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¿Hay porinas en la membrana interna o externa de las mitocondrias?

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He analizado varios recursos y dicen cosas diferentes.


Este no es mi campo, pero The Transporter Classification Database parece ser una fuente confiable y establece que:

Los miembros mejor caracterizados de la familia MPP son las porinas del canal selectivo de aniones dependiente de voltaje (VDAC) en el membrana externa mitocondrial.

Al buscar en el banco de datos de proteínas, se puede encontrar una estructura cristalina para el canal aniónico 1 dependiente del voltaje humano y el documento asociado también indica que está en la membrana mitocondrial externa, por lo que imagina que deberían saberlo.


Espacio Intermembrano

los Espacio Intermembrano es la región entre la membrana interna y la membrana externa de una mitocondria o un cloroplasto. Su función principal es la fosforilación de nucleótidos. Las proteínas de canal llamadas porinas en la membrana externa permiten el libre movimiento de iones y moléculas pequeñas hacia el interior de la membrana. Espacio Intermembrano.

A medida que los electrones se mueven por las proteínas en la cadena de transporte de electrones, los electrones pierden energía para llevar iones H + de la matriz mitocondrial a la Espacio Intermembrano.

Espacio Intermembrano
los Espacio Intermembrano (IMS corto) de la mitocondria es la región que se encuentra entre la membrana externa e interna de la mitocondria. Este es el lugar donde tiene lugar la fosforilación oxidativa [14].
Matriz mitocondrial .

es el espacio entre la membrana exterior y la membrana interior. También se conoce como espacio perimitocondrial.

- El espacio entre la membrana externa e interna en una mitocondria.
Lisosoma: un orgánulo unido a la membrana que se encuentra en las células eucariotas. Contiene ácidos y enzimas que degradan moléculas no deseadas.
Matriz: el espacio dentro de la membrana interna de las mitocondrias.

de las mitocondrias
C.Membrana interna de las mitocondrias
D. Matriz de las mitocondrias.

El cloroplasto en forma de elipsoide está encerrado en una doble membrana y el área entre las dos capas que componen la membrana se llama

. La capa externa de la doble membrana es mucho más permeable que la capa interna, que presenta una serie de proteínas transportadoras de membrana incrustadas.

El interior de las dos membranas se llama matriz, el espacio entre las dos membranas se llama

y los pliegues creados por la membrana interna se denominan crestas. Las mitocondrias también contienen su propio ADN que codifica algunas de las enzimas que se utilizan dentro de las mitocondrias.

de la matriz mitocondrial.
293
98 .

El gradiente de protones se desarrolla entre

La mitocondria consta de membranas externa e interna, una

(espacio entre las membranas), las crestas (pliegues de la membrana interna) y la matriz (espacio dentro de la membrana interna). La membrana externa contiene varias porinas que forman canales donde ciertas moléculas pueden difundirse libremente.

La energía liberada a medida que los electrones pasan de un portador a otro mueve los iones de hidrógeno (protones) a través de la membrana, desde la matriz mitocondrial a la

, creando un gradiente de concentración de protones.

Después de la intoxicación por cianuro, la cadena de transporte de electrones ya no puede bombear electrones al

aumentaría y la síntesis de ATP se detendría.
B
C .

mitocondrias membrana externa mitocondrial membrana interna crestas

Los componentes de la fosforilación oxidativa, la cadena de transporte de electrones y la ATP sintasa, están incrustados dentro de la membrana mitocondrial interna. Los protones (+) se bombean desde la matriz al espacio lleno de líquido entre las dos membranas, también llamado "

El espacio entre las membranas externa e interna se llama

. Dentro de la membrana interna hay estructuras planas en forma de panqueque llamadas tilacoides. Los tilacoides forman pilas llamadas grana.


Funciones de las mitocondrias

Las mitocondrias son responsables de muchas actividades importantes dentro de una célula:

  • Es el sitio principal para la síntesis de ATP y, por lo tanto, se le llama una fuente de energía de la célula (fosforilación oxidativa). Las células como las células musculares, el hígado, indican la mayor tasa de utilización de ATP en estas áreas. En los glóbulos rojos maduros, las mitocondrias están ausentes para crear más espacio para que la hemoglobina se una al oxígeno.
  • La membrana interna de las mitocondrias tiene proteínas (partículas F0-F1) que participan en el transporte de electrones y la síntesis de ATP.

  • Las mitocondrias tienen un papel vital en la captación y liberación de Ca2 + que mantiene la concentración de calcio en el citoplasma de las células.
  • Las mitocondrias también juegan un papel muy esencial en el proceso de apoptosis en células de mamíferos. Las proteínas de la familia BCL2 regulan la liberación del citocromo c de la membrana interna y externa de las mitocondrias que, una vez en el citoplasma, provoca la activación de otras señales apoptóticas, provocando finalmente la muerte celular.
  • En los tejidos adiposos, las mitocondrias liberan calor a través de la cadena de transporte de electrones.

Biocentro de la Universidad de Würzburg, Würzburg, Alemania

Biocentro de la Universidad de Würzburg, Würzburg, Alemania

Abstracto

La membrana externa mitocondrial contiene un canal que es responsable del paso de metabolitos hidrófilos a través de la membrana. La proteína formadora de canales conocida por muchos organismos, llamada porina mitocondrial o VDAC (canal selectivo de aniones dependiente de voltaje), tiene una longitud de aproximadamente 280 aminoácidos. Los genomas de los organismos eucariotas contienen varias isoformas de porina de función no bien definida. La estructura primaria de las porinas mitocondriales o eucariotas no es particularmente hidrófoba y las predicciones de la estructura secundaria sugieren que un cilindro de barril β típico de la estructura secundaria de las porinas bacterianas también forma el canal mitocondrial. Las quinasas implicadas en el metabolismo mitocondrial, como la hexoquinasa o la gliceroquinasa, se unen a la porina y desempeñan un papel importante en la formación de compartimentos en las mitocondrias. Las porinas mitocondriales están controladas por voltaje y cambian a subestados permeables a los iones a voltajes superiores a 20 a 30 mV. El canal abierto tiene una pequeña preferencia por los aniones sobre los cationes de la misma movilidad acuosa. Los estados cerrados son catiónicos selectivos e impermeables para ATP y ADP. Las porinas mitocondriales parecen estar involucradas en la apoptosis y la liberación de citocromo. C. Existe evidencia emergente de que la membrana citoplasmática de las células eucariotas también contiene porinas de la familia de las porinas eucariotas con un papel en el metabolismo celular que aún no se comprende.


¿Qué son las mitocondrias y por qué son importantes?

