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Tinciones comunes para microscopía fúngica

Tinciones comunes para microscopía fúngica



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Recientemente obtuve un microscopio óptico para comenzar a explorar las características microscópicas de los hongos (y para explorar la microscopía en general).

¿Cuáles son algunas de las tinciones más comunes y fácilmente disponibles que se utilizan al preparar portaobjetos de microscopio para hongos? ¿Para qué situaciones es mejor cada uno?


Informe de laboratorio n. ° 1 Microscopía y tinción

Abstracto
El enfoque principal de este laboratorio fue la microscopía y las tinciones simples. La microscopía que se utilizó fue ampliación, preparación de portaobjetos y tinción. Se utilizó azul de metileno, un componente de tinción simple, para teñir el portaobjetos con el fin de ver los diferentes microbios y determinar su forma celular.

Introducción
El propósito de este laboratorio fue familiarizarse con el microscopio óptico y cómo usarlo con precisión para ver muestras. El método de tinción se utilizó para observar diferentes formas celulares. Los ejercicios realizados con el microscopio óptico fueron: aumento, preparación de portaobjetos y tinción. La mancha utilizada en este laboratorio fue azul de metileno, una mancha simple común.

Los diferentes tipos de muestras utilizadas en el experimento incluyen: Una letra E como un portaobjetos de muestra y una muestra de bacterias raspada del interior de la boca de un individuo con un palillo de dientes.
Durante este experimento surgieron hipótesis sobre la muestra de bacterias. Por ejemplo, las bacterias tendrán una forma redonda y la nucleasa, si la hubiera, será de un color azul diferente al del resto de las bacterias porque la cantidad de proteína indicada en la nucleasa será más fuerte y, por lo tanto, tendrá un color más oscuro.

Materiales y métodos
(Consulte el paquete para conocer los materiales y métodos enumerados en los ejercicios 1.1, 1.2, 1.3)

Resultados
Ejercicio 1.1 (a) se utilizó la letra E como portaobjetos de muestra. La letra E era visible con un aumento de 4X con un campo de visión de 5 mm, 10X con un campo de visión de 2 mm y 40X sin campo de visión. El ejercicio 1.2 consistió en medir la letra E con medidas oculares y de escenario. Ejercicio 1.3 Se utilizó una muestra de bacterias extraída del interior de la boca con un palillo y se tiñó con azul de metileno. Las bacterias se agruparon en forma con dos tonos diferentes de azul, siendo la nucleasa el color más oscuro. Figura 1 (ejercicio 1.1)


Las técnicas y la preparación de tinción celular dependen del tipo de tinción y análisis utilizados. Es posible que se requieran uno o más de los siguientes procedimientos para preparar una muestra:

  • Permeabilización - tratamiento de las células, generalmente con un tensioactivo suave, que disuelve las membranas celulares para permitir que las moléculas de colorante más grandes entren en el interior de la célula.
  • Fijación - Sirve para "arreglar" o preservar la morfología celular o tisular a través del proceso de preparación. Este proceso puede implicar varios pasos, pero la mayoría de los procedimientos de fijación implican la adición de un fijador químico que crea enlaces químicos entre las proteínas para aumentar su rigidez. Los fijadores comunes incluyen formaldehído, etanol, metanol y / o ácido pícrico.
  • Montaje - implica colocar muestras en un portaobjetos de microscopio de vidrio para su observación y análisis. Las células se pueden cultivar directamente en el portaobjetos o se pueden aplicar células sueltas a un portaobjetos utilizando una técnica estéril. También se pueden aplicar secciones delgadas (rebanadas) de material, como tejido, a un portaobjetos de microscopio para su observación.
  • Tinción - aplicación de tinte a una muestra para colorear células, tejidos, componentes o procesos metabólicos. Este proceso puede implicar sumergir la muestra (antes o después de la fijación o el montaje) en una solución de tinte y luego enjuagar y observar la muestra bajo un microscopio. Algunos tintes requieren el uso de un mordiente, que es un compuesto químico que reacciona con el tinte para formar un precipitado insoluble de color. La mancha mordada permanecerá en la muestra cuando se elimine el exceso de solución de tinte.

Pruebas especiales

Secciones congeladas

En ocasiones, durante un procedimiento quirúrgico, es necesario pedirle al patólogo un diagnóstico rápido para planificar el tratamiento. Esto casi siempre es para permitir la evaluación de los márgenes de resección para verificar que la escisión esté completa en los casos en los que la extensión de la lesión no es fácil de ver clínicamente y cuando se requerirá una reconstrucción importante en el momento de la cirugía. A veces, en sitios anatómicos críticos, se puede utilizar una técnica especial de control de secciones congeladas (cirugía de Mohs).

Excepto en casos muy raros, generalmente no se considera una buena práctica realizar un diagnóstico primario de malignidad en una sección congelada. Esto es particularmente cierto en el caso de lesiones pigmentadas, donde el diagnóstico, incluso en cortes de parafina procesados ​​idealmente, puede ser extremadamente difícil.

Las secciones congeladas deben discutirse con el patólogo antes de comenzar la cirugía para asegurarse de que tanto el patólogo como el tecnólogo estén disponibles en el momento requerido.

El tejido se congela rápidamente t – 20 t – 70C en un líquido frío como nitrógeno líquido. El tejido congelado es lo suficientemente sólido como para seccionarlo con un micrótomo en un criostato y luego las secciones se recogen en un portaobjetos de vidrio listo para teñir.

Las secciones son más gruesas que las secciones de parafina estándar y la calidad del tejido no es tan alta. Por esta razón, el tejido tomado para una sección congelada siempre se procesa posteriormente para las secciones de parafina para verificar el informe, y ocasionalmente se encuentran características en estas secciones que no eran aparentes (o no estaban presentes) en la sección congelada.

Inmunohistoquímica (inmunocitoquímica)

La inmunohistoquímica es una herramienta muy poderosa para identificar células y sustancias en secciones de tejido mediante el uso de la especificidad de la unión antígeno-anticuerpo. Los anticuerpos disponibles comercialmente se generan contra constituyentes celulares particulares y estos, cuando se aplican en solución a una sección de tejido, se unirán específicamente a esos constituyentes. El anticuerpo unido está unido por un indicador de color de un paso más a que se puede ver al microscopio ("tinción").

A pesar de la especificidad de la unión antígeno-anticuerpo, la inmunohistoquímica no es una ciencia específica. En general, la tinción es confiable y reproducible, en particular utilizando los marcadores más comunes, para los que ahora se dispone de una gran cantidad de experiencia, pero la tinción aberrante puede ocurrir y ocurre (a veces relacionada con una fijación variable). Por lo tanto, una sola reacción positiva o negativa no debe anular los hallazgos histológicos básicos en un caso. La inmunotinción debería, en general, involucrar un panel de diferentes anticuerpos para minimizar el efecto de un único resultado aberrante, y el panel solicitado debería estar diseñado para responder una pregunta particular relacionada con el diagnóstico diferencial basado en las apariencias de H & ampE.

