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¿Están los genes de los factores transcripcionales cerca de sus objetivos en el genoma?


Los factores de transcripción (activadores y represores) son proteínas que regulan la transcripción. Al ser proteínas, ellas mismas también están hechas de la expresión de ciertas secuencias / genes de ADN.

Por ejemplo, el represor del operón lac está codificado por el gen lacI. Ahora, en el caso del operón lac, el gen del factor de transcripción está al lado de la secuencia promotora. De hecho, es parte del operón lac. De manera similar, el gen trpR es parte del operón trp.

Este es siempre el caso? ¿El gen que codifica el factor de transcripción siempre está presente junto a (o cerca de) la unidad de transcripción?

Los dos operones mencionados están solo en procariotas. ¿Podría ser que este hecho sea válido solo para procariotas y no para el ADN de eucariotas?


¿El gen que codifica el factor de transcripción siempre está presente junto a (o cerca de) la unidad de transcripción?

No necesariamente. Puede encontrar varios contraejemplos. Incluso para los procariotas, esto no es necesariamente cierto. Los genes regulados por un factor común se denominan regulones y, aunque los genes diana no necesitan estar próximos al regulador, se ha observado que E. coli y B. subtilis que los operones dentro de un regulón están agrupados en el genoma (Zhang et al, 2012). En el mismo estudio, los autores señalan que los regulones pequeños tienen el regulador próximo a ellos (consulte la figura siguiente).


Resumen

Los brasinoesteroides (BR) son reguladores importantes para el crecimiento y desarrollo de las plantas. Los BR señalan el control de las actividades de los factores de transcripción de la familia BES1 y BZR1. La red transcripcional a través de la cual BES1 y BZR regulan un gran número de genes diana se desconoce en su mayor parte. Mediante la combinación de inmunoprecipitación de cromatina junto con matrices de mosaico de Arabidopsis (chip-chip) y estudios de expresión génica, hemos identificado 1609 genes diana BES1 putativos, 404 de los cuales están regulados por BR y / o en ganancia de función bes1-D mutante. Los objetivos de BES1 contribuyen a las respuestas BR e interacciones con otras vías de señalización hormonal o luminosa. El modelado computacional de datos de expresión génica utilizando el algoritmo para la reconstrucción de redes celulares precisas (ARACNe) revela que los factores transcripcionales dirigidos a BES1 forman una red reguladora de genes (GRN). Los mutantes de muchos genes de la red mostraron defectos en las respuestas de BR. Además, encontramos que BES1 funciona para inhibir el desarrollo de cloroplasto al reprimir la expresión de los factores de transcripción GLK1 y GLK2, lo que confirma una hipótesis generada a partir del GRN. Por lo tanto, nuestros resultados proporcionan una visión global de la expresión génica regulada por BR y un GRN que guía los estudios futuros para comprender el crecimiento de las plantas regulado por BR.


Contenido

Una unidad de transcripción de ADN que codifica una proteína puede contener tanto un secuencia de codificación, que se traducirá en la proteína, y secuencias reguladoras, que dirigen y regulan la síntesis de esa proteína. La secuencia reguladora antes ("aguas arriba" de) la secuencia codificante se denomina región no traducida de cinco primos (5'UTR) la secuencia después ("aguas abajo" de) la secuencia codificante se denomina región no traducida de tres primos (3'UTR). [3]

A diferencia de la replicación del ADN, la transcripción da como resultado un complemento de ARN que incluye el nucleótido uracilo (U) en todos los casos en los que se habría producido timina (T) en un complemento de ADN.

Solo una de las dos cadenas de ADN sirve como plantilla para la transcripción. La ARN polimerasa lee la hebra antisentido de ADN desde el extremo 3 'hasta el extremo 5' durante la transcripción (3 '→ 5'). El ARN complementario se crea en la dirección opuesta, en la dirección 5 '→ 3', coincidiendo con la secuencia de la hebra sentido con la excepción del cambio de uracilo por timina. Esta direccionalidad se debe a que la ARN polimerasa solo puede agregar nucleótidos al extremo 3 'de la cadena de ARNm en crecimiento. Este uso de solo la cadena de ADN 3 '→ 5' elimina la necesidad de los fragmentos de Okazaki que se ven en la replicación del ADN. [3] Esto también elimina la necesidad de un cebador de ARN para iniciar la síntesis de ARN, como es el caso de la replicación del ADN.

los noLa hebra de ADN en plantilla (sentido) se denomina hebra codificante, porque su secuencia es la misma que la de la transcripción de ARN recién creada (excepto por la sustitución de timina por uracilo). Esta es la hebra que se usa por convención cuando se presenta una secuencia de ADN. [5]

La transcripción tiene algunos mecanismos de corrección de pruebas, pero son menos y menos efectivos que los controles para copiar ADN. Como resultado, la transcripción tiene una menor fidelidad de copia que la replicación del ADN. [6]

La transcripción se divide en iniciación, promotor escape, alargamiento, y terminación. [7]

Configuración para transcripción Editar

Potenciadores, factores de transcripción, complejo mediador y bucles de ADN en la transcripción de mamíferos Editar

La configuración para la transcripción en mamíferos está regulada por muchos elementos reguladores cis, incluidos el promotor central y los elementos proximales al promotor que se encuentran cerca de los sitios de inicio de la transcripción de los genes. Los promotores centrales combinados con factores de transcripción generales son suficientes para dirigir el inicio de la transcripción, pero generalmente tienen una baja actividad basal. [8] Otros módulos reguladores cis importantes se localizan en regiones de ADN que están distantes de los sitios de inicio de la transcripción. Estos incluyen potenciadores, silenciadores, aislantes y elementos de sujeción. [9] Entre esta constelación de elementos, los potenciadores y sus factores de transcripción asociados tienen un papel principal en el inicio de la transcripción de genes. [10] Un potenciador localizado en una región de ADN distante del promotor de un gen puede tener un efecto muy grande sobre la transcripción genética, y algunos genes experimentan una transcripción hasta 100 veces mayor debido a un potenciador activado. [11]

Los potenciadores son regiones del genoma que son los principales elementos reguladores de genes. Los potenciadores controlan los programas de transcripción de genes específicos del tipo de célula, la mayoría de las veces recorriendo largas distancias para acercarse físicamente a los promotores de sus genes diana. [12] Si bien hay cientos de miles de regiones de ADN potenciador, [13] para un tipo particular de tejido, solo los potenciadores específicos se acercan a los promotores que regulan. En un estudio de neuronas corticales cerebrales, se encontraron 24,937 bucles, lo que trajo potenciadores a sus promotores objetivo. [11] Múltiples potenciadores, cada uno a menudo a decenas o cientos de miles de nucleótidos distantes de sus genes diana, se enlazan con sus promotores de genes diana y pueden coordinarse entre sí para controlar la transcripción de su gen diana común. [12]

La ilustración esquemática de esta sección muestra un potenciador dando vueltas para acercarse físicamente al promotor de un gen diana. El bucle se estabiliza mediante un dímero de una proteína conectora (por ejemplo, dímero de CTCF o YY1), con un miembro del dímero anclado a su motivo de unión en el potenciador y el otro miembro anclado a su motivo de unión en el promotor (representado por el zigzags rojos en la ilustración). [14] Varios factores de transcripción específicos de la función celular (hay alrededor de 1600 factores de transcripción en una célula humana [15]) generalmente se unen a motivos específicos en un potenciador [16] y una pequeña combinación de estos factores de transcripción unidos al potenciador, cuando se acercan a un promotor mediante un bucle de ADN, rige el nivel de transcripción del gen diana. El mediador (un complejo que generalmente consta de aproximadamente 26 proteínas en una estructura que interactúa) comunica las señales reguladoras de los factores de transcripción unidos al ADN potenciador directamente a la enzima ARN polimerasa II (pol II) unida al promotor. [17]

Los potenciadores, cuando están activos, generalmente se transcriben a partir de ambas cadenas de ADN con las ARN polimerasas que actúan en dos direcciones diferentes, produciendo dos ARN potenciadores (eRNA) como se ilustra en la Figura. [18] Un potenciador inactivo puede estar unido por un factor de transcripción inactivo. La fosforilación del factor de transcripción puede activarlo y ese factor de transcripción activado puede activar el potenciador al que está unido (ver la pequeña estrella roja que representa la fosforilación del factor de transcripción unido al potenciador en la ilustración). [19] Un potenciador activado comienza la transcripción de su ARN antes de activar la transcripción del ARN mensajero de su gen objetivo. [20]

Metilación y desmetilación de islas CpG Editar

La regulación de la transcripción en aproximadamente el 60% de los promotores también se controla mediante la metilación de citosinas dentro de los dinucleótidos CpG (donde la citosina 5 'va seguida de guanina 3' o sitios CpG). La 5-metilcitosina (5-mC) es una forma metilada de la citosina base del ADN (ver Figura). 5-mC es un marcador epigenético que se encuentra predominantemente en los sitios CpG. Aproximadamente 28 millones de dinucleótidos CpG se encuentran en el genoma humano. [21] En la mayoría de los tejidos de los mamíferos, en promedio, del 70% al 80% de las citosinas CpG están metiladas (formando 5-metilCpG o 5-mCpG). [22] Las citosinas metiladas dentro de las secuencias de 5'citosina-guanina 3 'a menudo se encuentran en grupos, llamados islas CpG. Aproximadamente el 60% de las secuencias promotoras tienen una isla CpG, mientras que solo aproximadamente el 6% de las secuencias potenciadoras tienen una isla CpG. [23] Las islas CpG constituyen secuencias reguladoras, ya que si las islas CpG están metiladas en el promotor de un gen, esto puede reducir o silenciar la transcripción del gen. [24]

La metilación del ADN regula la transcripción de genes a través de la interacción con proteínas de dominio de unión a metilo (MBD), como MeCP2, MBD1 y MBD2. Estas proteínas MBD se unen más fuertemente a islas CpG altamente metiladas. [25] Estas proteínas MBD tienen un dominio de unión a metil-CpG y un dominio de represión de la transcripción. [25] Se unen al ADN metilado y guían o dirigen complejos de proteínas con actividad de remodelación de cromatina y / o modificación de histonas a islas CpG metiladas. Las proteínas MBD generalmente reprimen la cromatina local, por ejemplo, catalizando la introducción de marcas de histonas represivas o creando un entorno de cromatina represivo general a través de la remodelación de nucleosomas y la reorganización de la cromatina. [25]

Como se señaló en la sección anterior, los factores de transcripción son proteínas que se unen a secuencias de ADN específicas para regular la expresión de un gen. La secuencia de unión de un factor de transcripción en el ADN suele tener una longitud de aproximadamente 10 u 11 nucleótidos. Como se resume en 2009, Vaquerizas et al. indicó que hay aproximadamente 1.400 factores de transcripción diferentes codificados en el genoma humano por genes que constituyen aproximadamente el 6% de todos los genes que codifican proteínas humanas. [26] Aproximadamente el 94% de los sitios de unión del factor de transcripción (TFBS) que están asociados con genes que responden a la señal se encuentran en potenciadores, mientras que solo alrededor del 6% de dichos TFBS se encuentran en promotores. [dieciséis]

La proteína EGR1 es un factor de transcripción particular que es importante para la regulación de la metilación de islas CpG. Un sitio de unión al factor de transcripción EGR1 se localiza frecuentemente en secuencias potenciadoras o promotoras. [27] Hay alrededor de 12.000 sitios de unión para EGR1 en el genoma de los mamíferos y aproximadamente la mitad de los sitios de unión de EGR1 se encuentran en los promotores y la otra mitad en los potenciadores. [27] La ​​unión de EGR1 a su sitio de unión al ADN diana es insensible a la metilación de citosina en el ADN. [27]

Si bien solo se detectan pequeñas cantidades de la proteína del factor de transcripción EGR1 en las células no estimuladas, la traducción de la EGR1 gen en proteína una hora después de la estimulación se eleva drásticamente. [28] La expresión de las proteínas del factor de transcripción EGR1, en varios tipos de células, puede ser estimulada por factores de crecimiento, neurotransmisores, hormonas, estrés y lesiones. [28] En el cerebro, cuando se activan las neuronas, las proteínas EGR1 se regulan positivamente y se unen (reclutan) a las enzimas TET1 preexistentes que están altamente expresadas en las neuronas. Las enzimas TET pueden catalizar la desmetilación de 5-metilcitosina. Cuando los factores de transcripción EGR1 llevan las enzimas TET1 a los sitios de unión de EGR1 en los promotores, las enzimas TET pueden desmetilar las islas CpG metiladas en esos promotores. Tras la desmetilación, estos promotores pueden iniciar la transcripción de sus genes diana. Cientos de genes en neuronas se expresan diferencialmente después de la activación neuronal a través del reclutamiento de TET1 por EGR1 a secuencias reguladoras metiladas en sus promotores. [27]

La metilación de los promotores también se altera en respuesta a las señales. Las tres metiltransferasas de ADN de mamíferos (DNMT1, DNMT3A y DNMT3B) catalizan la adición de grupos metilo a las citosinas en el ADN. Mientras que DNMT1 es una metiltransferasa de “mantenimiento”, DNMT3A y DNMT3B pueden realizar nuevas metilaciones. También hay dos isoformas de proteínas de empalme producidas a partir de DNMT3A gen: proteínas ADN metiltransferasa DNMT3A1 y DNMT3A2. [29]

