella espera que la plataforma “transforme las vacunas contra la influenza” y que hay muchas otras vacunas que podría mejorar o reemplazar. Pero más allá de eso, también podría ayudar con lo que ella llama "problemas y enfermedades reales, difíciles e intratables". Debido a que la plataforma puede producir ARN nuevo de manera tan rápida y económica, “no es necesario que pase por este largo proceso de fabricación con cada idea. Es más rápido probarlos. Podemos llegar a nuevas ideas más rápido ".

Quizás ningún virus ha demostrado ser más duro o intratable que el VIH. “Estamos casi 40 años después del descubrimiento del VIH”, dice Mark Feinberg, director de la Iniciativa Internacional de Vacunas contra el SIDA (IAVI), y a pesar de los avances en tratamientos y profilaxis, una cura “no está cerca”. Hay una maraña de problemas. El VIH es una infección a largo plazo, que se esconde silenciosamente dentro de nuestras células en lugar de librar una batalla campal inmediata con el sistema inmunológico, como Covid-19 o la gripe. Muta increíblemente rápido, a menudo creando múltiples variantes dentro de un solo paciente, por lo que no tiene un objetivo único y estable al que apuntar una vacuna. Un bioquímico me describió la proteína del pico de coronavirus como un "objetivo jugoso", razón por la cual tantas vacunas diferentes actúan en su contra. “Un pico consigue una muy buena respuesta inmunológica. Las proteínas del VIH no tanto ”, dice Feinberg.

Pero los científicos creen que tienen una hoja de ruta para una vacuna. Como explica Derek Cain, profesor del Human Vaccine Institute de la Universidad de Duke, una pequeña fracción de las personas con infecciones prolongadas por el VIH finalmente desarrollan lo que se denominan "anticuerpos ampliamente neutralizantes" contra el virus, capaces de detenerlo antes de que ingrese a las células. . En ese punto de la enfermedad, dice, esos anticuerpos son como "un extintor de incendios contra el incendio de una casa con cuatro alarmas". No pueden revertir la infección por sí mismos. Pero si una persona recién expuesta al VIH tuviera los mismos anticuerpos, "de repente es un extintor contra un fósforo" y la infección podría detenerse.

Es como si el sistema inmunológico de esos pacientes fuera un entrenador que acertó en una estrategia ganadora en los últimos minutos de un partido, demasiado tarde para ayudar a su propio equipo. Pero, dice Cain, "podemos recrear esa lucha con una serie de vacunas", mostrando instantáneas de una vacuna del sistema inmunológico no probado de las mismas infecciones por VIH que progresaron durante años en los otros pacientes. Se necesitarán muchas pruebas y errores, múltiples vacunas y ajustes, lo que Stuart llama potencialmente "enjambres de vacunas, con muchos objetivos".

Usando métodos de vacunas tradicionales, esta sería una guerra masiva de desgaste científico. Feinberg dice que, con las vacunas a base de proteínas, "el intervalo entre tener una idea y comenzar un ensayo podría ser fácilmente de dos años".

“Es difícil imaginar tener que pasar por este proceso para cada inmunógeno, cada objetivo”, dice Cain. Pero el ARN no solo se puede hacer más rápido, porque es solo la señal química en lugar de una proteína en sí, sino que también siempre tiene los mismos ingredientes. No necesita un nuevo conjunto de pruebas de seguridad prolongadas antes de ir a juicio. “Puede pasar de una secuencia a la aplicación de una vacuna en la clínica en un período de tiempo sin precedentes. Nos permitiría movernos mucho más rápido ”, dice Feinberg.

De repente, la línea de tiempo científica para este proyecto increíblemente ambicioso se comprime en años, incluso décadas, dice Cain. Su grupo está colaborando actualmente con Pardi y Weissman en Pensilvania para comenzar a seleccionar objetivos, mientras que IAVI y la Fundación Gates están trabajando con Moderna. “La pregunta del millón de dólares sigue siendo si esto funcionará”, dice Cain, pero el enfoque del ARNm podría devolver una respuesta mucho antes de lo que nadie creía posible hace unos pocos años.

“Esa escala era inimaginable antes. Estamos en un punto muy emocionante ”, dice Feinberg.