Los usos principales de la inmunohistoquímica son para identificar un tumor maligno poco diferenciado como un carcinoma, sarcoma, melanoma o linfoma para identificar células tumorales escasas o un tumor oscurecido por la inflamación (por ejemplo, evaluar la profundidad de un melanoma muy inflamado) o para identificar un linfoide denso. infiltrarse como linfoma al demostrar la clonalidad de la expresión de la cadena ligera de inmunoglobulina. La inmunohistoquímica tiene poco papel en el diagnóstico de afecciones inflamatorias de la piel.

Los anticuerpos más utilizados son los producidos contra proteínas citoesqueléticas ("filamentos intermedios") como citoqueratina, desmina y actina, y marcadores de linaje o diferenciación melanocítica. También existen numerosos marcadores de diferenciación linfoide. Ahora hay cientos de marcadores disponibles (¡de utilidad variable!). A continuación se ofrece una selección de los más utilizados. Consulte Recursos para obtener un enlace a una lista completa.

Objetivo de anticuerpo Anticuerpo Identifica
Filamentos intermedios Citoqueratina
Desmin
Actina
Diferenciación epitelial
Diferenciación muscular
Músculo (mucho menos específico)
Diferenciación melanocítica S100
HMB-45
Melan-A
Sensible, pero inespecífico
Más específico, pero no sensible
Más específico, sensible
Marcadores linfoides / hematológicos Antígeno común de leucocitos
CD3
CD4 / CD8
CD20 / CD79a
CD30
CD68
Kappa / Lambda
La mayoría de los linfocitos maduros
Células T
Subconjuntos de células T
Células B
Células linfoides grandes
Macrófagos
Cadenas ligeras de inmunoglobulina

Inmunofluorescencia directa

La tinción por inmunofluorescencia directa es un tipo específico de inmunohistoquímica, generalmente para detectar la presencia de inmunoglobulinas y complemento en la piel. Se aplica un lote de anticuerpos marcados con isotiocianato de fluoresceína contra IgG, IgM, IgA, fibrina y C3 a secciones congeladas de tejido fresco y se examina mediante microscopía de fluorescencia.

Se observan patrones de tinción característicos en las enfermedades inmunobullosas, lupus eritematoso y vasculitis.

Los anticuerpos cutáneos circulantes se detectan mediante inmunofluorescencia indirecta. En esta técnica, el suero del paciente se incuba con epitelio escamoso y los anticuerpos que se unen se identifican mediante una sonda marcada con fluoresceína.


Materiales y métodos

Cultivo / cepas de hongos

los F. oxysporum f. sp. lycopersici En todos los experimentos se usó la cepa 4287 de raza 2 (FGSC 9935). los F. oxysporum El mutante que expresa constitutivamente la histona H1 fusionada con la proteína fluorescente roja mCherry (H1-mCherry) se describió previamente (Ruiz-Roldan et al., 2010). Para obtener un F. oxysporum cepa que expresa simultáneamente tanto H1-mCherry como el reportero fluorescente Lifeact-sGFP para visualización de F-actina (Fern & # x00E1ndez - & # x00C1balos et al., 1998 Riedl et al., 2008), los protoplastos de la cepa H1-mCherry previamente obtenida fueron cotransformado con un casete de resistencia a higromicina más un PgpdA:: Fragmento lineal LifeAct-sGFP (para obtener más detalles, consulte el texto complementario S1 y la tabla complementaria S1), como se describió anteriormente (Di Pietro et al., 2001 L & # x00F3pez-Berges et al., 2012). Para la producción de microconidios, los cultivos se cultivaron en caldo de dextrosa de patata (PDB Sigma P6685) a 28 ° C y 120 rpm durante 4 ° x20137 días. Los microconidios se filtraron a través de un sistema de filtro de algodón hecho a medida, se recolectaron por centrifugación y se lavaron dos veces con agua pura.

los U. maydis Las cepas que expresan opsina1 fusionadas con proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) se describieron en detalle anteriormente (Panzer et al., 2019) y se derivaron del aislado de tipo salvaje FB1 (Banuett y Herskowitz, 1989). O la cepa FB1 & # x0394UmOps1 Pcrg:: UmOps1-eGFP K1 o FB1 Pcrg:: Se usó UmOps1-eGFP KA para experimentos ExM. U. maydis Los esporidios se cultivaron como se describió anteriormente (Panzer et al., 2019). Los esporidios se cultivaron en PDB durante 15 & # x201324 ha 28 & # x00B0C y 100 rpm, recolectados por centrifugación (4000 & # x00D7 gramo, 3 min), lavado una vez en ddH2O y resuspendido en ddH2O hasta una densidad final de 6,5 x 10 5 esporidios / ml. Si fue necesario, la expresión de UmOps1-eGFP se indujo mediante tratamiento con medio de inducción que contenía arabinosa (Panzer et al., 2019).

La unión final no homóloga-deficiente A. fumigatus la cepa AfS35 (Krappmann et al., 2006 Wagener et al., 2008) se transformó con los plásmidos pYZ011 y pYZ012. pYZ012 alberga un casete de resistencia a fleomicina y codifica una proteína de fusión de proteína roja fluorescente (RFP) dirigida a mitocondrias que consta de la parte N-terminal (52 aminoácidos) de Aspergillus niger citrato sintasa seguida de mRFP1 bajo el control de la Aspergillus nidulans gpdA promotor. pYZ011 alberga un casete de resistencia a piritiamina y codifica A. fumigatus AFUA_1G10040 que incluye 230 pb de su región promotora, seguida sin codón de parada por la secuencia codificante de una GFP (S65T) (Heim et al., 1995), FPbase ID: derivado de B6J33 con las siguientes modificaciones: M1_S2insV, E235_K238delinsSCTSKISRPRETW. La cepa se cultivó en medio mínimo sólido de Aspergillus (AMM) (Hill y Kafer, 2001) en matraces de cultivo de tejidos T75 (Sarstedt) para evitar la propagación incontrolada de las esporas de hongos hidrófobos. Las esporas se recolectaron sumergiéndolas en PBS y resuspendiéndolas mediante perlas de vidrio.

