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Ensayo enzimático de pectinasa

Ensayo enzimático de pectinasa


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Estoy trabajando en un ensayo de enzima pectinasa. Incubé 900 ul de sustrato durante 10 minutos en el baño de agua, seguido de la adición de 2 ml de reactivo DNSA, luego 100 ul de extracto de enzima agregado finalmente leí la absorbancia @ 540 OD. Sin embargo, los valores son altos. ¿Cómo puedo solucionar problemas de valores altos de blanco de enzimas en el ensayo de pectinasa?


Entonces, ¿tu espacio en blanco es todo menos la enzima? Es decir, sustrato y DNSA con 100 uL de agua? En caso afirmativo, mida, como controles negativos, el sustrato solo y el DNSA solo. Si uno de ellos también absorbe mucho la luz, puede estar contaminado y se debe solicitar un nuevo vial. Si ambos son muy absorbentes, puede ser el agua que está usando o el espectrofotómetro.

Alternativamente, puede intentar medir un curso de tiempo. Si la absorbancia del blanco aumenta a medida que pasa el tiempo, hay contaminación y reordenar los reactivos puede ayudarlo. Si la absorbancia se mantiene constante, no está viendo una contaminación enzimática, es decir, el culpable es el agua en mal estado, la especificación rota o incluso un protocolo incorrecto. (Es decir, reordenar o repetir no ayudará).


Producción de complejo enzimático pectinasa por Aspergilo spp. en fermentación en estado sólido: un estudio comparativo

Una evaluación comparativa de tres Aspergilo especies según su producción de pectinasa en estado sólido se realizó la fermentación. La fermentación en estado sólido ofrece varias ventajas potenciales para la producción de enzimas por cepas de hongos. La utilización de subproductos agrícolas como sustratos de bajo costo para la producción de enzimas microbianas resultó en un proceso económico y prometedor. Las actividades de la enzima pectinolítica de dos Aspergillus sojae las cepas se compararon con un productor conocido, Aspergillus niger IMI 91881 y A. sojae ATCC 20235, que fue reclasificada como Aspergillus oryzae. Se llevó a cabo la evaluación de la actividad polimetilgalacturonasa y poligalacturonasa así como la actividad exo- vs. endoenzima en el complejo enzimático de pectinasa cruda de las cepas mencionadas. Además, se aplicó un ensayo de difusión en placa para determinar la presencia y acción de proteasas en los extractos brutos. A. sojae ATCC 20235 con mayor actividad de polimetilgalacturonasa y mayor actividad de poligalacturonasa tanto exo como endoenzimática, es un candidato prometedor para la producción industrial de pectinasa, un grupo de enzimas con alto valor comercial, en procesos de fermentación en estado sólido. Además de los ensayos enzimáticos, se proporciona un perfil de proteínas de cada cepa mediante electroforesis SDS-PAGE y, además, se observaron zimogramas específicos de especie para las enzimas pectinolíticas, lo que revela las diferencias en el patrón de proteínas de la A. sojae cepas al reclasificado A. oryzae.

Reflejos

► Proyección de diferentes Aspergilo especies para la producción de enzima pectinasa. ► Fermentación en estado sólido de Aspergilo spp. ► Comparación de las actividades enzimáticas obtenidas por las diferentes especies.


Eficacia de la pectinasa de Aspergillus fumigatus R6 en el encintado enzimático de kenaf

Enfriamiento enzimático puede ser una alternativa viable al enrojecimiento con agua, que es el método utilizado actualmente para extraer fibras del kenaf. Las ventajas del enfado con enzimas son su mayor respeto por el medio ambiente, el tiempo de enfado más corto y la calidad de la fibra más controlable. El objetivo de este estudio fue determinar la eficacia de la pectinasa producida a partir de Aspergillus fumigatusR6 en kenaf retting. A. fumigatus La pectinasa R6 separó eficazmente las fibras de los componentes que no eran fibras. Las micrografías electrónicas de barrido mostraron que la superficie de las fibras de kenaf líber tratadas con pectinasa parecía ser más suave y fina. El grado de irritación aumentó con el tiempo de incubación. Un tiempo de enfado de 32 h produjo fibras de kenaf líber de buena calidad con alta resistencia a la tracción (459 MPa). No se encontraron diferencias significativas entre las propiedades de tracción de las fibras de kenaf líber tratadas con A. fumigatus Filtrado de cultivo que contiene pectinasa R6 y otras fuentes de enzima pectinasa comercial. Por tanto, se concluyó que A. fumigatus La pectinasa R6 fue capaz de retomar el kenaf de forma eficaz.

Palabras clave: Kenaf Enzima pectinasa Alta resistencia a la tracción

Información de contacto: a: Departamento de Microbiología, b: Departamento de Tecnología de Bioprocesos, Facultad de Biotecnología y Ciencias Biomoleculares, Universiti Putra Malaysia, 43400 UPM Serdang, Selangor, Malasia c: Instituto de Silvicultura Tropical y Productos Forestales, Universiti Putra Malaysia, 43400 UPM Serdang, Selangor, Malasia * Autor para correspondencia: [email protected]

INTRODUCCIÓN

KenafCannabinus de hibisco L.), miembro de la familia del hibisco, es una de las fibras de líber más versátiles de África occidental. El kenaf se está cultivando para su uso como alimento para animales, cordajes y productos de papel (Dempsey 1975 Warnock et al. 2002). Las fibras naturales están emergiendo como sustituto de las fibras de carbono y vidrio en la industria del automóvil y en los materiales de construcción, así como en la medicina ortopédica y la industria protésica (Fowler et al. 2006 Baltina et al. 2012 Yo et al. 2012). La fibra Kenaf es sostenible y ambientalmente segura porque es biodegradable y renovable. Además, el rápido crecimiento del kenaf permite dos cosechas al año, lo que aumenta los rendimientos de producción y lo hace más rentable (Song y Obendorf 2007 Tahir et al. 2011).

Las fibras de kenaf se obtienen a través del retiro, que es un proceso bioquímico que divide los biopolímeros como la pectina, las hemicelulosas y otras sustancias mucilaginosas que se encuentran en la cutícula y la epidermis. Estas sustancias mantienen unidos los haces de fibras adyacentes, por lo que la eliminación de sustancias no fibrosas expone los haces de fibras. En última instancia, se pueden producir fibras (Van Sumere 1992 Othman et al. 2014). Las sustancias no celulósicas tienen un efecto negativo sobre las propiedades de la fibra, lo que afectará el proceso posterior, especialmente en la industria textil (Othman et al. 2014). Por lo tanto, la eliminación de materiales no celulósicos es necesaria para obtener fibras de kenaf líber de alta calidad.

El enjugado con agua es uno de los métodos tradicionales utilizados para producir fibras de alta calidad; sin embargo, los principales inconvenientes de este método son la contaminación del agua y un olor fuerte que se produce durante el proceso de enjugado (Van Sumere 1992 Akin et al. 2007). Otro método de irrigación, el rocío, produce fibras de calidad inconsistente, ya que este método está geográficamente limitado y depende del clima, lo que hace que las condiciones de irrigación sean incontrolables (Van Sumere 1992). Por lo tanto, se han realizado esfuerzos para encontrar métodos alternativos de enhebrado, y la atención se ha centrado en el enhebrado enzimático.

