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¿Cuál es el significado de ejecutar un plásmido sin cortar en gel de electroforesis?

¿Cuál es el significado de ejecutar un plásmido sin cortar en gel de electroforesis?



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¿Cuál es la importancia de ejecutar un plásmido sin cortar en gel de electroforesis?

En este caso, estamos hablando de insertar un gen en un plásmido, que luego pasa por PCR y luego por electroforesis.


Se utiliza para determinar si la cantidad no utilizada / en exceso de plásmido ha contaminado la solución final del ADN recombinante deseado o no. La electroforesis se realiza en el plásmido "blanco" (sin cortar) para definir sus bandas. Si el resultado de la electroforesis contiene las bandas de ADN "blanco" y recombinante, muestra que la solución no es 100% pura.


Propósitos del ADN plasmídico sin cortar - (28 / Jul / 2007)

Hola, hice electroforesis en gel después de la extracción del plásmido la semana pasada, un estudiante de último año nos explicó la importancia del ADN plasmídico sin cortar. pero todavía no comprendo los propósitos de estos ADN plasmídicos superenrollados, mellados y lineales. bastante confuso. Estaría muy contento si alguien pudiera ayudarme a resolver mis problemas. Soy un estudiante de segundo año de biotecnología, pero todavía soy muy terco a la hora de discutir los resultados de mi experimento.

Estoy tan perplejo como tú. Para la mayoría de los propósitos de clonación, el ADN plasmídico en su forma sin cortar no es muy informativo. Ni siquiera puedes decir el tamaño del plásmido. El ADN lineal (en la escalera) se ejecuta de manera diferente al ADN superenrollado (en el que entrará el plásmido)

Quizás su superior estaba explicando las diversas formas de plásmido, en el contexto del control de calidad. Si es así, piénselo de esta manera. Solo el plásmido completamente intacto, como en el plásmido superenrollado, es útil para usted. El ADN plasmídico dañado y roto es de poca utilidad, no se replican con precisión, en su mayoría inútiles para PCR e inutilizables para trabajos de ligación posteriores. Entonces, al ejecutar el plásmido sin procesar, puede saber si su preparación de ADN se ha realizado con éxito.

Ahora, por otro lado, casi todas las cepas modernas de clonación de E. coli se han diseñado de modo que la producción de endonucleasas nativas y recombinasas se haya eliminado en su mayor parte. Por lo tanto, ya no es tan importante ni tan difícil realizar una buena preparación de ADN.

tat tiene sentido, yo & # 96 tomaré la parte tat dice abt & # 96 ADN plasmídico dañado y problemas de replicación & # 96 gracias 4 la respuesta

Mi antiguo IP solía sugerir ejecutar ADN no digerido después de la clonación para tener una idea de si la ligadura funcionaba o no. Pero el inserto tiene que tener más del 10% del tamaño del plásmido original, creo. De esta manera, puede ahorrar algunas enzimas y no tiene que hacer muchos resúmenes de minipreparación. Pero puede llevar mucho tiempo.


ADN plasmídico sin cortar - (26 / Nov / 2006)

Cuando el ADN plasmídico sin cortar se separa mediante electroforesis en gel de agarosa, solo hay 1 banda visible de ADN superenrollado o 3 bandas visibles de círculo abierto, lineal y superenrollado.

Cuando el ADN plasmídico sin cortar se separa mediante electroforesis en gel de agarosa, solo hay 1 banda visible de ADN superenrollado o 3 bandas visibles de círculo abierto, lineal y superenrollado.

Plásmido circular más alto: mellado o relajado
Medio - lineal
Más bajo - superenrollado

Entonces puede obtener todas esas otras combinaciones de dímeros y son más altas que la banda de plásmido cirular mellada o relajada.

Plásmido circular más alto: mellado o relajado
Medio - lineal
Más bajo - superenrollado

Entonces puede obtener todas esas otras combinaciones de dímeros y son más altas que la banda de plásmido cirular mellada o relajada.

Dos de mi ADN de minipreparación. La izquierda es una BUENA en la que tiene un ADN superenrollado principal y a la derecha hay una minipreparación mala que tiene todo tipo de ADN mencionado en la cita anterior & # 33

está bien. ¿Puedo preguntar un qn: por qué uno puede encontrar las 3 formas aunque el plásmido se considera como & quot sin cortar & quot & # 33 & # 33 & # 33?

Porque simplemente no había suficiente amor. para que el ADN no te devuelva el amor.

Básicamente, el operador tardó demasiado en completar la extracción de ADN y la posterior desprotección y / o ha tratado el ADN con demasiada dureza, lo que ha provocado una gran ruptura del plásmido.

Demasiado vórtex y / o tomó demasiado tiempo para eliminar todas las nucleasas.