Digestión enzimática de la pared celular y tinción

Se sembraron esporas de hongos y esporidios en cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina (PDL) en placas de cultivo de tejidos de 4 pocillos (800 & # x03BCL / pocillo). Mientras que se investigaron los esporidios después de 30 min de sedimentación, los conidios se dejaron germinar en el medio de cultivo respectivo durante 18 h (A. fumigatus) o 14 & # x201319 h (F. oxysporum). Si se indica, las células fúngicas se incubaron durante 5 & # x201310 min en 0,5 & # x03BCM mCling-Atto643 colorante fluorescente disuelto en medio nutriente para teñir la membrana. Después de tres pasos de lavado con PBS, las muestras se fijaron directamente en formaldehído al 4% y glutaraldehído al 0,25% durante 15 min (procedimiento estándar) o, como en el caso de la detección de microtúbulos en U. maydis sporidia, tratados según el protocolo de Michie et al. (2017). Brevemente, los esporidios se prefijaron y se permeabilizaron durante 1 min en tampón de citoesqueleto precalentado (tampón MES 10 mM pH 6,1, NaCl 150 mM, EGTA 5 mM, glucosa 5 mM y MgCl 5 mM2) que contiene adicionalmente Triton X-100 al 0,25% y glutaraldehído al 0,3% y finalmente se fija durante 10 min en tampón de citoesqueleto provisto de glutaraldehído al 2%. Para apagar la autofluorescencia, la fijación fue seguida de una incubación de 7 minutos en NaBH al 0,1%.4. Después de lavados consecutivos, las paredes celulares se digirieron durante 1 ha TA con una solución de enzima lítica de la pared celular, basada en una mezcla enzimática (0,1 g de enzima de lisis de T. harzianum, 0,25 g de driselasa y 0,5 mg de quitinasa disueltos en 10 ml de NaCl 0,7 M) que se utilizó para la generación de Fusarium fujikuroi protoplastos antes (Garc & # x00EDa-Mart & # x00EDnez et al., 2015). La solución enzimática se utilizó directamente en los experimentos o se almacenó a & # x221280 & # x00B0C para su uso posterior. Para el tratamiento de germinados jóvenes y U. maydis sporidia, la solución de enzima se diluyó en una proporción de 1: 5 con NaCl 0,7 M. En caso de que se requiriera tinción adicional con anticuerpos, las muestras se bloquearon durante 30 min en BSA al 5% / Triton X-100 al 0,25% y posteriormente se incubaron con el anticuerpo primario anti - & # x03B1-tubulina (abcam, ab18251) durante 1 h. Después del lavado, las muestras se incubaron durante otra hora en el anticuerpo secundario correspondiente (etiqueta Alexa 488, Thermo-Fisher, A11008 o etiqueta ATTO647N, Sigma, 40839) resuelto en solución de bloqueo y lavado con PBS. Todas las muestras se procesaron instantáneamente para ExM.

Expansión

Inmediatamente antes de la gelificación, como se publicó anteriormente (Chozinski et al., 2016 Kunz et al., 2019), las muestras se incubaron durante 10 min con glutaraldehído al 0,25% y se lavaron con PBS. A continuación, una gota de la solución de monómero [acrilato de sodio al 8,625% (Sigma, 408220), acrilamida al 2,5% (Sigma, A9926), N, N & # x2032-metilenbisacrilamida al 0,15% (Sigma, A9926), NaCl 2 M (Sigma, S5886) ), 1 & # x00D7 PBS y 0,2% de persulfato de amonio recién añadido (APS, Sigma, A3678) y tetrametiletilendiamina (TEMED, Sigma, T7024)] se preparó en parafilm en una placa de Petri húmeda. Usando pinzas, el cubreobjetos con los hongos adheridos se transfirió luego boca abajo sobre la gota de gelificación. Se dejó que la muestra se gelificara durante al menos 1 ha TA en el plato cerrado. Para asegurar la expansión isotrópica, las muestras se homogeneizaron (Gao et al., 2017) en tampón de digestión [Tris 50 mM pH 8.0, EDTA 1 mM (Sigma, ED2P), Triton X-100 al 0.5% (Thermo Fisher, 28314) y 0.8 M guanidina HCl (Sigma, 50933)] suministrada con 8 U / ml de proteinasa K (Thermo Fisher, AM2548) durante 1 h hasta toda la noche. Este paso es necesario para reducir la cohesión de las proteínas fijadas, mientras que la mayoría de los compuestos celulares se eliminan del gel. Al mismo tiempo, la mayoría de los fluoróforos permanecen unidos al polímero (Tillberg et al., 2016). Las muestras digeridas se expandieron en ddH2O durante 3 & # x20134 h. El agua se cambió cada hora hasta que el tamaño del gel no aumentó más. Los geles expandidos se almacenaron a 4 ° C hasta su uso. El factor de expansión se determinó tanto por el diámetro de los hongos como por el tamaño del gel antes y después de la expansión. La formación de imágenes se realizó en cámaras recubiertas con PDL (Merck, 734-2055) para inmovilizar los geles.

Microscopio fluorescente

Las imágenes se realizaron en un sistema confocal invertido (Zeiss LSM700) o en un sistema SIM (Zeiss ELYRA S.1 SR-SIM) equipado con un aceite 63x (utilizado para muestras sin expandir) y un objetivo de inmersión en agua 63x (utilizado para muestras ExM C -Apocromático, 63 x 1,2 NA, Zeiss, 441777-9970). El objetivo de agua era necesario para proporcionar una distancia de trabajo suficiente para poder obtener imágenes de las muestras expandidas. Las imágenes CLSM no expandidas se capturaron utilizando los tamaños de píxeles ideales proporcionados por el software (entre 740 x 740 y 856 x 856 píxeles) y un tiempo de permanencia de píxeles entre 1,58 & # x03BC y 4,24 & # x03BC utilizando potencias láser que oscilan entre 1,5 y 10%. A continuación, se obtuvieron imágenes de las muestras expandidas nuevamente con el tamaño de píxel óptimo y el tiempo de permanencia de píxel en el rango de 6.30 & # x03BCs a 8.43 & # x03BCs, usando potencias de láser entre 10 y 26% con láseres de 488 nm, 555 nm y 639 nm. El orificio se ajustó a 1 unidad de aire y el fotomultiplicador se fijó en 700. Las imágenes SIM se reconstruyeron con la plataforma de procesamiento de imágenes ZEN del módulo SIM, con un tamaño de píxel fijo de 31 nm. La potencia del láser osciló entre el 8 y el 25% utilizando láser de 488 nm, 561 nm y 642 nm con tiempos de integración entre 100 ms y 300 ms. Para el procesamiento final de la imagen, se utilizaron Imaris 8.4.1 y FIJI 1.51 (Schindelin et al., 2012).


Microscopía directa de raspados de piel y de uñas.

El material se examina al microscopio mediante uno o más de estos métodos:

  • Preparación de hidróxido de potasio (KOH), teñida con tinta azul o negra
  • Tinción fluorescente
  • Un montaje en húmedo sin teñir
  • Un frotis seco teñido
  • Histopatología de la biopsia con tinciones especiales, como ácido periódico-Schiff (PAS).