La tecnología enzimática está ganando reconocimiento mundial porque es respetuosa con el medio ambiente y tiene un rendimiento específico y centrado (Bledzki et al. 2010 Hanana et al. 2015). El enrutado enzimático también es más controlable y se puede reducir la producción de efluentes (Kozlowski et al. 2006). La biodegradación de la pectina ocurre como resultado de la acción sinérgica de diferentes enzimas extracelulares que se utilizan en este proceso (Brühlmann et al. 1994). La poligalacturonasa y la pectina liasa, dos tipos de pectinasa, son las principales enzimas que intervienen en el proceso de retificación (Othman et al. 2014). Se pueden producir fibras de alta resistencia con calidad constante y finura variable víaEnzima en retting usando pectinasa. Estas fibras de alta calidad se pueden utilizar en resinas novedosas o se pueden desarrollar para compuestos de materia prima agrícola de fibra natural (Foulk et al. Bernava 2011 et al. 2015). Van Sumere (1992) sugirió que se requiere la presencia de hemicelulasas y celulasas para ayudar a la pectinasa a obtener buenos resultados de enrojecimiento. La eficacia de la pectinasa en la formación de enzimas ha variado con el tipo de pectinasa y la fuente del microorganismo (Henriksson et al. 1999).

Aunque ha habido logros en la investigación de retiro de enzimas que llevaron a una prueba a escala semiindustrial, no se ha desarrollado ningún sistema comercial (Tian et al. 2013). Hoy en día, se encuentran disponibles muchas preparaciones enzimáticas comerciales para la modificación de la fibra, pero los principales obstáculos son la vida útil de moderada a baja, el alto costo, la baja actividad y la baja capacidad de renovación (Bera et al. 2014). Los parámetros como la resistencia, la suavidad y la tenacidad de la fibra dependen en gran medida de la calidad del tratamiento enzimático.

El encolado enzimático parece ser un método prometedor para producir fibras de alta calidad en condiciones fácilmente controlables. La mayoría de los estudios realizados hasta la fecha se han centrado en el retiro de fibras naturales como el lino y el ramio (Foulk et al. 2011 Bera et al. Bernava 2014 et al. 2015) utilizando enzimas comerciales. Sin embargo, la dependencia de enzimas comerciales puede incrementar los costos de producción de fibra de kenaf. Por tanto, el objetivo de este estudio es determinar la eficacia de los fármacos aislados localmente. A. fumigatusR6 que produce un alto rendimiento de enzimas pectinasas en la formación de kenaf. Este trabajo puede servir como base para el trabajo futuro en este campo.

EXPERIMENTAL

Las plantas de kenaf utilizadas en este trabajo se obtuvieron de la Junta Nacional de Kenaf y Tabaco, Malasia. La variedad Kenaf V36 se cultivó en Rompin, Pahang. La edad a la cosecha fue de 4 meses. El tallo de Kenaf se cosechó mecánicamente y se llevó al laboratorio para su procesamiento. La estopa de kenaf decorticada se cortó en trozos de 10 cm desde la mitad del tallo, seguido de inmersión en agua del grifo a 30 ° C durante 4 h para eliminar la pigmentación, y se secó al aire durante 24 h antes de enjugar.

Las enzimas comerciales utilizadas en este estudio fueron productos de Sigma-Aldrich (EE. UU.). El filtrado de cultivo que contiene actividad pectinasa de Bacilo subtilis ADI1 fue proporcionado por el Departamento de Microbiología, Facultad de Biotecnología y Ciencias Biomoleculares, Universiti Putra Malaysia. Todas las enzimas se prepararon en tampón de acetato de sodio 0,2 M con un pH de 5.

Cultivo y recolección de pectinasa de Aspergillus fumigatus R6

A. fumigatus El R6 utilizado en este estudio se aisló del tanque de extracción de agua de kenaf (Instituto de Silvicultura Tropical y Productos Forestales, Malasia). Un estudio anterior ha demostrado que A. fumigatus El R6 produce una enzima de pectinasa alta y, por lo tanto, podría usarse potencialmente en el proceso de extracción de kenaf. Suspensión de esporas de A. fumigatus El R6 se preparó suspendiendo un bucle lleno de esporas en una solución de Tween 80® al 0,01% y usándolo como inóculo. El inóculo se inoculó sobre salvado de arroz suplementado con una solución mineral y se incubó a 33 ° C durante 129 h. Tras la incubación, se añadió al cultivo 0,2 M de tampón de acetato de sodio, pH 5. La pectinasa se recogió mediante centrifugación a 10.000 × g, 4 ° C durante 15 min utilizando la centrífuga Avanti® J-25I (Beckman Coulter, EE. UU.). El sobrenadante transparente se utilizó como enzima bruta durante todo el estudio. Una solución de azida sódica al 0,05% (NaN3) se añadió al sobrenadante para evitar el crecimiento microbiano.

Para determinar la actividad de la poligalacturonasa, se incubó enzima bruta adecuadamente diluida con ácido poligalacturónico al 1% en tampón de acetato de sodio 0,2 M, pH 5, durante 10 min a 40ºC. La reacción se terminó añadiendo 400 μl de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) y se hirvió durante 15 min. Luego, se agregaron 4.4 mL de agua destilada y se midieron a una longitud de onda de 530 nm (Kashyap et al. 2000). La concentración de azúcar reductor liberada se determinó utilizando ácido galacturónico como estándar. Una unidad de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima requerida para producir un μmol del producto en condiciones estándar.

La actividad de la pectina liasa se determinó espectrométricamente de acuerdo con el método de Nedjma et al. (2001). Una unidad se definió como cambios en la absorbancia de 0,01 de una longitud de onda de 550 nm en condiciones de ensayo estándar.

Las actividades de carboximetilcelulasa (CMCasa) y xilanasa se determinaron estimando la liberación de azúcar reductor utilizando el método del ácido 3, 5-dinitrosalicíclico (DNS) (Miller 1959), donde se utilizó carboximetilcelulosa al 1% y xilano como sustrato en la mezcla de reacción, respectivamente. .

La estopa de Kenaf se trató con enzima pectinasa adecuadamente diluida (A. fumigatus R6), se coloca en una caja de polietileno y se incuba a 30 ° C durante 40 h. Las muestras se recogieron en intervalos de 8 horas y se lavaron con agua corriente. La estopa de Kenaf se limpió y peinó al secarse. Se evaluó la calidad y morfología de las fibras reticuladas.

Caracterización morfológica de las fibras de kenaf retted

La estopa de kenaf se cortó a un tamaño de cerilla de 2 cm x 0,5 cm x 0,5 cm y se calentó en agua destilada para eliminar el oxígeno. Los palos se empaparon en una solución de ácido acético glacial y peróxido de hidrógeno según el método de Franklin (1945). Una vez que las barras se volvieron incoloras, se lavaron con agua destilada varias veces para eliminar los productos químicos. Los bastoncillos de kenaf se transfirieron a nuevos tubos de ensayo, se agitaron en agua destilada y se tiñeron con safranina. A continuación, las fibras se observaron al microscopio.

El índice de brillo y amarillez se midió de acuerdo con ASTM E313 (2015). Todas las medidas se tomaron en las condiciones del iluminante estándar CIE D65 (luz diurna media) y un ángulo de observación de 10 °. La topografía de la superficie de las fibras de kenaf se investigó cualitativamente para evaluar la eficacia de A. fumigatus Pectinasa R6 en extracción de kenaf utilizando un microscopio electrónico de barrido (JOEL, Japón).

Análisis de espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR)

Se utilizó un espectrofotómetro FT-IR (Perkin Elmer, EE.UU.) para evaluar la composición química de las fibras de kenaf líber tratadas. Los espectros se registraron en el rango de frecuencia de 4000 a 280 cm -1.

Las propiedades de tracción se determinaron usando una Universal Testing Machine (Instron®, EE. UU.). Las pruebas se realizaron de acuerdo con ASTM International D3379 (1975). Se analizaron treinta muestras para determinar la resistencia promedio de una sola fibra. Las pruebas se realizaron en una atmósfera de laboratorio estándar de 25 ° C y 50% de humedad relativa. La velocidad de la cruceta en este estudio fue de 3 mm / min, y la longitud del calibre se midió constantemente a 10 mm.

Todas las pruebas estadísticas se realizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA de una vía) y una prueba de Turquía post hoc utilizando un nivel de probabilidad inferior al 5% (P & lt 0,05).