Sede y laboratorio principal de BioNTech en Mainz, Alemania

LA MISMA HISTORIA se está desarrollando en cientos de campos científicos diferentes. 2020 abrió las compuertas. No es solo que las vacunas Covid-19 validaron el ARNm como un enfoque científico, el lanzamiento de la vacuna también creó una vasta red reguladora y de fabricación para una nueva tecnología en menos de un año. En cierto sentido, Covid construyó la infraestructura para el futuro del ARNm. Los investigadores siempre habían prometido que sería más limpio y más rápido que los métodos tradicionales, pero ahora las empresas también están desarrollando la capacidad para producir miles de millones de dosis al año, y ha sido probado y encontrado seguro en millones de personas. "Estos datos de seguridad, la escala de fabricación, todo es un valor agregado que podría haber tardado años en desarrollarse", dice Stuart. Muchas de las barreras que enfrentan otras tecnologías de cielo azul fueron barridas por la urgencia de la pandemia.

Debido a esto, el número de nuevos proyectos se está disparando. Un informe reciente de Roots Analysis contó más de 150 vacunas de ARNm y otras terapias en desarrollo. Si el ARNm es realmente una nueva era en vacunología, probablemente lo sabremos en un futuro muy cercano, por la gran cantidad de medicamentos que se están probando. BioNTech está trabajando en al menos siete nuevas vacunas, algunas "con el mismo enfoque que con Covid", dice Şahin. Otros, como la tuberculosis y el VIH, pueden ser recorridos más largos. Moderna tiene nueve vacunas en proceso. Nuevos laboratorios y empresas de biotecnología también están haciendo cola para probar suerte, atraídas por la creciente comunidad y la promesa de resultados rápidos.

Ziphius Vaccines, una pequeña empresa belga fundada en 2019 para centrarse en los tratamientos de ARNm para el cáncer, giró hacia las enfermedades infecciosas durante la pandemia. “Nadie creía que se pudiera producir una vacuna tan rápido, pero de repente, con la plataforma [ARNm], se puede obtener un objetivo en seis semanas”, dice Mathieu Ghadanfar, director médico de la empresa. Ziphius eligió rápidamente diez objetivos, incluidos el dengue, la hepatitis y la encefalitis transmitida por garrapatas, y espera tener resultados preclínicos de al menos cuatro para fines de 2022. Debido a los avances del año pasado, las empresas más grandes tienen el conocimiento para ampliar rápidamente los resultados prometedores procedentes de un laboratorio más pequeño. "Hay todas estas instalaciones que ahora pueden producir cualquier vacuna de ARNm, y están aquí para quedarse", dice Ghadanfar. "Todos los días veo una nueva empresa que se está metiendo en el ARNm".

Incluso el proceso de fabricación ya optimizado de estas vacunas puede estar a punto de reducirse aún más, lo que permite que se hagan no solo más fáciles, sino prácticamente en cualquier lugar. Debido a que su composición química es relativamente simple en comparación con todos los virus o células vivas que extraemos para las vacunas tradicionales, las fábricas de ARNm necesitan solo una fracción del espacio. Desde el tamaño de un “campo de fútbol hasta el césped delantero”, me bromeó un ingeniero. Pero no hay ninguna razón por la que no puedan ser aún más pequeños y simples. “Como encajar en un escritorio, del tamaño de una fotocopiadora. Tiene sus productos químicos en un cartucho y listo ”, dice Harris Makatsoris, profesor de sistemas de fabricación sostenible en el King's College de Londres.

Makatsoris está trabajando en un prototipo para hacer precisamente eso. Es parte de un proyecto financiado por el gobierno del Reino Unido llamado Future Vaccine Manufacturing Research Hub, que originalmente tenía la intención de encontrar formas para que las naciones del sur global fabriquen sus propias vacunas. Ese sigue siendo el objetivo, pero después de meses de casi todas las naciones de la Tierra luchando y luchando por suministros limitados, la capacidad de fabricar vacunas es ahora una prioridad gubernamental. Makatsoris imagina estas máquinas a escala personal utilizadas para operaciones a pequeña escala en hospitales, pero en el caso de una pandemia, se convierten en una especie de red nacional de vacunas. "Con algo así como 60 máquinas, podría hacer toda la población de Inglaterra", dice.

O póngalos en una caja y envíelos a donde los necesite. “Técnicamente es bastante desafiante, pero es pequeño, no involucra ningún material peligroso. Es muy transferible ”, dice Cleo Kontoravdi, profesor de ingeniería de biosistemas en el Imperial College. Robin Shattock del Imperial College, que dirige el centro, lo ve en términos similares a la revolución de la computación personal. “El lab-in-a-box es la PC, y las empresas o laboratorios fabrican software: vacunas u otros medicamentos”, dice. Siempre que tenga el hardware, puede ejecutar el programa en cualquier parte del mundo.