La microscopía puede identificar un dermatofito por la presencia de:

  • Hifas fúngicas (filamentos ramificados) que forman un micelio
  • Artrosporas (esporas rotas)
  • Artroconidios (esporas externas especializadas)
  • Esporas dentro de un cabello (endothrix) o fuera de un cabello (ectothrix).

Los elementos fúngicos a veces son difíciles de encontrar, especialmente si el tejido está muy inflamado, por lo que un resultado negativo no descarta una infección fúngica.

Una candidiasis puede identificarse por la presencia de:

  • Células de levadura, que pueden dividirse por gemación.
  • Pseudohifas (filamentos ramificados similares a los de un dermatofito) que forman un pseudomicelio.

Tinción PAS de aspergillus observada en una biopsia de piel


Se mezcla una gota de suspensión bacteriana con tintes, como tinta china o nigrosina. El fondo se tiñe de negro mientras que la cápsula bacteriana o de levadura sin teñir destaca en contraste. Esto es muy útil en la demostración de cápsulas que no absorben manchas simples.

Preparación de tinta china

Las tinciones negativas se utilizan cuando una muestra o una parte de ella, como la cápsula, se resiste a absorber la tinción. Se recomienda la preparación de tinta china para su uso en la identificación de Cryptococcus neoformans.


Preguntas y respuestas sobre hongos | Microbiología | Biología

Preguntas y respuestas frecuentes sobre hongos. En este artículo discutiremos sobre: ​​- 1. Definición de hongos 2. Origen de los hongos 3. Metabolismo 4. Características 5. Estructuras 6. Reproducción 7. Clasificación 8. Importancia 9. Formas de esporas 10. Diagnóstico de laboratorio.

  1. Preguntas y respuestas # Definición de hongos
  2. Preguntas y respuestas # Origen de los hongos
  3. Preguntas y respuestas # Metabolismo de los hongos
  4. Preguntas y respuestas # Características de los hongos
  5. Preguntas y respuestas # Estructuras de los hongos
  6. Preguntas y respuestas # Reproducción de hongos
  7. Preguntas y respuestas # Clasificación de hongos
  8. Preguntas y respuestas # Importancia de los hongos
  9. Preguntas y respuestas # Formas de esporas en hongos
  10. Preguntas y respuestas # Diagnóstico de laboratorio de la infección por hongos

Preguntas y respuestas n. ° 1. Definición de hongos:

Los hongos son formas de microorganismos evolutivamente más avanzados, en comparación con los procariotas (priones, virus, bacterias). Se clasifican como eucariotas. es decir, tienen un número diploide de cromosomas y una membrana nuclear y tienen esteroles en su membrana plasmática. La complejidad genética permite la complejidad morfológica y, por lo tanto, estos organismos tienen características estructurales complejas que se utilizan en la especiación.

Los hongos se pueden dividir en dos formas morfológicas básicas, levaduras e hifas. Las levaduras son hongos unicelulares que se reproducen asexualmente por formación de blastoconidios (gemación) o fisión. Las hifas son hongos multicelulares que se reproducen asexualmente y / o sexualmente. El dimorfismo es la condición en la que un hongo puede exhibir la forma de levadura o la forma de hifas, dependiendo de las condiciones de crecimiento.

Muy pocos hongos presentan dimorfismo. La mayoría de los hongos se presentan en forma de hifas como filamentos tubulares ramificados, filiformes. Estas estructuras filamentosas carecen de paredes transversales (cenocíticas) o tienen paredes transversales (septadas) dependiendo de la especie. En algunos casos, las hifas septadas desarrollan conexiones de pinza en los septos que conectan los elementos de las hifas.

Una masa de elementos hifas se denomina micelio (sinónimo de moho). Las hifas aéreas a menudo producen propagaciones de reproducción asexual denominadas conidios (sinónimo de esporas). Los conidios relativamente grandes y complejos se denominan macroconidios, mientras que los conidios más pequeños y simples se denominan microconidias.

Cuando los conidios están encerrados en un saco (el esporangio), se denominan endosporas. La presencia / ausencia de conidios y su tamaño, forma y ubicación son características principales utilizadas en el laboratorio para identificar las especies de hongos en muestras clínicas.

La reproducción asexual, a través de la formación de conidios, no implica la recombinación genética entre dos tipos sexuales, mientras que la reproducción sexual implica la recombinación genética entre dos tipos sexuales.

Preguntas y respuestas n. ° 2. Origen de los hongos:

La Irlanda de la década de 1840 era un país económicamente deprimido de ocho millones de habitantes. La mayoría eran arrendatarios que pagaban un alquiler a los terratenientes que eran responsables, a su vez, de los propietarios ingleses de la propiedad. La única cosecha de los agricultores irlandeses eran las patatas, que se cultivaban temporada tras temporada en pequeñas extensiones de tierra. El poco maíz disponible se usó para alimentar a las vacas y cerdos. A principios de la década, las fuertes lluvias y la humedad presagiaban una calamidad.

Luego, el 23 de agosto de 1845, The Gardener & # 8217s Chronicle and Agricultural Gazette informó:

& # 8220Una enfermedad fatal ha estallado entre la cosecha de papa. Por todos lados escuchamos de la destrucción. En Bélgica, se dice que los campos han sido completamente desolados. & # 8221

Las patatas habían sufrido antes. Había habido sarna, sequía, & # 8220 curl & # 8221 y demasiada lluvia, pero nada era tan destructivo como esta nueva enfermedad. Derribó las plantas como la escarcha en verano. Comenzó como manchas negras, descompuso las hojas y los tallos, y dejó a las papas una masa podrida y blanda con un olor peculiar y desagradable. Incluso las patatas cosechadas se pudrieron.

El invierno de 1845-1846 fue un desastre para Irlanda. Los agricultores dejaron las patatas podridas en los campos y la enfermedad se propagó. Primero los granjeros comieron el alimento para animales y luego los animales. También devoraron las patatas de siembra, sin dejar nada para la siembra de primavera.

A medida que se extendía el hambre, el gobierno inglés intentó ayudar importando maíz y estableciendo centros de ayuda. En Inglaterra, la enfermedad de la patata tuvo pocas repercusiones porque la agricultura inglesa incluía varios cereales, pero en Irlanda la hambruna se extendió rápidamente.

Después de dos años, la podredumbre de la papa pareció aflojarse, pero en 1847 regresó con fuerza. A pesar de los esfuerzos de ayuda de los ingleses, más de dos millones de irlandeses murieron de hambre. Finalmente, unos 900.000 supervivientes partieron hacia Canadá y Estados Unidos. Los que se quedaron tuvieron que lidiar con la agitación económica y política, así como con la miseria y la muerte.