¿Qué es una pectinasa? (con imagenes)

La pectinasa es un grupo de enzimas que descomponen una parte central de las paredes celulares de las plantas. Las enzimas son proteínas que aceleran la velocidad de reacción. Estas enzimas son una parte omnipresente de las industrias de elaboración de zumos de frutas y vino. También conocido como enzimas pécticas, se agregan a la alimentación del ganado para ayudar a los animales a digerir mejor su alimento. También se venden como suplementos nutricionales para humanos para ayudar a la digestión.

Los diferentes tipos de enzimas pécticas varían en la forma en que degradan la pectina, un polisacárido largo de azúcares que forma un gel. La pectina forma el centro de la pared celular vegetal. Otras moléculas, como la celulosa, están incrustadas en él. Cuando la pectina degrada la pectina, las paredes celulares se debilitan. Por ejemplo, durante la maduración de la fruta, la enzima poligalacturonasa ayuda a que ciertas frutas, como los tomates, se vuelvan blandas y comestibles.

En otros casos, los hongos y las bacterias producen estas enzimas para romper las paredes celulares como parte de su invasión del tejido vegetal. Esta descomposición puede causar una degradación total del tejido, como cuando una papa se pudre. Las enzimas pécticas también ayudan en la descomposición de la basura vegetal y se utilizan en el tratamiento de aguas residuales. Los hongos genéticamente alterados son una fuente importante de estas enzimas para la industria.

Comercialmente, la pectinasa se agrega a la alimentación del ganado para ayudar a los animales a digerir mejor su comida. Esto mejora la salud de sus sistemas digestivos y les ayuda a digerir mejor los nutrientes. También les permite ser alimentados con alimentos que no se han procesado demasiado y cuestan menos. Los suplementos que contienen enzimas que degradan los materiales vegetales también se venden para ayudar a la digestión humana, aunque dichos suplementos no están regulados por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA), por lo que su eficacia no está clara.

Las industrias alimentaria y vinícola utilizan con frecuencia estas enzimas en combinación con amilasa, que degrada el almidón, para clarificar las soluciones. Esto es particularmente cierto para el jugo de manzana, que a menudo está turbio debido a los materiales vegetales que quedan en él después de la producción. El tratamiento con enzimas pécticas degrada la pectina, lo que ayuda a producir un jugo claro. Al hacer jugos a base de bayas, dicho tratamiento también puede mejorar la retención de aroma y coloración. Se toma un enfoque similar con el vino, que retiene la pectina.

La pectinasa también se usa cuando la fruta se convierte en pulpa y luego se extrae para eliminar su jugo porque se ha descubierto que mejora el rendimiento. Otros usos de las enzimas pécticas en la industria alimentaria incluyen ablandar las cáscaras de las frutas para facilitar su pelado y fermentar el café y el té. Estas enzimas también se utilizan, junto con otras enzimas que degradan la pared celular, en el aislamiento de fibras vegetales, como el algodón, y reducen la necesidad de productos químicos tóxicos en dichos procesos.


  • NCBE, 2006. "In a Jam and Out of Juice", Centro Nacional para la Educación en Biotecnología, Universidad de Reading, Reino Unido [consultado el 7 de julio de 2006] http://www.ncbe.reading.ac.uk/NCBE/PROTOCOLS/ INAJAM / PDF / JAM03.pdf.
  • Colaboradores de Wikipedia, 2006a. "Cell Wall", Wikipedia, la enciclopedia libre. [consultado el 7 de julio de 2006] http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Cell_wall&oldid=61797174.
  • Colaboradores de Wikipedia, 2006b. "Enzima", Wikipedia, la enciclopedia libre. [consultado el 7 de julio de 2006] http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Enzyme&oldid=62644117.
  • Colaboradores de Wikipedia, 2006c. "Pectina", Wikipedia, la enciclopedia libre. [consultado el 7 de julio de 2006] http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Pectin&oldid=61390030.

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Efecto de la concentración de pectinasa sobre el volumen de jugo de manzana

En esta sociedad actual, las fábricas de jugo de manzana utilizan con frecuencia una enzima llamada pectinasa para acelerar el proceso de producción de jugo de manzana. Para probar si la pectinasa es realmente efectiva en la producción de jugo, realicé una investigación observando el rendimiento del jugo de manzana cuando se cambia la concentración de pectinasa. Hoy me gustaría compartir contigo los resultados de este experimento.

Para proporcionar información general, una enzima se refiere a un catalizador biológico que acelera las reacciones químicas en los organismos. La pectinasa, que incluye pectoliasa, pectozima y poligalacturonasa, es el grupo de enzimas de degradación de la pectina y # 8211. La pectina reduce la energía de activación necesaria para dividir una molécula de pectina, que rompe la pared celular y, en consecuencia, reduce el tiempo necesario para extraer los jugos de frutas. Se utiliza a menudo en la producción comercial, como la extracción de vino de la pulpa.

La actividad de la pectinasa está influenciada por la temperatura y el pH, al igual que cualquier otra actividad enzimática. El pH óptimo es de 4.5 a 5.5 y la temperatura óptima es de 45 ° C a 55 ° C. La pectinasa también se ve afectada por la presencia de microorganismos y las concentraciones de la enzima y el sustrato.

Diagrama del proceso de extracción de jugo de manzana

Durante el experimento, cambié la concentración de pectinasa del 10% al 0% (agua destilada) y medí el volumen de jugo de manzana extraído con un cilindro graduado. Primero agregué 10 ml de solución de pectinasa en 30 g de puré de manzana y coloqué la mezcla en el baño de agua a 40 grados centígrados. Después de 20 minutos, saqué los vasos del baño de agua y filtré el jugo. Registré los volúmenes de jugo y observé el color del jugo de manzana para registrar datos cuantitativos y cualitativos.

Los resultados revelaron una correlación positiva entre la concentración de pectinasa y el volumen de jugo de manzana extraído. Mientras que el volumen de zumo de manzana extraído de una concentración de pectinasa al 0,0% aumentó de 0,0 ml a 3,5 ml, el volumen de zumo de manzana extraído de una concentración de pectinasa al 10,0% aumentó de 0,0 ml a 7,9 ml. Sin embargo, las barras de error fueron excepcionalmente grandes en mi experimento, casi todas las barras de error se superpusieron entre sí. Probablemente resultaron de la división de medición más pequeña de herramientas o de un número limitado de ensayos.

En aplicación a la vida real, la industria del jugo de manzana puede utilizar los resultados de esta investigación para defender el uso de pectinasa. Aunque los resultados mostraron una correlación positiva entre el volumen de jugo de manzana y la concentración de pectinasa, las barras de error fueron significativamente grandes, lo que limita la validez de los datos. Por tanto, se puede concluir que el argumento de que un aumento en la concentración de pectinasa provocará un mayor rendimiento de zumo de manzana es débil e infundado.


Interacción planta-patógeno Parte I: Enzimas en fitopatología

La mayoría de los parásitos fúngicos y bacterianos producen muchas enzimas que degradan los materiales vegetales in vivo. Las enzimas involucradas en la patogénesis o virulencia (proceso de inicio de la enfermedad) incluyen enzimas tanto constitutivas como inducibles.

(1). Constitutivo enzimas son aquellas enzimas que están presentes todo el tiempo en las células.
(2). Enzimas inducibles Son aquellas enzimas que se producen solo cuando las células las necesitan en respuesta a determinados estímulos internos o externos.