La isoforma de empalme DNMT3A2 se comporta como el producto de un gen clásico inmediato temprano y, por ejemplo, se produce de forma robusta y transitoria después de la activación neuronal. [30] El lugar donde la isoforma de ADN metiltransferasa DNMT3A2 se une y agrega grupos metilo a las citosinas parece estar determinado por modificaciones postraduccionales de histonas. [31] [32] [33]

Por otro lado, la activación neural provoca la degradación de DNMT3A1 acompañada de metilación reducida de al menos un promotor dirigido evaluado. [34]

Iniciación Editar

La transcripción comienza con la unión de la ARN polimerasa, junto con uno o más factores de transcripción generales, a una secuencia de ADN específica denominada "promotor" para formar un "complejo cerrado" ARN polimerasa-promotor. En el "complejo cerrado", el ADN promotor sigue siendo completamente de doble hebra. [7]

La ARN polimerasa, asistida por uno o más factores de transcripción generales, luego desenrolla aproximadamente 14 pares de bases de ADN para formar un "complejo abierto" de ARN polimerasa-promotor. En el "complejo abierto", el ADN promotor está parcialmente desenrollado y es monocatenario. El ADN monocatenario expuesto se denomina "burbuja de transcripción". [7]

La ARN polimerasa, asistida por uno o más factores de transcripción generales, luego selecciona un sitio de inicio de transcripción en la burbuja de transcripción, se une a un NTP de inicio y un NTP de extensión (o un cebador de ARN corto y un NTP de extensión) complementarios a la secuencia del sitio de inicio de la transcripción, y cataliza la formación de enlaces para producir un producto de ARN inicial. [7]

En las bacterias, la holoenzima de la ARN polimerasa consta de cinco subunidades: 2 subunidades α, 1 subunidad β, 1 subunidad β 'y 1 subunidad ω. En las bacterias, existe un factor de transcripción de ARN general conocido como factor sigma. La enzima del núcleo de la ARN polimerasa se une al factor de transcripción general bacteriano (sigma) para formar la holoenzima de la ARN polimerasa y luego se une a un promotor. [7] (La ARN polimerasa se denomina holoenzima cuando la subunidad sigma está unida a la enzima central, que consta de 2 subunidades α, 1 subunidad β, 1 subunidad β 'únicamente). A diferencia de los eucariotas, el nucleótido iniciador del ARNm bacteriano naciente no está protegido con un nucleótido de guanina modificado. El nucleótido iniciador de las transcripciones bacterianas lleva un trifosfato 5 '(5′-PPP), que puede usarse para el mapeo de todo el genoma de los sitios de inicio de la transcripción. [35]

En arqueas y eucariotas, la ARN polimerasa contiene subunidades homólogas a cada una de las cinco subunidades de ARN polimerasa en bacterias y también contiene subunidades adicionales. En arqueas y eucariotas, las funciones del factor de transcripción general bacteriano sigma son realizadas por múltiples factores de transcripción generales que trabajan juntos. [7] En las arqueas, hay tres factores de transcripción generales: TBP, TFB y TFE. En eucariotas, en la transcripción dependiente de la ARN polimerasa II, hay seis factores de transcripción generales: TFIIA, TFIIB (un ortólogo de TFB arqueal), TFIID (un factor de múltiples subunidades en el que la subunidad clave, TBP, es un ortólogo de TBP arqueal), TFIIE (un ortólogo de archaeal TFE), TFIIF y TFIIH. El TFIID es el primer componente que se une al ADN debido a la unión de TBP, mientras que TFIIH es el último componente en ser reclutado. En arqueas y eucariotas, el complejo cerrado de ARN polimerasa-promotor se denomina habitualmente "complejo de preiniciación". [36]

El inicio de la transcripción está regulado por proteínas adicionales, conocidas como activadores y represores y, en algunos casos, coactivadores o correpresores asociados, que modulan la formación y función del complejo de inicio de la transcripción. [7]

Escape del promotor Editar

Después de que se sintetiza el primer enlace, la ARN polimerasa debe escapar del promotor. Durante este tiempo, existe una tendencia a liberar la transcripción de ARN y producir transcripciones truncadas. Esto se llama iniciación abortiva y es común tanto para eucariotas como para procariotas. [37] La ​​iniciación abortiva continúa ocurriendo hasta que se sintetiza un producto de ARN de una longitud umbral de aproximadamente 10 nucleótidos, momento en el que se produce el escape del promotor y se forma un complejo de elongación de la transcripción.

Mecánicamente, el escape del promotor se produce mediante la compresión del ADN, lo que proporciona la energía necesaria para romper las interacciones entre la holoenzima de la ARN polimerasa y el promotor. [38]

En las bacterias, históricamente se pensó que el factor sigma se liberaba definitivamente después de que se producía la eliminación del promotor. Esta teoría ha sido conocida como la modelo de liberación obligada. Sin embargo, datos posteriores mostraron que tras la eliminación del promotor, el factor sigma se libera de acuerdo con un modelo estocástico conocido como modelo de lanzamiento estocástico. [39]

En eucariotas, en un promotor dependiente de la ARN polimerasa II, tras la eliminación del promotor, TFIIH fosforila la serina 5 en el dominio carboxi terminal de la ARN polimerasa II, lo que conduce al reclutamiento de la enzima de protección (CE). [40] [41] El mecanismo exacto de cómo la CE induce la eliminación del promotor en eucariotas aún no se conoce.

Elongación Editar

Una hebra del ADN, el hebra de plantilla (o hebra no codificante), se utiliza como plantilla para la síntesis de ARN. A medida que avanza la transcripción, la ARN polimerasa atraviesa la hebra de la plantilla y utiliza la complementariedad de emparejamiento de bases con la plantilla de ADN para crear una copia de ARN (que se alarga durante el recorrido). Aunque la ARN polimerasa atraviesa la hebra molde de 3 '→ 5', la hebra codificante (no molde) y el ARN recién formado también se pueden usar como puntos de referencia, por lo que la transcripción puede describirse como ocurriendo 5 '→ 3'. Esto produce una molécula de ARN de 5 '→ 3', una copia exacta de la cadena codificante (excepto que las timinas se reemplazan con uracilos, y los nucleótidos están compuestos de un azúcar ribosa (5 carbonos) donde el ADN tiene desoxirribosa (un oxígeno menos átomo) en su esqueleto de azúcar-fosfato). [ cita necesaria ]

La transcripción de ARNm puede involucrar múltiples ARN polimerasas en una única plantilla de ADN y múltiples rondas de transcripción (amplificación de ARNm particular), por lo que muchas moléculas de ARNm se pueden producir rápidamente a partir de una sola copia de un gen. [ cita necesaria ] Las tasas de alargamiento características en procariotas y eucariotas son de aproximadamente 10-100 nts / seg. [42] En eucariotas, sin embargo, los nucleosomas actúan como barreras importantes para la transcripción de polimerasas durante el alargamiento de la transcripción. [43] [44] En estos organismos, la pausa inducida por los nucleosomas puede ser regulada por factores de elongación de la transcripción como TFIIS. [44]

El alargamiento también implica un mecanismo de corrección de pruebas que puede reemplazar bases incorporadas incorrectamente. En eucariotas, esto puede corresponder con breves pausas durante la transcripción que permiten que se unan los factores de edición de ARN apropiados. Estas pausas pueden ser intrínsecas a la ARN polimerasa o debidas a la estructura de la cromatina. [ cita necesaria ]

Terminación Editar

Las bacterias utilizan dos estrategias diferentes para la terminación de la transcripción: terminación independiente de Rho y terminación dependiente de Rho. En la terminación de la transcripción independiente de Rho, la transcripción del ARN se detiene cuando la molécula de ARN recién sintetizada forma un bucle en horquilla rico en G-C seguido de una serie de Us. Cuando se forma la horquilla, la tensión mecánica rompe los enlaces débiles rU-dA, llenando ahora el híbrido ADN-ARN. Esto saca la transcripción de poli-U del sitio activo de la ARN polimerasa, terminando la transcripción. En el tipo de terminación "dependiente de Rho", un factor proteico llamado "Rho" desestabiliza la interacción entre la plantilla y el ARNm, liberando así el ARNm recién sintetizado del complejo de elongación. [45]

La terminación de la transcripción en eucariotas se comprende menos que en bacterias, pero implica la escisión de la nueva transcripción seguida de la adición de adeninas independiente de la plantilla en su nuevo extremo 3 ', en un proceso llamado poliadenilación. [46]


RESULTADOS

Caracterización de todo el genoma de los sitios de unión de Foxa2 en progenitores de mDA

Para identificar genes diana directos de Foxa2, elegimos un enfoque de genoma completo utilizando ChIP-seq (Barski et al., 2007 Johnson et al., 2007 Robertson et al., 2007). Como no se pudo obtener un número suficiente de progenitores de mDA a partir de embriones de ratón en E10.5, obtuvimos progenitores de mDA por diferenciación in vitro de NestinLmx1a-células ES transfectadas (Andersson et al., 2006b). Generamos de manera eficiente progenitores de mDA puros al 60-80% después de 5 días de diferenciación de NestinLmx1acélulas madre embrionarias transfectadas en presencia de Fgf8 y Shh (material suplementario Fig. S1A, B) (Andersson et al., 2006b). Estos progenitores de mDA generados in vitro expresaron fuertemente Foxa2 en el día 5 y se diferenciaron más en neuronas maduras de mDA Nurr1 + Th + el día 8, como se describió previamente (material suplementario Fig. S1A, B) (Andersson et al., 2006b). Además, se ha demostrado que los progenitores de mDA diferenciados in vitro se desarrollan en neuronas mDA auténticas que integran e inervan el cuerpo estriado de ratas recién nacidas lesionadas con 6-hidroxidopamina cuando se trasplantan al cuerpo estriado (Friling et al., 2009), lo que indica que tienen un potencial funcional similar al de los progenitores embrionarios de mDA.

Diez millones NestinLmx1aSe utilizaron células madre embrionarias transfectadas para preparar cromatina y se utilizó un anticuerpo específico de Foxa2 para ChIP (Mavromatakis et al., 2011). Después de la secuenciación, la llamada de picos se realizó utilizando MACS con un umbral de FDR & lt5%, lo que resultó en un conjunto de datos de 9160 picos de alta confianza. Todas las FBR se anotaron en genes que tienen su sitio de inicio de transcripción (TSS) más cercano al pico. En este estudio se incluyeron varias RBA conocidas y validadas en el SNC, como la Shh potenciador del cerebro (Epstein et al., 1999), Foxa2 potenciador (Sasaki y Hogan, 1996), Foxa1 promotor (Peterson et al., 1997) y Ferd3l (Nato3) promotor (Mansour et al., 2011), pero no el Nkx2.2 y Th promotores (Lin et al., 2009). Como los dos últimos genes no se expresan en nuestro sistema de diferenciación de células ES in vitro, estos loci de genes podrían estar en una configuración de cromatina cerrada e inaccesibles para la unión de Foxa2.

La validación de este conjunto de datos fue realizada por ChIP-qPCR en un subconjunto seleccionado de FBRs ubicadas en genes que se sabe que se expresan en el PF del mesencéfalo, incluyendo Lmx1a, Lmx1b (Andersson et al., 2006b), Msx1 (Andersson et al., 2006b), Ferd3l (Ono et al., 2010 Segev et al., 2001), Corin (Ono et al., 2007), Slit2 (Wang et al., 1999), Cobl (Gasca et al., 1995), Rfx3 (Baas et al., 2006), Bmp6 y BMP7 (Kim et al., 2001), utilizando cromatina del mesencéfalo ventral de ratón E12.5 que contiene principalmente tejido FP. El enriquecimiento dependiente de Foxa2 se confirmó en 17 de 19 de estas FBR (Fig. 1A, B). También confirmamos la unión de Foxa2 en 16 de 20 FBR adicionales ubicadas en genes transcripcionalmente activos seleccionados (material suplementario Fig. S2). Juntos, estos resultados indican un conjunto de datos de alta calidad.

Inmunoprecipitación con cromatina de progenitores de mDA murinos diferenciados in vitro. (A) Los picos de enriquecimiento de Foxa2 identificados por ChIP-seq se muestran para genes seleccionados expresados ​​por progenitores de mDA. Los gráficos muestran las alturas de los picos como números de lecturas secuenciadas. Las flechas indican las ubicaciones de los picos a las que llama MACS. (B) Se realizaron experimentos ChIP-qPCR independientes con cromatina preparada a partir de tejido del mesencéfalo ventral E12.5 para la validación de objetivos candidatos seleccionados, donde el enriquecimiento se muestra como porcentaje de entrada (*PAG& lt0.05). Múltiples picos dentro de una región génica, correspondientes a la lista en el material complementario Tabla S1, se numeran E1 (para el Elemento 1), y así sucesivamente, de izquierda a derecha. -ve1, Foxa2 marco de lectura abierto (Mavromatakis et al., 2011). Las barras de error indican un s.e.m.

Inmunoprecipitación con cromatina de progenitores de mDA murinos diferenciados in vitro. (A) Los picos de enriquecimiento de Foxa2 identificados por ChIP-seq se muestran para genes seleccionados expresados ​​por progenitores de mDA. Los gráficos muestran las alturas de los picos como números de lecturas secuenciadas. Las flechas indican las ubicaciones de los picos a las que llama MACS. (B) Se realizaron experimentos ChIP-qPCR independientes con cromatina preparada a partir de tejido del mesencéfalo ventral E12.5 para la validación de objetivos candidatos seleccionados, donde el enriquecimiento se muestra como porcentaje de entrada (*PAG& lt0.05). Múltiples picos dentro de una región génica, correspondientes a la lista en el material complementario Tabla S1, se numeran E1 (para el Elemento 1), y así sucesivamente, de izquierda a derecha. -ve1, Foxa2 marco de lectura abierto (Mavromatakis et al., 2011). Las barras de error indican un s.e.m.