La plaga de la papa se desvaneció en 1848, pero no desapareció. En cambio, emergió de nuevo durante las estaciones húmedas y volvió a florecer. Al final, cientos de miles de irlandeses abandonaron la tierra y se mudaron a ciudades o países extranjeros. Durante la década de 1860, grandes oleadas de inmigrantes irlandeses llegaron a Estados Unidos. Muchos estadounidenses descienden de esos granjeros hambrientos y desmoralizados.

Tales son los efectos históricos, políticos, económicos y sociológicos de una especie de hongo. Otras enfermedades fúngicas de frutas, cereales y verduras pueden ser igualmente devastadoras. Además, tomaremos nota de varias enfermedades humanas y animales generalizadas que se deben a los hongos y encontraremos muchos hongos beneficiosos como los que se utilizan para hacer antibióticos, pan y alimentos o se utilizan como insecticidas. Nuestro estudio comenzará con un enfoque en las estructuras, patrones de crecimiento y ciclos de vida de los hongos.

Todos los hongos son de vida libre, es decir, no son parásitos intracelulares obligados. No contienen clorofila y no pueden sintetizar macromoléculas a partir del dióxido de carbono y la energía derivada de los rayos de luz. Por lo tanto, todos los hongos son heterótrofos y viven de materia orgánica preformada.

Para fines médicos, los aspectos importantes del metabolismo de los hongos son:

1. La síntesis de quitina, un polímero de N-acetilglucosamina, y otros compuestos, para su uso en la formación de la pared celular. Estos inducen hipersensibilidad inmunitaria.

2. La síntesis de ergosterol para su incorporación a la membrana plasmática. Esto hace que la membrana plasmática sea sensible a los agentes antimicrobianos que bloquean la síntesis de ergosterol o impiden su incorporación a la membrana o se unen a ella, p. anfotericina B.

3. La síntesis de toxinas como:

(a) Alcaloides del cornezuelo del centeno & # 8211 estos son producidos por Claviceps purpurea y causan un bloqueo adrenérgico alfa

(b) Agentes psicotrópicos & # 8211 estos incluyen psilocibina, psilocina y dietilamida de ácido lisérgico (LSD)

(c) Aflatoxinas & # 8211 estos son carcinógenos producidos por Aspergillus flavus cuando crece en grano. Cuando estos granos son consumidos por humanos o cuando son alimentados al ganado lechero y llegan al suministro de leche, afectan a los humanos.

4. La síntesis de proteínas en los ribosomas que son diferentes de las que se encuentran en las bacterias. Esto hace que los hongos sean inmunes a los agentes antimicrobianos que se dirigen contra el ribosoma bacteriano, por ejemplo, cloranfenicol.

5. La capacidad de ciertos metabolitos para alterar la morfología de la levadura y / o ser asimilados por la levadura con efectos de identificación clínica concomitantes.

2. No contienen clorofila

4. Los heterótrofos absorbentes y # 8211 digieren los alimentos primero y luego los absorben en sus cuerpos.

5. Liberar enzimas digestivas para descomponer el material orgánico o su huésped.

6. Almacenar energía alimentaria como glucógeno.

7. La mayoría son saprobios y viven en otros organismos muertos.

8. Descomponedores y recicladores importantes de nutrientes en el medio ambiente

9. La mayoría son multicelulares, pero algunas unicelulares como la levadura.

10. Algunos son parásitos internos o externos, algunos son depredadores que capturan presas

12. Carecen de verdaderas raíces, tallos y hojas

13. Las paredes celulares están hechas de quitina (un polisacárido complejo)

14. Crecen como tubos o filamentos microscópicos llamados hifas que contienen citoplasma y núcleos.

15. Las redes hifales se denominan micelio.

17. Reproducir por esporas sexuales y asexuales.

18. La penicilina antibiótica proviene del moho Penicillium.

19. Clasificados por sus estructuras de reproducción sexual

20. Crece mejor en ambientes cálidos y húmedos que prefieren la sombra.

21. Micología y estudio # 8211 de hongos

22. Fungicida y productos químicos # 8211 utilizados para matar hongos

23. Incluye levaduras, mohos, hongos, tiña, puffballs, royas, obscenidades, etc.

24. Los hongos pueden haber evolucionado de procariotas por endosimbiosis.

1. Cuerpo de un hongo formado por pequeños filamentos o tubos llamados hifas.

2. Las hifas contienen citoplasma y núcleos y tienen una pared celular de quitina.

3. Cada hifa es una celda continua.

4. Las hifas crecen y se ramifican continuamente.

5. El tabique (septa-plural) son paredes transversales con poros que permiten el movimiento del citoplasma en las hifas.

6. Las hifas con septos se denominan hifas septadas.

7. Las hifas sin septos se denominan hifas cenocíticas.

8. Las esteras enredadas de hifas se conocen como micelio.

9. Todas las hifas dentro de un micelio comparten el mismo citoplasma, por lo que los materiales se mueven rápidamente.

10. Las hifas crecen rápidamente desde las puntas por división celular.

11. El estolón son hifas horizontales que conectan grupos de hifas entre sí.

12. Los rizoides son partes de hifas en forma de raíz que anclan el hongo.

1. La mayoría de los hongos se reproducen asexualmente y sexualmente.

2. La reproducción asexual produce organismos genéticamente idénticos y es el método más utilizado.

3. La reproducción sexual en los hongos ocurre cuando los nutrientes o el agua son escasos.

4. Los cuerpos fructíferos son hifas modificadas que producen esporas asexuales.

5. Los cuerpos fructíferos consisten en un tallo erguido o esporangióforo con un saco que contiene esporas llamado esporangio.

6. Los tipos de cuerpos fructíferos incluyen basidios, esporangios y ascus.

7. Esporas & # 8211 células haploides con citoplasma deshidratado y una capa protectora capaz de convertirse en nuevos individuos.

8. El viento, los animales, el agua y los insectos esparcen las esporas.

9. Cuando la espora aterriza en una superficie húmeda, se forman nuevas hifas.

Preguntas y respuestas # 6. Reproducción de Hongos:

1. Los hongos se reproducen asexualmente cuando las condiciones ambientales son favorables.

2. Algunos hongos unicelulares se reproducen por mitosis.

3. Las células de levadura se reproducen por gemación donde una parte de la célula se pellizca para producir más células de levadura.

4. El hongo del pie de atleta se reproduce por fragmentación de un pequeño trozo de micelio.

5. La mayoría de los hongos se reproducen asexualmente por esporas.

6. El moho Penicillium produce esporas llamadas conidios sin un saco protector en la parte superior de un tallo llamado conidióforo.

1. Los hongos se reproducen sexualmente cuando las condiciones ambientales son desfavorables.

2. Sin hongos machos o hembras.

3. Dos tipos de apareamiento & # 8211 más (+) y menos (-)

4. La fertilización ocurre cuando las hifas (+) se fusionan con las hifas (-) para formar un cigoto 2N o diploide.

5. Algunos hongos muestran dimorfismo (capacidad de cambiar su forma en respuesta a sus condiciones ambientales)

Preguntas y respuestas # 7. Clasificación de hongos:

Los hongos se clasifican por sus estructuras reproductivas. Los 4 filos de hongos son Basidiomycota, Zygomycota, Ascomycota y Deuteromycota.

