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¿Qué sustancias químicas matarán al fago P1 pero no a la E. coli?

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Estoy trabajando con E. coli y P1 Phage. Me pregunto si hay algún agente químico que matará o desactivará P1 pero dejará E. coli intacto? No basta con prevenir la infección. Debe destruir el fago.


Nuevo material mata la bacteria E. coli en 30 segundos

Investigadores de Singapur han desarrollado un nuevo material que puede acabar con la E. coli bacterias en 30 segundos.

Todos los días, estamos expuestos a millones de bacterias dañinas que pueden causar enfermedades infecciosas, como la E. coli bacterias. Ahora, investigadores del Instituto de Bioingeniería y Nanotecnología (IBN) de la Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación (A * STAR), Singapur, han desarrollado un nuevo material que puede matar a la E. coli bacterias en 30 segundos. Este hallazgo ha sido publicado en la revista revisada por pares, Pequeña.

"La amenaza global de las bacterias resistentes a los medicamentos ha dado lugar a la necesidad urgente de nuevos materiales que puedan matar y prevenir el crecimiento de bacterias dañinas. Nuestro nuevo material antimicrobiano podría usarse en productos de cuidado personal y de consumo para respaldar las buenas prácticas de higiene personal y prevenir la propagación de enfermedades infecciosas ", dijo el director ejecutivo de IBN, el profesor Jackie Y. Ying.

El triclosán, un ingrediente común que se encuentra en muchos productos como pastas de dientes, jabones y detergentes para reducir o prevenir infecciones bacterianas, se ha relacionado con hacer que las bacterias sean resistentes a los antibióticos y a los efectos adversos para la salud. La Unión Europea ha restringido el uso de triclosán en cosméticos [1], y la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos está llevando a cabo una revisión continua de este ingrediente [2].

Impulsados ​​por la necesidad de encontrar una alternativa más adecuada, el líder del grupo IBN, el Dr. Yugen Zhang, y su equipo sintetizaron un compuesto químico formado por moléculas unidas en una cadena. Llamados oligómeros de imidazolio, este material puede matar el 99,7% de la E. coli bacterias en 30 segundos con la ayuda de su estructura en forma de cadena, que ayuda a penetrar la membrana celular y destruir las bacterias. Por el contrario, los antibióticos solo matan las bacterias sin destruir la membrana celular. Dejar la estructura celular intacta permite que crezcan nuevas bacterias resistentes a los antibióticos.

"Nuestro material único puede matar bacterias rápidamente e inhibir el desarrollo de bacterias resistentes a los antibióticos. Los estudios de química computacional respaldaron nuestros hallazgos experimentales de que el compuesto en forma de cadena actúa atacando la membrana celular. Este material también es seguro para su uso porque tiene un efecto positivo carga que se dirige a las bacterias más cargadas negativamente, sin destruir los glóbulos rojos ", dijo el Dr. Zhang.

Los oligómeros de imidazolio vienen en forma de un polvo blanco que es soluble en agua. Los investigadores también encontraron que una vez que se disolvió en alcohol, se formaron geles de forma espontánea. Este material podría incorporarse en aerosoles alcohólicos que se utilizan para la esterilización en hospitales u hogares.

E. coli es un tipo de bacteria que se encuentra en los intestinos de humanos y animales, y algunas cepas pueden causar diarrea severa, dolor abdominal y fiebre. Dicha infección es contagiosa y puede propagarse a través de alimentos o agua contaminados, o por contacto con personas o animales. Las buenas prácticas de higiene y la manipulación adecuada de los alimentos pueden prevenir


Vectores de bacteriófagos para E. Coli | Genética

La clonación de genes individuales generalmente se lleva a cabo mejor utilizando plásmidos, ya que el inserto rara vez tendrá un tamaño superior a aproximadamente 2 kb. Sin embargo, para la clonación de piezas más grandes de ADN (por ejemplo, durante la construcción de la biblioteca de genes), estos plásmidos no son adecuados ya que los insertos más grandes aumentan el tamaño del plásmido, lo que hace que la transformación sea ineficaz. Las partículas virales (bacteriófagos) pueden inyectar moléculas grandes de ADN en la célula bacteriana huésped. Los bacteriófagos comúnmente utilizados son los fagos M13, f1, fd y lambda (λ).

(i) Fago Lambda (λ) como vector:

Un vector comúnmente utilizado es el del fago lambda (λ). El bacteriófago λ, que infecta las células de E. coli, se puede utilizar como vector de clonación. El ADN del fago λ tiene una longitud de 48,5 kb. En sus extremos están los sitios cos (cohesivos), que constan de extremos cohesivos de 12 pb. Los extremos cos permiten circularizar el ADN en la célula huésped.

Para la clonación de fragmentos de ADN grandes, hasta aproximadamente 20 kb, gran parte del ADN lambda no esencial se elimina y se reemplaza por el inserto (deseado o ta. El ADN recombinante se empaqueta luego en partículas virales in vitro, y se permite que estas infecten células bacterianas (E. coli) que se han plaqueado en agar.

Una vez dentro de las células bacterianas, se replica el ADN viral recombinante. Todos los genes necesarios para el crecimiento lítico normal todavía están presentes en el ADN, por lo que la multiplicación del virus tiene lugar mediante ciclos de lisis celular e infección de las células circundantes. Da lugar a placas de células bacterianas lisadas sobre un fondo, o césped, de células bacterianas. El ADN clonado se puede recuperar de los virus en estas placas.

Existen los siguientes dos tipos de fagos de vectores lambda que difieren en el tamaño del ADN que aceptan:

(a) Vectores de reemplazo lambda y

(b) Vectores de inserción lambda.

(a) Vectores de reemplazo Lambda:

Los vectores de reemplazo lambda contienen un sitio de restricción para la propagación del fago en un hospedador bacteriano adecuado. La parte restante del genoma lambda se elimina y se reemplaza por ADN extraño. La ligadura se realiza en una proporción de brazos a ADN diana que favorece la formación de concatémeros muy largos. Los concatémeros son copias de múltiples longitudes con múltiples complejos de replicación y bifurcaciones. En cada uno de los concatémeros, el vector y las moléculas diana se intercalan.

Se han desarrollado varios de los llamados vectores de reemplazo a partir del fago λ, los ejemplos incluyen EMBL4, EMBL3, λ DASH, etc. En la mayoría de los vectores de reemplazo, la región interna que es reemplazada por la diana contiene un gen que hace que el fago sea inviable (muerto ) en un hospedante de E. coli apropiado. La molécula de vector que contiene ADN diana puede seleccionarse infectando al hospedador. El fago recombinante en el que la región interna se reemplaza por el ADN diana es viable y se usa principalmente para clonar fragmentos de ADN eucariótico.