Todos los seres vivos están compuestos por células, que son los componentes básicos de la vida. Dentro de estas células hay una serie de organell es - entidades parecidas a subcompartimentos que realizan funciones diversas pero específicas. Las diferentes células de su cuerpo tienen, en particular, diferentes formas y tamaños y, por lo tanto, diferentes propósitos. Células similares (las que hacen el mismo trabajo) forman tejidos corporales, como tejido muscular, cutáneo o óseo. Grupos de diferentes tipos de células forman los órganos de su cuerpo, como el corazón, el hígado o los pulmones. En conjunto, todos los órganos funcionan juntos como un sistema para mantenerte vivo y saludable (Science NetLinks).

Cuáles son mitocondrias?

"La central eléctrica de la celda " así es como la mayoría de la gente piensa y recuerda las mitocondrias (plural: mitocondrias) de su clase de biología de la escuela secundaria. Son organizaciones que funcionan como fábricas microscópicas, pero supercomplejas, que producen energía y eliminan los desechos que son perjudiciales para el cuerpo. Las mitocondrias son fundamentales para la supervivencia celular, y el ATP (energía) que su mitrocondria ayuda a producir es vital para los procesos metabólicos y para mantenerlo saludable.

La estructura de las mitocondrias

Las mitocondrias están diseñadas para maximizar su productividad. Contienen dos membranas: la membrana externa funciona como una piel y la membrana interna hace posible que ocurran más reacciones. Esto significa que sus células pueden hacer más trabajo. Membrana externa: Esta es una bicapa de fosfolípidos que incluye estructuras basadas en proteínas llamadas porinas, que permiten que las moléculas (iones, ATP, ADP, etc.) se crucen.

Membrana interna: Esta membrana es muy compleja y es donde se crea la mayor parte del ATP. Incluye todos los complejos del sistema de transporte de electrones, el complejo de ATP sintetasa y las proteínas de transporte. La membrana interna no tiene porinas como la membrana externa, por lo que es impermeable a la mayoría de las moléculas.

Cristae: Estos son los pliegues de la membrana interna, que aumentan la superficie y el espacio disponible para que se produzcan reacciones químicas. Aquí es también donde se encuentran la cadena de transporte de electrones y las enzimas. El número de crestas en las mitocondrias se correlaciona con la demanda de ATP de la célula dada. Por ejemplo, las células del músculo cardíaco contienen hasta tres veces más crestas que otras células debido a la mayor necesidad de ATP (Diccionario de Biología).

Matriz: Este es el espacio dentro de la membrana interna donde tiene lugar el ciclo del ácido cítrico o ciclo de Krebs. Esta es una parte importante de la respiración celular y la producción de ATP. El ADN mitocondrial también se encuentra aquí.

Cómo funcionan las poderosas mitocondrias

Las mitocondrias se encuentran en las células de animales, humanos, plantas y hongos. Si bien son conocidas principalmente por convertir energía de los alimentos en energía para procesos biológicos, las mitocondrias están profundamente involucradas en varias otras actividades que permiten que las células funcionen de manera eficiente para ayudarlo a mantener su cuerpo saludable. Estos son los cinco roles clave que desempeñan las mitocondrias en la salud celular y lo que puede suceder cuando se alteran estas funciones:

  1. Producción de ATP Las mitocondrias producen el 90% de la energía que nuestro cuerpo necesita para funcionar al convertir la energía química de los nutrientes en ATP. Durante la respiración celular, se produce otra sustancia química llamada NADH, que luego es utilizada por las enzimas para generar ATP en forma de enlaces químicos. La producción de ATP es esencial para ayudar al cuerpo a funcionar correctamente. Sin energía, sus células y su cuerpo sufren. La disfunción por falta de ATP puede contribuir a una variedad de problemas de salud, que incluyen, entre otros: Alzheimer, Parkinson, enfermedad de Lou Gehrig, diabetes, cáncer y varios tipos de enfermedades mitocondriales.
  2. Homeostasis del calcio & # 8212 Este es el flujo de calcio dentro y fuera de las mitocondrias de una célula. Este proceso es una parte importante de la regulación metabólica y la eliminación de las células enfermas. Cuando la homeostasis del calcio mitocondrial se ve comprometida, pueden ocurrir diferentes condiciones patológicas, dependiendo del tipo de célula involucrada (NCBI).
  3. Migración celular Esto se refiere al movimiento orquestado de células a ubicaciones específicas en respuesta a señales químicas. La regulación de la migración celular puede ayudar a eliminar las células enfermas y acelerar la cicatrización de heridas, por el contrario, si este proceso no se maneja bien, puede haber graves consecuencias para la salud, que incluyen, entre otras, la formación de tumores y cánceres, enfermedades vasculares, tumores. formación y metástasis. - Se trata esencialmente de muerte celular programada que implica mantener la salud del cuerpo mediante la eliminación de células viejas, células innecesarias y células enfermas. Sin la apoptosis adecuada (muy poca o demasiada), existe un mayor riesgo de sufrir afecciones de salud, incluidas enfermedades neurodegenerativas, daño isquémico, trastornos autoinmunes y muchos tipos de cáncer (NCBI).
  4. Inmunidad innata & # 8212 Esto se refiere a mecanismos de defensa inespecíficos - como piel, sustancias químicas en la sangre y células dentro de su sistema inmunológico que atacan a las células extrañas & # 8212 que básicamente vienen al rescate inmediatamente o pocas horas después de la aparición de un antígeno en el cuerpo . Además de regular la señalización antiviral, las mitocondrias también contribuyen a la activación inmune innata después del daño celular y el estrés (NCBI).

En resumen, el ATP es la moneda de energía para sus células, y sus mitocondrias son las fuentes principales para producir más para ayudarlo a mantenerse vivo y saludable. Estos orgánulos también son responsables de vigilar y eliminar el crecimiento de células enfermas. Si hay alguna deficiencia en sus mitocondrias, es más probable que experimente problemas de salud.


Resultados

Expresión de VDAC en E. coli

Para investigar si el E. coli El complejo Bam puede lidiar con una proteína de barril β mitocondrial, fusionamos genéticamente VDAC de N. crassa a la secuencia señal de la porina bacteriana PhoE para permitir el transporte a través de la membrana interna. Además de la proteína de longitud completa, se construyeron inicialmente dos variantes de VDAC para investigar si la señal β, que se requiere para el ensamblaje de proteínas de barril β en la OM mitocondrial, también es necesaria para su ensamblaje en la OM bacteriana. La eliminación de dos residuos de aminoácidos del extremo C no afecta la señal β identificada por Kutik et al. (2008) y coloca un residuo Phe en el extremo C como en la secuencia de firma de OMP bacteriana (fig. 1). La deleción de cinco residuos afecta la señal β y elimina el residuo Phe (fig. 1). Los constructos generados están bajo el control del foE promotor, que permite una expresión de alto nivel cuando las células se cultivan bajo PI limitación. Debido a que están ubicados en un plásmido de copia media, se anticipó una expresión de bajo nivel bajo PI-condiciones completas.