1. Hongos denominados esporangios o mohos comunes.

2. Incluye mohos y blings como tizones como Rhizopus stolonifer (moho del pan).

3. No hay septos en las hifas (cenocítico).

4. Estructura reproductiva asexual llamada esporangio y produce esporangiosporas.

5. Los rizoides anclan el moho, liberan enzimas digestivas y absorben los alimentos.

6. Estructura reproductiva asexual llamada esporangio y produce esporangiosporas.

7. La espora sexual producida por conjugación cuando las hifas (+) y la fusión (-) se denominan cigosporas.

8. Las zigosporas pueden soportar entornos hostiles hasta que mejoren las condiciones y se produzcan nuevos esporangios.

2. Incluye hongos, hongos venenosos, puffballs, hongos de soporte, hongos de estante, cuernos apestosos, herrumbres y obscenidades.

3. Algunos se utilizan como alimento (hongos) y otros causan daños a los cultivos (royas y carbonilla)

4. Rara vez se reproducen asexualmente

5. Basdiocarp formado por un tallo llamado estipe y un sombrero aplanado.

6. El estípite puede tener una falda similar a un anillo debajo de la tapa llamado anillo.

7. Las branquias se encuentran en la parte inferior del sombrero y están revestidas con basidios.

8. Basidium & # 8211 estructura reproductiva sexual que produce basidiosporas.

9. Las basidiosporas se liberan de las branquias y germinan para formar nuevas hifas y micelios.

10. Estructuras vegetativas que se encuentran bajo tierra e incluyen rizoides (anclan y absorben nutrientes), hifas y micelios.

2. Incluye levadura, hongos en taza, trufas, mildiú polvoriento y colmenillas.

1. Algunos son parásitos que causan la enfermedad del olmo holandés y el tizón del castaño.

2. Sac Fungi puede reproducirse tanto sexual como asexualmente.

3. La levadura se reproduce asexualmente por gemación (forma células pequeñas en forma de yema que se desprenden y producen más levadura)

4. Las esporas asexuales llamadas conidios se forman en las puntas de hifas especializadas llamadas condióforos.

5. Ascocarp – specialized hyphae formed by parent fungi during sexual reproduction.

6. Ascus – sacs within the ascocarp that form spores called ascospores.

1. Symbiotic association between a sac fungus and a photosynthetic green algae or cyanobacteria.

2. Both organisms benefit (algae makes food and fungus supplies moisture, shelter, and anchorage)

3. Grow on rocks, trees, buildings, etc. and help form soil.

4. Crustose lichens grow on rocks and trees fructose lichens grow shrub-like foliose lichens grow mat-like on the soil.

1. Symbiotic association of a fungus living on plant roots.

2. Most plants have mycorrhizae on their roots.

3. Fungus absorbs sugars made by plant.

4. Plants absorb more water and minerals with aid of the fungus.

1. Fungal spores cause allergies

2. Molds, mildew, rust, and smuts damage crops

3. Yeasts are used to make beer and bread

5. Decomposers and recyclers of nutrients

6. Mushrooms eaten as food

8. Aspergillus is used to make soy sauce

9. Cause athlete’s foot and ringworm

10. Amanita is poisonous mushroom

11. Can cause yeast infections

Species are important human pathogens that are best known for causing opportunist infections in immuno compromised hosts (e.g. transplant patients, AIDS sufferers, cancer patients). Infections are difficult to treat and can be very serious – 30-40% of systemic infections result in death.

The sequencing of the genome of C. albicans and those of several other medically relevant Candida species has provided a major impetus for Candida comparative and functional genomic analyses. These studies are aiding the development of sensitive diagnostic strategies and novel antifungal therapies.

Aspergillus spores are found nearly everywhere so we are routinely and almost constantly exposed to them. Such exposure is a normal part of the human condition and generally poses no adverse health effects. Nevertheless, Aspergillus can and does cause disease in three major ways: through the production of mycotoxins through induction of allergenic responses and through localized or systemic infections. With the latter two categories, the immune status of the host is pivotal.

Allergies and asthma are thought to be caused by an active host immune response against the presence of fungal spores or hyphae. In contrast, with invasive aspergillosis, the immune system has collapsed and little or no defence can be mounted.

The most common pathogenic species are Aspergillus fumigatus and Aspergillus flavus. Aspergillus flavus produces aflatoxin which is both a toxin and a carcinogen and which can potentially contaminate foods such as nuts. Aspergillus fumigatus and Aspergillus clavatus can cause allergic disease.

Some Aspergillus species cause disease on grain crops, especially maize, and synthesize mycotoxins including aflatoxin. Aspergillosis is the group of diseases caused by Aspergillus. The symptoms include fever, cough, chest pain or breathlessness. Usually, only patients with weakened immune systems or with other lung conditions are susceptible.

Cryptococcus neoformans can cause a severe form of meningitis and meningo­encephalitis in patients with HIV infection and AIDS. The majority of Cryptococcus species lives in the soil and do not cause disease in humans. Cryptococcus neoformans is the major human and animal pathogen.

Cryptococcus laurentii and Cryptococcus albidus have been known to occasionally cause moderate-to-severe disease in human patients with compromised immunity. Cryptococcus gattii is endemic to tropical parts of the continent of Africa and Australia and can cause disease in non-immunocompromised people

Histoplasma capsulatum can cause histoplasmosis in humans, dogs and cats. The fungus is most prevalent in the Americas, India and southeastern Asia. It is endemic in certain areas of the United States. Infection is usually due to inhaling contaminated air.

Pneumocystis jirovecii (or Pneumocystis carinii) can cause a form of pneumonia in people with weakened immune systems, such as premature children, the elderly, and AIDS patients.

Stachybotrys chartarum or “black mold” can cause respiratory damage and severe headaches. It frequently occurs in houses in regions that are chronically damp.

Questions and Answers # 9. Spore Forms in Fungi:

Fungi reproduce both asexually and sexual­ly by different types of spores. Some spores are the unit of dispersal, but others function as rest­ing spores to overcome the unfavourable period, and some others have the efficiency to serve both the above functions.

The spores are mainly divided into two groups:

The spores formed during asexual reproduction are the asexual spores. Basically the asexual spores are of two types: sporangiospores, and conidia.

The sporangiospores are developed inside a sac-like structure, the sporangium.