Un trabajador de laboratorio en un banco limpio en el laboratorio de cultivo celular de BioNTech

QUIZÁS EL MÁS Lo emocionante de los próximos años es que, como dice Blakney, hay "tantas cosas que aún no sabemos" sobre lo que puede hacer exactamente esta tecnología. El biólogo fundador del ARN James Eberwine dice que a medida que aprendemos más sobre cómo funciona dentro de nuestras células y cómo manipularlo, más poderoso puede volverse. "El futuro realmente es el ARN", dice. "He sido un defensor de eso durante todo este tiempo".

En el futuro inmediato, los conceptos básicos de la entrega de ARN podrían mejorarse enormemente. En este momento, las vacunas de ARNm funcionan como las vacunas tradicionales, inyectadas en un músculo y succionadas por las células que encuentran allí. "Es una herramienta muy contundente", dice Blakney. Se centra en el recubrimiento de nanopartículas de lípidos, el glóbulo de grasa que rodea la carga útil de la vacuna de ARNm como una pompa de jabón. “La gente está encontrando formas ahora de cambiar la composición para que actúe de manera diferente en el cuerpo, para apuntar al bazo o apuntar a los pulmones. Estamos empezando a entender cómo controlar este sistema ”, dice. Karikó prevé agregar nuevas instrucciones que jueguen con las propias señales del cuerpo para mezclar y organizar su ARN, evitando que se use en ciertos tipos de células o cambiando el tiempo y la duración de su acción. Esto podría hacer que la entrega sea más precisa, menos tóxica y, en última instancia, más eficaz.

"Hay posibilidades reales de cielo azul", dice Stuart. Las proteínas creadoras de ARNm son la plantilla básica. Ella sugiere que la tecnología también podría usarse para el reemplazo de proteínas (tratar enfermedades como la fibrosis quística, donde el cuerpo produce una proteína vital de manera incorrecta) y anticuerpos monoclonales (pequeñas células inmunitarias que pueden atacar a las células enfermas y cancerosas para su destrucción). En BioNTech, Şahin ha estado trabajando en ambos desde mucho antes de Covid, y también está entusiasmado con lo que él llama "ingeniería inmunológica", utilizando ARNm para entregar instrucciones para versiones mejoradas de las moléculas inmunes del propio cuerpo, reforzando sus defensas existentes para durar más o reconocer mejor a los invasores.


¿El ARNm se produce de forma constante durante el tiempo? - biología

El dogma central se centra en la producción de los grandes polímeros de ácidos nucleicos y proteínas de la biología. Sin embargo, el control y mantenimiento de las funciones de la célula depende de algo más que la síntesis de nuevas moléculas. La degradación es otro proceso clave en la vida de las macromoléculas de la célula y está estrictamente controlada. De hecho, en el modelo más simple de producción de ARNm, la dinámica del nivel promedio de ARNm viene dada por

donde r es la tasa de producción de ARNm y γ es la constante de velocidad que dicta la desintegración del ARNm. El valor de estado estacionario del ARNm viene dado por

mostrando que, en una primera aproximación, es el equilibrio de los procesos de producción y desintegración lo que controla los niveles de estado estacionario de estas moléculas. Si nuestra ecuación es para el número de copias de moléculas por célula, habrá un cambio abrupto en el número cada vez que las células se dividan, ya que el contenido total de ARNm y proteínas se reparte entre las dos células hijas. Si, en cambio, nuestra ecuación se piensa en el lenguaje de las concentraciones, no tenemos que enfrentar este problema porque a medida que la célula crece, también lo hace el número de moléculas y, por lo tanto, la concentración varía suavemente. El efecto del crecimiento sobre la concentración se puede absorber en la constante de velocidad para que la degradación tenga en cuenta la dilución. Esta es una solución matemáticamente elegante común, pero no inmediatamente intuitiva, por lo que intentaremos aclararla a continuación. Pero primero, ¿cuáles son los valores característicos del ARNm y los tiempos de degradación de las proteínas?

Figura 1: Semividas medidas de ARNm en E. coli, levadura en ciernes y fibroblastos NIH3T3 de ratón. (A, adaptado de JA Bernstein y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA 99: 9697, 2002 B, adaptado de Y. Wang y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA 99: 5860, 2002 C. adaptado de B. Schwanhausser, Nature, 473: 337, 2013).

