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¿Qué tan diferentes son los fibroblastos específicos de tejido entre sí?


Estoy planeando utilizar un nuevo sistema en nuestro laboratorio, en el que co-cultivaré células cancerosas de diferentes tejidos con fibroblastos. Tengo la opción de recibir fibroblastos primarios derivados de la piel. Me han dicho que los fibroblastos normales son muy similares en todo el cuerpo. ¿Es esto realmente cierto? Supongo que los fibroblastos secretan factores, por ejemplo, que son específicos de tejido. La pregunta es, ¿con qué rapidez se adaptan a un nuevo entorno? Por ejemplo, si tomo estos fibroblastos derivados de la piel y los cocultivo con células de cáncer de mama, ¿cuánto tiempo tardarán los fibroblastos, si los hay, en parecerse más a los fibroblastos derivados de la mama?


Me han dicho que los fibroblastos normales son muy similares en todo el cuerpo. ¿Es esto realmente cierto?

No.

Hay pruebas contundentes que indican que los fibroblastos en diferentes partes del cuerpo son intrínsecamente diferentes, y puede haber diferencias entre ellos incluso en una sola región [3].

Tienen similitudes morfológicas, pero actúan de manera diferente (al menos en las culturas):

El examen de fibroblastos de piel y pulmón derivados de los mismos fetos humanos reveló diferencias significativas in vitro. Los cultivos de pulmón fetal tenían tasas de replicación celular más rápidas, mayor incorporación de [$ ^ 3H $] timidina en el ADN, mayor número de células en la confluencia, volúmenes celulares más pequeños, menor contenido de ARN celular y proteínas y una mayor vida útil in vitro en comparación con los cultivos de piel fetal. Además, estos cultivos celulares tuvieron diferentes respuestas a la adición de hidrocortisona a los medios de cultivo [1].

Difícilmente se adaptan a un suero diferente (in vitro) [2]. Sin embargo, tienen una gran capacidad para diferenciar (en vivo):

[…] Los fibroblastos también parecen ser las más versátiles de las células del tejido conectivo, mostrando una notable capacidad para diferenciarse en otros miembros de la familia. […] Los fibroblastos "maduros" con una menor capacidad de transformación pueden, por ejemplo, coexistir con fibroblastos "inmaduros" (a menudo llamados células mesenquimales) que pueden convertirse en una variedad de tipos de células maduras [3].


Referencias:

  1. E.L. Schneider, Y. Mitsui, K.S. Au, S. Stuart Shorr. Diferencias específicas de tejido en fibroblastos diploides humanos cultivados. Investigación celular experimental. Volumen 108, Número 1, agosto de 1977, páginas 1-6. DOI 10.1016 / S0014-4827 (77) 80002-5
  2. Zamansky, GLEN B. y col. "Adaptación de fibroblastos diploides humanos in vitro a suero de diferentes fuentes". Revista de ciencia celular 61.1 (1983): 289-297.
  3. Alberts B, Johnson A, Lewis J y col. Biología molecular de la célula. 4ª edición. Nueva York: Garland Science; 2002. Fibroblastos y sus transformaciones: la familia de células de tejido conectivo. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26889/

Abstracto

Fondo

Los fibroblastos son las principales células del estroma que existen en órganos completos y desempeñan funciones vitales en muchos procesos biológicos. Aunque se ha estimado la diversidad funcional de los fibroblastos, no se ha realizado un análisis completo de los fibroblastos de todo el cuerpo y su diversidad transcripcional no se ha explorado suficientemente. El objetivo de este estudio fue dilucidar la diversidad transcripcional de los fibroblastos humanos en todo el cuerpo.

Métodos

El análisis de la expresión génica global se realizó en 63 fibroblastos primarios humanos de 13 órganos. De estos, 32 fibroblastos de órganos gastrointestinales (fibroblastos gastrointestinales: GIF) se obtuvieron de un par de 2 sitios anatómicos: la capa submucosa (fibroblastos submucosos: SMF) y la capa subperitoneal (fibroblastos subperitoneales: SPF). Utilizando el análisis de agrupamiento jerárquico, aclaramos subgrupos identificables de fibroblastos y analizamos el carácter transcripcional de cada subgrupo.