Sporangio­spores are of two types, zoospores and aplanospores:

Zoospores (Fig. 4.4) are the characteristic spore of the subdivision Mastigomycotina. Three types of zoo­spores are produced in this group.

i. Anteriorly uniflagellate, these are pyriform in shape having one whiplash (Synchytrium) or tinsel (Rhizidiomyces) type of flagellum anteriorly.

ii. Anteriorly biflagellate. These are pyriform in shape having two flagella (one whiplash and one tinsel type), placed anteriorly., e.g., Saprolegnia etc.

iii. Laterally biflagellate. These are kidney-shaped having two flagella (one whiplash and one tinsel type), placed laterally, e.g., Phytophthora, Pythium etc.

The sporangiospores of this type are devoid of flagella and are called aplanospores (Fig. 4.8L). It is the characteristic spore of Mucorales under Zygomycetes, e.g., Mucor, Rhizopus etc.

The conidia (Fig. 4.8A, B, C) differ from aplanospores because they are not enclosed by a separate sporangial wall. They are usually developed at the apex of hyphae.

Conidia show variability in both their form and development. They are main­ly divided on the basis of their mode of development.

There are two basic modes of development of conidia: bias- tic and thallic. In blastic type, marked enlargement of conidium initial takes place before it is delimited by the sep­tum. In thallic type, enlargement of the conidium initial takes place only after the initial has been delimited by the septum.

These are divided into two types:

1. Blastoconidia. They can develop from a cell of an undifferentiated hypha or conidiophore at o e or more points through budding, either apically or late­rally. They may develop either singly or in chains, e.g., Aureobasidium, Cladosporium etc.

2. Phialoconidia. They develop from a bottle-shaped cell, the phialide. Single conidium reaches full size before being cut off by septation and immediately another one develops underneath. Thus generally a chain of conidia are deve­loped, where younger one always remains near the mother, e.g., Tricho- derma, Fusarium.

1. Thalloconidia. In this type, the conidia are developed on hypha either singly or in short or long, branched or unbranched chains and enlargement of the conidium initial takes place only after the initial has been delimited by septum, e.g., Erysiphe, Penicillium, Geotrichum, Oidium etc.

The spores formed after sexual reproduction are the sexual spores. There are four types of sexual spores in fungi.

These are oospores, zygospores, ascospores and basidiospores:

These are diploid (2n) spores formed by the union between egg and male nucleus. Coming in contact with the oogonium, the antheridium passes its nucleus inside the oogonium through fertilisation tube and forms oospore. It is a resting spore, e.g., members of Oomycetes under Mastigomycotina.

Like Oospore, it is also a resting spore formed by the union of two gametangia into a single cell. The cell develops into a thick-walled, black and warty structure, the Zygospore, e.g., members of Zygomycetes. In majority of the members of Mastigo­mycotina and Zygomycotina, the sexually produced spores are developed freely and are not surrounded by sterile hyphae. But in Ascomycotina and Basidiomycotina, the spores are commonly surrounded by sterile hyphae and are called ascocarps and basidiocarps respec­tively.

Ascospores are developed by the union of two gametangia. The ascospores are always developed in (i.e., endogenously) a sac-like structure, the ascus, and thus the fungi containing asci are commonly called sac fungi.

The ascospores are uninucleate and uni­cellular generally oval, round or elon­gated structure. They are generally 8 in an ascus, but may be 4 (Saccharomyces cerevisiae, Saccharo­mycodes ludwigii) or numerous.

The basidiospores are developed on (i.e., exogenously) basidia. The basidia are developed from the dikaryotic cell. During this process a long gap is generally maintained between plasmogamy and karyogamy. Basidia are usually of two types: Holobasidium i.e., aseptate basidium and Phragmobasidium.

The basidiospores are unicellular, uni­nucleate, thin walled generally round to oval structure, developed on basi­dium. They are generally four in num­ber per basidium but may be two or many (e.g., Ustigo nuda tritici).

Questions and Answers # 10. Laboratory Diagnosis of Fungal Infection:

The KOH test for fungus is conducted on an outpatient basis and patients do not need to prepare in advance. Results are usually available while the patient waits or the next day if sent to a clinical laboratory. The KOH test procedure may be performed by a physician, physician assistant, medical assistant, nurse, or medical laboratory technician. If fungal cultures are required, the test is performed by a technologist who specializes in microbiology.

1. Collection – Skin, nail, or hair samples are collected from the infected area on the patient. For skin samples, a scalpel or edge of a glass slide is used to gently scrape skin scales from the infected area. For hair samples, a forceps is used to remove hair shafts and follicles from the infected site. If the test is being sent to a laboratory, the scrapings are placed in a sterile covered container.

2. The scrapings are placed directly onto a microscope slide and are covered with 10% or 20% potassium hydroxide.

3. The slide is left to stand until clear, normally between five and fifteen minutes, in order to dissolve skin cells, hair, and debris.

4. To enhance clearing dimethyl sulfoxide can be added to the slide. To make the fungi easier to see lactophenol cotton blue stain can be added.

5. The slide is gently heated to speed up the action of the KOH.

6. Adding calcofluor-white stain to the slide will cause the fungi to become fluorescent, making them easier to identify under a fluorescent microscope.

7. Place the slide under a microscope to read.

Dermatophytes are easily recognized under the microscope by their long branch-like tubular structures called hyphae. Fungi causing ringworm infections produce septate (segmented) hyphae. Some show the presence of spores formed directly from the hyphae (arthroconidia).

Under the microscope Tinea versicolor is recognized by curved hyphae and round yeast forms that give it a spaghetti-and-meatball appearance. Yeast cells appear round or oval and budding forms may be seen. The KOH prep cannot identify the specific organism the specimen can be submitted for fungal culture to identify the organism.

8. A normal, or negative, KOH test shows no fungi (no dermatophytes or yeast). Dermatophytes or yeast seen on a KOH test indicate the person has a fungal infection. Follow-up tests are usually unnecessary.

9. The skin may be sore after the test because of the tissue being scraped off the top of the surface of the skin.

Specimens should be collected in sterile containers or with sterile swabs and transported immediately to the laboratory. This product is used in conjunction with other biochemical and serological tests to identify cultures of isolated organisms.

Mix the specimen with a small drop of India on a clean glass slide. Place a cover slip over the smear and press gently. The preparation should be brownish, not black. Using reduced examine the smear microscopically (100X) for the presence of encapsulated cells as indicated by clear zones surrounding the cells.

Note – The India is ready to use. Further dilution with water is not recommended.

Note – Production of capsular material may be increased by cultivation in a 1% peptone solution (Peptone Broth ).

Fungal cultures are a test to try and ascertain the type of fungal organism that is responsible for an infection or even the presence of the organism in the first place. Fungi are one of the five classes of pathogens that cause disease the other being viruses, bacteria, prions, and helminthes.

It is very important that the correct organism is identified during an infection because the drug treatments differ according to the type of organism and one treatment would not work for the other.