Análisis del sitio de unión

Los picos en las FBR tenían un ancho promedio de 290 pb y una altura promedio de 16 etiquetas (Fig. 1A). El análisis de motivo de novo de sus secuencias usando MEME (Zhang et al., 2008) reveló, como se esperaba, un enriquecimiento sustancial en los sitios del motivo Foxa2 (Fig. 2A). De los picos, 7298 (80%) contenían al menos un motivo Foxa2 dentro de los 60 pb de la cima del pico (Fig. 2A). Para caracterizar aún más la distribución de los picos, comparamos sus ubicaciones con los genes UCSC RefSeq utilizando CEAS (Shin et al., 2009) y encontramos que el 46,7% de los picos de alta confianza se ubicaron dentro de una región genética que se extiende desde el TSS hasta el 3 ′ UTR aguas abajo (Fig. 2B). En total, el 44,2% de todos los picos se ubicaron dentro de un intrón, el 0,7% dentro de un exón, el 0,8% dentro de la 5'UTR y el 1% dentro de la 3'UTR. Los picos restantes de Foxa2 estaban en regiones intergénicas ubicadas a más de 10 kb aguas arriba o aguas abajo de los genes anotados. Curiosamente, la unión de Foxa2 se enriqueció en las regiones promotoras, con un 3,7% de picos ubicados dentro de 1 kb y un 11% dentro de 10 kb corriente arriba del TSS en comparación con el fondo del genoma (Fig. 2B). La unión de Foxa2 no se enriqueció en las regiones directamente aguas abajo de los genes (Fig. 2B).

Análisis de motivos y distribución de picos en regiones unidas a Foxa2. (A) MEME identificó motivos de unión al factor de transcripción de novo dentro de los 60 pb del centro de los picos de Foxa2. Los resultados de Genomatix incluyen: (1) el número de picos que contenían el motivo de unión del factor de transcripción (2) la puntuación Z de la sobrerrepresentación contra el fondo seleccionado (secuencias aleatorias) y (3) la sobrerrepresentación contra el genoma del ratón, que es el factor de multiplicación del número de motivos Foxa2 dentro del conjunto de datos de ChIP-seq en comparación con una muestra del genoma del mismo tamaño. (B) La distribución y el enriquecimiento en relación con el fondo del genoma de los picos de Foxa2 con respecto a diferentes características genéticas. los PAG-el valor se da entre paréntesis.

Análisis de motivos y distribución de picos en regiones unidas a Foxa2. (A) MEME identificó motivos de unión al factor de transcripción de novo dentro de los 60 pb del centro de los picos de Foxa2. Los resultados de Genomatix incluyen: (1) el número de picos que contenían el motivo de unión del factor de transcripción (2) la puntuación Z de la sobrerrepresentación contra el fondo seleccionado (secuencias aleatorias) y (3) la sobrerrepresentación contra el genoma del ratón, que es el factor de multiplicación del número de motivos Foxa2 dentro del conjunto de datos de ChIP-seq en comparación con una muestra del genoma del mismo tamaño. (B) La distribución y el enriquecimiento en relación con el fondo del genoma de los picos de Foxa2 con respecto a diferentes características genéticas. los PAG-el valor se da entre paréntesis.

La señalización de Foxa2 y Shh tienen funciones similares en el patrón del mesencéfalo ventral (Blaess et al., 2006 Lin et al., 2009) sin embargo, recientemente descubrimos que Foxa2 también atenúa la señalización de Shh al reprimir la expresión de sus transductores intracelulares Gli1, Gli2 y Gli3 ( Mavromatakis et al., 2011). Por lo tanto, examinamos si los objetivos de Gli1 que fueron previamente identificados por el chip ChIP en los progenitores neuronales (Vokes et al., 2007) también están unidos por Foxa2. La unión de Foxa2 se superpuso con diez de las 25 regiones de unión de Gli1, incluidas las ubicadas en Ptch1, Nkx2.9, Gli1, Hhip, Shh y Prdx2, muchos de los cuales se sabe que funcionan como potenciadores dependientes de Gli (Sasaki et al., 1997 Dai et al., 1999 Santagati et al., 2003 Agren et al., 2004 Hallikas et al., 2006) (Fig.3 y material complementario Cuadro S3). Por lo tanto, estos resultados sugieren que Foxa2 y Gli1 co-regulan una serie de objetivos comunes a través de sitios de unión cercanos en el genoma. Además, Foxa2 también enlazó sitios en Gli2 y Gli3 (Mavromatakis et al., 2011) que no se sabe que estén unidos por Gli1 (Fig. 3), lo que sugiere la posibilidad de que Foxa2 regule directamente los tres genes Gli.

Foxa2 alcanza su punto máximo en genes de la vía Shh. (A) Se observaron sitios de unión de Foxa2 en regiones genómicas previamente identificadas como unidas por Gli1 (Vokes et al., 2007), incluso en los genes Ptch1, Nkx2-9, Gli1, Hhip y Foxa2. Picos encontrados en el Shh y Gli3 también se incluyen genes. (B) Se utilizaron experimentos de ChIP-qPCR realizados con cromatina de tejido del mesencéfalo ventral de ratón E12.5 para validar los datos (*PAG& lt0.05). Las barras de error indican un s.e.m. -ve1, Foxa2 marco de lectura abierto -ve2, Gli-ve (una región aguas arriba de Gli2) (Mavromatakis et al., 2011).

Foxa2 alcanza su punto máximo en genes de la vía Shh. (A) Se observaron sitios de unión de Foxa2 en regiones genómicas previamente identificadas como unidas por Gli1 (Vokes et al., 2007), incluso en los genes Ptch1, Nkx2-9, Gli1, Hhip y Foxa2. Picos encontrados en el Shh y Gli3 también se incluyen genes. (B) Se utilizaron experimentos de ChIP-qPCR realizados con cromatina de tejido del mesencéfalo ventral de ratón E12.5 para validar los datos (*PAG& lt0.05). Las barras de error indican un s.e.m. -ve1, Foxa2 marco de lectura abierto -ve2, Gli-ve (una región aguas arriba de Gli2) (Mavromatakis et al., 2011).

Foxa2 regula directa y positivamente la expresión de determinantes clave del linaje mDA

Con el fin de identificar un conjunto básico de genes diana de Foxa2 que son funcionalmente relevantes para el progenitor neuronal mDA y la especificación de FP, mapeamos las FBR a los genes TSS de Ensembl más cercanos. Luego comparamos este conjunto de genes diana candidatos de Foxa2 con una lista de 444 genes que se expresan específicamente en el cerebro medio FP según se genera mediante el perfil de expresión de embriones de ratón E10.5 (Gennet et al., 2011). Curiosamente, el 40% (178) de estos genes FP estaban unidos por Foxa2 (análisis hipergeométrico, PAG= 2,27 × 10 −40 Fig. 4C), lo que sugiere que Foxa2 regula directamente muchos de los genes expresados ​​en este tejido. Luego examinamos las anotaciones funcionales de estos supuestos objetivos Foxa2 utilizando Gene Ontology (GO). Se enriqueció significativamente un amplio espectro de procesos biológicos, incluido el crecimiento celular, el desarrollo embrionario, la diferenciación celular y la comunicación celular (Fig. 4B). Las dianas de Foxa2 también muestran una amplia gama de funciones moleculares, incluida la actividad reguladora de la transcripción, la unión al receptor y la unión del ión calcio (Fig. 4D).

Foxa2 regula directamente genes con múltiples funciones de desarrollo. (A) La superposición entre genes asociados con eventos de unión a Foxa2 y genes expresados ​​predominantemente en la placa del piso (FP) o la región ventrolateral (VL) del mesencéfalo de embriones de ratón E10.5. Los datos de FP y VL se obtuvieron de Gennet et al. (Gennet et al., 2011). (B) Enriquecimiento de términos de ontología genética (GO) de GO Slim para procesos biológicos asociados con genes unidos a Foxa2 específicos de FP. Se muestra el número de genes diana en cada categoría. (C) El número de genes diana Foxa2 en cada región con análisis estadístico. (D) Enriquecimiento de términos GO para funciones moleculares (GO Slim) asociados con genes unidos a Foxa2 específicos de FP. (mi) Análisis de qRT-PCR de genes unidos a Foxa2 específicos de FP seleccionados utilizando tejido del mesencéfalo ventral de E10.5 de tipo salvaje y Foxa1 / 2 embriones cko (*PAG& lt0.05). Las barras de error indican un s.e.m.

Foxa2 regula directamente genes con múltiples funciones de desarrollo. (A) La superposición entre genes asociados con eventos de unión a Foxa2 y genes expresados ​​predominantemente en la placa del piso (FP) o la región ventrolateral (VL) del mesencéfalo de embriones de ratón E10.5. Los datos de FP y VL se obtuvieron de Gennet et al. (Gennet et al., 2011). (B) Enriquecimiento de términos de Ontología Genética (GO) de GO Slim para procesos biológicos asociados con genes unidos a Foxa2 específicos de FP. Se muestra el número de genes diana en cada categoría. (C) El número de genes diana Foxa2 en cada región con análisis estadístico. (D) Enriquecimiento de términos GO para funciones moleculares (GO Slim) asociados con genes unidos a Foxa2 específicos de FP. (mi) Análisis de qRT-PCR de genes unidos a Foxa2 específicos de FP seleccionados utilizando tejido del mesencéfalo ventral de E10.5 de tipo salvaje y Foxa1 / 2 embriones cko (*PAG& lt0.05). Las barras de error indican un s.e.m.

Para abordar aún más la importancia funcional de la unión de Foxa2, analizamos mediante qRT-PCR la expresión de algunos de estos objetivos en el cerebro medio FP de tipo salvaje y Foxa1 / 2 Embriones de ratón mutantes condicionales en E10.5. Seleccionamos objetivos implicados en la regulación transcripcional y la unión a receptores, dos clases de genes con funciones potencialmente importantes en la regulación de la identidad celular. La expresión de nueve de los 17 objetivos de Foxa2 con actividad transcripcional y nueve de los 18 objetivos con actividad de unión al receptor se redujo gravemente en En1CreFoxa1 flox / flox Foxa2 flox / flox (denominado Foxa1 / 2 cko) en comparación con los embriones de control (Fig. 4E). Por tanto, el análisis de esta muestra sugiere que

El 50% de los objetivos de FP candidatos identificados en la Fig.4A están regulados en Foxa1 / 2 embriones cko. Curiosamente, cinco de los 17 objetivos vinculados y regulados identificados en la Fig. 4E, a saber Lmx1a (Andersson et al., 2006b), Msx1 (Andersson et al., 2006b), Ferdl3 (Ono et al., 2010), Foxa1 y Foxa2 (Andersson et al., 2006b), se sabe que tienen funciones esenciales en la regulación de la especificación del progenitor mDA, lo que sugiere que Foxa2 controla directamente la expresión de determinantes esenciales del linaje. Lmx1b también tiene un papel en la regulación de la especificación y diferenciación de neuronas mDA (Andersson et al., 2006b) y está unida (material suplementario Tabla S1) y regulada (Lin et al., 2009) por Foxa2. Su omisión de la lista de genes específicos de FP se debe presumiblemente a que su expresión no está restringida a FP, sino que también está presente en los progenitores del mesencéfalo lateral. En conjunto, estos resultados sugieren que Foxa2 tiene múltiples entradas directas en las vías moleculares que regulan la especificación y diferenciación del linaje progenitor mDA.

Foxa2 regula directa y positivamente la expresión de las moléculas de guía del axón FP

En los embriones de pez cebra, Foxa2 participa en el mantenimiento del carácter diferenciado del FP (Norton et al., 2005). En embriones de ratón, se requiere Foxa2 para la inducción de FP a través de la regulación del morfógeno secretado Shh (Ang y Rossant, 1994 Weinstein et al., 1994), pero se desconoce en gran medida si también tiene papeles posteriores en la función de FP. El FP expresa proteínas secretadas y transmembrana que regulan el crecimiento de los axones comisurales a través de la línea media (revisado por Brose y Tessier-Lavigne, 2000). Los objetivos Foxa2 específicos de FP incluyen genes que codifican factores con actividades de guía de axones (revisados ​​por Kolodkin y Tessier-Lavigne, 2011), como los ligandos Slit Slit2 y Slit3, los miembros de la superfamilia TGFβ Tgfβ2 y Bmp7, las moléculas de adhesión celular de la inmunoglobulina superfamilia Alcam, Chl1 y Nrcam, y Shh (material complementario Cuadro S2). Los experimentos de qRT-PCR indican que la expresión de siete de nueve (78%) de estos genes se reduce en Foxa1 / 2 embriones cko (Fig. 4E), lo que demuestra un nuevo papel de Foxa2 en la promoción de la expresión de factores que controlan la guía de los axones a través de la línea media ventral. Dado que el FP se transforma en progenitores GABAérgicos más dorsales, no podemos descartar formalmente la posibilidad de que algunos de los cambios en la expresión génica (Fig. 4E) en Foxa1 / 2 Los mutantes cko en E10.5 son una consecuencia de la transformación del destino celular (Lin et al., 2009). Por lo tanto, examinamos Slit1, Slit2 y Shh expresión también en NestinCre / + Foxa1 - / - Foxa2 flox / flox embriones, en los que la especificación parcial de la FP todavía ocurre cuando Foxa1 / 2 se eliminan en E10.5. Shh, Slit1 y Slit2 no se expresan en el FP de estos embriones mutantes. Por el contrario, estos genes todavía se expresan en el FP de embriones de tipo salvaje en E12.5 (material suplementario Fig. S3).