(b) Vectores de inserción Lambda:

Cuando se clona en un vector de inserción, el ADN del fago se escinde con una enzima de restricción que lo corta solo una vez, y la diana se inserta en este sitio. No se elimina el ADN del fago, por lo tanto, se puede insertar ADN diana de tamaño mucho más pequeño.

En el vector del fago λ gt 10 comúnmente utilizado, el sitio de clonación Eco II está en un gen que es perjudicial para la replicación del fago en ciertas cepas hospedadoras. Esto permite la selección contra fagos no recombinantes.

(ii) Fagos filamentosos como vector de clonación:

Incluye la clase Ff de fagos filamentosos, incluidas las cepas f1, fd y M13, que infectan las células de E. coli. Estos viriones Ff son largos y delgados y contienen un circuito cerrado de ADN monocatenario. Debido a que los fagos aceptan fácilmente inserciones de ADN extraño y suministran una hebra de ese ADN en una forma fácilmente aislada, los vectores basados ​​en fagos Ff se han convertido en la elección estándar de la biotecnología.

una. Bacteriófago M13:

El M13 es un bacteriófago filamentoso de E. coli. Tiene 870 nm de largo y 6 nm de ancho. Tiene una cubierta de proteína (la cápside) que se compone de tres tipos de capsómeros. Este fago filamentoso de ADN monocatenario infecta la célula bacteriana adsorbiendo y entrando a través de un pilius. Los fagos M13 solo infectan células F + o Hfr, no células F & # 8211.

Las partículas del fago M 13 contienen un ADN monocatenario circular de 6,7 kb. Después de la infección de un huésped E. coli sensible, la hebra complementaria se sintetiza y el ADN se replica como un círculo doble estándar, la forma replicativa (RF), con aproximadamente 100 copias por célula.

Los fagos M13 adicionales no lisan las células huésped (para liberar el fago de la progenie y el ADN bacteriano de las células huésped bacterianas rotas) como el fago lambda durante el ciclo lítico. En lugar de esto, los virus / fagos de la progenie M13 se extruyen a través de las capas de la membrana plasmática y la pared celular sin mayor interferencia con el crecimiento celular.

Las células bacterianas infectadas continuarán creciendo y extruyendo miles de partículas de virus de progenie (es decir, hasta 1000 por generación celular), cada una de las cuales contiene un genoma monocatenario en el medio. Dado que las partículas de virus son muy pequeñas en comparación con las bacterias huésped, las células huésped pueden eliminarse mediante centrifugación a baja velocidad.

A continuación, las partículas de virus pueden recogerse de la suspensión sobrenadante mediante centrifugación a alta velocidad y sus moléculas de ADN monocatenarias pueden aislarse mediante extracciones simples de fenol-cloroformo. La cadena de ADN del virus siempre está empaquetada y se denomina cadena & # 8220 + & # 8221 o más (su complemento es la & # 8220 - & # 8221 o cadena menos).

La hebra "+" empaquetada de la fase tiene el mismo "sentido" que el mRNA, es decir, los tripletes de nucleótidos de la hebra + DNA del fago M13 corresponden a los codones del mRNA, pero con T en lugar de U.

El empaquetamiento de hebras simples de ADN de fago en la progenie del fago proporciona una purificación biológica ordenada del ADN de una sola hebra. Es importante destacar que esta afirmación es válida para un gen extraño clonado en el cromosoma viral al igual que para los propios genes del fago. Esta propiedad de la fase M13 se ha aprovechado para su uso como vector.

Por último, el fago M13 no se usa como vector primario para clonar nuevos objetivos de ADN, pero los fragmentos normalmente se subclonan en M13RF usando métodos de plásmido estándar cuando se requiere la forma monocatenaria de un fragmento.

1. Organización genética del bacteriófago M13 de tipo salvaje:

La molécula de ADN del fago M13 es monocatenaria y circular. Tiene 6407 bases de longitud y 10 genes muy empaquetados. Todos estos genes son esenciales para la replicación de los fagos. Hay un segmento de secuencia intergénica (IS) de 507 bases de longitud que contiene el origen de replicación (OR).

La región del genoma viral que contiene IS se manipula para la clonación sin alterar el origen de la replicación. Por tanto, el fago salvaje M13 tiene un uso limitado en experimentos de clonación de genes. El tamaño de la partícula del fago se decide por el tamaño del ADN del fago. Se pueden empaquetar hasta seis veces la longitud normal del ADN del fago M13.

2. Construcción de vectores basados ​​en M13:

En el ADN del fago M13, la secuencia intergénica es la única región que puede manipularse para la clonación de genes. Como esta región tiene solo dos sitios de restricción (Asa I y Ava II), el fago de tipo salvaje no es un vector eficaz. Sin embargo, la secuencia intergénica se puede modificar para introducir sitios de restricción adicionales.

Algunos de estos vectores se analizan a continuación:

M13mp1 y M13mp2:

El gen lac Z se introduce en la secuencia intergénica de tipo salvaje para obtener los fagos mpl M13. Este paso produce placas azules en placas de agar X-gal. El gen lac Z no tiene ningún sitio de restricción. Sin embargo, tiene una secuencia de hexanucleótidos, GGATTC cerca del inicio. Si el segundo residuo G está sustituido por un residuo A, esta secuencia se convierte en un sitio Eco R1, es decir, GAATTC. Este tipo de conversión se realiza mediante mutagénesis in vitro.

Ahora bien, este fago se llama M13 mp2. El gen lac Z & # 8217 ahora tiene una secuencia de bases ligeramente alterada. Debido a este cambio, la enzima β-galactosidasa que está codificada por el gen lacZ tiene el aminoácido asparagina en lugar del ácido aspártico (aminoácido) en la quinta posición. Tal cambio (debido a una mutación) no afecta la actividad de la enzima β-galactosidasa. Esto se puede probar con agar X-gal, donde la placa da un color azul.

El gen lac Z de E. coli codifica el péptido a N-terminal de la enzima (3-galactosidasa que es responsable de la hidrólisis de lactosa en galactosa y glucosa.

El M13 mp2 es el vector de clonación más simple derivado del fago M13. En el sitio exclusivo Eco RI de M13 mp2, se puede insertar cualquier ADN extraño con extremos pegajosos Eco RI. Esta inserción inactiva el gen lac Z y se denomina inactivación por inserción. Dichos fagos recombinantes no producen placas azules en agar X-gal, sino que producen placas claras.