Las clases importantes de enzimas involucradas en la patogénesis son:

(1). Cutinasas
(2). Pectinasas
(3). Celulasas
(4). Hemicelulasas
(5). Ligninasas
(6). Lipasas
(7). Proteinasas

La superficie de la planta está cubierta con una capa fina o gruesa de cutícula para protección y prevención de la pérdida de agua. La capa de la cutícula sobre la epidermis de la planta suele estar impregnada y cubierta con cera. La cutícula se compone principalmente de cutina, un polímero estructural compuesto por ésteres de ácidos grasos hidroxi e hidroxiepoxi. Las cutinasas son un grupo de enzimas que hidrolizan la cutícula de las plantas. Bioquímicamente, la enzima cutinasa pertenece a la familia de las serina hidrolasas. Se sabe que muchos hongos fitopatógenos y pocas bacterias producen la enzima cutinasa durante la patogénesis. Las enzimas cutinasas rompen la cutícula y liberan monómeros y oligómeros. Estos monómeros entran en la célula y desencadenan una mayor expresión de genes cutinasa. La enzima cutinasa es muy esencial para la penetración directa de hongos patógenos en la cutícula del huésped. Las concentraciones más altas de cutinasa están presentes en el punto de penetración de las hifas y en la clavija de infección del apresorio.

(2). Pectinasas:

Las sustancias pécticas son los componentes de la laminilla media y actúan como material cementante intercelular entre las células vegetales. La sustancia péctica también forma una gran parte de la pared celular primaria. En la pared celular primaria, la pectina forma un gel amorfo que llena el espacio entre las microfibrillas de celulosa. La pectina vegetal es un polisacárido compuesto por una gran cantidad de residuos de ácido galacturónico. Para la entrada exitosa del patógeno en las células huésped, la degradación de los componentes de la pared celular es muy esencial. Muchos hongos patógenos pueden producir la enzima pectinasa durante el proceso de infección. La degradación de la pectina por la enzima pectinasa da como resultado la licuefacción de las sustancias pécticas y el despertar de la pared celular, lo que conduce a la maceración de los tejidos. Las pectinasas son la principal enzima implicada en la pudrición blanda de los tejidos por hongos. La pudrición suave y la licuefacción de los tejidos facilitan la rápida invasión y establecimiento de patógenos.

Se sabe que dos clases de pectinasas están implicadas en la patogénesis de las plantas.

(1). Pectina esterasas (PE) o Pectina metilesterasas (PME): que elimina pequeñas ramas de la cadena de pectina

(2). Poligalacturonasas (PG) o Glicosidasas pécticas: divide la cadena de pectina en cadenas más cortas de una o pocas moléculas de ácidos galacturónicos.

Los monómeros de galacturanan producidos por la degradación de la pectina entran en las células y desencadenan una mayor producción de pectinasa en el patógeno. Estas unidades de monómero que son absorbidas por el patógeno actúan como inductores de la producción masiva de pectinasa en la célula.

(3). Celulasas:

A diferencia de las células animales, las células vegetales están protegidas con una pared celular celulósica. Para establecer la entrada en la célula huésped, el patógeno debe romper la pared celular celulósica gruesa presente alrededor de la célula. La capacidad de producir la enzima celulasa es una característica importante de los patógenos vegetales de origen bacteriano y fúngico. Las celulasas son una clase de enzima que degrada la celulosa vegetal, el componente principal de la pared celular. Las celulasas de diferentes clases son:

(1). Celulasa-C1: Atacar la celulosa nativa y escindir el enlace cruzado entre las cadenas.

(2). Celulasa-C2: también ataca la celulosa nativa y la rompe en cadenas más cortas

(3). Celulasa-Cx: La enzima ataca cadenas más cortas de celulosas y se hidroliza a unidades de disacáridos llamadas celobiosa.

(4). β-glucosidasa: Escinde la celobiosa y libera unidades de glucosa.

(4). Hemicelulasa:

La hemicelulosa es una mezcla compleja de plisacárido presente junto con la celulosa y forma un componente principal de la pared celular primaria, laminilla media y la pared celular secundaria de las plantas. Las hemicelulasas son las enzimas producidas por muchos patógenos vegetales para la degradación de los componentes de la hemicelulosa en la pared celular. Muchos hongos fitopatógenos producen varios tipos de hemicelulasas. La variación de la hemicelulasa producida por los hongos patógenos se debe a la variación de las unidades de monómero liberadas por el polímero. Las principales categorías de hemicelulasas implicadas en la patogenia son (1). xilanasa, (2). galactanasa, (3). glucanasa, (4). arabinasa y (5). mannase.

(5). Ligninasa:

La lignina es un polímero orgánico complejo presente en la pared celular secundaria. La lignina es un polímero complejo y la unidad estructural más importante es un fenilpropanoide con uno o más de sus carbonos que tienen –OH, -O-CH3 o = O grupos. La lignina se considera el componente más resistente de las plantas. Las ligninasas son enzimas que degradan la lignina de la pared celular secundaria. Solo los microorganismos de grupos muy pequeños son capaces de degradar la lignina. La mayoría de las especies de hongos pertenecen a los basidiomicetos de la clase Los himenomicetos son capaces de producir la enzima ligninasa y degradar la lignina.

Los hongos productores de liginasa causan un síntoma característico llamado podredumbre parda. La actividad de la ligninasa es la causa de la descomposición de la madera por infecciones fúngicas. Aunque los hongos pueden degradar la lignina, no pueden utilizar la lignina como fuente de alimento. Aparte de los hongos basidiomicetos, también se sabe que pocos hongos de pudrición blanca producen ligninasa. Este grupo de hongos puede utilizar la lignina como fuente de alimento.

Las lipasas son las enzimas que hidrolizan la bicapa lipídica de la membrana plasmática. Se sabe que algunos patógenos bacterianos y fúngicos producen la enzima lipasa.

(7). Proteinasas

Para establecer la patogénesis, se requiere que los patógenos degraden muchas proteínas de origen del huésped. Estas proteínas no solo incluyen las proteínas estructurales de la membrana plasmática del huésped, sino que también incluyen muchas enzimas de origen del huésped tales como nucleasas, proteinasas del huésped, etc. Casi todos los hongos y bacterias patógenos pueden producir muchas proteinasas.

Estas son las principales enzimas implicadas en la patogenia. La mayoría de estas producciones de enzimas en el parásito son provocadas por pequeñas moléculas de origen del huésped. Estas pequeñas moléculas, llamadas inductores o elicitores, ingresan a la célula del parásito e interactúan específicamente con algunas proteínas diana, como los factores de transcripción. Los factores de transcripción activados luego inducen la producción en masa de la enzima en cuestión. Las actividades coordinadas de todas las enzimas mencionadas anteriormente son necesarias para la inducción exitosa de la infección en plantas.


Extracción, purificación y aplicaciones industriales de pectinasa: una revisión

La pectina es una molécula de heteropolisacárido con ácido α-D-galacturónico ligado en 1,4 como componente principal. La enzima pectinasa es responsable de la rotura de los enlaces gliosídicos del residuo del ácido galacturónico presente en las sustancias pécticas. Para la producción de la enzima pectinasa se suelen utilizar ambos tipos de fermentación sumergida y en estado sólido (SSF). En su mayoría, la producción de enzima se encuentra mejor en SSF. Existen ciertas técnicas diferentes como filtración, diálisis, precipitación con sal de amonio, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y SDS-PAGE que se pueden aplicar para la purificación de la enzima pectinasa. La pectinasa juega un papel importante en los procesos industriales como la extracción de zumos de frutas, el desgomado de fibras vegetales, el tratamiento de aguas residuales, la extracción de aceite, la fermentación de café y té, la industria del papel y la pulpa.

Palabras clave: Biomolécula Polisacárido Enzimología Fermentación

Introducción

El uso de organismos vivos en procesos industriales para el desarrollo de diferentes productos se vuelve vital debido al menor consumo de energía. Los microorganismos son beneficiosos para la sociedad ya que son responsables de producir productos importantes como enzimas, antibióticos, vacunas, queso, pan y muchos otros [1]. Las enzimas extraídas de microbios se utilizan en el sector industrial debido a su naturaleza ecológica. Las enzimas microbianas reemplazan el uso de productos químicos en procesos tanto técnicos como industriales, lo que reduce la tasa de contaminación. Una de estas enzimas es la pectinasa para su uso en diferentes industrias que puede producirse a partir de diferentes microorganismos como bacterias y hongos [2]. Los compuestos que son catalizados por enzimas pectinolíticas tienen un nombre genérico conocido como sustancias pécticas (Figura 1). Estos son ácidos y tienen carga negativa [3].