La vida útil de las moléculas de ARNm suele ser corta en comparación con la escala de tiempo fundamental de la biología celular definida por el tiempo entre las divisiones celulares. Como se muestra en la Figura 1A, para E. coli, la mayoría de las moléculas de ARNm tienen una vida útil de entre 3 y 8 minutos.Los experimentos que condujeron a estos resultados se realizaron inhibiendo la transcripción mediante el uso del fármaco rifampicina que interactúa con la ARN polimerasa y luego preguntando a las células por sus niveles de ARNm en intervalos de dos minutos después del tratamiento con el fármaco. En particular, los niveles de ARN se cuantificaron hibridando con ADN complementarios en una micromatriz y midiendo los niveles relativos de fluorescencia en diferentes puntos de tiempo. Estos tiempos de degradación son solo varias veces más largos que el tiempo mínimo requerido para el alargamiento transcripcional y traduccional, como se explica en la viñeta sobre "¿Qué es más rápido, transcripción o traducción?". Esto refleja la existencia fugaz de algunos mensajes de ARNm.

Dados estos datos de todo el genoma, se pueden explorar varias hipótesis para los fundamentos mecanicistas de las vidas observadas. Por ejemplo, ¿existe una correlación entre la abundancia de ciertos mensajes y su tasa de desintegración? ¿Hay motivos de estructura secundaria o motivos de secuencia que confieren diferencias en las tasas de desintegración? Una de las grandes sorpresas de las mediciones que conducen a la Figura 1A es que no se encontró que ninguno de los conocimientos convencionales sobre los orígenes de la vida útil del ARNm fuera coherente con los datos, que no revelaron una correlación clara con la estructura secundaria, la abundancia de mensajes o la tasa de crecimiento.

Figura 2: L & # 8217éléphant et l & # 8217 Escheria Coli, diciembre de 1972. & # 8220Tout ce qui est vrai pour le Colibacille est vrai pour l & # 8217éléphant & # 8221, o en inglés “Lo que es cierto para E. coli es cierto para el elefante". De: http://www.pasteur.fr/infosci/ archives / mon / im_ele.html

¿Hasta qué punto la afirmación de Monod de que "lo que es cierto para E. coli ¿Es cierto para el elefante ”(representado por Monod en la Figura 2) nos lleva en nuestra evaluación de la vida útil del ARNm en otros organismos? La respuesta corta no es muy. Mientras que la vida media de degradación del ARNm es de aproximadamente 5 minutos en E. coli, la vida media es aproximadamente 20 minutos en el caso de la levadura (ver Figura 1B) y 600 minutos (BNID 106869) en células humanas. Curiosamente, se observa una escala clara con los tiempos del ciclo celular para estos tres tipos de células de aproximadamente 30 minutos (E. coli), 90 minutos (levadura en ciernes) y 3000 minutos (humano), bajo las tasas de crecimiento exponencial rápido en las que se cultivaron las células de interés para estos experimentos. Como regla general, estos resultados sugieren que la escala de tiempo de degradación del ARNm en estos casos es, por tanto, aproximadamente una quinta parte del tiempo del ciclo celular exponencial rápido.

El ARN mensajero no es el único objetivo de degradación. Las moléculas de proteína también son el objetivo de una destrucción específica, aunque en general, su vida útil tiende a ser más larga que la de los ARNm que conducen a su síntesis, como se analiza a continuación. Debido a estas vidas prolongadas, con tasas de crecimiento rápidas, el número de copias de una proteína en particular por célula se reduce no debido a un proceso de degradación activo, sino simplemente porque la célula duplica todos sus demás componentes y se divide en dos hijas dejando a cada una de las hijas. con la mitad de copias de la proteína de interés que estaban presentes en la célula madre. Para comprender el efecto de dilución, imagine que toda la síntesis de proteínas para una proteína determinada se ha desactivado mientras la célula sigue duplicando su volumen y poco después se divide. En términos de valores absolutos, si el número de copias de nuestra proteína de interés antes de la división es N, luego es N / 2. En términos de concentraciones, si comenzaba con una concentración c, durante el ciclo celular se diluía a c / 2 al duplicar el volumen. Este mecanismo es especialmente relevante en el contexto de las bacterias, donde la vida útil de las proteínas suele estar dominada por el tiempo de división celular. Como resultado, la tasa de pérdida de proteína total α (el término que tiene el mismo significado que γ para el ARNm) es la suma de una parte debido a la degradación activa y una parte debido a la dilución que ocurre cuando las células se dividen y podemos escribir el total tasa de eliminación en la forma α = αactivo+ αdilución.

La afirmación de que la vida útil de las proteínas en las bacterias de crecimiento rápido es más larga que el ciclo celular en sí está respaldada por mediciones ya realizadas en la década de 1960, en las que se utilizaba el etiquetado radiactivo como una forma de medir las tasas. En este caso, la degradación de las proteínas marcadas se controló observando la acumulación de aminoácidos radiactivos en un perfundido intercambiado rápidamente. Se estimó que solo el 2-7% del proteoma se degradaba activamente, con una vida media de aproximadamente 1 hora (BNID 108404). Más recientemente, los estudios mostraron casos específicos de degradación rápida, incluidos algunos factores sigma, factores de transcripción y proteínas de choque frío, sin embargo, la afirmación general de que la dilución es el mecanismo de pérdida de proteínas dominante en las bacterias sigue siendo válida.