Análisis de la actividad potenciadora por transitoria lacZ transgénesis en embriones de ratón y pollo

Para explorar las contribuciones de las RBA a la regulación cis de la expresión génica, seleccionamos las asociadas con Lmx1a, Lmx1b y Corin, tres genes expresados ​​en progenitores de mDA, para análisis funcional por transgénesis. Foxa2 vinculado a tres regiones que rodean Lmx1a que se conservan en 15-18 especies, denominadas E1, E2 y E3, y dos regiones conservadas alrededor Lmx1b denominados E1 y E2 (material complementario Tabla S4). Estos elementos conservados se clonaron en un promotor de β-globina mínimo.lacZ plásmido indicador y se inyecta en cigotos de ratón fertilizados para evaluar su actividad potenciadora mediante tinción con X-gal en E10.5.

El tres Lmx1a regiones genómicas, 522 pb E1, 881 pb E2 y 446 pb E3, promovidas lacZ expresión en embriones transgénicos (Fig. 5A-C ”). Lmx1a Los embriones transgénicos E1 mostraron actividad β-galactosidasa (β-gal) en todo el tubo neural ventral, similar al patrón de expresión de Foxa2 (Fig. 5A-A ″), mientras que el patrón de actividad β-gal en Lmx1a Los embriones transgénicos E2 y E3 se restringieron a la parte rostral del dominio de expresión endógeno de Lmx1a (Andersson et al., 2006b), es decir, el prosencéfalo caudal y el mesencéfalo anterior (Fig. 5B-C ”). La identificación de tres potenciadores para Lmx1a sugiere que múltiples elementos cis-reguladores cooperan para especificar el patrón de expresión espacial preciso de este gen.

Predicción exitosa de potenciadores de FP a partir de eventos de unión de Foxa2 en progenitores de mDA. (A-E) E10.0-10.5 embriones de ratón transgénico que expresan lacZ de un promotor mínimo y potenciadores candidatos unidos por Foxa2 en el Lmx1a, Lmx1b y Corin genes. (A′-E ″) Cortes histológicos a través del mesencéfalo (A′-E ′) y la médula espinal (A ″ -E ″). (F) Montaje completo lacZ tinción de embriones transgénicos que contienen el Lmx1b Potenciador de E1 con una mutación en el sitio de unión de Foxa2. (GRAMO) Alineación de múltiples especies del Lmx1b Potenciador E1 usando ClustalW, con el motivo Foxa2 indicado por el cuadro rojo y las sustituciones de nucleótidos en la versión mutada del motivo en rojo. Se observó una tinción similar en el tejido del mesencéfalo en al menos tres embriones transgénicos para cada uno de los potenciadores ilustrados en esta figura. Barras de escala: 100 μm.

Predicción exitosa de potenciadores de FP a partir de eventos de unión de Foxa2 en progenitores de mDA. (A-E) E10.0-10.5 embriones de ratón transgénico que expresan lacZ de un promotor mínimo y potenciadores candidatos unidos por Foxa2 en el Lmx1a, Lmx1b y Corin genes. (A′-E ″) Cortes histológicos a través del mesencéfalo (A′-E ′) y la médula espinal (A ″ -E ″). (F) Montaje completo lacZ tinción de embriones transgénicos que contienen el Lmx1b Potenciador de E1 con una mutación en el sitio de unión de Foxa2. (GRAMO) Alineación de múltiples especies del Lmx1b Potenciador E1 usando ClustalW, con el motivo Foxa2 indicado por el cuadro rojo y las sustituciones de nucleótidos en la versión mutada del motivo en rojo. Se observó una tinción similar en el tejido del mesencéfalo en al menos tres embriones transgénicos para cada uno de los potenciadores ilustrados en esta figura. Barras de escala: 100 μm.

Uno Lmx1b elemento, la región E1 de 206 pb, gobernó la expresión del gen informador en el FP del mesencéfalo y la médula espinal y en el tejido auditivo futuro (Fig. 5D-D ″), similar a los dominios endógenos de la expresión de Lmx1b (Guo et al., 2007 ). Por el contrario, ninguno de los cinco embriones transgénicos que contienen el Lmx1b La construcción E2 que se analizó expresó β-gal en E10.5. Generamos una mutación en el único sitio de unión de Foxa2 en el Lmx1b Potenciador de E1 para determinar el requisito de unión de Foxa2 para la actividad de este elemento (Fig. 5G). los Lmx1b E1 Foxa2 La construcción mutante no logró impulsar la expresión de β-gal en el FP a lo largo del eje anteroposterior del embrión, el corazón y la parte dorsal del vaso ótico, mientras que la expresión de β-gal ectópica en los somitas se mantuvo (Fig. 5F), lo que indica que la expresión en el FP depende del sitio de Foxa2. Sin embargo, Foxa2 no se expresa en el corazón ni en el vaso ótico, por lo que la dependencia de la expresión de β-gal en el sitio Foxa2 en estas estructuras sugiere que otras proteínas de cabeza de horquilla con propiedades de unión similares ocupan estos sitios.

Corin es una proteasa de la superficie celular que se expresa específicamente en progenitores de mDA en el FP (Ono et al., 2007). Se encontraron dos RBA en el Corin gen, solo uno de los cuales se conserva. Este elemento, llamado E1, fue capaz de promover la expresión de β-gal en el FP en las regiones del mesencéfalo y caudal, excepto en el rombómero 1 (Fig. 5E-E ”).

En conjunto, estos resultados demuestran que al menos algunas de las FBR en los tres genes analizados tienen funciones reguladoras potenciadoras en el FP y que la unión de Foxa2 es necesaria para la actividad potenciadora en el caso de la Lmx1b Elemento E1.

También examinamos si las RBA en Lmx1a, Lmx1b y Corin funcionan como potenciadores en pollos mediante la electroporación de las mismas construcciones anteriores en el mesencéfalo de embriones de pollo en etapa 10 y el análisis de la actividad β-gal 48 horas después. En este ensayo, Lmx1b E1 y Corin E1 promovió la expresión de β-gal en el FP, mientras que ninguna de las tres FBR de Lmx1a mostró actividad (Fig. 6A, datos B no mostrados). Dos FBR adicionales, en BMP7 y Slit2, también promovió la expresión de β-gal en el FP (Fig. 6A). Estos resultados indican que algunas FBR tienen funciones potenciadoras tanto en ratones como en polluelos.

Detección de elementos potenciadores candidatos unidos por Foxa2 en embriones de pollo. (A) El neuroepitelio del mesencéfalo de embriones de pollo en estadio 10 se sometió a electroporación con potenciadores candidatos seleccionados en el Lmx1a, Lmx1b, Bmp7, Ranura2 y Corin genes clonados en un lacZ constructo reportero. Se co-electroporó una construcción de GFP con las construcciones de prueba para evaluar la eficiencia de la electroporación y el vacío lacZ La construcción informadora se utilizó como control (no se muestra). Los embriones recolectados 48 horas después de la electroporación se muestran en vista lateral (izquierda) y vista dorsal (derecha). Las líneas discontinuas indican el límite entre el mesencéfalo y el rombencéfalo. (B) Corte coronal de un embrión de pollo electroporado con el Lmx1b E1 lacZ construcción que muestra células electroporadas GFP + en la mayor parte del mesencéfalo (verde), mientras que la expresión de β-gal (rojo) está restringida al mesencéfalo ventral. La imagen de la derecha es una fusión.

Detección de elementos potenciadores candidatos unidos por Foxa2 en embriones de pollo. (A) El neuroepitelio del mesencéfalo de embriones de pollo en estadio 10 se sometió a electroporación con potenciadores candidatos seleccionados en el Lmx1a, Lmx1b, Bmp7, Ranura2 y Corin genes clonados en un lacZ constructo reportero. Se co-electroporó una construcción de GFP con las construcciones de prueba para evaluar la eficiencia de la electroporación y el vacío lacZ La construcción informadora se usó como control (no se muestra). Los embriones recolectados 48 horas después de la electroporación se muestran en vista lateral (izquierda) y vista dorsal (derecha). Las líneas discontinuas indican el límite entre el mesencéfalo y el rombencéfalo. (B) Corte coronal de un embrión de pollo electroporado con el Lmx1b E1 lacZ construcción que muestra células electroporadas GFP + en la mayor parte del mesencéfalo (verde), mientras que la expresión de β-gal (rojo) está restringida al mesencéfalo ventral. La imagen de la derecha es una fusión.

Foxa2 inhibe destinos neuronales alternativos del mesencéfalo mediante la unión directa a determinantes del destino celular

Nuestros estudios funcionales anteriores mostraron que Foxa2 promueve la especificación del destino de las neuronas mDA en parte al inhibir la expresión de un determinante del mesencéfalo dorsal y ventrolateral, Helt, que es esencial para el desarrollo de la mayoría de las neuronas GABAérgicas del mesencéfalo (Miyoshi et al., 2004 Guimera et al., 2004 Guimera et al. al., 2006 Nakatani et al., 2007). Dado que se ha demostrado que Foxa2 actúa como un activador transcripcional en experimentos de transfección in vitro, no estaba claro si Foxa2 reprime directamente Helt para suprimir el destino de las células GABAérgicas. El examen de los datos de Foxa2 ChIP-seq mostró que Helt de hecho, está vinculado por Foxa2 y, por lo tanto, es probable que sea un objetivo directo de la represión de Foxa2 (material complementario, Tabla S1). Además, Foxa2 también reprime un determinante ventrolateral del mesencéfalo, Nkx2.2, probablemente a través de la unión directa (Lin et al., 2009).

Dado que Foxa2 reprime directamente determinantes ventrolaterales como Helt y Nkx2.2 (Lin et al., 2009), racionalizamos que la intersección de nuestra lista de genes asociados a FBR (FBG) con una lista de genes expresados ​​específicamente en el mesencéfalo ventrolateral podría conducir a la identificación de genes adicionales que normalmente son reprimidos por Foxa2 en el FP . Recientemente se publicó una lista de 312 genes expresados ​​específicamente en el mesencéfalo ventrolateral (Gennet et al., 2011). De las FBG identificadas en este estudio, 108 estaban presentes en esta lista (análisis hipergeométrico, PAG= 2,47 × 10 -19 Fig.4E), incluidos los genes que se ha demostrado que están reprimidos en Foxa1 / 2 mutantes cko, como Gli1, Gli2 y Gli3 (Mavromatakis et al., 2011), apoyando así la justificación inicial. El examen de la expresión de otros cinco factores de transcripción, a saber, Tle4, Otx1, Sox1, Tal2 y Pax3, mostró que todos menos Pax3 exhibían una expresión expandida del mesencéfalo ventral en E10.5 Foxa1 / 2 embriones cko (Fig.7). Estos resultados sugieren fuertemente que los genes unidos a Foxa2 que se expresan en el mesencéfalo ventrolateral representan una lista enriquecida de genes que son reprimidos por Foxa2 en el FP. Al igual que los genes que están regulados positivamente por Foxa2 en el FP, algunos de los genes reprimidos podrían estar regulados indirectamente por Foxa2, aunque hemos encontrado que Otx1 y Ptch1 se expresan ectópicamente en el FP de NestinCreFoxa1 - / - Foxa2 flox / flox mutantes en ausencia de Foxa1 y Foxa2 en E12.5 (material suplementario Fig. S3). Estos resultados son consistentes con la idea de que estos genes son reprimidos directamente por Foxa2.

Inhibición de determinantes ventrolaterales en el FP del mesencéfalo. (ANUNCIO') Tle4, Otx1, Sox1 y Tal2 se expresan ectópicamente en el FP además de su expresión normal en las regiones dorsal y / o ventrolateral del mesencéfalo del ratón E10.5 Foxa1 / 2 mutantes cko, en comparación con los compañeros de camada de control. (mi,MI') No se observaron cambios para Pax3 expresión en el mesencéfalo dorsal entre Foxa1 / 2 mutantes cko y compañeros de camada de control.

Inhibición de determinantes ventrolaterales en el FP del mesencéfalo. (ANUNCIO') Tle4, Otx1, Sox1 y Tal2 se expresan ectópicamente en el FP además de su expresión normal en las regiones dorsal y / o ventrolateral del mesencéfalo del ratón E10.5 Foxa1 / 2 mutantes cko, en comparación con los compañeros de camada de control. (mi,MI') No se observaron cambios para Pax3 expresión en el mesencéfalo dorsal entre Foxa1 / 2 mutantes cko y compañeros de camada de control.


16.4 Regulación de genes de transcripción eucariota

Al igual que las células procariotas, la transcripción de genes en eucariotas requiere las acciones de una ARN polimerasa para unirse a una secuencia corriente arriba de un gen para iniciar la transcripción. Sin embargo, a diferencia de las células procariotas, la ARN polimerasa eucariota requiere otras proteínas, o factores de transcripción, para facilitar el inicio de la transcripción. Los factores de transcripción son proteínas que se unen a la secuencia promotora y otras secuencias reguladoras para controlar la transcripción del gen diana. La ARN polimerasa por sí sola no puede iniciar la transcripción en células eucariotas. Los factores de transcripción deben unirse primero a la región promotora y reclutar ARN polimerasa en el sitio para que se establezca la transcripción.

Vea el proceso de transcripción: la fabricación de ARN a partir de una plantilla de ADN.