Consejos y trucos del resumen de restricciones:

Los siguientes consejos le facilitarán la obtención de un resumen de restricciones de diagnóstico útil e informativo.

Para su resumen:

  • Intente elegir enzimas únicas. Las enzimas que solo cortan una vez le permiten visualizar de manera más fácil y precisa el tamaño completo de su construcción.

Para tu gel:

  • Agregue bromuro de etidio (EtBr) a su gel antes de verterlo. EtBr se une al ADN y le permite visualizar el ADN bajo luz ultravioleta (UV).

Espero que estos consejos demuestren que la verificación de plásmidos no solo es necesaria, sino que también es un proceso sencillo. Visite el recurso de Addgene para la verificación de plásmidos para encontrar consejos adicionales y protocolos detallados sobre temas como cómo configurar sus resúmenes y verter / ejecutar un gel de ADN.


Para visualizar los resultados del experimento, realizaremos electroforesis en agarosa en nuestras muestras digeridas. El examen del gel puede permitirnos detectar digestiones de plásmido fallidas porque las diferencias en la forma física de los plásmidos cortados y no cortados hacen que migren a diferentes velocidades a través del gel incluso cuando tienen la misma longitud. Los plásmidos sin cortar pueden tener dos formas: relajado y superenrollado (o superhelical). Estas dos formas pueden entenderse comparándolas con una goma elástica. Una banda de goma normal es como la forma relajada. Si agarra un lado de la banda entre el pulgar y el índice y gira ese lado, la banda se retorcerá en una forma compacta similar a un plásmido superenrollado. Si corta la banda con unas tijeras, ya no quedará torcida.

En la electroforesis en gel de ADN, normalmente consideramos que la velocidad de migración de un fragmento de ADN depende principalmente de su tamaño (a diferencia de las proteínas que tienen una velocidad de migración que también puede verse afectada significativamente por el pH del gel). Sin embargo, esto no es así con los fragmentos de ADN no lineales porque su forma tiene un efecto importante en su velocidad de migración. Debido a su tamaño compacto, los plásmidos superenrollados pueden moverse a través de un gel mucho más rápidamente que un fragmento lineal de ADN con el mismo número de pares de bases. Del mismo modo, los plásmidos relajados sin cortar generalmente se mueven a una velocidad diferente que un fragmento cortado de la misma masa.

Fig. 5. Bandas de gel de plásmidos cortados (izquierda) y sin cortar (derecha). Todos tienen la misma masa en pares de bases, pero están en diferentes posiciones porque su forma diferente hace que se muevan a través del gel a diferentes velocidades.

En la Fig. 5, el carril de la izquierda contiene un plásmido que se digirió en un lugar con una enzima de restricción. El carril de la derecha contiene el mismo plásmido sin digerir. El carril con la muestra digerida tiene una sola banda, mientras que el carril con la muestra no digerida tiene tres bandas. Si la banda inferior se hubiera movido más rápidamente porque era un fragmento más pequeño que los demás, entonces esperaríamos que fuera mucho más tenue que las otras porque, en general, el tinte menos fluorescente está intercolado por fragmentos más pequeños. Sin embargo, en este caso, la banda inferior es mucho más brillante que las otras bandas, ya sea porque la forma superenrollada retiene mejor el tinte o porque una fracción más alta de las moléculas en ese carril estaban en la forma superenrollada que en otras formas. Una banda tenue es apenas visible en el carril derecho a la misma altura que la banda en el carril con el plásmido digerido. Es probable que se trate de moléculas de plásmido lineales que se rompieron mecánicamente (no se agregó enzima a esa muestra); la debilidad de la banda es una indicación de que hay relativamente pocas de estas moléculas. Por eliminación, podemos inferir que la banda superior es un plásmido sin cortar en forma relajada. Algún aspecto de su forma hace que se mueva más lentamente que las moléculas lineales. Dado que las tres bandas del carril derecho contienen fragmentos de ADN con el mismo número de pares de bases, está claro que la forma de la molécula tiene un efecto importante en su velocidad de migración.


Cómo interpretar los resultados de la electroforesis en gel

  1. Si es posible, cargue plásmidos no digeridos, linealizados y con radiación UV uno al lado del otro en el gel de agarosa, luego puede comparar las bandas entre esas muestras.
  2. En general, las formas CCC superenrolladas de monómeros se mueven más rápido que cualquier otra forma, porque tienen una estructura de ADN superenrollada compacta. Por lo tanto, aparecerán más abajo en el gel.
  3. Los monómeros circulares abiertos (OC) y lineales se mueven más lentamente que el monómero CCC superenrollado. Tienen más dificultad para atravesar los poros de la matriz de gel que la forma CCC. Por lo tanto, las formas OC aparecerán más arriba en el gel. El orden de migración suele ser la forma CCC del monómero (la más rápida), seguida de la forma lineal y la forma OC.
  4. El ADN plasmídico completamente digerido generalmente muestra solo una banda única, una forma lineal del plásmido, en su carril con el tamaño esperado. El plásmido no digerido puede presentar dos formas en su carril: formas de dímero CCC y monómero CCC. Las formas de dímero, debido a su tamaño mayor y duplicado en comparación con los monómeros, generalmente se mueven más lentamente que los monómeros. Por lo tanto, aparecerá más alto en un gel que en un monómero. La forma de monómero CCC corre más rápido que la forma lineal de ADN plasmídico digerido.