Resultados

En agrupaciones no supervisadas, se observaron 2 agrupaciones principales que separan GIF y no GIF. También se observaron agrupaciones dependientes de órganos y sitios anatómicos dentro de GIF. Los genes característicos que discriminaban GIF de no GIF, SMF de SPF y los fibroblastos de un órgano de otro órgano consistían en genes asociados con la regulación transcripcional, ligandos de señalización y remodelación de la matriz extracelular.

Conclusiones

Los GIF son fibroblastos característicos con expresiones génicas específicas de la regulación transcripcional, ligandos de señalización y genes relacionados con la remodelación de la matriz extracelular. Además, también se descubrió la diversidad dependiente de órganos y sitios anatómicos de los GIF. Estas características de los GIF contribuyen a su función fisiológica específica y al mantenimiento homeostático, y crean una diversidad funcional del tracto gastrointestinal.

Citación: Higuchi Y, Kojima M, Ishii G, Aoyagi K, Sasaki H, Ochiai A (2015) Los fibroblastos gastrointestinales tienen fenotipos transcripcionales diversos y especializados: un análisis completo de la expresión genética de fibroblastos humanos. PLoS ONE 10 (6): e0129241. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0129241

Editor académico: Mathias Chamaillard, INSERM, FRANCIA

Recibió: 19 de enero de 2015 Aceptado: 6 de mayo de 2015 Publicado: 5 de junio de 2015

Derechos de autor: © 2015 Higuchi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia de atribución Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se acredite el autor y la fuente originales.

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes, excepto los datos de microarrays sin procesar, están dentro del documento y sus archivos de información de respaldo. El número de acceso de datos de microarrays es GSE63626, que está disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE63626.

Fondos: Este trabajo fue apoyado por: Subvenciones para Investigación en Ciencias del Trabajo y Salud, número de subvención 26270601 (Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, [http://www.mhlw.go.jp/: MK]) y una subvención para un tercer período Subvención de la Estrategia decenal para el control del cáncer número 23-A-3 (Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, [http://www.mhlw.go.jp/: AO]). Los patrocinadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.


Fondo

Los fibroblastos se han considerado durante mucho tiempo como células estructurales bastante simples que contribuyen a la matriz extracelular (MEC) en los tejidos conectivos y son responsables de la reparación del tejido durante la cicatrización de heridas. En los últimos años, sin embargo, se ha reconocido que estas células también juegan un papel importante en otros procesos, pudiendo ejercer una influencia significativa en todo tipo de células de su entorno. Por lo tanto, ahora parece evidente que los fibroblastos son actores decisivos en los procesos inflamatorios, ya que modulan las actividades de los leucocitos al secretar moléculas de señalización específicas en los sitios de inflamación [1]. Es importante destacar que los fibroblastos parecen ser responsables de la terminación de las respuestas inmunitarias o, alternativamente, del cambio de inflamación aguda a crónica [2, 3]. Durante la inflamación aguda, las células inmunitarias se reclutan y expanden en el tejido dañado. En condiciones fisiológicas normales, los mecanismos de control evitan sobreestimular estas células. De este modo, los fibroblastos desempeñan un papel importante al liberar señales de regulación inmunológica que promueven la eliminación de células inmunitarias muertas o redundantes. La inflamación crónica puede ocurrir cuando estos mecanismos de depuración fallan. Esto puede suceder cuando los fibroblastos inhiben los procesos apoptóticos al producir citocinas de supervivencia o retienen las células inmunitarias mediante la liberación de quimiocinas específicas [2]. Los procesos de inflamación crónica también están involucrados en enfermedades como la fibrosis y el cáncer. Se han demostrado los efectos reguladores de los fibroblastos sobre el desarrollo y la progresión de la fibrosis y el cáncer [4-8]. La reorganización de la ECM por fibroblastos juega, por tanto, un papel importante. En los tumores, además, las interacciones entre los fibroblastos y las células tumorales parecen ser esenciales para el crecimiento y la progresión del tumor. Estas interacciones están mediadas por factores de señalización solubles como factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas y productos lipídicos, o por la comunicación directa de las células a través de las integrinas [9]. Las enzimas que degradan la ECM, como las metaloproteinasas de la matriz (MMP), producidas por fibroblastos, contribuyen a la degradación y remodelación del entorno tumoral, lo que favorece la progresión tumoral, incluidas la angiogénesis, la invasividad y la metástasis [10].