Comparación de las señales de ensamblaje de OMP de barril β bacteriano y mitocondrial y los extremos C de las variantes de VDAC utilizadas en este estudio. Se utiliza un código de una letra para los aminoácidos. X, cualquier aminoácido φ, residuo hidrofóbico π, residuo polar norte, 1–28 residuos. La señal β mitocondrial está bordeada por líneas gruesas.

Comparación de las señales de ensamblaje de OMP de barril β bacteriano y mitocondrial y los extremos C de las variantes de VDAC utilizadas en este estudio. Se utiliza un código de una letra para los aminoácidos. X, cualquier aminoácido φ, residuo hidrofóbico π, residuo polar norte, 1–28 residuos. La señal β mitocondrial está bordeada por líneas gruesas.

Células de tipo salvaje E. coli La cepa MC4100 que contenía los plásmidos relevantes se cultivaron en PISe analizaron el caldo L completo y los lisados ​​de células completas mediante SDS-PAGE y transferencia Western. La inmunodecoración de las transferencias reveló que el VDAC de longitud completa se expresaba en estas condiciones (figura 2A). La especificidad del antisuero VDAC se confirmó por la ausencia de una señal en la cepa portadora del vector vacío (fig. 2A). Después de la interrupción ultrasónica del E. coli células, VDAC fraccionado con las membranas como las porinas endógenas OmpF y OmpC, mientras que la chaperona citoplasmática SecB se recuperó en el sobrenadante (fig. 2A). La deleción de dos residuos del extremo C no influyó en los niveles de proteína y, al igual que la proteína de longitud completa, esta forma mutante también se recuperó en la fracción de membrana (fig. 2A). Sin embargo, la proteína mutante que carece de cinco residuos C-terminales no se detectó en estas condiciones, posiblemente porque esta variante no se ensambló en la OM y, por lo tanto, se degradó proteolíticamente. De manera similar, no se detectó VDAC cuando se expresó sin una secuencia señal (figura 2A). Para verificar la degradación proteolítica de la proteína mutante que carece de cinco residuos C-terminales, el plásmido que codifica esta construcción se introdujo en la cepa JW0157, que carece de la proteasa periplásmica principal DegP, y su cepa parental isogénica BW25113. Debido a que la proteína mutante se detectó solo en el degP mutante (figura 2B), parece ser un sustrato para la proteasa periplásmica en la cepa de tipo salvaje.

VDAC mitocondrial de Neurospora crassa está localizado en el OM en Escherichia coli. (A) Se aislaron lisados ​​de células enteras, envolturas celulares y fracciones solubles (sobrenadante) de células MC4100 que contienen plásmidos que codifican VDAC (longitud completa), variantes truncadas C-terminales que carecen de cinco (Δ5 C-término) o dos (Δ2 C-término. .) aminoácidos, VDAC sin secuencia señal (señal Δ) o el vector vacío. Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE y western blot utilizando antisueros dirigidos contra VDAC, E. coli porinas (OmpC / F), o la proteína citoplasmática SecB. (B) Células enteras de E. coli cepa BW25113 y su degP El derivado mutante JW0157, ambos que contienen plásmidos que codifican VDAC de longitud completa o VDAC mutante que carece de cinco residuos C-terminales, se analizaron mediante SDS-PAGE seguido de transferencia Western usando antisueros dirigidos contra VDAC u OmpA. (C) Las membranas internas y los MO de las células MC4100 que expresan VDAC de longitud completa se separaron mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia Western usando antisueros dirigidos contra VDAC o E. coli porinas. La actividad NADH-oxidasa se evaluó como un marcador de la membrana interna. Las señales o actividades para cada proteína en cada fracción se normalizaron a la cantidad detectada en la fracción pico. (D) Mitocondrias aisladas de N. crassa (izquierda) y suspensiones de envolturas celulares de E. coli cepa MC4100 expresando N. crassa Los VDAC (derecha) se dejaron intactos (entrada), se digirieron con las concentraciones indicadas de proteinasa K (PK) o se extrajeron con urea 6 M y se separaron en una fracción extraíble (sobrenadante) y una fracción embebida en la membrana (sedimento). Las muestras se sometieron a SDS-PAGE, seguido de tinción con Coomassie Brilliant Blue para detectar las proteínas OmpC, OmpF y OmpA o transferencia de Western usando anticuerpos contra VDAC y Tom40. Tom40, OMP mitocondrial con un bucle OmpA accesible a proteasa, E. coli OMP con extensión periplásmica accesible a proteasa OmpC y OmpF, OMP protegidos por proteasa.

VDAC mitocondrial de Neurospora crassa está localizado en el OM en Escherichia coli. (A) Se aislaron lisados ​​de células enteras, envolturas celulares y fracciones solubles (sobrenadante) de células MC4100 que contienen plásmidos que codifican VDAC (longitud completa), variantes truncadas C-terminales que carecen de cinco (Δ5 C-término) o dos (Δ2 C-término. .) aminoácidos, VDAC sin secuencia señal (señal Δ) o el vector vacío. Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE y western blot utilizando antisueros dirigidos contra VDAC, E. coli porinas (OmpC / F), o la proteína citoplasmática SecB. (B) Células enteras de E. coli cepa BW25113 y su degP El derivado mutante JW0157, ambos que contienen plásmidos que codifican VDAC de longitud completa o VDAC mutante que carece de cinco residuos C-terminales, se analizaron mediante SDS-PAGE seguido de transferencia Western usando antisueros dirigidos contra VDAC u OmpA. (C) Las membranas internas y los MO de las células MC4100 que expresan VDAC de longitud completa se separaron mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia Western usando antisueros dirigidos contra VDAC o E. coli porinas. La actividad NADH-oxidasa se evaluó como un marcador de la membrana interna. Las señales o actividades para cada proteína en cada fracción se normalizaron a la cantidad detectada en la fracción pico. (D) Mitocondrias aisladas de N. crassa (izquierda) y suspensiones de envolturas celulares de E. coli cepa MC4100 expresando N. crassa Los VDAC (derecha) se dejaron intactos (entrada), se digirieron con las concentraciones indicadas de proteinasa K (PK) o se extrajeron con urea 6 M y se separaron en una fracción extraíble (sobrenadante) y una fracción embebida en la membrana (sedimento). Las muestras se sometieron a SDS-PAGE, seguido de tinción con Coomassie Brilliant Blue para detectar las proteínas OmpC, OmpF y OmpA o transferencia de Western usando anticuerpos contra VDAC y Tom40. Tom40, OMP mitocondrial con un bucle OmpA accesible a proteasa, E. coli OMP con extensión periplásmica accesible a proteasa OmpC y OmpF, OMP protegidos por proteasa.