El M13 mp7 es un derivado de MB mp2. Cuando se inserta un polienlazador en el sitio Eco RI del gen lac Z & # 8217, el M13 mp7 se convierte en M13 mp7. El polienlazador está diseñado de tal manera que no inactiva el gen lac Z & # 8217.

Cuando el vector fago M13 se corta con Eco RI, Bam HI, Sal I o Pst I, el polienlazador completo o una parte del mismo se escinde y forma extremos pegajosos. Se inserta ADN extraño con los extremos pegajosos correspondientes para producir mp7 de M13 recombinante. Por tanto, M13 mp7 es un vector más complejo que tiene cuatro posibles sitios de inserción.

La inserción de ADN extraño tiende a inactivar el gen lac Z y se evita la producción de la enzima galactosidasa. Esto se demuestra por la formación de placas claras en agar X-gal por el ADN del fago recombinante.

3. Vectores híbridos de plásmido M13:

Los vectores híbridos contienen componentes de plásmidos y cromosomas de fagos. Estos vectores se replican en E. coli como plásmidos bicatenarios normales hasta que se proporciona un fago auxiliar. Después de la adición del fago & # 8220helper & # 8221, cambian al modo de replicación del fago (es decir, replicación en círculo rodante) como el observado para el fago ф × 1- y empaquetan hebras simples de ADN en partículas de fago.

El fago auxiliar es un mutante que replica su propio ADN de manera ineficiente, pero proporciona enzimas de replicación viral y proteínas estructurales para la producción de moléculas de ADN plasmídico que se empaquetan en capas de fago.

(b) pUC 118 y pUC 119 Vectores de clonación:

Los vectores fago-plásmido & # 8220híbrido & # 8221 pUC118 y pUC119 son un par de vectores que son esencialmente idénticos excepto que las regiones en las que se insertan los ADN extraños están presentes en orientación opuesta (es decir, giradas de un extremo a otro en relación con el resto de los genes del vector.

Por tanto, si se inserta un ADN extraño en un sitio de restricción específico en ambos vectores, un vector empaquetará la hebra complementaria del gen. Por tanto, ambas cadenas del gen pueden aislarse, secuenciarse, someterse a mutagénesis específica de sitio, etc.

Los vectores se designaron pUC para el plásmido, Universidad de California (donde los primeros vectores pUC de la serie fueron construidos por J. Messing y J. Vieira 1987) y 118, 119 para distinguirlos de los miembros anteriores (es decir, números más bajos) de la serie. .

Los vectores pUC 118 y pUC 119 se diferencian de los vectores anteriores de la serie pUC por la adición de un origen de replicación del fago M13. Esto permite que pUC118 y pUC119 se repliquen (1) como un plásmido de doble estándar en ausencia de un fago "auxiliar" o (2) como un ADN monocatenario que se empaqueta en capas de fago M13 y se extruye de la célula en presencia de & # 8220helper & # 8221 fago (más comúnmente un derivado de M13 llamado K07).

En ausencia del fago & # 8220helper & # 8221, la replicación está controlada por el origen de replicación del plásmido. Los vectores pUC se derivaron de un vector de clonación de plásmido temprano llamado pBR322 mediante una serie de modificaciones directas.

El vector pUC tal como PBR322 contiene un origen de replicación inicialmente presente en el plásmido Col E1. En presencia de fagos auxiliares, la replicación de pUC118 y pUC119 está dirigida por el origen de replicación del fago M13 que se ha añadido a los plásmidos.

Algunas características importantes de los vectros de clonación pUC11S y pUC119 son las siguientes:

1. Están presentes como ADN circular covalentemente cerrado, superenrollado y pequeño. Debido a esta característica, se aíslan y manipulan fácilmente en & # 8216 vitro.

2. Llevan el gen amp & # 8221 como marcador seleccionable. Por lo tanto, solo las bacterias que albergan un plásmido crecerán en un medio que contenga el antibiótico amplicilina.

3. Llevan un alto número de copias, hasta 5000 copias por bacteria. Por lo tanto, habría grandes rendimientos de ADN a partir de cultivos de células pequeñas.

4. Llevan una región de policlonación que tiene una variedad de sitios de escisión de enzimas de restricción. Por tanto, se pueden insertar muchos tipos diferentes de fragmentos de restricción sin modificación.

5. La región de policlonación interrumpe la región codificante del extremo 5 & # 8242 del gen lac Z de E. coli. Por tanto, las colonias que albergan plásmidos con inserciones de ADN extraño se pueden distinguir de las que llevan plásmidos sin inserto mediante una simple prueba de color.

6. El gen lac Z está bajo el control del promotor lac. Por tanto, los genes insertados en el marco (codones en el marco de lectura adecuado) pueden expresarse para producir productos de fusión de proteína extraña β-galactosidasa.

7. Llevan un origen de replicación plásmido. Por tanto, la replicación del ADN del vector produce un gran número de ADN de plásmido bicatenario en ausencia del fago & # 8220 & # 8221.

8. Llevan un origen de replicación del fago M13. Por tanto, la producción de ADN monocatenario y el empaquetamiento de este ADN en capas de fagos tienen lugar en presencia de fagos "auxiliares".

9. Las regiones de policlonación están presentes en pUC118 y pUC119 en orientaciones opuestas. Por tanto, si pUC118 empaqueta una hebra de un gen clonado, pUC119 empaquetará la hebra del complemento.

Los diferentes miembros de la serie de vectores pUC contienen conjuntos diferentes, pero relacionados, de sitios de escisión de enzimas de restricción. Las regiones de policlonación de pUC118 y pUC119 contienen 10 sitios de escisión de enzimas de restricción agrupados. Algunos de estos sitios son sustratos para dos o más enzimas de restricción diferentes.

La utilidad de pUC aumenta en gran medida mediante una simple prueba de color que permite distinguir las células que albergan plásmidos con inserciones de ADN extraño de las que albergan plásmidos sin inserción. La base de esta prueba de indicador de color es la inactivación funcional del segmento 5 'del gen lac Z presente en el vector mediante la inserción de ADN extraño en la región de policlonación.

El vehículo de clonación pEMBL8:

El vehículo de clonación pEMBL8 se construye transformando un fragmento de 1300 pb del genoma del fago M13 en el plásmido pUC8. Este fragmento del genoma M13 tiene la secuencia señal reconocida por las enzimas que convierten el ADN dsM13 en una molécula de ADNss. Por lo tanto, las moléculas de pEMBL 8 también se convierten en moléculas de ADN monocatenario y estas se liberarán como partículas de fagos infecciosos.

Cuando se usa el vector pEMBL 8, las células de E. coli también deben infectarse con una partícula M13 intacta. Este actuará como un fago auxiliar al proporcionar las enzimas necesarias y las proteínas de la cubierta del fago. Dado que pEMBL 8 se deriva de pUC8, tiene el polienlazador en el gen lac Z & # 8217 necesario.