El promotor y la maquinaria de transcripción

Los genes están organizados para facilitar el control de la expresión genética. La región promotora está inmediatamente aguas arriba de la secuencia codificante. Esta región puede ser corta (solo unos pocos nucleótidos de longitud) o bastante larga (cientos de nucleótidos de longitud). Cuanto más largo sea el promotor, más espacio disponible para que las proteínas se unan. Esto también agrega más control al proceso de transcripción. La longitud del promotor es específica de un gen y puede diferir dramáticamente entre genes. En consecuencia, el nivel de control de la expresión génica también puede diferir de forma bastante drástica entre genes. El propósito del promotor es unir factores de transcripción que controlan el inicio de la transcripción.

Dentro de la región promotora, justo aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción, se encuentra la caja TATA. Esta caja es simplemente una repetición de dinucleótidos de timina y adenina (literalmente, repeticiones de TATA). La ARN polimerasa se une al complejo de iniciación de la transcripción, lo que permite que se produzca la transcripción. Para iniciar la transcripción, un factor de transcripción (TFIID) es el primero en unirse a la caja TATA. La unión de TFIID recluta otros factores de transcripción, incluidos TFIIB, TFIIE, TFIIF y TFIIH a la caja TATA. Una vez que se ensambla este complejo, la ARN polimerasa puede unirse a su secuencia aguas arriba. Cuando se une junto con los factores de transcripción, la ARN polimerasa se fosforila. Esto libera parte de la proteína del ADN para activar el complejo de iniciación de la transcripción y coloca a la ARN polimerasa en la orientación correcta para comenzar la transcripción. proteínas mediadoras (figura 16.9).

Además de los factores de transcripción generales, otros factores de transcripción pueden unirse al promotor para regular la transcripción de genes. Estos factores de transcripción se unen a los promotores de un conjunto específico de genes. No son factores de transcripción generales que se unen a cada complejo promotor, sino que se reclutan en una secuencia específica en el promotor de un gen específico. Hay cientos de factores de transcripción en una célula y cada uno de ellos se une específicamente a un motivo de secuencia de ADN particular. Cuando los factores de transcripción se unen al promotor justo aguas arriba del gen codificado, se denomina cis-Elemento que actúa, porque está en el mismo cromosoma justo al lado del gen. La región a la que se une un factor de transcripción particular se denomina sitio de unión del factor de transcripción. Los factores de transcripción responden a los estímulos ambientales que hacen que las proteínas encuentren sus sitios de unión e inicien la transcripción del gen que se necesita.

Mejoradores y transcripción

En algunos genes eucariotas, hay regiones que ayudan a aumentar o mejorar la transcripción. Estas regiones, llamadas potenciadoras, no están necesariamente cercanas a los genes que potencian. Pueden ubicarse corriente arriba de un gen, dentro de la región codificante del gen, corriente abajo de un gen, o pueden estar a miles de nucleótidos de distancia.

Las regiones potenciadoras son secuencias de unión, o sitios, para factores de transcripción. Cuando una proteína que dobla el ADN se une, la forma del ADN cambia (Figura 16.9). Este cambio de forma permite la interacción de los activadores unidos a los potenciadores con los factores de transcripción unidos a la región promotora y la ARN polimerasa. Mientras que el ADN se representa generalmente como una línea recta en dos dimensiones, en realidad es un objeto tridimensional. Por lo tanto, una secuencia de nucleótidos a miles de nucleótidos de distancia puede doblarse e interactuar con un promotor específico.

Desactivación de genes: represores transcripcionales

Como las células procariotas, las células eucariotas también tienen mecanismos para prevenir la transcripción. Los represores transcripcionales pueden unirse a regiones promotoras o potenciadoras y bloquear la transcripción. Al igual que los activadores de la transcripción, los represores responden a los estímulos externos para evitar la unión de los factores de transcripción activadores.


Los factores de transcripción hacen los contactos adecuados

La identidad celular está determinada por una interacción compleja entre factores de transcripción, potenciadores y organización del genoma. Un estudio ahora revela un papel dinámico para el factor de transcripción KLF4 en la dirección de interacciones reguladoras de genes durante la reprogramación de células pluripotentes, lo que demuestra que los factores de transcripción pueden funcionar como organizadores de la cromatina.

El descubrimiento de que las células adultas se pueden reprogramar en células madre pluripotentes (PSC) con pleno potencial de desarrollo cambió la forma en que pensamos sobre cómo se controla la identidad celular 1. La reprogramación se logra mediante la sobreexpresión de cuatro factores de transcripción, OCT4, KLF4, SOX2 y cMYC, en células que se nutren de condiciones de cultivo de apoyo. La determinación de los eventos moleculares que ocurren después de la unión del factor de transcripción tiene consecuencias de gran alcance para nuestra comprensión de cómo se altera la identidad celular en el desarrollo y la enfermedad. La modulación de estos procesos podría conducir a mejoras en la producción de tipos de células terapéuticas. En este número de Biología celular de la naturaleza, Di Giammartino y col. Añada a esta comprensión revelando que el factor de reprogramación KLF4 dirige los elementos reguladores para controlar la expresión de su gen diana a través de un bucle de cromatina tridimensional de largo alcance 2.


Unión de TF a corto plazo, expresión a largo plazo

Si bien el modelado computacional de cómo se desarrolla la dinámica reguladora de genes a lo largo de horas puede revelar la topología de las redes reguladoras de genes de plantas, la realización de análisis experimentales de series de tiempo a escalas muy finas de interacciones TF-objetivo en el orden de minutos también ha resultado fructífero. La observación de las respuestas reguladoras de genes que ocurren dentro de marcos de tiempo más pequeños ha sido capaz de capturar la dinámica del ADN-TF que de otra manera se habría perdido durante períodos más largos. De hecho, estos enfoques han descubierto nuevos


16.4 Regulación génica transcripcional eucariota

En esta sección, explorará la siguiente pregunta:

Conexión para cursos AP ®

Para iniciar la transcripción, los factores de transcripción generales primero deben unirse a un área específica del ADN llamada caja TATA y luego reclutar la ARN polimerasa en esa ubicación. Además, otras áreas del ADN llamadas regiones potenciadoras ayudan a aumentar la transcripción. Los factores de transcripción pueden unirse a regiones potenciadoras para aumentar o prevenir la transcripción.

La información presentada y los ejemplos resaltados en la sección apoyan los conceptos descritos en la Gran Idea 3 del Marco del Currículo de Biología AP ®. Los objetivos de aprendizaje enumerados en el marco curricular proporcionan una base transparente para el curso de biología AP®, una experiencia de laboratorio basada en la investigación, actividades de instrucción y preguntas del examen AP®. Un objetivo de aprendizaje fusiona el contenido requerido con una o más de las siete prácticas científicas

Gran idea 3 Los sistemas vivos almacenan, recuperan, transmiten y responden a información esencial para los procesos de la vida.
Comprensión duradera 3.B La expresión de información genética involucra mecanismos celulares y moleculares.
Conocimiento esencial 3.B.1 La regulación genética da como resultado una expresión genética diferencial, lo que conduce a la especialización celular.
Práctica de la ciencia 7.1 El estudiante puede conectar fenómenos y modelos a través de escalas espaciales y temporales.
Objetivo de aprendizaje 3.18 El estudiante es capaz de describir la conexión entre la regulación de la expresión génica y las diferencias observadas entre diferentes tipos de organismos.
Conocimiento esencial 3.B.1 La regulación genética da como resultado una expresión genética diferencial que conduce a la especialización celular.
Práctica de la ciencia 7.1 El estudiante puede conectar fenómenos y modelos a través de escalas espaciales y temporales.
Objetivo de aprendizaje 3.19 El estudiante es capaz de describir la conexión entre la regulación de la expresión génica y las diferencias observadas entre los individuos de una población.
Conocimiento esencial 3.B.1 La regulación genética da como resultado una expresión genética diferencial, lo que conduce a la especialización celular.
Práctica de la ciencia 6.2 El estudiante puede construir explicaciones de fenómenos basados ​​en evidencia producida a través de prácticas científicas.
Objetivo de aprendizaje 3.20 El alumno es capaz de explicar cómo la regulación de la expresión génica es esencial para los procesos y estructuras que sustentan la función celular eficiente.
Conocimiento esencial 3.B.1 1 La regulación génica da como resultado una expresión génica diferencial que conduce a la especialización celular.
Práctica de la ciencia 1.4 El alumno puede utilizar representaciones y modelos para analizar situaciones o resolver problemas de forma cualitativa y cuantitativa.
Objetivo de aprendizaje 3.21 El estudiante puede usar representaciones para describir cómo la regulación genética influye en los productos y la función de las células.

Apoyo a los profesores

Haga que los estudiantes creen una representación visual utilizando papel de colores que muestre la transcripción del ADN y el papel de los potenciadores y represores en la transcripción.

Las preguntas del desafío de práctica científica contienen preguntas de prueba adicionales para esta sección que lo ayudarán a prepararse para el examen AP. Estas preguntas abordan los siguientes estándares:
[APLO 3.18]

Al igual que las células procariotas, la transcripción de genes en eucariotas requiere las acciones de una ARN polimerasa para unirse a una secuencia corriente arriba de un gen para iniciar la transcripción. Sin embargo, a diferencia de las células procariotas, la ARN polimerasa eucariota requiere otras proteínas, o factores de transcripción, para facilitar el inicio de la transcripción. Los factores de transcripción son proteínas que se unen a la secuencia promotora y otras secuencias reguladoras para controlar la transcripción del gen diana. La ARN polimerasa por sí sola no puede iniciar la transcripción en células eucariotas. Los factores de transcripción deben unirse primero a la región promotora y reclutar ARN polimerasa en el sitio para que se establezca la transcripción.

La actividad de los factores de transcripción puede regular la expresión génica diferencial en las células, lo que da como resultado el desarrollo de diferentes productos y funciones celulares. Por ejemplo, los científicos han descubierto que las características sexuales primarias están reguladas por varios genes. Figura 16.9. En la mosca de la fruta Drosophila, los slx el gen determina el sexo. Este gen se expresa cuando el organismo tiene dos copias del cromosoma X. El producto genético para slx se une al ARNm de la tra gen y regula su empalme. En la presencia de slx, tra se empalma en su forma femenina e influye en la expresión de dsx y fru para dar lugar a características sexuales femeninas. En ausencia de slx, tra se empalma en su forma masculina y resultan las características sexuales masculinas.

Enlace al aprendizaje

Vea el proceso de transcripción (la fabricación de ARN a partir de una plantilla de ADN) en este sitio.

  1. El ADN se desenrolla, los factores de transcripción se unen, se forma el complejo de terminación y la ADN polimerasa agrega nucleótidos al ARNm.
  2. El ADN se desenrolla, los factores de transcripción se unen y la ARN polimerasa agrega nucleótidos al ARNm.
  3. El complejo de transcripción se forma, los factores de transcripción agregan nucleótidos al ARNm que se forma y el ARNm se desconecta del ADN.
  4. Se produce el alargamiento, seguido de la formación del complejo de iniciación de la transcripción y la desconexión de la hebra de ARNm del ADN.

El promotor y la maquinaria de transcripción

Los genes están organizados para facilitar el control de la expresión genética. La región promotora está inmediatamente aguas arriba de la secuencia codificante. Esta región puede ser corta (solo unos pocos nucleótidos de longitud) o bastante larga (cientos de nucleótidos de longitud). Cuanto más largo sea el promotor, más espacio disponible para que las proteínas se unan. Esto también agrega más control al proceso de transcripción. La longitud del promotor es específica de un gen y puede diferir dramáticamente entre genes. En consecuencia, el nivel de control de la expresión génica también puede diferir de forma bastante drástica entre genes. El propósito del promotor es unir factores de transcripción que controlan el inicio de la transcripción.

Dentro de la región promotora, justo aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción, se encuentra la caja TATA. Esta caja es simplemente una repetición de dinucleótidos de timina y adenina (literalmente, repeticiones de TATA). La ARN polimerasa se une al complejo de iniciación de la transcripción, lo que permite que se produzca la transcripción. Para iniciar la transcripción, un factor de transcripción (TFIID) es el primero en unirse a la caja TATA. La unión de TFIID recluta otros factores de transcripción, incluidos TFIIB, TFIIE, TFIIF y TFIIH a la caja TATA. Una vez que se ensambla este complejo, la ARN polimerasa puede unirse a su secuencia aguas arriba. Cuando se une junto con los factores de transcripción, la ARN polimerasa se fosforila. Esto libera parte de la proteína del ADN para activar el complejo de iniciación de la transcripción y coloca a la ARN polimerasa en la orientación correcta para comenzar la transcripción. proteínas mediadoras (figura 16.10).

Además de los factores de transcripción generales, otros factores de transcripción pueden unirse al promotor para regular la transcripción de genes. Estos factores de transcripción se unen a los promotores de un conjunto específico de genes. No son factores de transcripción generales que se unen a cada complejo promotor, sino que se reclutan en una secuencia específica en el promotor de un gen específico. Hay cientos de factores de transcripción en una célula y cada uno de ellos se une específicamente a un motivo de secuencia de ADN particular. Cuando los factores de transcripción se unen al promotor justo aguas arriba del gen codificado, se denomina cis-Elemento que actúa, porque está en el mismo cromosoma justo al lado del gen. La región a la que se une un factor de transcripción particular se denomina sitio de unión del factor de transcripción. Los factores de transcripción responden a los estímulos ambientales que hacen que las proteínas encuentren sus sitios de unión e inicien la transcripción del gen que se necesita.