Montaje de VDAC en el OM bacteriano

Queríamos determinar en qué membrana se encontraba el VDAC. Para separar las membranas internas y los OM, aplicamos centrifugaciones en gradiente de densidad de sacarosa. VDAC fraccionado con las proteínas marcadoras OM OmpF y OmpC y no con el marcador de membrana interna NADH-oxidasa (fig. 2C). A continuación, monitoreamos la integración de VDAC en el OM en experimentos de digestión de proteasas. En su entorno nativo, la OM mitocondrial, la proteína es resistente a la proteinasa K, mientras que la Tom40, que tiene un gran bucle expuesto a la superficie de las mitocondrias, está degradada (fig. 2D). También en la OM bacteriana, VDAC fue en gran medida resistente a proteinasa K, como las porinas endógenas OmpC y OmpF y a diferencia de OmpA, que tiene un gran dominio expuesto al periplasma y se degradó en estas condiciones (fig. 2D). Además, al igual que las porinas bacterianas, el VDAC no pudo extraerse de las membranas bacterianas con urea (fig. 2D), lo que confirma que se insertó integralmente en la MO.

Si VDAC está realmente ensamblado en la OM bacteriana, podría detectarse en la superficie de la célula bacteriana con anticuerpos específicos. La expresión de fondo de bajo nivel en células MC4100 no inducidas fue insuficiente para la detección de VDAC mediante microscopía de inmunofluorescencia. Para aumentar los niveles de expresión, se introdujo el plásmido que codifica VDAC en E. coli cepa CE1224, que no produce porinas endógenas. Cultivando las células transformadas bajo PI La limitación dio como resultado una sobreproducción drástica de VDAC, incluso hasta tal punto que se detectó una pequeña fracción de proteínas precursoras no procesadas (fig. 3A). Usando microscopía de inmunofluorescencia, la proteína se detectó en la superficie de la célula bacteriana, como si estuviera en la superficie de las mitocondrias aisladas (fig. 3B). La especificidad de la señal observada fue confirmada por su ausencia en bacterias portadoras del vector vacío. Además, la proteína mutante que carece de dos residuos de aminoácidos C-terminales se detectó en la superficie de la célula bacteriana, pero no la que carece de cinco aminoácidos (figura 3B), aunque se produjo abundantemente en estas condiciones (figura 3C). En conjunto, estos resultados indican que VDAC se ensambla en la OM bacteriana y que el ensamblaje depende de la señal β.

Detección de VDAC en la superficie de la célula bacteriana mediante microscopía de inmunofluorescencia. (A) Niveles de estado estacionario de VDAC de longitud completa en diferentes Escherichia coli cepas utilizadas en este estudio. Escherichia coli la cepa CE1224 se cultivó bajo PI privación, mientras que las cepas CE1265 y MC4100 se cultivaron exponencialmente en caldo L. Todas las cepas contenían el plásmido pJPNcPor1 que codificaba VDAC de longitud completa bajo el control del foE promotor. Se recogieron cantidades iguales de células. Se aislaron las envolturas celulares, se diluyeron en serie y se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia Western usando un antisuero contra VDAC. Se observa acumulación de precursor (P) sin procesar que contiene la secuencia señal en las células CE1224 completamente inducidas. (B) Mitocondrias aisladas de Neurospora crassa o E. coli Células CE1224 que expresan variantes de VDAC truncadas en C-terminal o de longitud completa, o que llevan un vector vacío, cultivadas durante la noche bajo PI privación, se fijaron e inmunoteñieron con un antisuero contra VDAC seguido de un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo. Las imágenes se adquirieron en canales de fluorescencia (FL) o de campo brillante (BF). (C) Comparación de los niveles de expresión de VDAC de longitud completa y la proteína mutante que carece de cinco residuos C-terminales (Δ5 C-término) en la cepa CE1224 cultivada bajo PI limitación. Se recogieron y analizaron cantidades iguales de células mediante SDS-PAGE y transferencia Western con antisuero contra VDAC. P, precursor y M, forma madura.

Detección de VDAC en la superficie de la célula bacteriana mediante microscopía de inmunofluorescencia. (A) Niveles de estado estacionario de VDAC de longitud completa en diferentes Escherichia coli cepas utilizadas en este estudio. Escherichia coli la cepa CE1224 se cultivó bajo PI privación, mientras que las cepas CE1265 y MC4100 se cultivaron exponencialmente en caldo L. Todas las cepas contenían el plásmido pJPNcPor1 que codificaba VDAC de longitud completa bajo el control del foE promotor. Se recogieron cantidades iguales de células. Se aislaron las envolturas celulares, se diluyeron en serie y se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia Western usando un antisuero contra VDAC. Se observa acumulación de precursor (P) sin procesar que contiene la secuencia señal en las células CE1224 completamente inducidas. (B) Mitocondrias aisladas de Neurospora crassa o E. coli Células CE1224 que expresan variantes de VDAC truncadas en C-terminal o de longitud completa, o que llevan un vector vacío, cultivadas durante la noche bajo PI privación, se fijaron e inmunoteñieron con un antisuero contra VDAC seguido de un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo. Las imágenes se adquirieron en canales de fluorescencia (FL) o de campo brillante (BF). (C) Comparación de los niveles de expresión de VDAC de longitud completa y la proteína mutante que carece de cinco residuos C-terminales (Δ5 C-término) en la cepa CE1224 cultivada bajo PI limitación. Se recogieron cantidades iguales de células y se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia Western con antisuero contra VDAC. P, precursor y M, forma madura.

Formación de poros por VDAC en el E. coli OM

VDAC es la vía principal por la cual los metabolitos atraviesan la membrana mitocondrial externa. Por lo tanto, si VDAC se ensambla correctamente en el OM bacteriano, debería formar poros grandes. Para probar esta posibilidad, el plásmido que codifica VDAC se introdujo en E. coli cepa CE1265, que no produce porinas endógenas. Debido a una mutación en el gen regulador phoR, esta cepa expresa el pho regulon constitutivamente pero no en la misma medida que una cepa totalmente inducida como CE1224 (fig. 3A). La formación de poros en la MO se determinó en una prueba de sensibilidad a antibióticos en la que la zona de inhibición del crecimiento alrededor de un disco que contiene el antibiótico probado es una medida de la difusión del antibiótico a través de los poros. Cuando las bacterias produjeron VDAC, fueron más sensibles a todos los antibióticos probados (tabla 1), lo que indica que VDAC forma poros en la OM bacteriana. Para corroborar esta conclusión, se midió la escisión de la nitrocefina por la β-lactamasa periplásmica en células intactas, un proceso en el que la permeación de este antibiótico cromogénico a través de la MO limita la velocidad. La síntesis de VDAC dio como resultado una tasa drásticamente aumentada de escisión de nitrocefina en células intactas (figura 4A) consistente con la formación de poros acuosos en la MO. En ambos ensayos, la expresión de foE del mismo vector resultó en un aumento más moderado en la absorción de antibiótico (tabla 1 y figura 4A) consistente con la observación de que VDAC tiene un tamaño de poro considerablemente mayor que el E. coli porinas (Freitag et al. 1982). Colectivamente, similar a su papel en las mitocondrias, la integración de VDAC en la OM bacteriana promueve el flujo de solutos a través de esta membrana.