Figura 1:Clasificación de sustancias pécticas [3].


Hay cuatro tipos de sustancias pécticas clasificadas por la sociedad química estadounidense [4]:

A. Ácido péctico: es el polímero del galacturonano que tiene la propiedad de solubilidad y los grupos metoxilo son despreciables. El pectato es la sal ácida o normal del ácido péctico [5].

B. Protopectina: esta sustancia péctica es insoluble en agua. Los tejidos intactos de las plantas contienen protopectina. Debido a la hidrólisis restringida, la protopectina produce ácido péctico o pectina [6].

C. Ácidos pectínicos: la cahina del poligalacturón es ácido pectínico que tiene unidades metiladas de galacturonato. Las sales normales y ácidas del ácido pectínico se denominan pectinatos [5].

D. Pectina: La pectina se conoce generalmente como galacturonato de polimetilo. En la pectina, el galacturonato unifica grupos carboxilo de los cuales hasta un 75% se unen con metanol por estrificación. Al unirse a la celulosa en la pared celular, proporciona rigidez a la pared celular [3].

Las frutas son la principal fuente de pectina y la alta viscosidad de los jugos de frutas se debe al triturado mecánico de las frutas que son ricas en pectina. Extraer el jugo por el método mecánico es difícil [7]. La pectinasa junto con algunas otras enzimas reemplaza el proceso de extracción mecánica y clarifica el jugo obtenido de la fruta que contiene pectina (Tablas 1). Pectinase enzyme is responsible for the breakage of glycosidic bonds of galaturonic acid’s residues present in pectic substances [8]. Pectinase is a complex of enzymes enzyme also known as pectic enzyme complex which includes pectozyme, pectolyase and polygalacturonase involved in pectin breakdown. Polygalacturonase is commercially used pectinase. The pectinolytic enzyme has been divided into three major groups that are Protopectinase, Esterase, and Depolymerase [6].

Tables 1:Pectic content of different fruits.


Proto-pectinases act by degrading the insoluble protopectin and produce in soluble proteins. Esterases remove methoxy ester D-galaturonic acids by the deesterification of pectin while α-(1- 4)-glycosidic bonds present in D-galaturonic acid, is subjected to hydrolytic cleavage by deploymerases [3]. For the production of pectinolytic enzymes, both submerged and solid-state fermentation can be employed. The use of stirred tank bioreactors is preferred in the submerged process because it has the upside of controlled aeration and agitation rate which facilitates in the maximum transfer of Oxygen [9]. Conditions for culture medium are provided such that they are in accordance with the natural habitat of filamentous fungi. It gives the added benefit of maximum production because the fungi acclimatize to the culture conditions, thus escalating its efficiency. Moreover, these processes provide an uplift in the economy of the countries which are rich in deposits of biomass and agricultural waste [10].

Production and Extraction of Pectinase Enzyme

Submerged fermentation

Submerged fermentation and SSF, both can be employed to produce pectinase. The process which uses liquid broth to culture organisms is called submerged fermentation (Tables 2). The prerequisites for submerged fermentation are continuous agitation, provision of large amount of water. A colossal amount of effluents is released in this process [11-15]. After production of enzyme, it is easily extracted by using Whatman filter-paper 4. Biomass stays on the filter paper and liquid as supernatant passes through it [16]. The broth is centrifuged for measuring activity of pectinase [17].

Tables 2:Comparison of different media used for submerged fermentation.


Solid state fermentation

The process in which growth is proceeded on a solid surface or particles, in the absence or partial presence of water is termed as solid-state fermentation [18,19]. For extraction of enzyme after fermentation, the particular amount of specific buffer and water added into the fermented flask and allowed to mix well by using mechanical stirring. Filtration and centrifugation was done after mixing and centrifugation was carried out for obtaining the clear extract of enzyme [20]. Different fungal strains are metabolically different and grow differently in different media (Tables 3). Some fungal strains are not able to produce enzyme under solid state fermentation but become active when submerged conditions were provided [21,22].

Microbial sources

Tables 3:Comparison of different media used for SSF.


Aspergillus niger, Aspergillus. awamori, Penicillium restrictum, Trichoderma viride, Mucor piriformis and Yarrowia lipolytica are the filamentous fungi employed in both submerged as well as solid state fermentation for production of various industrially important products such as citric acid, ethanol etc. [23,24]. Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Penicillium expansum, are the types of fungi which are considered as safe (GRAS) by United States Food and Drugs Administration (USFDA) and are put to use in food industry. Some bacteria (Bacillus licheniformis, Aeromonas cavi, Lactobacillus, etc), yeasts like Saccharomyces, Candida and Actinomycetes like Streptomycetes are also used. Amongst these, the filamentous fungi are most commonly employed [11].

Importance of solid state fermentation over submerged fermentation

Solid state fermentation is opted in place of submerged fermentation because it has more advantages [10] as the one is that it uses substrates which are considered as waste but actually contains nutrients. These substrates are important for long term use in fermentation because of their slow utilization rate [25]. Solid state fermentation gives more products after extraction as compared to submerged fermentation [22]. As in the example Penicillium citrinum produced more percentage yield of pectinase in solid as compared to submerged fermentation and is shown below (Tables 4) [26].

Tables 4:Comparison of units obtained from solid state and submerged fermentation.


Purificación

The enzyme, pectinase may have extracted from different sources by using fermentation techniques. It is necessary to purify it for further processing. The purification steps are following [17]:

Filtration

If enzyme and the spore’s bodies are required to separate, then filtration is the best technique. In this filtration is done using Filter paper and centrifugation is carried out for 15 minutes at a rpm of 10,000. The resulting enzyme extract is used for pectinase activity assay [17].

Precipitación de etanol

For ethanol precipitation, crude enzyme must be dialyzed and the resultant supernatant has been mixed with chilled ethanol. Up to 3 volumes of ethanol were used and the mixture was placed undisrupted at a temperature of 4 °C overnight [27]. Centrifugation of resultant precipitate after overnight incubation was carried out at same temperature at 9,000×g. Time for centrifugation was 30 minutes. 10mL Sodium citrate buffer with a pH of 6.5 was used for dissolving the precipitate [28].

Ammonium sulfate precipitation

Supernatant was used as an enzyme source obtained by the centrifugation of cultural medium. The enzyme precipitated by the addition of 60 percent ammonium sulfate [27]. Incubate it for overnight at a temperature of 40 °C after that centrifugation was done for twenty minutes at a rpm of 5000. Dissolved the resultant pellet in appropriate buffer such as T.E. buffer (pH 7.0) [6].

Dialysis

Activation of dialysis membrane is mainly achieved by sodium bi carbonate, and by boiling in hot water. This membrane contains dialysis tubing and after the activation of membrane the partially purified sample was added in to it and sealed it [28]. The salt impurities from protein extract was allowed to remove by suspending the tube in water and then incubated overnight [17].

Cromatografía de intercambio de iones

This chromatography technique helps mainly in the removal of proteins either bound or unbound [27]. Sephadex G 150 is used for packing the glass column. After packing, the sample have been loaded into column. Tris HCl was used for protein elution in this method, having a pH 7.5. The volume collected after void volume were fractions of 1.5ml and their absorbance were taken. Those fractions having positive results for pectinase activity were saved by pooling out and concentrated them for further processing [23].