Mejoradores y transcripción

En algunos genes eucariotas, hay regiones que ayudan a aumentar o mejorar la transcripción. Estas regiones, llamadas potenciadoras, no están necesariamente cercanas a los genes que potencian. Pueden ubicarse corriente arriba de un gen, dentro de la región codificante del gen, corriente abajo de un gen, o pueden estar a miles de nucleótidos de distancia.

Las regiones potenciadoras son secuencias de unión, o sitios, para factores de transcripción. Cuando una proteína que dobla el ADN se une, la forma del ADN cambia (Figura 16.10). Este cambio de forma permite la interacción de los activadores unidos a los potenciadores con los factores de transcripción unidos a la región promotora y la ARN polimerasa. Mientras que el ADN se representa generalmente como una línea recta en dos dimensiones, en realidad es un objeto tridimensional. Por lo tanto, una secuencia de nucleótidos a miles de nucleótidos de distancia puede doblarse e interactuar con un promotor específico.

Desactivación de genes: represores transcripcionales

Como las células procariotas, las células eucariotas también tienen mecanismos para prevenir la transcripción. Los represores transcripcionales pueden unirse a regiones promotoras o potenciadoras y bloquear la transcripción. Al igual que los activadores de la transcripción, los represores responden a los estímulos externos para evitar la unión de los factores de transcripción activadores.


Contenido

Transcripción Editar

La producción de una copia de ARN a partir de una hebra de ADN se llama transcripción y se realiza mediante ARN polimerasas, que añaden un ribonucleótido a la vez a una hebra de ARN en crecimiento según la ley de complementariedad de las bases de nucleótidos. Este ARN es complementario de la cadena de ADN molde 3 '→ 5', [7] con la excepción de que las timinas (T) se reemplazan con uracilos (U) en el ARN.

En los procariotas, la transcripción se lleva a cabo mediante un solo tipo de ARN polimerasa, que necesita unirse a una secuencia de ADN llamada caja de Pribnow con la ayuda de la proteína del factor sigma (factor σ) para iniciar la transcripción. En eucariotas, la transcripción se realiza en el núcleo mediante tres tipos de polimerasas de ARN, cada una de las cuales necesita una secuencia de ADN especial llamada promotor y un conjunto de proteínas de unión al ADN (factores de transcripción) para iniciar el proceso (consulte la regulación de la transcripción a continuación). . La ARN polimerasa I es responsable de la transcripción de genes de ARN ribosómico (ARNr). La ARN polimerasa II (Pol II) transcribe todos los genes que codifican proteínas, pero también algunos ARN no codificantes (p.ej., snRNA, snoRNA o RNA largos no codificantes). La ARN polimerasa III transcribe ARNr 5S, genes de ARN de transferencia (ARNt) y algunos ARN pequeños no codificantes (p.ej., 7SK). La transcripción finaliza cuando la polimerasa encuentra una secuencia llamada terminador.

Procesamiento de ARNm Editar

Mientras que la transcripción de genes que codifican proteínas procariotas crea ARN mensajero (ARNm) que está listo para su traducción en proteína, la transcripción de genes eucariotas deja una transcripción primaria de ARN (pre-ARN), que primero debe someterse a una serie de modificaciones para convertirse en un ARN maduro. Los tipos y pasos involucrados en los procesos de maduración varían entre preARN codificantes y no codificantes. es decir. a pesar de que las moléculas de preRNA tanto para mRNA como para tRNA se someten a empalme, los pasos y la maquinaria involucrados son diferentes. [8] El procesamiento de ARN no codificante se describe a continuación (maduración del ARN no núcleo).

El procesamiento de premRNA incluye 5 ′ taponamiento, que es un conjunto de reacciones enzimáticas que agregan 7-metilguanosina (m 7 G) al extremo 5 'del pre-ARNm y así protegen al ARN de la degradación por exonucleasas. La tapa de m 7 G se une luego por el heterodímero del complejo de unión a la tapa (CBC20 / CBC80), que ayuda en la exportación de ARNm al citoplasma y también protege al ARN de la desintegración.

Otra modificación es 3 ′ escisión y poliadenilación. Ocurren si la secuencia señal de poliadenilación (5′- AAUAAA-3 ′) está presente en el pre-mRNA, que normalmente se encuentra entre la secuencia codificadora de proteínas y el terminador. El pre-ARNm se escinde primero y luego una serie de

Se agregan 200 adeninas (A) para formar una cola de poli (A), que protege al ARN de la degradación. La cola de poli (A) está unida por múltiples proteínas de unión a poli (A) (PABP) necesarias para la exportación de ARNm y el reinicio de la traducción. En el proceso inverso de desadenilación, las colas de poli (A) se acortan por la exonucleasa CCR4-Not 3′-5 ′, que a menudo conduce a la desintegración completa de la transcripción.

Una modificación muy importante del pre-mRNA eucariota es Empalme de ARN. La mayoría de los pre-ARNm eucariotas consisten en segmentos alternos llamados exones e intrones. Durante el proceso de empalme, un complejo catalítico de ARN-proteína conocido como spliceosoma cataliza dos reacciones de transesterificación, que eliminan un intrón y lo liberan en forma de estructura de lazo, y luego empalman los exones vecinos. En ciertos casos, algunos intrones o exones pueden eliminarse o retenerse en el ARNm maduro. Este llamado empalme alternativo crea una serie de diferentes transcripciones que se originan a partir de un solo gen. Debido a que estas transcripciones pueden traducirse potencialmente en diferentes proteínas, el empalme extiende la complejidad de la expresión génica eucariota y el tamaño del proteoma de una especie.

El procesamiento extenso de ARN puede ser una ventaja evolutiva que es posible gracias al núcleo de eucariotas. En los procariotas, la transcripción y la traducción ocurren juntas, mientras que en los eucariotas, la membrana nuclear separa los dos procesos, dando tiempo para que se produzca el procesamiento del ARN.

Maduración del ARN no codificante Editar

En la mayoría de los organismos, los genes no codificantes (ncRNA) se transcriben como precursores que se someten a un procesamiento posterior. En el caso de los ARN ribosomales (ARNr), a menudo se transcriben como un prerARN que contiene uno o más ARNr. El pre-rRNA se escinde y modifica (2'-O-metilación y formación de pseudouridina) en sitios específicos por aproximadamente 150 especies de RNA pequeñas restringidas por nucleolo diferentes, llamadas snoRNA. Los snoRNA se asocian con proteínas y forman snoRNP. Mientras que la parte de snoRNA se empareja con el RNA objetivo y, por lo tanto, coloca la modificación en un sitio preciso, la parte de proteína realiza la reacción catalítica. En eucariotas, en particular un snoRNP llamado RNasa, MRP escinde el pre-rRNA 45S en los rRNA 28S, 5.8S y 18S. Los factores de procesamiento de ARNr y ARN forman grandes agregados llamados nucleolo. [9]

En el caso del ARN de transferencia (ARNt), por ejemplo, la secuencia 5 ′ es eliminada por la RNasa P, [10] mientras que el extremo 3 ′ es eliminado por la enzima tRNasa Z [11] y la cola CCA 3 ′ sin plantilla. se añade mediante una nucleotidil transferasa. [12] En el caso del micro ARN (miARN), los miARN se transcriben primero como transcripciones primarias o pri-miARN con una tapa y una cola poli-A y se procesan en estructuras cortas de bucle de tallo de 70 nucleótidos conocidas como pre-miARN en el núcleo celular por las enzimas Drosha y Pasha. Después de ser exportado, se procesa para madurar miARN en el citoplasma mediante la interacción con la endonucleasa Dicer, que también inicia la formación del complejo silenciador inducido por ARN (RISC), compuesto por la proteína Argonaute.

Incluso los snRNAs y snoRNAs mismos sufren una serie de modificaciones antes de que se conviertan en parte del complejo funcional de RNP. Esto se hace en el nucleoplasma o en los compartimentos especializados llamados cuerpos de Cajal. Sus bases están metiladas o pseudouridiniladas por un grupo de pequeños ARN específicos del cuerpo de Cajal (scaRNA), que son estructuralmente similares a los snoRNA.

Exportación de ARN Editar

En eucariotas, la mayor parte del ARN maduro debe exportarse al citoplasma desde el núcleo. Si bien algunos ARN funcionan en el núcleo, muchos ARN se transportan a través de los poros nucleares hacia el citosol. [13] La exportación de ARN requiere la asociación con proteínas específicas conocidas como exportinas. Las moléculas específicas de exportina son responsables de la exportación de un tipo de ARN determinado. El transporte de ARNm también requiere la asociación correcta con Exon Junction Complex (EJC), lo que garantiza que se complete el procesamiento correcto del ARNm antes de la exportación. En algunos casos, los ARN se transportan adicionalmente a una parte específica del citoplasma, como una sinapsis, luego son remolcados por proteínas motoras que se unen a través de proteínas enlazadoras a secuencias específicas (llamadas "códigos postales") en el ARN. [14]

Traducción Editar

Para algunos ARN (ARN no codificante), el ARN maduro es el producto génico final. [15] En el caso del ARN mensajero (ARNm), el ARN es un portador de información que codifica la síntesis de una o más proteínas. El ARNm que lleva una sola secuencia de proteínas (común en eucariotas) es monocistrónico, mientras que el ARNm que lleva múltiples secuencias de proteínas (común en procariotas) se conoce como policistrónico.

Cada ARNm consta de tres partes: una región 5 'no traducida (5'UTR), una región codificadora de proteínas o marco de lectura abierto (ORF) y una región 3' no traducida (3'UTR). La región codificante transporta información para la síntesis de proteínas codificada por el código genético para formar tripletes. Cada triplete de nucleótidos de la región codificante se denomina codón y corresponde a un sitio de unión complementario a un triplete anticodón en el ARN de transferencia. Los ARN de transferencia con la misma secuencia de anticodón siempre llevan un tipo idéntico de aminoácido. A continuación, el ribosoma encadena los aminoácidos según el orden de tripletes en la región codificante. El ribosoma ayuda a transferir ARN para unirse al ARN mensajero y toma el aminoácido de cada ARN de transferencia y lo convierte en una proteína sin estructura. [16] [17] Cada molécula de ARNm se traduce en muchas moléculas de proteína, en promedio

En los procariotas, la traducción generalmente se produce en el punto de la transcripción (cotranscripcionalmente), a menudo utilizando un ARN mensajero que aún está en proceso de creación. En eucariotas, la traducción puede ocurrir en una variedad de regiones de la célula dependiendo de dónde se supone que está la proteína que se escribe. Las ubicaciones principales son el citoplasma para las proteínas citoplasmáticas solubles y la membrana del retículo endoplásmico para las proteínas que se exportan desde la célula o se insertan en una membrana celular. Las proteínas que se supone que se expresan en el retículo endoplásmico se reconocen en la mitad del proceso de traducción. Esto está gobernado por la partícula de reconocimiento de señales, una proteína que se une al ribosoma y lo dirige al retículo endoplásmico cuando encuentra un péptido señal en la cadena de aminoácidos en crecimiento (naciente). [20]

Edición plegable

Cada proteína existe como un polipéptido desplegado o una espiral aleatoria cuando se traduce de una secuencia de ARNm a una cadena lineal de aminoácidos. Este polipéptido carece de estructura tridimensional desarrollada (el lado izquierdo de la figura vecina). El polipéptido luego se pliega en su estructura tridimensional característica y funcional a partir de una espiral aleatoria. [21] Los aminoácidos interactúan entre sí para producir una estructura tridimensional bien definida, la proteína plegada (el lado derecho de la figura) conocida como estado nativo. La estructura tridimensional resultante está determinada por la secuencia de aminoácidos (dogma de Anfinsen). [22]

La estructura tridimensional correcta es esencial para el funcionamiento, aunque algunas partes de las proteínas funcionales pueden permanecer desplegadas. [23] La falta de plegado en la forma deseada generalmente produce proteínas inactivas con diferentes propiedades, incluidos priones tóxicos. Se cree que varias enfermedades neurodegenerativas y otras son el resultado de la acumulación de mal plegado proteínas. [24] Muchas alergias son causadas por el plegamiento de las proteínas, ya que el sistema inmunológico no produce anticuerpos para ciertas estructuras proteicas. [25]

Las enzimas llamadas chaperonas ayudan a la proteína recién formada a alcanzar (plegarse) la estructura tridimensional que necesita para funcionar. [26] De manera similar, las chaperonas de ARN ayudan a los ARN a alcanzar sus formas funcionales. [27] Ayudar al plegamiento de proteínas es una de las funciones principales del retículo endoplásmico en eucariotas.

Translocación Editar

Las proteínas secretoras de eucariotas o procariotas deben translocarse para entrar en la vía secretora. Las proteínas recién sintetizadas se dirigen al canal de translocación eucariota Sec61 o procariota SecYEG mediante péptidos señal. La eficacia de la secreción de proteínas en eucariotas depende en gran medida del péptido señal que se haya utilizado. [28]

Transporte de proteínas Editar

Muchas proteínas están destinadas a otras partes de la célula además del citosol y se utiliza una amplia gama de secuencias de señalización o (péptidos señalizadores) para dirigir las proteínas a donde se supone que deben estar. En procariotas, este es normalmente un proceso simple debido a la compartimentación limitada de la célula. Sin embargo, en eucariotas existe una gran variedad de diferentes procesos de focalización para asegurar que la proteína llegue al orgánulo correcto.