Expresión de VDAC en Escherichia coli Las células aumentan su susceptibilidad a los antibióticos.

Plásmido Zona de inhibición del crecimiento (mm)
Ery (25) Amplificador (5) Tet (2) Rif (0,3) Vnc (5) Ceph (5)
Vector 4.0 4.3 3.7 1.0 1.7 2.0
PhoE 6.0 5.7 6.3 2.3 1.0 4.0
VDAC 15.7 16.7 10.7 14.0 12.3 6.3
Plásmido Zona de inhibición del crecimiento (mm)
Ery (25) Amplificador (5) Tet (2) Rif (0,3) Vnc (5) Ceph (5)
Vector 4.0 4.3 3.7 1.0 1.7 2.0
PhoE 6.0 5.7 6.3 2.3 1.0 4.0
VDAC 15.7 16.7 10.7 14.0 12.3 6.3

N OTA. — Sin porin E. coli la cepa CE1265 se transformó con un vector vacío, un plásmido que codifica PhoE o un plásmido que codifica VDAC. La susceptibilidad de las células transformadas a los antibióticos se evaluó en placas midiendo la zona de inhibición del crecimiento alrededor de los discos de filtro empapados con los antibióticos a la concentración indicada entre paréntesis (en mg / ml). Se muestran los valores medios de la zona de inhibición del crecimiento (en mm desde el borde de los discos de filtro) de tres experimentos. Ery, eritromicina Amp, ampicilina Tet, tetraciclina Rif, rifamicina Vnc, vancomicina y Ceph, cefaloridina.

Expresión de VDAC en Escherichia coli Las células aumentan su susceptibilidad a los antibióticos.

Plásmido Zona de inhibición del crecimiento (mm)
Ery (25) Amplificador (5) Tet (2) Rif (0,3) Vnc (5) Ceph (5)
Vector 4.0 4.3 3.7 1.0 1.7 2.0
PhoE 6.0 5.7 6.3 2.3 1.0 4.0
VDAC 15.7 16.7 10.7 14.0 12.3 6.3
Plásmido Zona de inhibición del crecimiento (mm)
Ery (25) Amplificador (5) Tet (2) Rif (0,3) Vnc (5) Ceph (5)
Vector 4.0 4.3 3.7 1.0 1.7 2.0
PhoE 6.0 5.7 6.3 2.3 1.0 4.0
VDAC 15.7 16.7 10.7 14.0 12.3 6.3

N OTA. — Sin porin E. coli la cepa CE1265 se transformó con un vector vacío, un plásmido que codifica PhoE o un plásmido que codifica VDAC. La susceptibilidad de las células transformadas a los antibióticos se evaluó en placas midiendo la zona de inhibición del crecimiento alrededor de los discos de filtro empapados con los antibióticos a la concentración indicada entre paréntesis (en mg / ml). Se muestran los valores medios de la zona de inhibición del crecimiento (en mm desde el borde de los discos de filtro) de tres experimentos. Ery, eritromicina Amp, ampicilina Tet, tetraciclina Rif, rifamicina Vnc, vancomicina y Ceph, cefaloridina.

VDAC forma poros en la OM bacteriana. (A) Se utilizaron células de la cepa CE1265 que contenían pBR322 que codificaba β-lactamasa. Las células se transformaron adicionalmente con el vector vacío o un plásmido que codifica PhoE o las variantes de VDAC indicadas y se incubaron con nitrocefina. La rotación del sustrato se determinó mediante espectrofotometría. (B) Los lisados ​​de células completas de células utilizadas en experimentos de captación de nitrocefina se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia Western utilizando anticuerpos contra las proteínas indicadas.

VDAC forma poros en la OM bacteriana. (A) Se utilizaron células de la cepa CE1265 que contenían pBR322 que codificaba β-lactamasa. Las células se transformaron adicionalmente con el vector vacío o un plásmido que codifica PhoE o las variantes de VDAC indicadas y se incubaron con nitrocefina. La rotación del sustrato se determinó mediante espectrofotometría. (B) Los lisados ​​de células completas de células utilizadas en experimentos de captación de nitrocefina se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia Western utilizando anticuerpos contra las proteínas indicadas.

Asamblea VDAC en el E. coli OM depende de la señal β

En el ensayo de captación de nitrocefina, la expresión del VDAC mutante que carece de dos residuos del extremo C promovió la escisión del antibiótico con eficiencias similares a las obtenidas tras la expresión de la proteína de longitud completa (figura 4A), lo que sugiere que esta mutación no afectan el ensamblaje y la formación de poros. Por el contrario, la escisión de nitrocefina fue mucho menos promovida por la expresión de la variante que carece de cinco residuos (figura 4A). La última variante pudo detectarse en la cepa constitutiva CE1265 aunque claramente menor que la proteína de longitud completa (figura 4B). La proteína se degradó en gran medida cuando la fracción de la envoltura celular de estas células se trató con proteinasa K y se pudo extraer de estas membranas con urea, mientras que la proteína de longitud completa producida en esta cepa era resistente a la proteasa y no se podía extraer de las membranas con urea. (figura 5A). Por lo tanto, parece que una gran fracción de la proteína mutante detectada no se insertó en la MO, estos polipéptidos solo se fraccionan con las membranas, presumiblemente porque forman agregados densos que se sedimentan con las membranas durante el procedimiento de centrifugación (Tommassen 1986). Sin embargo, una pequeña parte de los polipéptidos era resistente a la proteinasa K y no se extrajo con urea (figura 5A). Estos polipéptidos probablemente se ensamblan correctamente en la OM bacteriana, ya que facilitaron la degradación de nitrocefina en células intactas hasta cierto punto (figura 4A). ) consistente con la formación de poros funcionales.

Ensamblaje de VDAC en el Escherichia coli OM depende de una señal β intacta. (A) La mayoría de las moléculas de VDAC que carecen de los cinco residuos C-terminales no están integradas correctamente en la MO. Sobres de celdas de E. coli cepa CE1265 que expresa el VDAC de longitud completa (parte superior) o el VDAC mutante (parte inferior) se trataron con proteinasa K (PK) o se extrajeron con urea como se describe en la leyenda de la figura 2D y se analizaron por SDS-PAGE y tinción con Coomassie Brilliant Blue para visualizar OmpA o western blot para detectar la variante VDAC. (B) Sobres de celdas de E. coli la cepa MC4100 que expresa VDAC de longitud completa o la proteína mutante que carece de cuatro residuos C-terminales se extrajeron con urea como se describe en la leyenda de la figura 2D y se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia de Western usando antisuero contra VDAC.