Por tanto, este vector plasmídico tiene las siguientes ventajas de los plásmidos pUC8 y de los fagos M13:

1. Se pueden insertar fragmentos de ADN extraño con dos extremos pegajosos diferentes en el sitio de clonación múltiple en el gen lac Z & # 8217.

2. El genoma pEMBL 8 recombinante se puede empaquetar en la cápside del fago M13.

3. Las partículas de fago que contienen el genoma pEMBL 8 recombinante son tan eficaces como los fagos M13 de tipo salvaje en su capacidad para infectar células de E. coli y luego en la expresión del gen extraño.

4. El genoma recombinante de pEMBL 8 se puede cribar fácilmente usando el medio que contiene X-gal.


¿Canto de cisne para antibióticos? ¿Pueden la terapia de fagos y la edición de genes llenar el vacío?

Es hora de enfrentar la música: la edad de oro de los antibióticos ha terminado.

Los seres humanos han estado en una guerra interminable contra las bacterias, de hecho, pueden matarnos, y durante décadas los antibióticos han sido nuestra única arma real contra ellas. Revolucionaron la medicina en el siglo XX y, junto con la vacunación, han llevado a la casi erradicación de muchas enfermedades en el mundo desarrollado.

Pero a pesar de su asombroso éxito, y han tenido un milagro como correr, las superbacterias resistentes a los medicamentos como MRSA, CRE y VRE están ganando lentamente. Cada año, más y más personas mueren por infecciones resistentes a los medicamentos a medida que nos acercamos a los días anteriores a la penicilina. Su eficacia y fácil acceso llevaron a un uso excesivo, especialmente en la cría de ganado, lo que provocó que las bacterias desarrollaran resistencia. Esto llevó a la Organización Mundial de la Salud el año pasado a clasificar la resistencia a los antimicrobianos como una & # 8220 amenaza seria [que] ya no es una predicción para el futuro, está sucediendo ahora mismo en todas las regiones del mundo y tiene el potencial de afectar a cualquiera, de cualquier edad, en cualquier país & # 8221

Hay mucha culpa que compartir por esta reversión: los médicos recetan antimicrobianos para el resfriado común, los pacientes exigen medicamentos para la gripe, los gobiernos desincentivan el desarrollo de nuevos antibióticos y las compañías farmacéuticas consideran que no son rentables.

Independientemente de a quién se pudiera culpar, esta situación actual estaba destinada a suceder, nuestro comportamiento fortuito simplemente aceleró la llegada de este día. Siempre que el objetivo es matar un organismo vivo, la resistencia es inevitable. Así es como funciona la naturaleza: selección natural. En este caso, un antibiótico mata todas las bacterias susceptibles, pero unas pocas resistentes al fármaco debido a mutaciones aleatorias sobreviven y finalmente prosperan. A punto de acabar con un problema, vuelve a rugir incluso peor de lo que empezó.

Así es como toda la vida responde a los factores estresantes. Nos adaptamos. También aparece en el mundo vegetal. Mire el debate de la tormenta de fuego sobre las malezas resistentes a los herbicidas en la agricultura. Ya sea que un agricultor use herbicidas orgánicos aprobados, cultivos convencionales (como cultivos de girasol cultivados convencionalmente) o cultivos diseñados genéticamente para resistir el glifosato, las malas hierbas mutantes sobreviven y se adaptan y se desarrollan reemplazos. Es la ley de la naturaleza. Sí, podemos cambiar los herbicidas o crear otros nuevos, pero el proceso comienza de nuevo. Eso también es cierto con respecto a los antibióticos. Entonces, incluso si creamos una nueva clase de antibióticos, eventualmente seguirá la resistencia, sin importar cuán responsables seamos con su uso.

En este sentido, está claro que términos como "superbacterias" y "supermalezas" son nombres incorrectos porque estos organismos no son especiales de ninguna manera, simplemente están haciendo exactamente lo que la naturaleza se propone que hagan.

Lo que agrava el desafío de los antibióticos es que las bacterias parecen ser capaces de desarrollar resistencia más rápido que cualquier otro tipo de organismo. La conjugación (sexo bacteriano) permite que las bacterias compartan genes de resistencia no solo con miembros de su especie, sino entre especies e incluso entre tipos de bacterias (es decir, de gram positivas a gram negativas). Esto se denomina transferencia genética horizontal y permite que los rasgos ventajosos se difundan entre los miembros de la generación actual, en lugar de hacerlo en las generaciones futuras. Además, alguna evidencia sugiere que las bacterias también pueden sentir cuando su espalda está contra la pared y mutar su genoma a velocidades más rápidas en un último esfuerzo para que uno de sus descendientes mute lo suficiente como para desarrollar resistencia al antibiótico.

Pero aparte de Darwin, nos conviene ir más allá de la era de los antibióticos. Usar antibióticos para tratar una infección es como usar un martillo para clavar un clavo. Seguro que el clavo se clavará, pero también habrá un gran agujero en la pared. Incluso el espectro más estrecho de antibióticos afecta drásticamente nuestra flora normal de formas que pueden tener consecuencias de gran alcance en nuestra fisiología.

Terapia de fagos

Lo que necesitamos en nuestra guerra contra los microbios son agentes biocidas que sean efectivos pero que también tengan más especificidad de especie. Una estrategia en proceso consiste en recurrir al enemigo natural de la bacteria, el virus, en busca de ayuda. En otras palabras El enemigo de mi enemigo es mi amigo.

Los virus no solo infectan a los humanos, de hecho, todas las especies del planeta tienen numerosas especies de virus que pueden infectarlos. Cuando un virus infecta una bacteria, los científicos le asignan un nombre especial: bacteriófago o simplemente fago. En las bacterias, al igual que en los humanos, los virus funcionan obteniendo acceso al interior de una célula y manipulando la maquinaria celular del huésped (es decir, enzimas, ribosomas, etc.) para hacer más copias del virus. En cierto punto, la cantidad de copias de un virus induce a la célula a estallar liberando a veces miles de nuevas copias del virus, que luego pueden infectar otra célula y el proceso se repite.

La corrupción de este proceso para adaptarlo a las necesidades humanas en la lucha contra los antibióticos ha estado ocurriendo desde los primeros días de la guerra fría. Mientras Estados Unidos invirtió en antibióticos, los soviéticos estaban desarrollando lo que ahora se llama terapia con fagos. De hecho, en lugares como Georgia, Rusia y Polonia, la terapia con fagos todavía se usa ampliamente hoy en día para tratar infecciones.