No todas las proteínas permanecen dentro de la célula y muchas se exportan, por ejemplo, enzimas digestivas, hormonas y proteínas de la matriz extracelular. En eucariotas, la vía de exportación está bien desarrollada y el mecanismo principal para la exportación de estas proteínas es la translocación al retículo endoplásmico, seguida del transporte a través del aparato de Golgi. [29] [30]

La regulación de la expresión génica se refiere al control de la cantidad y el momento de aparición del producto funcional de un gen. El control de la expresión es vital para permitir que una célula produzca los productos génicos que necesita cuando los necesita a su vez, esto le da a las células la flexibilidad para adaptarse a un entorno variable, señales externas, daño a la célula y otros estímulos. De manera más general, la regulación génica da a la célula el control de toda la estructura y función, y es la base para la diferenciación celular, la morfogénesis y la versatilidad y adaptabilidad de cualquier organismo.

Se utilizan numerosos términos para describir los tipos de genes dependiendo de cómo se regulan, estos incluyen:

  • A gen constitutivo es un gen que se transcribe continuamente a diferencia de un gen facultativo, que solo se transcribe cuando es necesario.
  • A gen de limpieza es un gen que se requiere para mantener la función celular básica y, por lo tanto, se expresa típicamente en todos los tipos de células de un organismo. Los ejemplos incluyen actina, GAPDH y ubiquitina.Algunos genes domésticos se transcriben a una velocidad relativamente constante y estos genes se pueden utilizar como punto de referencia en experimentos para medir las tasas de expresión de otros genes.
  • A gen facultativo es un gen que solo se transcribe cuando es necesario en contraposición a un gen constitutivo.
  • Un gen inducible es un gen cuya expresión responde al cambio ambiental o depende de la posición en el ciclo celular.

Se puede modular cualquier paso de la expresión génica, desde el paso de transcripción de ADN-ARN hasta la modificación postraduccional de una proteína. La estabilidad del producto génico final, ya sea ARN o proteína, también contribuye al nivel de expresión del gen; un producto inestable da como resultado un nivel de expresión bajo. En general, la expresión génica se regula a través de cambios [31] en el número y tipo de interacciones entre moléculas [32] que influyen colectivamente en la transcripción del ADN [33] y la traducción del ARN. [34]

Algunos ejemplos simples de dónde la expresión génica es importante son:

  • Control de la expresión de insulina para que dé una señal para la regulación de la glucosa en sangre. en hembras de mamíferos para prevenir una "sobredosis" de los genes que contiene. los niveles de expresión controlan la progresión a través del ciclo celular eucariota.

Regulación transcripcional Editar

La regulación de la transcripción se puede dividir en tres rutas principales de influencia genética (interacción directa de un factor de control con el gen), interacción de modulación de un factor de control con la maquinaria de transcripción y epigenética (cambios sin secuencia en la estructura del ADN que influyen en la transcripción) .

La interacción directa con el ADN es el método más simple y directo por el cual una proteína cambia los niveles de transcripción. Los genes suelen tener varios sitios de unión a proteínas alrededor de la región codificante con la función específica de regular la transcripción. Hay muchas clases de sitios de unión de ADN reguladores conocidos como potenciadores, aislantes y silenciadores. Los mecanismos para regular la transcripción son muy variados, desde bloquear sitios clave de unión en el ADN para la ARN polimerasa hasta actuar como activador y promover la transcripción al ayudar a la unión de la ARN polimerasa.

La actividad de los factores de transcripción se modula además mediante señales intracelulares que provocan una modificación postraduccional de la proteína que incluye fosforilada, acetilada o glicosilada. Estos cambios influyen en la capacidad de un factor de transcripción para unirse, directa o indirectamente, al ADN promotor, para reclutar ARN polimerasa o para favorecer el alargamiento de una molécula de ARN recién sintetizada.

La membrana nuclear en eucariotas permite una mayor regulación de los factores de transcripción por la duración de su presencia en el núcleo, que está regulada por cambios reversibles en su estructura y por la unión de otras proteínas. [35] Los estímulos ambientales o las señales endocrinas [36] pueden causar la modificación de las proteínas reguladoras [37] provocando cascadas de señales intracelulares, [38] que dan como resultado la regulación de la expresión génica.

Más recientemente, se ha hecho evidente que existe una influencia significativa de los efectos específicos de secuencias que no son de ADN sobre la transcripción. Estos efectos se denominan epigenéticos e involucran la estructura de orden superior del ADN, las proteínas de unión al ADN no específicas de secuencia y la modificación química del ADN. En general, los efectos epigenéticos alteran la accesibilidad del ADN a las proteínas y así modulan la transcripción.

En eucariotas, la estructura de la cromatina, controlada por el código de histonas, regula el acceso al ADN con impactos significativos en la expresión de genes en áreas de eucromatina y heterocromatina.

Potenciadores, factores de transcripción, complejo mediador y bucles de ADN en la transcripción de mamíferos Editar

La expresión génica en los mamíferos está regulada por muchos elementos reguladores en cis, incluidos los promotores centrales y los elementos proximales al promotor que se encuentran cerca de los sitios de inicio de la transcripción de los genes, aguas arriba del ADN (hacia la región 5 'de la cadena con sentido). Otros módulos reguladores cis importantes se localizan en regiones de ADN que están distantes de los sitios de inicio de la transcripción. Estos incluyen potenciadores, silenciadores, aislantes y elementos de sujeción. [39] Entre esta constelación de elementos, los potenciadores y sus factores de transcripción asociados tienen un papel principal en la regulación de la expresión génica. [40]

Los potenciadores son regiones del genoma que son los principales elementos reguladores de genes. Los potenciadores controlan los programas de expresión génica específicos del tipo de célula, la mayoría de las veces recorriendo largas distancias para acercarse físicamente a los promotores de sus genes diana. [41] Múltiples potenciadores, cada uno a menudo a decenas o cientos de miles de nucleótidos distantes de sus genes diana, se enlazan con sus promotores de genes diana y se coordinan entre sí para controlar la expresión de su gen diana común. [41]

La ilustración esquemática de la izquierda muestra un potenciador dando vueltas para acercarse físicamente al promotor de un gen objetivo. El bucle se estabiliza mediante un dímero de una proteína conectora (por ejemplo, dímero de CTCF o YY1), con un miembro del dímero anclado a su motivo de unión en el potenciador y el otro miembro anclado a su motivo de unión en el promotor (representado por el zigzags rojos en la ilustración). [42] Varios factores de transcripción específicos de la función celular (hay alrededor de 1600 factores de transcripción en una célula humana [43]) generalmente se unen a motivos específicos en un potenciador [44] y una pequeña combinación de estos factores de transcripción unidos al potenciador, cuando se acercan a un promotor mediante un bucle de ADN, rige el nivel de transcripción del gen diana. El mediador (un complejo que generalmente consta de aproximadamente 26 proteínas en una estructura que interactúa) comunica las señales reguladoras de los factores de transcripción unidos al ADN potenciador directamente a la enzima ARN polimerasa II (pol II) unida al promotor. [45]

Los potenciadores, cuando están activos, generalmente se transcriben a partir de ambas cadenas de ADN con las ARN polimerasas que actúan en dos direcciones diferentes, produciendo dos eRNA como se ilustra en la Figura. [46] Un potenciador inactivo puede estar unido por un factor de transcripción inactivo. La fosforilación del factor de transcripción puede activarlo y ese factor de transcripción activado puede activar el potenciador al que está unido (ver la pequeña estrella roja que representa la fosforilación del factor de transcripción unido al potenciador en la ilustración). [47] Un potenciador activado comienza la transcripción de su ARN antes de activar la transcripción del ARN mensajero de su gen objetivo. [48]

Metilación y desmetilación del ADN en la regulación transcripcional Editar

La metilación del ADN es un mecanismo generalizado de influencia epigenética en la expresión génica y se observa en bacterias y eucariotas y tiene funciones en el silenciamiento de la transcripción hereditaria y la regulación de la transcripción. La metilación ocurre con mayor frecuencia en una citosina (ver Figura). La metilación de la citosina ocurre principalmente en secuencias de dinucleótidos donde una citosina es seguida por una guanina, un sitio CpG. El número de sitios CpG en el genoma humano es de unos 28 millones. [49] Según el tipo de célula, alrededor del 70% de los sitios CpG tienen una citosina metilada. [50]

La metilación de la citosina en el ADN tiene un papel importante en la regulación de la expresión génica. La metilación de CpG en una región promotora de un gen generalmente reprime la transcripción génica [51], mientras que la metilación de CpG en el cuerpo de un gen aumenta la expresión. [52] Las enzimas TET juegan un papel central en la desmetilación de citosinas metiladas. La desmetilación de CpG en un promotor de gen mediante la actividad de la enzima TET aumenta la transcripción del gen. [53]

Regulación transcripcional en el aprendizaje y la memoria Editar

En una rata, el condicionamiento del miedo contextual (CFC) es una experiencia de aprendizaje dolorosa. Un solo episodio de CFC puede resultar en un recuerdo aterrador para toda la vida. [54] Después de un episodio de CFC, la metilación de la citosina se altera en las regiones promotoras de aproximadamente el 9,17% de todos los genes en el ADN de la neurona del hipocampo de una rata. [55] El hipocampo es donde se almacenan inicialmente los nuevos recuerdos. Después de CFC, alrededor de 500 genes han aumentado la transcripción (a menudo debido a la desmetilación de sitios CpG en una región promotora) y alrededor de 1000 genes han disminuido la transcripción (a menudo debido a 5-metilcitosina recién formada en sitios CpG en una región promotora). El patrón de genes inducidos y reprimidos dentro de las neuronas parece proporcionar una base molecular para formar el primer recuerdo transitorio de este evento de entrenamiento en el hipocampo del cerebro de rata. [55]

En particular, el gen del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) se conoce como "gen de aprendizaje". [56] Después de los CFC hubo una regulación al alza de BDNF expresión génica, relacionada con la metilación disminuida de CpG de ciertos promotores internos del gen, y esto se correlacionó con el aprendizaje. [56]

Regulación transcripcional en el cáncer Editar

La mayoría de los promotores de genes contienen una isla CpG con numerosos sitios CpG. [57] Cuando muchos de los sitios CpG promotores de un gen están metilados, el gen se silencia. [58] Los cánceres colorrectales suelen tener de 3 a 6 mutaciones de conductor y de 33 a 66 mutaciones de autoestopista o pasajero. [59] Sin embargo, el silenciamiento transcripcional puede ser más importante que la mutación para provocar la progresión al cáncer. Por ejemplo, en los cánceres colorrectales alrededor de 600 a 800 genes son silenciados transcripcionalmente por la metilación de la isla CpG (ver regulación de la transcripción en el cáncer). La represión transcripcional en el cáncer también puede ocurrir por otros mecanismos epigenéticos, como la expresión alterada de microARN. [60] En el cáncer de mama, la represión transcripcional de BRCA1 puede ocurrir con mayor frecuencia por microARN-182 sobreexpresado que por hipermetilación del promotor BRCA1 (consulte Baja expresión de BRCA1 en cánceres de mama y ovario).

Regulación postranscripcional Editar

En eucariotas, donde se requiere la exportación de ARN antes de que sea posible la traducción, se cree que la exportación nuclear proporciona un control adicional sobre la expresión génica. Todo el transporte dentro y fuera del núcleo se realiza a través del poro nuclear y el transporte está controlado por una amplia gama de proteínas importinas y exportinas.

La expresión de un gen que codifica una proteína solo es posible si el ARN mensajero que lleva el código sobrevive lo suficiente para ser traducido. En una célula típica, una molécula de ARN solo es estable si está específicamente protegida contra la degradación. La degradación del ARN tiene una importancia particular en la regulación de la expresión en células eucariotas donde el ARNm tiene que viajar distancias significativas antes de ser traducido. En eucariotas, el ARN se estabiliza mediante ciertas modificaciones postranscripcionales, particularmente la tapa 5 'y la cola poliadenilada.

La degradación intencional del ARNm se utiliza no solo como mecanismo de defensa frente al ARN extraño (normalmente de virus), sino también como ruta de ARNm. desestabilización. Si una molécula de ARNm tiene una secuencia complementaria a un ARN interferente pequeño, entonces se dirige a la destrucción a través de la vía de interferencia del ARN.

Tres regiones principales no traducidas y microARN Editar

Tres regiones primarias no traducidas (3'UTR) de ARN mensajeros (ARNm) a menudo contienen secuencias reguladoras que influyen postranscripcionalmente en la expresión génica. Tales 3'-UTR a menudo contienen sitios de unión tanto para microARN (miARN) como para proteínas reguladoras. Al unirse a sitios específicos dentro de la 3'-UTR, los miARN pueden disminuir la expresión génica de varios ARNm inhibiendo la traducción o provocando directamente la degradación del transcrito. La 3'-UTR también puede tener regiones silenciadoras que se unen a proteínas represoras que inhiben la expresión de un ARNm.

El 3′-UTR a menudo contiene elementos de respuesta de microARN (MRE). Los MRE son secuencias a las que se unen los miARN. Estos son motivos prevalentes dentro de las 3'-UTR. Entre todos los motivos reguladores dentro de las 3'-UTR (por ejemplo, incluidas las regiones silenciadoras), los MRE constituyen aproximadamente la mitad de los motivos.

En 2014, el sitio web miRBase, [61] un archivo de secuencias y anotaciones de miARN, enumeró 28.645 entradas en 233 especies biológicas. De estos, 1.881 miARN estaban en loci de miARN humanos anotados. Se predijo que los miARN tenían un promedio de aproximadamente cuatrocientos ARNm diana (que afectaban la expresión de varios cientos de genes). [62] Friedman y col. [62] estiman que & gt45,000 sitios diana de miARN dentro de los ARNm 3'UTR humanos se conservan por encima de los niveles de fondo, y & gt60% de los genes codificadores de proteínas humanas han estado bajo presión selectiva para mantener el apareamiento con los miARN.