Ensamblaje de VDAC en el Escherichia coli OM depende de una señal β intacta. (A) La mayoría de las moléculas de VDAC que carecen de los cinco residuos C-terminales no se integran correctamente en la MO. Sobres de celdas de E. coli cepa CE1265 que expresa el VDAC de longitud completa (parte superior) o el VDAC mutante (parte inferior) se trataron con proteinasa K (PK) o se extrajeron con urea como se describe en la leyenda de la figura 2D y se analizaron por SDS-PAGE y tinción with Coomassie Brilliant Blue to visualize OmpA or western blotting to detect the VDAC variant. (B) Cell envelopes of E. coli strain MC4100 expressing either full-length VDAC or the mutant protein lacking four C-terminal residues were extracted with urea as described in the legend to figure 2D and analyzed by SDS-PAGE and western blotting using antiserum against VDAC.

The results presented so far indicated that the mutant protein lacking five C-terminal residues is only very inefficiently incorporated into the E. coli OM, whereas the mutant protein lacking two residues, which still retains an intact β-signal and presents a Phe residue at the C terminus, is assembled as efficiently as is the wild-type VDAC. To investigate whether the presence of a C-terminal Phe could compensate for the disruption of the β-signal, an additional mutant was constructed, which lacks four amino acid residues from the C terminus where it presents a Phe ( fig. 1). In contrast to the mutant protein lacking five C-terminal residues ( fig. 2A), the protein lacking four residues was detected when the construct was expressed in the wild-type E. coli cepa. However, when the membrane fraction of this strain was extracted with urea, the mutant protein was partially solubilized, whereas the wild-type protein was insoluble as before ( fig 5B). Therefore, in spite of the presence of a Phe at the C terminus, the mutant protein lacking four C-terminal residues is inefficiently assembled into the E. coli OM. Together, our results are consistent with the notion that an intact β-signal is needed for efficient insertion of VDAC into the bacterial OM but is not absolutely essential for this process.

VDAC Assembly Is Dependent on BamA

To determine whether assembly of VDAC into the OM of E. coli depends on the Bam complex, we made use of a temperature-sensitive (ts) bamA mutant strain ( Doerrler and Raetz 2005). This strain fails to grow at 44 °C, but even at a permissive temperature, it shows an assembly defect of OMPs as evidenced by decreased levels of these proteins. These reduced levels probably result from degradation of misassembled OMPs by periplasmic proteases, such as DegP. The plasmid encoding VDAC was introduced into this mutant strain and into an isogenic strain carrying a wild-type bamA gene, and the bacteria were grown at 32 °C under PI-limiting conditions to induce VDAC synthesis. los bamA(ts) mutation did not affect growth under these conditions ( fig. 6A). Like the amounts of correctly assembled endogenous porins and OmpA, the amount of membrane-inserted VDAC was drastically reduced in the bamA(ts) mutant strain ( fig. 6B). In contrast, levels of the periplasmic enzyme alkaline phosphatase (PhoA), the inner–membrane-located enzyme leader peptidase, and the cytoplasmic chaperone SecB in the cell lysates were unaffected ( fig. 6B). Thus, BamA is required for the efficient assembly of VDAC into the bacterial OM.

BamA is required for membrane insertion of VDAC in Escherichia coli. (A) Escherichia coli cells containing either a ts allele or wild-type bamA were grown overnight in L-broth at 30 °C. Cells were resuspended at time 0 in PI-poor medium (LPI) or the same medium supplemented with 660 μM K2HPO4 (HPI) and growth at 32 °C was determined by measuring the optical density at 660 nm. (B) PI-starved cells containing either the ts bamA allele or the wild-type allele grown in LPI or HPI were harvested after 6 h (arrow in panel A). Cell envelopes were isolated and extracted with 6 M urea to determine the amount of membrane-inserted VDAC and E. coli OMPs. Whole-cell lysates were analyzed to determine the effect of the bamA ts mutation on other proteins. Samples were analyzed by SDS-PAGE, followed either by staining with Coomassie Brilliant Blue to visualize PhoE, OmpC, OmpF, and OmpA or by western blotting using antisera against the following controls: PhoA, periplasmic alkaline phosphatase, which is expressed upon PI limitation leader peptidase, an inner-membrane protein SecB, a cytoplasmic protein.

BamA is required for membrane insertion of VDAC in Escherichia coli. (A) Escherichia coli cells containing either a ts allele or wild-type bamA were grown overnight in L-broth at 30 °C. Cells were resuspended at time 0 in PI-poor medium (LPI) or the same medium supplemented with 660 μM K2HPO4 (HPI) and growth at 32 °C was determined by measuring the optical density at 660 nm. (B) PI-starved cells containing either the ts bamA allele or the wild-type allele grown in LPI or HPI were harvested after 6 h (arrow in panel A). Cell envelopes were isolated and extracted with 6 M urea to determine the amount of membrane-inserted VDAC and E. coli OMPs. Whole-cell lysates were analyzed to determine the effect of the bamA ts mutation on other proteins. Samples were analyzed by SDS-PAGE, followed either by staining with Coomassie Brilliant Blue to visualize PhoE, OmpC, OmpF, and OmpA or by western blotting using antisera against the following controls: PhoA, periplasmic alkaline phosphatase, which is expressed upon PI limitation leader peptidase, an inner-membrane protein SecB, a cytoplasmic protein.


Mitochondria are double-membrane and rods shaped organelles found in the cells of both animals and plants and are responsible for various metabolic functions within the cells. Mitochondria play a vital role in providing the necessary biological energy for the cell through enzymatic oxidation of the substrates of the Krebs&rsquos cycle. The mitochondrion is made up of the outer membrane, inner membrane, intermembrane space, and matrix.

The outer membrane consists of the same amounts of proteins and phospholipids as well as a large number of porins which are specialized proteins. The outer membrane is permeable to ions, nutrients, and energy molecules such as ADP and ATP (Abdrakhimova et al, 2011). The inner membrane of the mitochondrion is complex and consists of a number of folds known as the cristae which are important since it increases the surface area within the organelle. The increased surface area within the organelle coupled with the presence of various proteins within the inner membrane is crucial in aiding various enzymatic reactions including the production of ATP.

However, unlike the outer membrane, the inner membrane is strictly permeable to ATP, Oxygen, and the movement of metabolites across the membrane (Jones, 2013). The space between the outer and the inner membranes is referred to as the intermembrane space and its composition is similar to that of the cytoplasm. The matrix which is the fourth component of the mitochondrion is made up of a complex mixture of enzymes and proteins which are important in the synthesis of the ribosome, ATP, mitochondrial DNA, and tRNAs (Miles et al, 2014).