Figura 3: Semividas medidas de proteínas en levadura en ciernes y una línea celular de cáncer humano HeLa. El experimento de levadura utilizó el inhibidor de la traducción cicloheximida que altera la fisiología celular normal. La vida media media de las proteínas 4100 medidas en la célula HeLa que no se divide es de 36 horas. (A, adaptado de A. Belle et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 103: 13004, 2006 B, adaptado de S. Cambridge et al, J. Proteome Res. 10: 5275, 2011.)

Al igual que con los estudios de todo el genoma de la vida útil del ARNm descritos anteriormente, la vida útil de las proteínas se ha sometido a un escrutinio similar. Sorprendentemente, no pudimos encontrar información de todo el genoma en la literatura sobre los tiempos de degradación de las proteínas en E. coli pero en la levadura en ciernes, se usó un fármaco de inhibición de la traducción (cicloheximida) para inhibir la síntesis macromolecular y luego se cuantificó el contenido de proteína en puntos de tiempo posteriores usando transferencias Western. La técnica de Western blot es un esquema en el que las proteínas de interés se extraen mediante la unión específica a alguna parte de la proteína (por ejemplo, mediante anticuerpos) y la cantidad de proteína se lee a partir de la intensidad de un indicador que ha sido calibrado contra un estandar. La inhibición de la traducción podría causar artefactos, pero con esa salvedad en mente, las vidas útiles medidas que se muestran en la Figura 3A usando el método de inhibición de la traducción revelan las vidas más largas de las proteínas en comparación con sus contrapartes de ARNm, con una vida media de aproximadamente 40 minutos (BNID 104151). La cuestión de la precisión de estos resultados todavía requiere el desarrollo de nuevos métodos para construir tales encuestas.

Figura 4: Distribución de 100 proteínas de una línea celular humana H1299, comparando la velocidad de degradación con la dilución para encontrar qué mecanismo de eliminación es dominante para cada una de las proteínas. La tasa de eliminación total alfa varía entre 0,03 y 0,82 hora-1 con un promedio de 0,1 +/- 0,09 hora-1. Esto equivale a una semivida de ~ 7 horas mediante la relación semivida, T1 / 2 = ln (2) / alfa. Adaptado de E. Eden et al, Science, 331: 764, 2011.

Utilizando técnicas modernas de fluorescencia, ha sido posible medir las tasas de degradación de proteínas humanas. en vivo sin necesidad de lisar las células. Los largos tiempos de eliminación observados en células humanas se muestran en la Figura 3B. Las mediciones se realizaron fusionando la proteína de interés con una proteína fluorescente. Luego, dividiendo la población en dos grupos, uno de los cuales está fotoblanqueado y el otro no, y observando el resurgimiento de la fluorescencia en la población fotoblanqueada, es posible medir directamente el tiempo de degradación. Como se muestra en la Figura 4, para las células humanas existe una interacción interesante entre la degradación activa y la eliminación de proteínas por dilución. Se observó que las semividas de degradación activa estaban ampliamente distribuidas con la rotación más rápida observada de menos de una hora y la más lenta mostrando solo una degradación activa insignificante en los pocos días de microscopía de lapso de tiempo. Estos resultados pueden contrastarse con una predicción basada en la regla del extremo N que establece que el aminoácido en el extremo N de la proteína tiene un fuerte efecto sobre la degradación activa realizada a través del sistema de ubiquitinación. Por ejemplo, en los sistemas de mamíferos predice que la arginina, el glutamato y la glutamina conducirán a la degradación en aproximadamente una hora, mientras que la valina, la metionina y la glicina serán estables durante decenas de horas.

Al tratar de caracterizar la vida útil de las proteínas más estables, se les dio a los ratones alimentos marcados isotópicamente durante un período corto a una edad temprana y luego se analizaron un año después. Los resultados mostraron que la mayoría de las proteínas se renuevan en unos pocos días, pero algunas muestran una estabilidad notable. Las vidas medias de las histonas se midieron a ~ 200 días, incluso más tentador, el poro nuclear consiste en un andamio de proteína con vida media & gt1 año, mientras que todos los componentes circundantes se reponen mucho más rápido.


Ver el vídeo: Will the vaccine continue to make spike proteins? (Agosto 2022).