Uno de los principales beneficios de la terapia con fagos sobre los antibióticos tradicionales es la especificidad que tiene un fago para su huésped. En su mayor parte, un fago que infecta un E. coli no podrá infectar otro tipo de bacteria, como un comensal Estafilococo. Incluso hay alguna evidencia de que los fagos son cepas específicas, lo que significa que podemos desarrollar fagos que pueden infectar diferencialmente cepas patógenas de E. coli (es decir. E. coli O157: H7) dejando al comensal sano E. coli cepas solas.

Otra ventaja de la terapia con fagos es que se auto-llena. Un solo fago que infecta una célula producirá miles de nuevas copias de sí mismo que pueden matar más bacterias. Sin embargo, algunos señalan que el mecanismo por el cual los virus matan las células, al abrirlas, presenta un inconveniente para el tratamiento, ya que liberará toxinas bacterianas que pueden provocar sepsis, una afección potencialmente mortal en la que el sistema inmunológico reacciona de forma exagerada a las bacterias que mueren.

Pero los investigadores ya están buscando una solución a este problema. En el MIT, han desarrollado "fagémidos": fagos diseñados que transportan plásmidos en lugar de un genoma completo. Los plásmidos son un fragmento corto de ADN circular que lleva un par de genes que a menudo codifican factores de virulencia y / o factores de resistencia a los antibióticos. Cuando las bacterias experimentan conjugación, esto es generalmente lo que comparten para transmitir genes de resistencia. En un fagémido, el plásmido está codificado con genes que matan a las bacterias sin que la célula sea lisada. No lisis significa que esas toxinas internas no se liberan en el cuerpo. Estos científicos ya han tenido un alto grado de éxito en el tratamiento de la peritonitis en ratones.

La edición de genes con CRISPR-Cas9 (repeticiones palindrómicas cortas intercaladas repetidas agrupadas) podría usarse para combatir las bacterias. Si las bacterias combaten con éxito la infección de un fago, salvan una pequeña porción del genoma del virus en el genoma. La bacteria expresa estas secuencias como secuencias de ARN cortas que son complementarias a partes del genoma del fago. Si la bacteria se vuelve a infectar con el mismo fago, la secuencia de ARN se une de manera complementaria a esa porción del genoma del fago. Dentro de la célula, estas secuencias de ARN están asociadas con una proteína de corte de ADN llamada Cas9, que escinde el genoma del fago y lo vuelve ineficaz.

El truco con CRISPR-Cas9 es que se puede hacer que la secuencia de ARN sea complementaria a cualquier cosa, incluidos los genes de resistencia bacteriana. Por ejemplo, un grupo de la Universidad de Tel Aviv ha creado un sistema CRISPR-Cas9 para apuntar al gen Beta lactamasa. Este gen produce una enzima que inactiva una amplia variedad de antibióticos que incluyen penicilinas, cefamicinas y carbapenémicos. Otros grupos han tenido un éxito excelente dirigiéndose a los genes que se vuelven Staphylococcus aureus en MRSA.

La secuencia CRISPR y la proteína Cas9 se entregarán a las bacterias a través de un fago diseñado y la técnica tiene éxito para dirigirse tanto a genes cromosómicos como a genes basados ​​en plásmidos. Actualmente, gran parte de la investigación sobre esta técnica ha consistido en volver a sensibilizar las bacterias a los antibióticos comunes, pero no está fuera de lo posible que CRISPR-Cas9 pueda diseñarse para atacar genes bacterianos esenciales, lo que hace que la técnica sea bactericida.

El uso de fagos, fagémidos y CRISPR-Cas9 nos presenta una forma más sofisticada y específica de tratar infecciones por bacterias. Sin embargo, de ninguna manera se debe pensar en esto como una fórmula mágica que es el tipo de pensamiento que nos metió en problemas con los antibióticos. Se producirá resistencia a estas técnicas. Es inevitable que estos organismos se adapten.

La resistencia a CRISPR-Cas9 en fagos ya se ha documentado en algunas especies, por lo que es posible que las bacterias también desarrollen resistencia a ellos. Las bacterias también desarrollarán sistemas CRISPR-Cas9 para crear una memoria de los fagos diseñados que usaremos en la terapia con fagos. Pero estas no son razones para abandonar esta tecnología. Estos deberían servir como un modelo para lo que deberíamos estar preparados cuando llegue el día en que se observe resistencia a nuestras opciones iniciales de terapia con fagos. En esencia, ahora tenemos los planes de batalla del enemigo sobre cómo reaccionarán ante nuestra defensa más reciente. Necesitamos usar esa información para tener nuestros contraataques esperando entre bastidores.


Especificidad del huésped del ADN producido por Escherichia coli : I. Modificación del bacteriófago λ * controlada por el hospedador

Las partículas de bacteriófago lambda tienen una "especificidad del huésped" determinada por las cepas bacterianas en las que se produjeron. Tras la infección de un huésped bacteriano diferente (1) el ADN del fago puede aceptarse o rechazarse sobre la base de esta especificidad, (2) si se acepta, el fago se multiplica y se produce la progenie del fago. Aquellos descendientes a los que se transfiere la molécula de ADN del fago parental, en forma conservada o semiconservada, también reciben la especificidad del huésped del fago parental. Toda la progenie que contiene solo ADN recién sintetizado recibe solo la especificidad del nuevo huésped bacteriano. Se concluye que la especificidad del hospedador se lleva a cabo en el ADN del bacteriófago.

El fago P1, presente en una célula bacteriana como profago o fago vegetativo, imparte a λ El ADN multiplica en la misma célula una especificidad del huésped por encima de la determinada por el propio huésped. Tal especificidad inducida por P1 puede imprimirse igualmente bien en replicación y no replicación λ ADN.

El trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional Suiza para la Investigación Científica.


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Es hora de enfrentar la música: la edad de oro de los antibióticos ha terminado.

Los seres humanos han estado en una guerra interminable contra las bacterias, de hecho, pueden matarnos, y durante décadas los antibióticos han sido nuestra única arma real contra ellas. Revolucionaron la medicina en el siglo XX y, junto con la vacunación, han llevado a casi la erradicación de muchas enfermedades en el mundo desarrollado.