Succinate dehydrogenase is one of the enzyme complex bound to the inner membrane of the mitochondrion. Succinate dehydrogenase plays a vital role in Krebs&rsquos cycle since it catalyzes the oxidation of Succinate to fumarate within the inner membrane (Gorbacheva et al, 2013).


How do proteins enter mitochondria?

If the inner membrane is so impermeable, how do proteins enter?

The outer membrane of the mitochondria contains the protein "porin". This forms an aqueous channel through which proteins up to 10,000 daltons can pass and go into the intermembrane space. Indeed, the small molecules actually equilibrate between the outer membrane and the cytosol. However, most proteins cannot get into the matrix unless they pass through the inner membrane. This membrane contains cardiolipin which renders it virtually impermeable. This requires transport mechanisms across the membrane that are more organized and regulated. A very simple view of the process is diagrammed in this cartoon.

This figure is taken from Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, N.Y. 1994, Third Edition

Transport across the mitochondrial membranes requires the concerted action of a number of translocation machineries. The machinery in the outer membrane is called the Tom complex (Translocator outer metroembrane) and that for the inner membrane is called the Tim complex (Translocator Inner Membrane). Proteins that have to go all the way to the matrix have an NH2 cleavable signal sequence (see the above cartoon).

Most proteins must be uncoiled or stretched out to go through the translocators. This involves ATP binding and is monitored and stabilized by a chaperone proteins, including hsp70. Thus, before the protein can go through Tom complex, it must become "translocation competent".

Transport through the outer membrane: characteristics of Tom complex.

Not surprisingly, the TOM complex will include import receptors that initially recognize the signal peptide or a signal sequence (these include Tom20, Tom22, and Tom70). Different proteins use different receptors. In the above cartoon, the receptor is represented as a blue oval in which the signal peptide is inserted. The receptors then bring the protein to the region containing the translocator proteins. This is actually a complex of proteins.
It is called the General Import Pore (GIP) and it facilitates the translocation of the presequence of the protein across the outer membrane. (the GIP is made of Tom40, Tom5, Tom 6, and Tom7). Tom40 appears to be the core element of the pore and forms oligomers. It traverses the membrane as a series of 14 anti-parallel beta strands which form a beta barrel. It also interacts with polypeptide chains passing through the pore. All of the other Tom components in GIP are anchored to the outer membrane by helical transmembrane segments (hydrophobic anchors).

Recent study of Tom40: Rapaport, D and Neupert W, Biogenesis of Tom40, Core Component of the TOM complex of mitochondria. J Cell Biol 146 321-332, 1999. Study looked at how Tom40 entered outer membrane and became a part of the GIP. The study reported that:

  • First, as with many mitochondrial proteins, Tom40 requires cytosolic chaperones to prepare it for entry. In the case of this protein, becoming "translocation competent" requires ATP and a partially folded state (the latter is mediated by the cytosolic chaperone (hsp70).
  • Second, when it is "competent", it interacts with the surface receptor, Tom20. There is no cleavable signal peptide however, the experiments showing the requirement for partial folding suggests targeting information is found in discontinuous sites brought together in the folded domain.
  • Final insertion is into preexisting Tom complexes. This requires an intact N terminus.
  • Dimerization occurs after entry into the membrane.

Characteristics of Tim Complexes

Mitochondrial proteins destined for the matrix often have a cleavable signal peptide on the protein which must be recognized before it will be admitted through the mitochondrial translocator. These proteins with "amino terminal signals" (your text), or "preproteins" or "presequences" (current literature) usually interact with Tom20 first. Then, they have to get through the outer membrane. To do that, they are transferred to the GIP complex: First, they interact with Tom22 and Tom5 which ushers them to the pore formed by Tom40. They then enter the matrix using the pore complex made of Tim23 and Tim17 which are in the inner membrane. Also, very important, their entry is dependent on membrane potential. This is set up by the electron transport complexes. Recall that hydrogen ions are being pumped into the intermembrane space creating a charge gradient that is more negative on the matrix site. This membrane potential actually helps pulls the protein into the Tim23-Tim17 channels. The protein then enters the matrix where the cleavable preprotein is clipped off by a protease, MPP. mt- hsp 70 in the matrix works with Tim44 to complete the full transfer to the matrix. mthsp70 and Tim 44 actually "pull" the protein into the matrix by a process that requires ATP. It also requires the membrane potential set up by the electron transport chain.

Some mitochondrial proteins destined for the inner membrane have a cleavable presequence followed by one or more hydrophobic membrane-spanning segments that function as stop-transfer sequences in the IM or, serve to insert the polypeptide into the IM after it gets in the matrix. These are like the Type I membrane proteins described in the unit on the rough endoplasmic reticulum.

However, other proteins do not have a cleavable targeting signal (Types II and III). Mitochondrial proteins that have an internal signal sequence (examples include a number of proteins in the inner membrane) generally interact with Tom70 as the receptor. Then, after they transit the outer membrane via the GIP complex, they enter the special Tim pathway. This may involve interactions with small Tim's of the intermembrane space and Tim22-Tim54 of the inner membrane itself.

Those proteins that do not have a cleavable targeting signal sequence often have signals with the following characteristics: They are often a stretch of positively charged amino acids (sometimes adjacent to a membrane spanning hydrophobic region). Sometimes these form loops that face the matrix. Recall the "positive inside rule" has positively charged amino acids concentrated at the cytosolic side for proteins being inserted into the rough endoplasmic reticulum. These mitochondrial proteins tend to follow this rule, only the matrix becomes the site where the positive charges are most numerous.

Examples from the literature:

Davis, AJ, Ryan, KR, and Jensen, RE Tim23p contains separate and distinct signals for targeting to mitochondria and insertion in to the inner membrane. Molecular Biology of the Cell 9: 2577-2593 (1999).

  • Tim23 is one of the inner membrane translocator proteins. It does not have an amino-terminal presequence. Targeting information is found within the mature protein.
  • Tim23 has 4 transmembrane segments and two positively charged loops facing the matrix. What is needed for signalling an import?
  • Replaced positively charged amino acids in one or both loops with alanine residues.
  • At least one of these loops is required for insertion into the inner membrane.
  • The signal for targeting to mitochondria is found in at least two of the hydrophobic transmembrane segments.