A fungus culture is usually acquired from wound exudates and swabs of areas that are within the body like the mouth and vagina. Very rarely can fungi cause infections within the body because the human immune system is more than adapt at eliminating fungi.

However, sometimes, a fungal blood culture might need to be done because of a condition called fungal sepsis. Sepsis is the presence of bacteria or an infection in the blood. This is a very rare condition and a medical emergency as well. The fungal culture test that is performed in this condition will usually turn up the Candida fungus as the causative organism, though the list is quite endless.

A fungal culture is taken from a part of the body in secretions or by taking a blood sample. Most infections with fungi are limited to the skin, oral mucosa, or the genitals. Very rarely does fungal sepsis actually occur unless a patient is severely immune-compromised. This is usually the case in patients with AIDS or with diabetes. Both of these diseases will cause the immune system to stop working altogether giving rise to all sorts of opportunistic infections.

A fungal growth is acquired by analyzing the secretions and exudates from a wound or by swabbing a surface that is infected. A blood sample might also be required for checking for the presence of fungi in the blood. The sample is then cultured in a fungus-friendly environment for up to a week or more before the fungal colonies become visible.

This stain is prepared over two days.

1. On the first day, dissolve the Cotton Blue in the distilled water. Leave overnight to eliminate insoluble dye.

2. On the second day, wearing gloves add the phenol crystals to the lactic acid in a glass beaker, place on magnetic stirrer until the phenol is dissolved.

4. Filter the Cotton Blue and distilled water solution into the phenol/glycerol/lactic acid solution. Mix and store at room temperature.

1. Calcofluor White with 10% KOH

2. Potassium Hydroxide (KOH) with Chlorazol Black

5. Cello tape Flag Preparations

6. Slide Culture Preparations

7. Southgate’s Mucicarmine stain

8. Periodic acid-Schiff (PAS) and PAS Digest stain

9. Grocott’s Methenamine Silver (GMS) stain

Cryptococcus neoformans, because of its large polysaccharide capsule, can be visualized by the India stain. Organisms that possess a polysaccharide capsule exhibit a halo around the cell against the black background created by the India.


Common Stains for Slide Preparation

Since most biological structures are transparent, we need a technique to distinguish clearly the parts as we observe under the microscope. This is possible by employing some means by which contrast between different structures can be obtained. Sometimes adjusting light helps but the most common method is staining.

Stains such as methylene blue in low concentrations does not harm the tissues and so can be safely used on living materials. Such stains are called vital stains.

For making temporary slides stains such as methylene blue, idodine, aniline hydrochloride, safranin etc are used.

Given below are some common stains and their uses and the colour they show up as:

Iodine: Stains carbohydrates in plant and animal specimens brown or blue- black.Stains glycogen red.

Methylene blue: Stains acidic cell parts (like nucleus) blue. Use on animal, bacteria and blood specimens. Can be used as a substitute for Janis B green.

Eosin Y: Stains alkaline cell parts (like cytoplasm) pink. Use on plants,animals and blood. Can be used as a substitute for Congo Red and Carmine.

Safranin : Mainly used for sections of plant tissues, stains red

Toluidene blue: Stains acidic cell parts (like nucleus) dark blue. Good to show mitosis in plant cells.

Wright’s stain: Stains red blood cells pink/red.

Leishman’s stain: Stains nucleus of WBC blue and blood cells pink

Crystal Violet: Stains bacteria purple

Aceto-orcein: Biological stain for chromosomes and connective tissue.

Sudan III: Biological stain used as a lipid indicator.

1 comment to Common Stains for Slide Preparation

can you give memore information about slides stains and detail yours thanks leon


3.2B: General Staining Methods

  • Contributed by Boundless
  • General Microbiology at Boundless

Staining is a technique used in microscopy to enhance contrast in a microscopic image. Stains and dyes are frequently used to highlight structures in microbes for viewing, often with the aid of different microscopes. Stains may be used to define and examine different types of microbes, various stages of cellular life (e.g., the mitotic cycle), and even organelles within individual cells (e.g., mitochondria or chloroplasts).

In-vivo staining is the process of dyeing living tissue &mdash en vivo means &ldquoin life&rdquo (as contrasted to in-vitro staining). When a certain cell or structure takes on contrasting color(s), its form (morphology) or position within a cell or tissue can be readily seen and studied. The usual purpose is to reveal cytological details that might otherwise not be apparent however, staining can also reveal where certain chemicals or specific chemical reactions are taking place within cells. In-vitro staining involves coloring cells or structures that have been removed from their biological context. Certain stains are often combined to reveal more details and features than a single stain could reveal alone, and a counterstain is a stain that increases visibility of cells or structures when the principal stain is not sufficient. Scientists and physicians can combine staining with specific protocols for fixation and sample preparation and can use these standard techniques as consistent, repeatable diagnostic tools.

There are an incredible number of stains that can be used in a variety of different methods. What follows here are some common aspects of the process of preparing for in-vitro staining.

  • Fixation: This can itself consist of several steps. Fixation aims to preserve the shape of the cells (in this case, microbes) as much as possible. Sometimes heat fixation is used to kill, adhere, and alter the cells so they will accept stains. Most chemical fixatives generate chemical bonds between proteins and other substances within the sample, increasing their rigidity. Common fixatives include formaldehyde, ethanol, methanol, and picric acid.
  • Permeabilization: This involves treatment of the cells with (usually) a mild surfactant. This treatment dissolves cell membranes, allowing larger dye molecules to enter the cell&rsquos interior.
  • Mounting: This step usually involves attaching the samples to a glass microscope slide for observation and analysis. In some cases, cells may be grown directly on a slide. For samples of loose cells the sample can be directly applied to a slide.

At its simplest, the actual staining process may involve immersing the sample (before or after fixation and mounting) in dye solution, followed by rinsing and observation. Many dyes, however, require the use of a mordant &mdash a chemical compound that reacts with the stain to form an insoluble colored precipitate. When the excess dye solution is washed away, the mordanted stain remains. There is an incredible array of stains that can be used at this step, from those that stain specific microbial types (see the figure below) to those that highlight sub-compartments or organelles of a cell, such as the nucleus or endoplasmic reticulum. Alternatively, negative staining can be employed. This is a simple staining method for bacteria, performed by smearing the cells onto the slide and then applying nigrosin (a black synthetic dye) or Indian ink (an aqueous suspension of carbon particles). After drying, the microorganisms may be viewed in bright field microscopy as lighter inclusions contrast well against the dark environment surrounding them

Figure: Chlamydia Stain: Cells of the bacterial pathogen chlamydia (indicated by arrows) are highlighted by a stain called &ldquogeimsa. &ldquo

Live, in-vivo staining microscopy shares many of these steps, with the exception of fixation, which invariably kills the microbe to be examined.


Ver el vídeo: Técnicas de Tinción (Agosto 2022).