Pero a pesar de su asombroso éxito, y han tenido un milagro como correr, las superbacterias resistentes a los medicamentos como MRSA, CRE y VRE están ganando lentamente. Cada año, más y más personas mueren por infecciones resistentes a los medicamentos a medida que nos acercamos a los días anteriores a la penicilina. Su eficacia y fácil acceso llevaron a un uso excesivo, especialmente en la cría de ganado, lo que provocó que las bacterias desarrollaran resistencia. Esto llevó a la Organización Mundial de la Salud el año pasado a clasificar la resistencia a los antimicrobianos como una & # 8220 amenaza seria [que] ya no es una predicción para el futuro, está sucediendo ahora mismo en todas las regiones del mundo y tiene el potencial de afectar a cualquiera, de cualquier edad, en cualquier país & # 8221

Hay mucha culpa que compartir por esta reversión: los médicos recetan antimicrobianos para el resfriado común, los pacientes exigen medicamentos para la gripe, los gobiernos desincentivan el desarrollo de nuevos antibióticos y las compañías farmacéuticas consideran que no son rentables.

Independientemente de a quién se pudiera culpar, esta situación actual estaba destinada a suceder, nuestro comportamiento fortuito simplemente aceleró la llegada de este día. Siempre que el objetivo es matar un organismo vivo, la resistencia es inevitable. Así es como funciona la naturaleza: selección natural. In this case an antibiotic kills off all susceptible bacteria, but a hardy few resistant to the drug because of random mutations survive, and eventually thrive. On the verge of wiping out a problem, it roars back even worse than how it started.

This is how all life responds to stressors. We adapt. It shows up in the plant world as well. Look at the firestorm debate over herbicide resistant weeds in agriculture. Whether a farmer uses organic approved herbicides, conventionally bred ones (such as conventionally bred sunflower crops) or crops genetically engineered to resist glyphosate, mutant weeds survive and adapt and supersedes develop. It’s the law of nature. Yes, we can change up herbicides or create new ones, but the process then begins again. That’s true about antibiotics as well. So even if we create a new class of antibiotics, resistance will eventually follow, no matter how responsible we are with using it.

In this light, it’s clear that terms like “superbugs” and “superweeds” are misnomers because these organisms aren’t special in any way, they are simply doing exactly what nature intends them to do.

What compounds the challenge for antibiotics is that bacteria appear to be able to evolve resistance faster than any other type of organism. Conjugation (bacterial sex) allows bacteria to share resistance genes with not only members of their species, but across species and even across bacterial type (i.e. gram positive to gram negative). This is called horizontal gene transfer and allows advantageous traits to be spread among members of the current generation, instead of in future generations. Furthermore, some evidence suggests that bacteria can also sense when their back is against the wall and mutate their genome at faster rates in a last ditch effort for one of their descendants to mutate enough to develop resistance to the antibiotic.

But Darwin aside, it’s in our best interest to move beyond the era of antibiotics. Using antibiotics to treat an infection is like using a sledge hammer to pound in a nail. Sure the nail will get pounded in but there’s also going to be a large hole in your wall. Even the most narrow spectrum of antibiotics drastically affect our normal flora in ways that can have far reaching consequences on our physiology.

Phage therapy

What we need in our war against microbes are biocidal agents that are effective but also have more species specificity. One strategy in the works involves turning to the natural enemy of the bacteria, the virus for help. En otras palabras the enemy of my enemy is my friend.

Viruses don’t just infect humans, in fact every species on the planet has numerous species of virus that can infect them. When a virus infects a bacteria, scientists have a special name for them: bacteriophage, or just phage. In bacteria, as they do in humans, viruses work by gaining access to the interior of a cell and manipulating the host’s cell machinery (i.e. enzymes, ribosomes etc) into making more copies of the virus. At a certain point, the number of copies of a virus induces the cell to burst releasing sometimes thousands of new copies of the virus, which can then go on to infect another cell and the process repeats.

Corrupting this process to fit human needs in the fight against antibiotics has actually been going on since the early days of the cold war. While the U.S. was investing in antibiotics, the Soviets were developing what is now called phage therapy. In fact in places like the country of Georgia, Russia and Poland phage therapy is still widely used today to treat infections.

One of the major benefits of phage therapy over traditional antibiotics is the specificity a phage has for its host. For the most part, a phage that infects an E. coli will not be able to infect another bacteria type, like a commensal Estafilococo. There is even some evidence that phages are strain specific meaning we can develop phages that can differentially infect pathogenic strains of E. coli (es decir. E. coli O157:H7) while leaving the healthy commensal E. coli strains alone.

Another advantage of phage therapy is that it is self-repleting. A single phage infecting a cell will produce thousands of new copies of itself that can go on to kill more bacteria. However, some point to the mechanism in which viruses kill cell, by bursting it open, presents a drawback to the treatment as it will release bacterial toxins which can lead to sepsis, a potentially deadly condition in which the immune system overreacts to dieing bacteria.

But researchers are already working up a solution to this problem. At MIT, they have developed “phagemids”: engineered phages that carry plasmids instead of a whole genome. Plasmids are short piece of circular DNA that carry a couple of genes which often code for virulence factors and/or for antibiotic resistance factors. When bacteria undergo conjugation this is generally what they share to pass around resistance genes. In a phagemid, the plasmid is encoded with genes that kill the bacteria without the cell being lysed. No lysis means those internal toxins aren’t released into the body. These scientists have already had a high degree of success treating mice for peritonitis.

Gene editing using CRISPR-Cas9 (clustered repeating interspaced short palindromic repeats) could be used to fighting bacteria. If bacteria successfully fights off infection from a phage, they save a short portion of the viruses genome in the genome. The bacteria expresses these sequences as short RNA sequences that are complementary to parts of the phage’s genome. If the bacteria becomes reinfected with the same phage, the RNA sequence binds complementary to that portion of the phages genome. Inside the cell, these RNA sequences are associated with a DNA cutting protein called Cas9, which cleave the phage genome, rendering it ineffective.

The trick with CRISPR-Cas9 is that RNA sequence can be made to be complementary to anything including bacterial resistance genes. For example, a group at Tel Aviv University has created a CRISPR-Cas9 system to target the Beta lactamase gene. This gene produces an enzyme that inactivates a wide variety of antibiotics including penicillins, cephamycins, and carbapenems. Other groups have seen excellent success targeting the genes that turn Staphylococcus aureus into MRSA.

The CRISPR sequence and the Cas9 protein will be delivered to bacteria via an engineered phage and the technique is successful at targeting both chromosomal genes and plasmid based ones. Currently, much of the research on this technique has been to re-sensitize bacteria to common antibiotics, but it is not out of the realm of possibility that CRISPR-Cas9 could be engineered to target essential bacterial genes, thus making the technique bactericidal.

The use of phages, phagemids and CRISPR-Cas9 present to us a more sophisticated and targeted way to treat infections from bacteria. However, in no way should this be thought of as a magic bullet that’s the kind of thinking that got us into trouble with antibiotics. Resistance to these techniques will happen. It is inevitable that these organisms will adapt.