Gel filtration chromatography: The sample which was properly dialyzed, loaded in a column which is Sephadex G-250. 0.2M solution of phosphate buffer having a pH of 7.5 was used for column equilibration. The same buffer was used for protein elution. The flow rate was 0.1ml/min and with this rate the which were collected were ten. Factions having pectinase activity were separated out for further analysis [7].

SDS- Page

SDS PAGE was used for purity checking. Molecular weight was determined by running the marker and purified enzyme. Coomassie brilliant blue is used for staining the gel band for clear visualized [29].

Different purification techniques having different conditions become suitables for one but not for other proteins [30]. The slight change in pH above or below the optimum value change the activity of enzyme which could be a reason for variation in percentage yield of same proteins using different purification strategies.

Solicitud

One of the enzymes, that are the reason of unprecedented success of the textile and fruit industries, is pectinase [1]. Pectinases have a variety of applications in the industrial sector. This particular enzyme is used in the extraction of fruit juices such as apples, grape wine, strawberries, grapes, raspberries etc [31]. Pectin have a vital role in the turbidity and viscosity of fruits. For the purpose of clarifying fruit juices, a mixture of amylases and pectinases is used. The time of filtration is decreased upto 50% [32]. Pectinases are applied for the treatment of waste water coming from different industries [33]. Textile processing and bioscouring of cotton also finds a role of pectinase in their process. Pectinases combined with lipases, amylases, cellulases and hemicelluloses, is being used in place of caustic soda which is toxic in nature [34]. Pectinase is also used in paper making. It has the ability to depolymerize pectin. Pectin has a higher cationic demand which is lowered by the implementation of pectinase and the filtrate from peroxidase [35]. Besides all these, fermentation of tea and coffee [36], oil extraction and [37], and animal feed production also requires pectinase [34].

Conclusión

Pectinases are of humongous importance as they can be employed in a variety of industrial processes which ultimately leads to an escalation in the quality and yield of the product. A great deal of work done on pectinases involves its screening, isolation, production, purification, characterization and application in the arena of fruit juice production and clarification. Apart from fruit industry, other industries also enjoy the perks of pectinases according to some reports. In the coming times, protein engineering and the technique of site directed mutagenesis should be applied to search for the molecular aspects of pectinases which can increase its robustness regarding the pH and temperature kinetics. The main focus of research on pectinase should be its regulatory mechanism of secretion at a molecular level in the future. This will also aid in the understanding of how different pectinolytic enzymes act on pectin substances.

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Resultados

Plackett-Burman design screening of the main components affecting cell biomass and pectinase production by A. niger

Fractional factorial design was applied to find out the most significant medium components affecting pectinase production by A. niger. Table 1 shows different investigated medium components and their low (− 1) and high (+ 1) levels. The performed experiments (36 runs, Table 3) revealed that the highest pectinase activity of 87.73–88.85 U/mL was obtained from runs 2, 27 and 29, which were conducted using medium containing (g/L): pectin, 30.0 (NH4)2ASI QUE4, 3.3 K2HPO4, 0.50 MgSO4.5H2O, 0.50. Moreover, the coefficients of determination (R 2 ) for both cell biomass and pectinase activity were 86.94 and 85.31%, respectively, indicating that this design had a good model fitting.

However, based on the analysis of variance (ANOVA) for pectinase activity (Table 4, Fig. 1), it can be concluded that the first investigated medium components i.e. pectin, (NH4)2ASI QUE4 y K2HPO4, were the most significant factors affecting pectinase production. This can be seen based on the obtained model F-value and the lower pag-value (pag- < 0.05). Accordingly, magnesium sulphate was excluded from the second step of optimization, since its effect on pectinase production was insignificant (pag- = 0.23).

Pareto chart for the effect of the four factors on total enzyme production

Statistical medium optimization using Box-Behnken design

The BB experimental design was further applied to optimize the concentrations of pectin, (NH4)2ASI QUE4 y K2HPO4 in the culture medium according to the three levels (low, − 1 middle, 0 and high + 1) studied and shown in Table 2. The obtained results (Table 5) clearly showed that highest pectinase activity was obtained upon using the middle levels of all tested three components (Runs 8, 10, 21, 22, 24 and 25), where the maximal pectinase activity obtained ranged from 84.88 to 101.06 U/mL.

The present results show that the applied model exhibited significant pag-values for the effects of the investigated factors on pectinase production (Table 6). Thus, this model was considered highly significant. From the obtained ANOVA results for the regression model in Table 6, we can deduce the following polynomial:

Response surface plots (Fig. 2a-c) represent correlations between the experimental factors (pectin, (NH4)2ASI QUE4 y K2HPO4) and the response of pectinase production. Figure 2a shows the relative effects between (NH4)2ASI QUE4 concentration (1.0–6.0 g/L) and pectin concentration (10–50 g/L) while keeping K2HPO4 concentration constant at 1.25 g/L. Pectinase production increased with increasing pectin concentration to reach its maximal production at 32.22 g/L of pectin, while (NH4)2ASI QUE4 was less effective on pectinase production. Figure 2b shows the relative effects between K2HPO4 concentration (0.5–2.0 g/L) and pectin concentration (10–50 g/L), while keeping (NH4)2ASI QUE4 concentration constant at 3.5 g/L. Results showed that highest pectinase production will be obtained at the most optimum pectin concentration (32.22 g/L), while 1.36 g/L K2HPO4 was suitable for producing maximal pectinase production. On the other hand, the combined surface plot for (NH4)2ASI QUE4 y K2HPO4 (Fig. 2c), where pectin concentration was fixed at 30 g/L, shows that increasing both components gradually increased pectinase production up to its maximal, and that further increase resulted in decreased pectinase production. The final optimum concentration for both components were 1.36 and 4.33 g/L for K2HPO4, and (NH4)2ASI QUE4, respectivamente. Furthermore, from the model results compared to our experimental runs, it can be seen that the maximal obtained experimental pectinase production (90 U/mL) was in good agreement with the model predicted production (92.48 U/mL) with a desirability of 0.915. It can be generally seen, that the evaluated components are significant for pectinase production. Carbon and nitrogen sources are basic components of fermentation medium, where they are used for cellular growth and metabolic machinery, which is finally reflected on the production of pectinase.

Contour plots of pecinase production by A. niger showing the interactions between pectin, (NH4)2ASI QUE4 y K2HPO4

Growth kinetics of A. niger cultivated in un-optimized and optimized medium

This part of the work was designed to compare the kinetics of cell growth and pectinase production on both un-optimized and statistically optimized media in shake flasks (Fig. 3). Cells grew exponentially in both cultures for the first 36 h with a similar growth rate (0.054 g/L/h), after which, cell dry weight remained more or less constant till the end of fermentation. Maximal cell growth recorded comparable values by the end of both cultivations (2.26 and 2.29 g/L for un-optimized and optimized media, respectively). Moreover, during the early exponential phase (0–24 h), the pH dropped from 5.5 to 3.8 and 4.1 in un-optimized and optimized media, respectively, and remained approximately constant for the remaining cultivation time. On the other hand, pectinase production was significantly improved upon using optimized medium, where pectinase was produced at a production rate of about 2.12 U/mL/h and recorded a maximal production of 76.35 U/mL after 36 h. In contrast, in the un-optimized medium, the maximal pectinase achieved was 27.2 U/mL at 60 h, which was about 35.6% of the maximal pectinase produced in the optimized medium. Similarly, the production rate in the un-optimized was only 26.9% (0.57 U/mL/h) of the production rate in the optimized medium. Concerning production yield (YP/X) results showed that the maximal yield obtained in optimized medium (38,270.7 U/g cells) was almost 3-folds of the maximal yield obtained in un-optimized medium (12,895.4 U/g cells).