Ejemplos de electroforesis en gel para formas plásmidas. Carril 1: Escalera de ADN. Carril 2: Plásmido A no digerido. Carril 3: Plásmido A completamente digerido. Carril 4: ADN plasmídico irradiado con UV.

Ahora, como práctica, ¿puedes adivinar cada forma de plásmido a partir de estas bandas del gel de agarosa de abajo?

Electroforesis en gel. Carril 1: Escalera de ADN. Carril 2: Plásmido A no digerido. Carril 3: Plásmido A completamente digerido.

Para el carril 2, es posible que pueda ver dos bandas. La banda tenue en la parte superior es OC y la de abajo es la forma CCC. Para el carril 3, es el plásmido completamente digerido, por lo que la banda tiene una forma lineal.

¿Cómo identifica sus bandas a partir de sus geles de agarosa?

Durante la electroforesis en gel, es posible que deba cargar ADN plasmídico sin cortar, fragmento de ADN digerido, producto de PCR y probablemente ADN genómico que utilice como plantilla de PCR en los pocillos. Su fragmento de ADN digerido es un producto de PCR digerido. El siguiente paso es identificar esas bandas para averiguar cuál cortar.

Electroforesis en gel. Carril 1: Escalera de ADN. Carril 2: Plásmido A no digerido. Carril 3: Plásmido A completamente digerido. Carril 4: Producto de PCR digerido (o Fragmento de ADN). Carril 5: Producto de PCR (con una banda de dímero de cebador tenue). Carril 6: ADN genómico. Las flechas blancas indican las bandas que desea eliminar.

Consejos para identificar la banda correcta para eliminar de su gel

  • El ADN plasmídico sin cortar en el gel de agarosa es fácil de identificar porque puede tener dos formas de plásmido (formas OC y CCC).
  • El plásmido digerido, el fragmento de ADN digerido, el producto de PCR y el ADN genómico pueden tener una sola banda. Para identificar estas bandas, deberá verificar su tamaño consultando la escala de ADN. Su plásmido digerido tiene una forma lineal con el tamaño entre las formas OC y CCC del plásmido sin cortar. El ADN genómico tiene un tamaño grande. Entonces, el ADN genómico generalmente se muestra en la parte superior de su gel (muy cerca de su pozo).
  • El fragmento de ADN digerido puede tener una sola banda de tamaño casi similar al de su producto de PCR. Este es su tamaño objetivo, y la banda en este fragmento de ADN digerido es la que desea eliminar.
  • En la parte inferior de la línea de productos de PCR, es posible que vea una banda tenue que indica moléculas pequeñas. Estas pequeñas moléculas son sus moléculas de cebador que se unen a otras moléculas de cebador para formar un dímero de cebador. El tamaño de estas pequeñas moléculas no es su tamaño objetivo, por lo que no desea eliminar esta banda.

Para obtener más información sobre cómo interpretar la electroforesis en gel de ADN, vea nuestro video a continuación:


Electroforesis en gel de agarosa de ADN plasmídico - Electroforesis en gel de agarosa de ADN plasmídico (06 / Mar / 2005)

Tengo un fagémido pBSK + de tamaño 2958 pb. Cloné un gen de tamaño 1167bp en este fagémido. Ahora, someto lo siguiente a electroforesis en gel de agarosa:
(1) Sin cortar, pBSK + nativo, sin inserto.
(2) Sin cortar, pBSK, con mi inserto clonado.
Entonces, son básicamente ADN circulares cerrados.
¿Cuáles serían los tamaños de banda con los que observaría las 2 muestras anteriores?
Por favor ayuda. Este es un proyecto de estudiantes.
--- Thivaharan ([email protected])

Puede ejecutar estas muestras contra otros plásmidos circulares cerrados para comparar los tamaños, pero probablemente sería mejor linealizar primero el plásmido. Un plásmido circular cerrado dará una serie de bandas dependiendo del grado de superenrollamiento. Lo que haría sería cortar ambos plásmidos con las enzimas de restricción que usaste para clonar para que puedas ver que el fragmento que clonaste tiene el tamaño correcto.