Resistance to CRISPR-Cas9 in phages has already been documented in some species, so it is possible bacteria could evolve resistance to them too. Bacteria will also develop CRISPR-Cas9 systems to create a memory of the engineered phages we will use in phage therapy. But these are not reasons to abandon this technology. These should serve as a blueprint for what we should be prepared for when the day comes that resistance to our initial phage therapy options is observed. In essence, we now have the enemy’s battle plans for how they will react to our newest defense. We need to use that information to have our counter attacks waiting in the wings.


What is BAC in biology?

A bacterial artificial chromosome (BAC) is an engineered DNA molecule used to clone DNA sequences in bacterial cells (for example, E. coli). BACs are often used in connection with DNA sequencing. Segments of an organism's DNA, ranging from 100,000 to about 300,000 base pairs, can be inserted into BACs.

Likewise, how do you get bac? Making a BAC library To hacer a genomic Bacterial Artificial Chromosome (BAC) library you first tengo to isolate the cells containing the DNA you want to store. For animal and human BAC libraries the DNA normally comes from white blood cells. These isolated cells are then mixed with hot agarose, a jelly-like substance.

YAC stands for yeast artificial chromosome and BAC stands for bacterial artificial chromosomes. These are the vectors which are basically tools to insert the gene of interest in the host cell. The major difference between these two vectors is that of the insert size of the gene of interest.

Yeast artificial chromosomes (YACs) are genetically engineered chromosomes derived from the DNA of the yeast, Saccharomyces cerevisiae, which is then ligated into a bacterial plasmid. The primary components of a YAC are the ARS, centromere, and telomeres from S. cerevisiae.


Nota: It will be a very helpful if you have access to a lab with pipets, petri dishes, cotton swabs, and other common supplies. Talk to your teachers at school to obtain access.

  • Coliphage culture and titer determination study kit available from Ward's Science Notas: 1) This kit has enough supplies to go through the procedure uno tiempo. Purchase additional materials for repeat trials, which will help ensure your results are accurate and repeatable. This is an advanced procedure, so the details of how to repeat the procedure are not supplied. 2) This kit contains the strain E. coli B which is no a human pathogen and is safe to use in a classroom laboratory. Standard bacterial safety, detailed below, should still be followed.
    • Culture of E. coli B
    • Culture of T4r phage
    • Tryptic soy agar (125 mL)
    • 2-mL tubes of soft agar (6)
    • 9-mL dilution tubes (12)
    • 1- x 0.01-mL sterile pipets (12)
    • Sterile petri dishes (6)
    • Sterile swab
    • Pipet bulb
    • Tryptic soy agar
    • Soft soy agar
    • Tryptic soy broth
    • Placas de Petri

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    'Deadman' and 'Passcode' microbial kill switches for bacterial containment

    Biocontainment systems that couple environmental sensing with circuit-based control of cell viability could be used to prevent escape of genetically modified microbes into the environment. Here we present two engineered safeguard systems known as the 'Deadman' and 'Passcode' kill switches. The Deadman kill switch uses unbalanced reciprocal transcriptional repression to couple a specific input signal with cell survival. The Passcode kill switch uses a similar two-layered transcription design and incorporates hybrid LacI-GalR family transcription factors to provide diverse and complex environmental inputs to control circuit function. These synthetic gene circuits efficiently kill Escherichia coli and can be readily reprogrammed to change their environmental inputs, regulatory architecture and killing mechanism.


    Influenza and Coronavirus Demise Could Lie with Phage Nanoparticles

    Given the current global viral pandemic, it wouldn’t be difficult for most to think of viruses in only a negative context. However, over the past several years, a slew of researchers and data has come to light on the benefits of using phage viruses as therapeutic options. Now, a team of investigators led by scientists at the Leibniz-Forschungsinstitut for Molecular Pharmacology (FMP) and Humboldt University (HU) has found a new use for phage in the fight against seasonal influenza and avian flu. The researchers developed a chemically modified phage capsid that “stifles” influenza viruses. Perfectly fitting binding sites cause influenza viruses to be enveloped by the phage capsids in such a way that it is practically impossible for them to infect lung cells any longer. This phenomenon has been proven in preclinical trials using human lung tissue and is being used for the immediate investigation of coronavirus infections.

    Findings from the new study were published recently in Nature Nanotechnology through an article entitled “Phage capsid nanoparticles with defined ligand arrangement block influenza virus entry.”

    Current antiviral drugs are only partially effective because they attack viruses like influenza and coronavirus after lung cells have been infected. It would be desirable—and much more effective—to prevent infection in the first place. This is exactly what the new approach from the current study promises. The phage capsid, developed by a multidisciplinary team of researchers, envelops flu viruses so perfectly that they can no longer infect cells.

    “Preclinical trials show that we are able to render harmless both seasonal influenza viruses and avian flu viruses with our chemically modified phage shell,” explained senior study investigator Christian Hackenberger PhD, head of the department chemical biology at FMP and a professor for chemical biology at HU. “It is a major success that offers entirely new perspectives for the development of innovative antiviral drugs.”

    The new inhibitor makes use of a feature that all influenza viruses have: There are trivalent receptors on the surface of the virus, referred to as hemagglutinin protein, that attaches to sugar molecules (sialic acids) on the cell surface of lung tissue. In the case of infection, viruses hook into their victim—in this case, lung cells—like a hook-and-loop fastener. The core principle is that these interactions occur due to multiple bonds, rather than single bonds.

    It was the surface structure of flu viruses that inspired the researchers to ask the following initial question more than six years ago: Would it not be possible to develop an inhibitor that binds to trivalent receptors with a perfect fit, simulating the surface of lung tissue cells? The answer to the question lies with Q-beta phage, which has the ideal surface properties and is excellently suited to equip it with ligands—sugar molecules—as “bait.” An empty phage shell does the job perfectly.

    “We present a multivalent binder that is based on a spatially defined arrangement of ligands for the viral spike protein haemagglutinin of the influenza A virus,” the authors wrote. “Complementary experimental and theoretical approaches demonstrate that bacteriophage capsids, which carry host cell haemagglutinin ligands in an arrangement matching the geometry of binding sites of the spike protein, can bind to viruses in a defined multivalent mode. These capsids cover the entire virus envelope, thus preventing its binding to the host cell as visualized by cryo-electron tomography. As a consequence, virus infection can be inhibited in vitro, ex vivo, y en vivo.”

    Lead study investigator Daniel Lauster, PhD, a former graduate student in the Group of Molecular Biophysics (HU) and now a postdoc at Freie Universität Berlin added that “Our multivalent scaffold molecule is not infectious, and comprises 180 identical proteins that are spaced out exactly as the trivalent receptors of the hemagglutinin on the surface of the virus. It, therefore, has the ideal starting conditions to deceive the influenza virus—or, to be more precise, to attach to it with a perfect spatial fit. In other words, we use a phage virus to disable the influenza virus!”