Cell growth, pectinase production, yield coefficient, and pH changes in the shake flask cultures using un-optimized and optimized media

Batch cultivation in the bioreactor under controlled and uncontrolled pH

The optimized production conditions were transferred from shake-flask level to bioreactor level to gain insights about process performance in semi-industrial scale bioreactor. Cultivations were run in a 16-L stirred tank bioreactor at an aeration rate of 1 v/v/min, under uncontrolled pH. This cultivation was compared with cultivation conducted at controlled pH conditions at 5.5 by the continuous addition of H2ASI QUE4/NaOH using a computerized pH control system (Fig. 4). Results showed that the pH in the uncontrolled cultivation dropped from 5.5 to about 3.6 after 18 h, and remained more or less constant until the end of the cultivation. It can also be noticed that cells grew exponentially without a lag phase, in both cultivations. Maximal cell growth reached 2.38 and 3.28 g/L for uncontrolled and controlled pH, respectively. Additionally, the average cell growth rates were similar (0.02 and 0.028 g/L/h, for uncontrolled and controlled cultivations, respectively). Concerning pectinase production, results showed that the enzyme was exponentially produced until 84 h with production rates of 0.94 and 0.86 U/mL/h in pH-uncontrolled and -controlled cultivations, respectively. The maximal pectinase produced in pH-controlled cultivation (109.63 U/mL) was higher by about 10% from the maximal pectinase produced in pH-uncontrolled cultivation (99.55 U/mL). This increase in enzyme production can be attributed to the increase in cell biomass rather than the increase in cell productivity, since the maximal recorded production yields (YP/X) were comparable in both cultivations (46,282.7 and 43,760.3 U/g cell for controlled and uncontrolled pH cultures, respectively). Additionally, both produced maximal pectinase concentrations were higher by about 30.4 (uncontrolled pH) and 43.6% (controlled pH) than the maximal pectinase produced in optimized shake flask cultivation (76.35 U/mL).

Cell growth, volumetric and specific pectinase production, and change in pH during batch cultivation of A. niger in a 16-L bioreactor under uncontrolled and controlled pH conditions

Fed-batch cultivation in the bioreactor with constant sucrose feeding

Based on the previous data obtained from batch cultivations, fed-batch cultivation was conducted under controlled pH conditions in 16-L stirred tank bioreactor (Fig. 5). The cultivation was started as a normal batch mode for the first 60 h, where the cell growth and pectinase production kinetics were similar to the previous experiments, reaching maximal cell growth and pectinase production of 2.8 g/L and 120 U/mL, respectively. At 60 h, and before entering the stationary growth phase, sucrose was added at a constant feeding rate of 2.0 g/L/h. Accordingly, cells continued to grow exponentially with the same growth rate (0.028 g/L/h) and reached a maximal of 6.58 g/L after 120 h. Concomitantly, the volumetric pectinase production increased with an average production rate of 7.33 U/mL/h and reached a maximal of 450 U/mL at 108 h (about 4-folds higher than the corresponding batch culture). Afterwards, pectinase production remained approximately constant for the rest of cultivation. The highest production yield coefficient (YP/X) obtained in the fed-batch cultivation recorded 75,762 U/g cells, which was almost 63.7% higher than the highest production yield obtained in pH-controlled batch cultivation (46,282.7 U/g cells).

Cell growth, volumetric and specific pectinase production, and change in pH during fed-batch cultivation of A. niger in a 16-L bioreactor

Finally, Table 7 summarizes different steps applied for the development of the production bioprocess for pectinase enzyme. There were significant increases in both volumetric and specific enzyme production through medium optimization, bioreactor cultivation, and switching to fed-batch mode. The statistical media optimization enhanced the pectinase activity up to 76.35 U/mL, compared with only 26.85 U/mL in the un-optimized medium in shake flasks. Moreover, cells cultivated in the bioreactor under controlled pH conditions yielded the highest volumetric pectinase production of 109.63 U/mL. Pectinase production was maximized using sucrose feeding. The highest enzyme production was 450 U/mL after 108 h, which represented about 16-folds increase in volumetric production, compared with the initial un-optimized culture medium and conditions.


Pectinase and polygalacturonase production by a thermophilic Aspergillus fumigatus isolated from decomposting orange peels

A thermophilic fungal strain producing both pectinase and polygalacturonase was isolated after primary screening of 120 different isolates. The fungus was identified as Aspergillus fumigatus Fres. MTCC 4163. Using solid-state cultivation, the optimum levels of variables for pectinase and polygalacturonase (PG) production were determined. Maximal levels of enzyme activities were achieved upon growing the culture in a medium containing wheat bran, sucrose, yeast extract and (NH4)2SO4 after 2-3 days of incubation at a temperature of 50ºC. Highest enzyme activities of 1116 Ug-1 for pectinase and 1270 Ug-1 for polygalacturonase were obtained at pH 4.0 and 5.0, respectively.

thermophilic fungi pectinase polygalacturonase

Através da tiragem de 120 cepas de fungos, isolou-se uma cepa capaz de produzir tanto pectinase quanto poligalacturonase. A cepa foi identificada como Aspergillus fumigatus Fres. MTCC 4163. Empregando cultivo em estado sólido, determinou-se os níveis ótimos das variáveis para a produção de pectinase e de poligalacturonase. Os níveis máximos de atividade enzimática foram obtidos quando a cultura era realizada em meio contendo farelo de trigo, sacarose, extrato de levedura e (NH4)2SO4 por 2-3 dias a uma temperatura de 50ºC. A atividade máxima de pectinase (1116 Ug-1) e de poligalacturonase (1270 Ug-1) foi obtida em pH 4,0 e 5,0, respectivamente.

fungos termofílicos pectinase poligalacturonase

Pectinase and polygalacturonase production by a thermophilic Aspergillus fumigatus isolated from decomposting orange peels

Produção de pectinases e poligalacturonase por Aspergillus fumigatus termofílico isolado de cascas de laranja em decomposição

Urmila Phutela Vikram Dhuna Shobhna Sandhu B.S. Chadha * * Corresponding Author. Mailing address: Department of Microbiology, Guru Nanak Dev University, Amritsar, Punjab, 143005, India. Tel.: (+91183) 225-8802 Extn. 3317, Fax: (+91183) 225-8820. E-mail: [email protected]

Department of Microbiology, Guru Nanak Dev University, Amritsar, Punjab, India

A thermophilic fungal strain producing both pectinase and polygalacturonase was isolated after primary screening of 120 different isolates. The fungus was identified as Aspergillus fumigatus Fres. MTCC 4163. Using solid-state cultivation, the optimum levels of variables for pectinase and polygalacturonase (PG) production were determined. Maximal levels of enzyme activities were achieved upon growing the culture in a medium containing wheat bran, sucrose, yeast extract and (NH4)2ASI QUE4 after 2-3 days of incubation at a temperature of 50ºC. Highest enzyme activities of 1116 Ug -1 for pectinase and 1270 Ug -1 for polygalacturonase were obtained at pH 4.0 and 5.0, respectively.

Palabras clave: thermophilic fungi, Aspergillus fumigatus, pectinase, polygalacturonase

Através da tiragem de 120 cepas de fungos, isolou-se uma cepa capaz de produzir tanto pectinase quanto poligalacturonase. A cepa foi identificada como Aspergillus fumigatus Fres. MTCC 4163. Empregando cultivo em estado sólido, determinou-se os níveis ótimos das variáveis para a produção de pectinase e de poligalacturonase. Os níveis máximos de atividade enzimática foram obtidos quando a cultura era realizada em meio contendo farelo de trigo, sacarose, extrato de levedura e (NH4)2ASI QUE4 por 2-3 dias a uma temperatura de 50ºC. A atividade máxima de pectinase (1116 Ug -1 ) e de poligalacturonase (1270 Ug -1 ) foi obtida em pH 4,0 e 5,0, respectivamente.