Lisis alcalina:

La lisis alcalina es un método utilizado en biología molecular para aislar el ADN plasmídico u otros componentes celulares, como las proteínas, rompiendo las células para abrirlas. Las bacterias que contienen el plásmido de interés se cultivan primero y luego se dejan lisar con un tampón de lisis alcalino que consiste en un detergente dodecilsulfato de sodio (SDS) y una base fuerte de hidróxido de sodio. El detergente escinde la bicapa de fosfolípidos de la membrana y el álcali desnaturaliza las proteínas que participan en el mantenimiento de la estructura de la membrana celular. Mediante una serie de pasos que implican agitación, precipitación, centrifugación y eliminación del sobrenadante, se eliminan los restos celulares y se aísla y purifica el plásmido.


Los amplios pasos involucrados en un protocolo común de electroforesis en gel de ADN:

1. Preparación de las muestras para su ejecución.

2. Se prepara una solución de gel de agarosa TAE.

El tampón TAE proporciona una fuente de iones para configurar el campo eléctrico durante la electroforesis. La concentración de peso a volumen de agarosa en tampón TAE se utiliza para preparar la solución. Por ejemplo, si se requiere un gel de agarosa al 1%, se agrega 1 g de agarosa a 100 ml de TAE. El porcentaje de agarosa utilizado está determinado por el tamaño que se espera que tenga el ADN. Si se busca separar un grupo de bandas de ADN de menor tamaño (& lt500bp), se prepara un gel de agarosa de mayor porcentaje (& gt1%). El mayor porcentaje de agarosa crea un tamiz más denso para aumentar la separación de pequeñas diferencias en la longitud del ADN. La solución de agarosa-TAE se calienta para disolver la agarosa.

3. Colada del gel

La solución de agarosa TAE es vertido en una bandeja de fundición que, una vez que la solución de gel se ha enfriado y solidificado, crea una losa de gel con una fila de pocillos en la parte superior.

4. Configuración de la cámara de electroforesis

El gel sólido se coloca en una cámara llena de Tampón TAE. El gel se coloca de modo que los pozos de la cámara estén más cerca del electrodo negativo de la cámara.

5. Carga del gel

los pozos de la cámara de gel se cargan con las muestras de ADN y, por lo general, también se carga una escalera de ADN como referencia para los tamaños.

6. Electroforesis

Los cables negativo y positivo están conectados a la cámara y a una fuente de alimentación donde se establece el voltaje. Al encender la fuente de alimentación se configura el campo eléctrico y las muestras de ADN cargadas negativamente comenzarán a migrar a través del gel y alejarse del electrodo negativo hacia el positivo.

7. Detener la electroforesis y visualizar el ADN

Una vez que el tinte azul en las muestras de ADN ha migrado a través del gel lo suficiente, se apaga la fuente de alimentación y se retira el gel y se coloca en una solución de bromuro de etidio. El bromuro de etidio se intercala entre el ADN y es visible a la luz ultravioleta. A veces, se agrega bromuro de etidio directamente a la solución de gel de agarosa en el paso 2. A continuación, el gel teñido con bromuro de etidio se expone a luz ultravioleta y se toma una fotografía. Las bandas de ADN se visualizan en cada carril correspondiente a un pozo de la cámara. También se visualiza la escalera de ADN que se cargó y se puede estimar la longitud de las bandas de ADN. En la figura siguiente se ofrece un ejemplo.


Cómo funciona la electroforesis

En la electroforesis, hay dos factores principales que controlan la rapidez con que se puede mover una partícula y en qué dirección. Primero, el cargo en la muestra es importante. Las especies cargadas negativamente son atraídas por el polo positivo de un campo eléctrico, mientras que las especies cargadas positivamente son atraídas por el extremo negativo. Una especie neutra puede ionizarse si el campo es lo suficientemente fuerte. De lo contrario, no tiende a verse afectado.

El otro factor es el tamaño de las partículas. Los iones y moléculas pequeños pueden moverse a través de un gel o líquido mucho más rápidamente que los más grandes.

Mientras que una partícula cargada es atraída por una carga opuesta en un campo eléctrico, existen otras fuerzas que afectan la forma en que se mueve una molécula. La fricción y la fuerza de retardo electrostático ralentizan el progreso de las partículas a través del fluido o gel. En el caso de la electroforesis en gel, la concentración del gel se puede controlar para determinar el tamaño de los poros de la matriz del gel, lo que influye en la movilidad. También está presente un tampón líquido, que controla el pH del medio ambiente.

A medida que las moléculas pasan a través de un líquido o gel, el medio se calienta. Esto puede desnaturalizar las moléculas y afectar la velocidad de movimiento. El voltaje se controla para tratar de minimizar el tiempo necesario para separar moléculas, manteniendo una buena separación y manteniendo intactas las especies químicas. A veces, la electroforesis se realiza en un refrigerador para ayudar a compensar el calor.


Ver el vídeo: Electroforesis de ADN en gel de agarosa IQOG-CSIC (Agosto 2022).