    To enable the Q-beta scaffold to fulfill the desired function, it must first be chemically modified. Produced from E. coli bacteria, the researchers used synthetic chemistry to attach sugar molecules to the defined positions of the virus shell.

    Several studies using animal models and cell cultures have proven that the suitably modified spherical structure possesses considerable bond strength and inhibiting potential. The study also enabled the research team to examine the antiviral potential of phage capsids against many current influenza virus strains, and even against avian flu viruses. Its therapeutic potential has even been proven on human lung tissue: when tissue infected with flu viruses was treated with the phage capsid, the influenza viruses were practically no longer able to reproduce.

    Additionally, high-resolution cryo-electron microscopy and cryo-electron microscopy show directly and, above all, spatially, that the inhibitor completely encapsulates the virus. Moreover, mathematical-physical models were used to simulate the interaction between influenza viruses and the phage capsid on the computer.

    “Our computer-assisted calculations show that the rationally designed inhibitor does indeed attach to the hemagglutinin, and completely envelops the influenza virus,” confirmed study co-author Susanne Liese, PhD, professor at Freie Universität Berlin. “It was therefore also possible to describe and explain the high bond strength mathematically.”

    These findings must now be followed up by more preclinical studies. It is not yet known, for example, whether the phage capsid provokes an immune response in mammals. Ideally, this response could even enhance the effect of the inhibitor. However, it could also be the case that an immune response reduces the efficacy of phage capsids in the case of repeated-dose exposure, or that flu viruses develop resistances. And, of course, it has yet to be proven that the inhibitor is also effective in human

    “Our rationally developed, three-dimensional, multivalent inhibitor points to a new direction in the development of structurally adaptable influenza virus binders. This is the first achievement of its kind in multivalency research,” Hackenberger concluded.


    What chemicals will kill P1 Phage but not E. coli? - biología

    A major thrust of vector development has been to create vectors that will handle larger foreign DNA inserts, aiming to reduce the number of recombinants it is necessary to look at in order to identify a specific DNA sequence.

    Cosmid vectors were among the first large insert cloning vehicles developed.

    The vector replicates as a plasmid
    (it contains a ColE1 origin of replication),
    uses Amp r for positive selection and
    employs lambda phage packaging to select for recombinant plasmids carrying foreign DNA inserts 45 KB in size.

    Ligation of cosmid vector and foreign DNA fragments (SauIIIA partial digest fragments 45 kb in size) is similar to ligation into a lambda substitution vector.
    The desired ligation product is a concatemer of
    45 kb foreign DNA fragment and 5 kb cosmid vector sequences.

    This concatemer is then packaged into viral particles (remember packaging is cos site to cos site) and these are used to infect E. coli where the cosmid vector replicates using the ColE1 orignin of replication. Phage packaging serves only to select for recombinant molecules and to transfer these long DNA molecues (50 kb total) into the bacterial host (50 kb fragments transform very inefficiently while phage infection is very efficient).

    Recently, the need for prokaryotic vectors capable of replicating very large foreign DNA fragments
    (> 1 MB in size) has produced a couple of additional prokaryotic vector systems.
    One is based on another bacteriophage called P1.
    P1 phage can carry in excess of 100 KB of foreign DNA but do not seem to have found wide acceptance.

    A few years ago, a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) vector was developed allowing foreign DNA fragements over 1 MB to be propagated in E. coli.
    These BAC vectors replicate as low copy number plasmids (to minimize the demands on the host replication system) but how do we get such large DNA fragments into E. coli?

    Standard methods for transforming E coli rely on the chemical preparation of the E coli to put them in a 'transformation competent' state.
    This typically involves incubating the bacteria in the presence of divalent cations (particularly Ca +2 ) at low temperature (4 o C) which puts the cell membrane into a 'semi-crystaline state. Addition of DNA to these 'competent cells' allow the DNA to bind to the semi-crystaline membrane. Heat shocking the cells (42 o C) remobilizes the membrane and allows the DNA to cross the membrane. This transit across the membrane is sensitive to DNA length - small plasmids cross the membrane rapidly while larger molecules are unable to cross.

    Getting very large molecules across the cell membrane relies on an alternative mechanism called electroporation. This involves mixing DNA with E coli cells and then exposing the mixture to a high-voltage pulse. The high voltage induces massive membrane rearrangements and the coincident uptake of DNA which is independant of size. BACs have been an important tool for the human genome sequencing project.

    Numerous vector systems have been developed for use in eukaryotic systems.
    The most common of these are often called 'shuttle vectors' as they replicate in both prokaryotic and eukaryotic hosts. In general, DNA manipulations and characterizations are done in prokaryotic systems, and then the manipulated DNA is reintroduced to eukaryotic systems for functional analysis.

    Yeast Vectors
    Shuttle vectors were first developed for transfering DNA fragments between E coli and S cerevisiae. These vectors contain an antibiotic resistance gene for positive selection in E coli, and E coli origin of replication (ColE1 ori), and a polylinker in the lacZ alpha-complementing fragment for insertional inactivation by the foreign DNA insert. In addition, the vector contains a yeast specific origin of replication (derived from the naturally occuring yeast plasmid called the 2 um circle - 2um ori)
    and amino-acid or N-base biosynthsis enzymes for positive selection in yeast (HIS, LEU and ADE genes)

    Mammalian Vectors
    Shuttle vectors have also been developed for use in mammalian tissue culture.
    Like the yeast shuttle vectors, mammalian shuttle vectors require sequeces enabling them to replicate in mammalian tissue culture. These eukaryotic origins of replication are typically derived from well characterized mammalian viruses - most commonly SV-40 (SV-40 ori and Large T antigen system) or Epstein-Barr virus (mononucleosis). Both systems allow the vector to replicate within the host cell as a plasmid without integrating into the genome. In addition to the origin of replication, these shuttle vectors also carry antibiotic resistance genes which function in eukaryotic cells (ie neomycin (G418) resistance, hygromycin resistance, methotrexate resistance etc).

    Finally, artificial chromosome vectors have been developed for use in yeast (YACs) and are being developed for use in mammalian cells (MACs).
    These eukaryotic vectors contain telomeric sequences (eukaryotic chromsomes are linear not circular molecules) and centromeres to ensure appropriate segregation of the artificial chromosomes as well as selectable markers. Such vector systems may gain in importance as we move towards manipulating the eukaryotic genome.


    Ver el vídeo: coli Escherichia coli (Mayo 2022).