Palavras-chave: fungos termofílicos, Aspergillus fumigatus, pectinase, poligalacturonase

Pectinolytic enzymes catalyzing the degradation of pectic substances are of great industrial importance (28). The pectinases are required for extraction and clarification of fruit juices and wines, extraction of oils, flavors and pigments from plant materials, preparation of cellulose fibers for linen, jute and hemp manufacture (8), coffee and tea fermentations (29) and novel applications in the production of oligogalacturonides as functional food components (13). Fungal polygalacturonases used in industrial processes for juice clarification are mainly obtained from mesophilic aspergilli and penicillia (3) and the range of enzyme sources is being extended through new recombinant and non-recombinant fungal strains. Thermophilic fungi are potential sources of various industrially important thermostable enzymes, such as lipases, xylanases, proteases, amylases and pectinases. These enzymes have numerous applications in the detergent, starch, food, paper and pharmaceutical industries (17).

Higher cost of the production is perhaps the major constraint in commercialization of new sources of enzymes. Though, using high yielding strains, optimal fermentation conditions and efficient enzyme recovery procedures can reduce the cost. In addition, technical constraint includes supply of cheap and pure raw materials and difficulties in achieving high operational stabilities, particularly to temperature and pH. Therefore, the understanding of various physiological and genetic aspects of pectinase is required for producing thermostable and acid stable strains of pectinolytic fungi.

Literature highlighting the optimization, biochemical characterization, genetics and strain improvement studies of pectinases from mesophilic fungi (7,11,18,19) is available. However, the studies on pectinases from thermophilic fungi are lacking. Considering the biotechnological importance of thermophilic fungi in the enzyme industry, the present paper reports the isolation of pectin degrading thermophilic fungi from various sources, their screening and process evaluation.

MATERIALS AND METHODS

Isolation of thermophilic fungi

Thermophilic fungi were isolated from different soil samples, compost and decomposed matter collected from the vegetable, fruit markets and composting soils of Amritsar, Jalandhar, Ludhiana, and Gurdaspur cities of Punjab (India). Isolation medium of following composition, gL -1 (pectin, 10.0 sucrose, 10.0 tryptone, 3.0 yeast extract, 2.0 KCl, 0.5 MgSO4. 7H2O, 0.5 MnSO4.5H2O, 0.01 (NH4)2ASI QUE4, 2.0) supplemented with mineral salt solution of composition g/100 mL (CuSO4.5H2O, 0.04 FeSO4, 0.08 Na2MoO4, 0.08 ZnSO4, 0.8 Na2B4O7, 0.004, MnSO4, 0.008), 1 mL distilled water to make 1L solution pH 5.5-6.0 was used (27). To the above medium, ampicillin (100 mg/mL) was added to restrict bacterial growth. The inoculated plates were incubated at 50ºC for 5-7 days. The cultures were further purified by sub culturing on YPSS (Yeast soluble starch agar) medium having composition, gL -1 (starch, 15 yeast extract, 0.4 K2HPO4, 0.23 KH2correos4, 0.2 MgSO4.7H2O, 0.05 citric acid, 0.052 pH 5.5-6.0).

Screening of thermophilic fungal isolates for pectinolytic activity

Preliminary screening of isolates for pectinase production was carried out by disc plate method of Acuna-Arguelles et al. (2). The size of clearance zone formed around the colonies using 1% cetrimide solution corresponds to the enzymatic activity of a particular culture. The potency index of each isolate was calculated as the ratio of zone diameter to colony diameter. The cultures showing high potency index were further screened by semiquantitative plate assay method (22,23). The cultures were individually plated on YPSS medium (9) containing pectin in place of starch and incubated at 50ºC. A 6 mm colony from the growing edge of the colony was transferred to 2mL citrate buffer (0.1M pH 4.0), incubated for 1 h at 50ºC under shaking conditions. The resultant extract was assayed for pectinase activity. The released sugars were estimated using DNS. On the basis of plate assay, eight cultures were selected for further studies and were compared along with three standard cultures for pectinase production by solid state culturing. The solid-state cultivation was carried out using basal medium of following composition (1), given as gL -1 : (pectin, 10 urea, 3.0 sucrose, 31.4 (NH4)2ASI QUE4, 12.6 KH2correos4, 6.5 FeSO4, 0.29 sugarcane bagasse, 231.0 pH, 5.0-5.5. The final moisture was adjusted to 70%. The flasks were inoculated with spore suspension (1 mL) containing (10 6 spores mL -1 ) and incubated at 50ºC for 2-3 days. The crude enzyme was extracted by adding 100mL of citrate buffer (0.05M pH 5.5) to each flask followed by filtration and centrifugation at 14400 g. The resultant extract was used for enzyme assay.

The isolate TF3, identified as Aspergillus fumigatus Fres. MTCC 4163 by Microbial Type Culture Collection (MTCC), Chandigarh, India, was taken up for further studies.

The production of the pectinase was followed for 5 days the contents of the flasks were harvested at regular intervals (24h) by adding 100ml citrate buffer (50 mM, pH 5.0) followed by centrifugation. The resultant clear extract was assayed for pectinase and PG activities.

Effect of physico-chemical parameters

The effect of natural substrates like different complex carbon source (malt sprouts, wheat bran, rice bran and pectin from pomegranate, lemon, banana, orange and mussami) and purified commercial carbon sources (glucose, sucrose, galactose, trehalose, carboxymethyl cellulose and starch), nitrogen sources urea and (NH4)2ASI QUE4 (U+N), yeast extract and (NH4)2ASI QUE4 (Y+N), peptone and (NH4)2ASI QUE4 (P+N), soybean meal and (NH4)2ASI QUE4 (So+N), malt sprouts and (NH4)2ASI QUE4 (M+N), yeast extract and NaNO3 (Y+S), peptone and NaNO3 (P+S), urea and NaNO3 (U+S), incubation temperature between 30 and 80ºC and effect of pH on pectinase and PG production were studied.

The pectinase and PG activities were determined using pectin and polygalactouronic acid as substrates (20). The reaction mixture (1mL) containing equal amounts of substrate (1%) prepared in citrate buffer (0.05 M pH4.4) and suitably diluted enzyme was incubated at 50ºC for 30 minutes in water bath. After incubation 3 mL DNS solution was added to stop the reaction and tubes were kept in boiling water for 10 minutes. On cooling, the developed colour was read at 575 nm using UV-visible spectrophotometer (Shimadzu-Mini 1240). The amount of released reducing sugar was quantified using galactouronic acid as standard. The enzyme activity was calculated as the amount of enzyme required to release one micromole equivalent of galactouronic acid per minute under assay condition. The activities expressed as units/g of substrate. The protein in the supernatant was measured by the method of Lowry et al. (16)

Effect of pH and temperature on enzyme activities

The enzyme extract was pre-incubated at different temperatures ranging from 30-80ºC for different time intervals and then assayed for pectinase and PG activity. The effect of pH on pectinase and PG activities were studied between pH 3.0 - 9.0 using citrate/phosphate (pH 3.0-7.2) and Tris-HCl (pH 7.2-9.0) buffers (50 mM). All the experiments were conducted in triplicate and the results show the mean values of the activities.

Screening of isolates

Thermophilic fungal strains isolated from various sources and sites of different cities of Punjab, were purified and their cultural and morphological characteristics were examined (9). Fungal cultures were further screened by disc plate method and the potency index was calculated. Fifteen cultures had a potency index above 3.5, thirty-five cultures had potency index between 3.0-3.5, and forty-three isolates had a potency index of 2.0-3.0. These isolates were categorized as high, moderate and low pectinase producers, respectively.


Ver el vídeo: Enzymatic Assays (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Cha'tima

    exactamente hasta el punto :)

  2. Quint

    Gracias por el consejo, ¿cómo puedo agradecerte?

  3. Mazujar

    Bien, muchas gracias por su ayuda en este asunto.

  4. Omer

    Me uno. Todo lo anterior es cierto. Discutamos este tema.

  5. Bragul

    Esta pregunta no me queda clara.



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