Los experimentos directos muestran que un solo miRNA puede reducir la estabilidad de cientos de mRNA únicos. [63] Otros experimentos muestran que un solo miARN puede reprimir la producción de cientos de proteínas, pero que esta represión a menudo es relativamente leve (menos del doble). [64] [65]

Los efectos de la desregulación de la expresión génica por miARN parecen ser importantes en el cáncer. [66] Por ejemplo, en cánceres gastrointestinales, nueve miARN han sido identificados como alterados epigenéticamente y efectivos para regular a la baja las enzimas reparadoras del ADN. [67]

Los efectos de la desregulación de la expresión génica por miARN también parecen ser importantes en los trastornos neuropsiquiátricos, como la esquizofrenia, el trastorno bipolar, la depresión mayor, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y los trastornos del espectro autista. [68] [69]

Regulación traslacional Editar

La regulación directa de la traducción es menos frecuente que el control de la transcripción o la estabilidad del ARNm, pero se usa ocasionalmente. La inhibición de la traducción de proteínas es un objetivo importante para las toxinas y los antibióticos, por lo que pueden matar una célula anulando su control normal de expresión génica. Los inhibidores de la síntesis de proteínas incluyen el antibiótico neomicina y la toxina ricina.

Modificaciones postraduccionales Editar

Las modificaciones postraduccionales (PTM) son modificaciones covalentes de proteínas. Al igual que el empalme de ARN, ayudan a diversificar significativamente el proteoma. Estas modificaciones suelen estar catalizadas por enzimas. Además, los procesos como las adiciones covalentes a los residuos de la cadena lateral de aminoácidos a menudo pueden ser revertidos por otras enzimas. Sin embargo, algunos, como la escisión proteolítica del esqueleto proteico, son irreversibles. [70]

Los PTM desempeñan muchas funciones importantes en la célula. [71] Por ejemplo, la fosforilación participa principalmente en la activación y desactivación de proteínas y en las vías de señalización. [72] Las PTM participan en la regulación transcripcional: una función importante de la acetilación y metilación es la modificación de la cola de histonas, que altera la accesibilidad del ADN para la transcripción. [70] También se pueden ver en el sistema inmunológico, donde la glicosilación juega un papel clave. [73] Un tipo de PTM puede iniciar otro tipo de PTM, como puede verse en cómo la ubiquitinación marca las proteínas para su degradación mediante proteólisis. [70] La proteólisis, además de estar involucrada en la descomposición de proteínas, también es importante para activarlas y desactivarlas, y para regular procesos biológicos como la transcripción del ADN y la muerte celular. [74]

La medición de la expresión génica es una parte importante de muchas ciencias de la vida, ya que la capacidad de cuantificar el nivel en el que se expresa un gen en particular dentro de una célula, tejido u organismo puede proporcionar mucha información valiosa. Por ejemplo, medir la expresión génica puede:

  • Identificar la infección viral de una célula (expresión de proteína viral).
  • Determinar la susceptibilidad de un individuo al cáncer (expresión de oncogén).
  • Encuentre si una bacteria es resistente a la penicilina (expresión de beta-lactamasa).

De manera similar, el análisis de la ubicación de la expresión de proteínas es una herramienta poderosa, y esto se puede hacer a escala orgánica o celular. La investigación de la localización es particularmente importante para el estudio del desarrollo en organismos multicelulares y como indicador de la función de las proteínas en células individuales. Idealmente, la medición de la expresión se realiza detectando el producto génico final (para muchos genes, esta es la proteína); sin embargo, a menudo es más fácil detectar uno de los precursores, típicamente ARNm, e inferir los niveles de expresión génica a partir de estas mediciones.

Cuantificación de ARNm Editar

Los niveles de ARNm se pueden medir cuantitativamente mediante transferencia Northern, que proporciona información sobre el tamaño y la secuencia de las moléculas de ARNm. Se separa una muestra de ARN en un gel de agarosa y se hibrida con una sonda de ARN marcada radiactivamente que es complementaria a la secuencia diana. A continuación, se detecta el ARN radiomarcado mediante una autorradiografía. Debido a que el uso de reactivos radiactivos hace que el procedimiento requiera mucho tiempo y sea potencialmente peligroso, se han desarrollado métodos alternativos de detección y etiquetado, como las químicas de digoxigenina y biotina. Las desventajas percibidas de la transferencia Northern son que se requieren grandes cantidades de ARN y que la cuantificación puede no ser completamente precisa, ya que implica medir la fuerza de la banda en una imagen de un gel. Por otro lado, la información adicional del tamaño del ARNm de la transferencia Northern permite la discriminación de transcripciones empalmadas alternativamente.

Otro enfoque para medir la abundancia de ARNm es RT-qPCR. En esta técnica, la transcripción inversa es seguida por PCR cuantitativa. La transcripción inversa genera primero una plantilla de ADN a partir del ARNm, esta plantilla monocatenaria se denomina ADNc. La plantilla de ADNc se amplifica luego en el paso cuantitativo, durante el cual la fluorescencia emitida por las sondas de hibridación marcadas o los colorantes intercalados cambia a medida que avanza el proceso de amplificación del ADN. Con una curva estándar cuidadosamente construida, qPCR puede producir una medida absoluta del número de copias del ARNm original, típicamente en unidades de copias por nanolitro de tejido homogeneizado o copias por célula. La qPCR es muy sensible (la detección de una sola molécula de ARNm es teóricamente posible), pero puede ser costosa según el tipo de indicador utilizado. Las sondas de oligonucleótidos marcadas con fluorescencia son más caras que los colorantes fluorescentes intercalados no específicos.

Para el perfil de expresión o el análisis de alto rendimiento de muchos genes dentro de una muestra, se puede realizar una PCR cuantitativa para cientos de genes simultáneamente en el caso de matrices de baja densidad. Un segundo enfoque es la micromatriz de hibridación. Una sola matriz o "chip" puede contener sondas para determinar los niveles de transcripción de cada gen conocido en el genoma de uno o más organismos. Alternativamente, se pueden utilizar tecnologías "basadas en etiquetas" como el análisis en serie de la expresión génica (SAGE) y RNA-Seq, que pueden proporcionar una medida relativa de la concentración celular de diferentes mRNA. Una ventaja de los métodos basados ​​en etiquetas es la "arquitectura abierta", que permite la medición exacta de cualquier transcripción, con una secuencia conocida o desconocida. La secuenciación de próxima generación (NGS), como RNA-Seq, es otro enfoque, que produce grandes cantidades de datos de secuencia que pueden compararse con un genoma de referencia. Aunque NGS es comparativamente lento, costoso y requiere muchos recursos, puede identificar polimorfismos de un solo nucleótido, variantes de empalme y genes nuevos, y también se puede usar para perfilar la expresión en organismos para los que hay poca o ninguna información de secuencia disponible. .

Perfiles de ARN en Wikipedia Editar

Se encuentran perfiles como estos para casi todas las proteínas enumeradas en Wikipedia. Son generados por organizaciones como el Instituto de Genómica de la Fundación de Investigación Novartis y el Instituto Europeo de Bioinformática. Se puede encontrar información adicional buscando en sus bases de datos (para ver un ejemplo del transportador GLUT4 que se muestra aquí, consulte la cita).[75] Estos perfiles indican el nivel de expresión de ADN (y por lo tanto de ARN producido) de una determinada proteína en un determinado tejido, y están codificados por colores en consecuencia en las imágenes ubicadas en el Cuadro de proteínas en el lado derecho de cada página de Wikipedia.

Cuantificación de proteínas Editar

Para los genes que codifican proteínas, el nivel de expresión puede evaluarse directamente mediante varios métodos con algunas analogías claras con las técnicas de cuantificación de ARNm.

Uno de los métodos más utilizados es realizar una transferencia de Western contra la proteína de interés. [76] Esto proporciona información sobre el tamaño de la proteína además de su identidad. Se separa una muestra (a menudo lisado celular) en un gel de poliacrilamida, se transfiere a una membrana y luego se prueba con un anticuerpo contra la proteína de interés. El anticuerpo puede conjugarse con un fluoróforo o con peroxidasa de rábano picante para la obtención de imágenes y / o cuantificación. La naturaleza basada en gel de este ensayo hace que la cuantificación sea menos precisa, pero tiene la ventaja de poder identificar modificaciones posteriores de la proteína, por ejemplo, proteólisis o ubiquitinación, a partir de cambios de tamaño.

Correlación ARNm-proteína Editar

La cuantificación de proteínas y ARNm permite una correlación de los dos niveles. La cuestión de qué tan bien se correlacionan los niveles de proteína con sus niveles de transcripción correspondientes es muy debatida y depende de múltiples factores. La regulación en cada paso de la expresión génica puede afectar la correlación, como se muestra para la regulación de la traducción [19] o la estabilidad de las proteínas. [77] Los factores postraduccionales, como el transporte de proteínas en células muy polares, [78] también pueden influir en la correlación mRNA-proteína medida.

Localización Editar

El análisis de expresión no se limita a la cuantificación, también se puede determinar la localización. El ARNm puede detectarse con una hebra de ARNm complementaria adecuadamente marcada y la proteína puede detectarse mediante anticuerpos marcados. Luego, la muestra sondada se observa mediante microscopía para identificar dónde está el ARNm o la proteína.

Al reemplazar el gen con una nueva versión fusionada con un marcador de proteína fluorescente verde (o similar), la expresión puede cuantificarse directamente en células vivas. Esto se hace mediante imágenes usando un microscopio de fluorescencia. Es muy difícil clonar una proteína fusionada con GFP en su ubicación nativa en el genoma sin afectar los niveles de expresión, por lo que este método a menudo no se puede utilizar para medir la expresión génica endógena. Sin embargo, se usa ampliamente para medir la expresión de un gen introducido artificialmente en la célula, por ejemplo mediante un vector de expresión. Es importante tener en cuenta que al fusionar una proteína diana con un reportero fluorescente, el comportamiento de la proteína, incluida su localización celular y nivel de expresión, se puede cambiar significativamente.

El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas funciona mediante el uso de anticuerpos inmovilizados en una placa de microtitulación para capturar proteínas de interés de las muestras agregadas al pocillo. Usando un anticuerpo de detección conjugado con una enzima o fluoróforo, la cantidad de proteína unida puede medirse con precisión mediante detección fluorimétrica o colorimétrica. El proceso de detección es muy similar al de una transferencia Western, pero al evitar los pasos de gel se puede lograr una cuantificación más precisa.

Un sistema de expresión es un sistema diseñado específicamente para la producción de un producto genético de elección. Normalmente es una proteína, aunque también puede ser ARN, como ARNt o una ribozima. Un sistema de expresión consta de un gen, normalmente codificado por ADN, y la maquinaria molecular necesaria para transcribir el ADN en ARNm y traducir el ARNm en proteína utilizando los reactivos proporcionados. En el sentido más amplio, esto incluye todas las células vivas, pero el término se usa más normalmente para referirse a la expresión como una herramienta de laboratorio. Por lo tanto, un sistema de expresión es a menudo artificial de alguna manera. Los sistemas de expresión son, sin embargo, un proceso fundamentalmente natural. Los virus son un excelente ejemplo en el que se replican utilizando la célula huésped como un sistema de expresión para las proteínas virales y el genoma.

Expresión inducible Editar

En la naturaleza Editar

Además de estas herramientas biológicas, ciertas configuraciones de ADN observadas naturalmente (genes, promotores, potenciadores, represores) y la propia maquinaria asociada se denominan sistema de expresión. Este término se usa normalmente en el caso en el que un gen o conjunto de genes se enciende en condiciones bien definidas, por ejemplo, el sistema de expresión del interruptor represor simple en el fago Lambda y el sistema operador lac en las bacterias. Varios sistemas de expresión natural se usan o modifican directamente y se usan para sistemas de expresión artificial tales como el sistema de expresión Tet-on y Tet-off.

En ocasiones, los genes se han considerado como nodos en una red, donde las entradas son proteínas, como los factores de transcripción, y las salidas, el nivel de expresión génica. El propio nodo realiza una función, y la operación de estas funciones se ha interpretado como que realiza una especie de procesamiento de información dentro de las células y determina el comportamiento celular.

Las redes de genes también se pueden construir sin formular un modelo causal explícito. Este suele ser el caso cuando se ensamblan redes a partir de grandes conjuntos de datos de expresión. [79] La covariación y correlación de la expresión se calcula en una gran muestra de casos y mediciones (a menudo, datos de transcriptomas o proteomas). La fuente de variación puede ser experimental o natural (observacional). Hay varias formas de construir redes de expresión génica, pero un enfoque común es calcular una matriz de todas las correlaciones de expresión por pares entre condiciones, puntos de tiempo o individuos y convertir la matriz (después de establecer el umbral en algún valor de corte) en una representación gráfica en la que los nodos representan genes, transcripciones o proteínas y los bordes que conectan estos nodos representan la fuerza de la asociación (ver [1]). [80]

Las siguientes técnicas experimentales se utilizan para medir la expresión génica y se enumeran aproximadamente en orden cronológico, comenzando con las tecnologías más antiguas y establecidas. Se dividen en dos grupos según su grado de multiplexidad.


Ver el vídeo: Regulacion de la expresión de los genes (Enero 2022).