Kurz, M, Martin, H, Rassow J, Pfanner, N, and Ryan, MT. Biogenesis of Tim proteins of the mitochondrial carrier import pathway: differential targeting mechanisms and crossing over with the main import pathway. Molecular Biology of the Cell 10: 2461-2474 (1999). Compared the route and binding of three Tim proteins

  • Tim54 carries a amino terminal, noncleaved translocation sequence that is positively charged. However, it prefers to use Tom70 as its receptor instead of Tom20. After moving through the GIP, it uses its positively charged amino terminal sequence to enter the matrix. It required chaperones and ATP to get to the matrix.
  • Tim22 is a hydrophobic protein that uses Tom20 for targeting to the OM. Then it follows the Tim route for carrier proteins, like Tim23. It does not require hsp70 or ATP for entry.
  • Small Tims are normally found in the intermembrane space and are not membrane proteins. They used Tom20 for their receptor and transfer to the GIP complex. However, when Tom20 was destroyed by trypsin, leaving only Tom5, the small Tims were able to enter.

The above cartoon from your text shows more ways that proteins can be inserted into inner and outer membranes, once they are recognized by the receptors. As shown by proteins in the literature examples above, the mitochondria uses both positively charged signals as well as membrane spanning hydrophobic sequences to translocate and then reach their final destination. As in the above examples, there can be multiple signal and insertion sites. However, the distribution of the charged amino acids helps orient the protein so that the positive charges are in the matrix. This is how the cytochromes in the respiratory chain or the elementary particles are inserted by mitochondrial actions.

This figure is taken from Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, N.Y. 1994, Third Edition

The following figure is from another text by Lodish et al, Molecular Cell Biology. It shows the entire sequence of events required to take a protein into the matrix.

  • Step 1: Protein unfolds as it binds to hsp70 chaperone. Red positive area indicates targeting sequence. Chaperone binding is ATP dependent.
  • Step 2: Targeting sequence binds to receptor (usually Tom20)
  • Step 3. Receptor ushers protein to site of translocator. Other Tom proteins involved, but Tom40 is the core of the translocator channel.
  • Step 4: Protein is translocated stimulated by the membrane potential. Electron transport complexes on inner membrane have pumped H+ across to the intermembrane space, leaving the matrix more negative. This attracts the protein (the signal is positively charged). Protein moves through Tim translocators. Tim 44 and hsp70 in the matrix continue to guide and pull the protein through the pore. An ATP requiring process.
  • Step 5. another chaperone (called a chaperonin), hsp60 causes the folding of the the protein into its tertiary sequence. Also an ATP requiring process.
  • Step 6. Presequence is cleaved in the matrix.

What happens if an import protein is defective?

Studies of yeast have helped us learn about the receptor and translocation machinery contains a complex of proteins that work together to allow entry. In yeast, these have been named the MOMX. series, where the number designates the protein number. An important protein in the recognition of the signal peptide and its binding to the receptor is called "MOM19". MOM 19 works with MOM 72 to recognize and bind the proteins. Then MOM22 helps the protein to pass from the receptor binding site to the insertion point at the outer membrane. The importance of MOM19 can be proved by adding antibodies to MOM19 and blocking import.

In a recent paper by Harkness et al (J Cell Biology 124: 637-648, 1995), they created mutant yeast cells that included a defective gene for MOM19.

They also included a drug resistant marker so they could selectively grow cells with the mutant gene (in the presence of the drug, p=fluorophenyl alanine, or fpa). So, the longer the cells grow in the drug, the more drug-resistant mutant cells will be found. The above electron micrographs are from their paper (cited above). They show the result of the absent MOM19 protein. What is absent in the cells grown for 16 or 32 h in the drug?

When they did the assays for the proteins, what proteins were actually missing? Tests showed that there was a dramatic decrease in most of the respiratory chain (electron transport chain) including cytochromes a/a3, and b. However, cytochrome C was unaffected. This suggests that another protein must control its import.


Centrifugación diferencial

Differential centrifugation is the most common method of fractionating cell. Fractionation is separation of different organelles within a cell. It is a classical procedure used to isolate different particles by stepwise successive centrifugations at increasing RCF's (Relative Centrifugal Forces).
Centrifugation separates particles in a suspension based on differences in size, shape and density that together define their sedimentation coefficient. The tube containing the suspension of particles is rotated at a high speed, which exerts a centrifugal force directed from the center of the rotor towards the bottom of the tube. Centrifugal Force 'G' is more commonly expressed as the Relative Centrifugal Force (RCF) or g value in multiples of the earth's gravitational field 'g'.

Relative centrifugal force or g value is calculated using the following formula:

RCF =Relative Centrifugal Force,
r = radius in centimeter,
Q = revolutions per minute.

Thus depending on the radius of centrifuge being used the Q value will vary for different centrifuge to obtain the same g value. When doing differential centrifugation, density of the liquid in which the centrifugation is carried out should be uniform and its density must be far lower than that of the particles to be separated. The viscosity of the particles should also be very low. As a consequence, the rate of particle sedimentation depends on its size and the applied g force. Differential centrifugation gives a crude resolution of sub cellular fraction. This centrifugation is usually carried out using fixed angle rotor.


Mitochondria: Structure and Functions

Mitocondrias are known as the powerhouses de la celda. Son orgánulos that act like a digestive system that takes in nutrients, breaks them down, and creates energy-rich molecules for the cell. The biochemical processes of the cell are known as respiración celular. Many of the reactions involved in cellular respiration happen in the mitochondria. They are the working organelles that keep the cell full of energy.

There are small organelles floating free throughout the cell. Some cells have several thousand mitochondria while others have none. Muscle cells need a lot of energy so they have loads of mitochondria. Neurons (cells that transmit nerve impulses) don’t need as many. If a cell feels it is not getting enough energy to survive, more mitochondria can be created. Sometimes it can grow larger or combine with other mitochondria. It all depends on the needs of the cell.


Metabolons and Supramolecular Enzyme Assemblies

Kendrick B. Turner , . Scott A. Walper , in Methods in Enzymology , 2019

2.2.1.2 Cultivation conditions

Cultivation conditions as described in Section 2.1.1.2 can be followed until the induction of expression (steps 1–4). The subsequent protocols are based on the protein–protein packaging strategy described by Alves et al. that employs a SpyTagged-porin protein (OmpA-ST) and a SpyCatcher-labeled phosphotriesterase enzyme (PTE-SC) ( Alves et al., 2018 Alves, Turner, Medintz, et al., 2016 Zakeri et al., 2012 ). The methods below are based on a two vector expression system in which the anchor protein (OmpA-ST) is under the control of an arabinose-inducible promoter, and the enzyme (PTE-SC) is regulated using a T7 promoter. Expression of the T7 polymerase is itself regulated by a lactose-inducible promoter.

After the culture reaches an OD600 = 0.8 add l -arabinose (0.02%–1% final concentration v/v) to induce expression of the PTE-SC construct under the control of the arabinose inducible promoter.

Incubate an additional 2 h at 37°C.

Induce expression of the OmpA-ST anchor by adding the lactose analog Isopropyl β- d -1-thiogalactopyranoside (IPTG) to a final concentration of 0.5 mM.


Ver el vídeo: LAS MITOCONDRIAS: Qué son y para qué sirven (Mayo 2022).