Hoy en día parece claro que los fibroblastos no solo están involucrados en problemas estructurales, sino que también son actores importantes en los procesos fisiopatológicos. Sin embargo, quedan muchas preguntas sin respuesta. Por lo tanto, la caracterización de diferentes subtipos de fibroblastos, incluidos sus perfiles de expresión en estados celulares inactivados, así como activados y relacionados con la enfermedad, todavía no se evalúa claramente. Hasta ahora no se han establecido marcadores selectivos y células con morfología fusiforme, que en-vitro se adhieren sobre artículos de plástico, y además tienen fenotipos no linfoides, no endoteliales y no epiteliales, generalmente se consideran fibroblastos [1]. Por lo tanto, se han realizado algunos intentos para caracterizar mejor estas células [4, 11, 12]. Sin embargo, los resultados de estas investigaciones están planteando nuevos interrogantes. En efecto, parece que existen más subtipos de fibroblastos diferentes de lo esperado [13]. Algunos investigadores incluso afirman definir nuevos tipos de células y señalan el hecho de que los fibroblastos de diferentes sitios anatómicos muestran diferencias que son comparables a las observadas entre diferentes linajes de leucocitos [14]. No se puede excluir la posibilidad de que múltiples subtipos estén co-localizados en una sola ubicación. Además, el origen de los fibroblastos en un sitio específico no se puede determinar con precisión. Pueden surgir del mesénquima primario o, alternativamente, de células precursoras derivadas de la MO, o de la transición local epitelial-mesenquimal (EMT) [6, 15]. El conocimiento sobre moléculas marcadoras específicas, que podrían distinguir entre fibroblastos de diferentes sitios anatómicos, así como entre fibroblastos en diferentes estados funcionales o relacionados con la enfermedad, contribuiría enormemente a la comprensión de los mecanismos fisiopatológicos. Además, en el cáncer, la mortalidad a menudo se relaciona con metástasis distantes que ocurren más bien como etapas tardías de la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, se necesitan con urgencia marcadores de cáncer tempranos para permitir tratamientos rápidos antes de que se desarrollen formas agresivas de cáncer. Estos primeros marcadores de enfermedad podrían encontrarse en el microambiente estromal alterado del tumor, cuyos principales contribuyentes son los fibroblastos. La caracterización de fenotipos exactos de fibroblastos normales y activados y relacionados con la enfermedad sería de particular importancia en este contexto. Como diferentes funcionalidades van acompañadas de la síntesis o regulación positiva de proteínas específicas, pueden revelarse mediante experimentos de expresión o de perfiles de proteomas.

El objetivo de este estudio fue contribuir a la caracterización proteómica de fibroblastos de diferentes sitios anatómicos y en diferentes estados celulares funcionales y relacionados con la enfermedad. Se generaron perfiles de proteoma de fibroblastos de pulmón humano normal y se compararon con los obtenidos previamente a partir de piel primaria y fibroblastos de BM. El objetivo era encontrar firmas de proteoma características para estas células. Además, las mismas células se trataron de forma inflamatoria utilizando IL-1β, con el fin de descubrir alteraciones del proteoma específicas de función. Finalmente, en un último paso nos propusimos determinar los estados funcionales de los fibroblastos asociados a tumores a partir de tejidos análogos. Por un lado, se analizó el perfil del proteoma de los fibroblastos asociados al cáncer de pulmón. Por otro lado, se utilizaron datos proteómicos previamente publicados obtenidos del análisis de fibroblastos relacionados con el melanoma y por tanto representativos de los fibroblastos cutáneos asociados al cáncer, así como fibroblastos obtenidos de pacientes con mieloma múltiple, un tumor de células plasmáticas de la MO [16, 17]. Además, los resultados obtenidos de nuestras investigaciones anteriores sobre fibroblastos asociados al CHC [18] se incluyeron en el presente estudio para análisis comparativos. El objetivo era responder a las preguntas si los fibroblastos asociados a tumores manifiestan un estado de células inflamatorias activadas y si los fibroblastos relacionados con diferentes cánceres pueden revelar similitudes con respecto a sus perfiles de proteomas.


Resultados y discusión

Un tipo de tejido

Los genes MRPL19, PSMC4, SF3A1, PUM1, ACTB y GAPD se analizaron mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real. Se midieron los números de copias iniciales de los seis genes candidatos de mantenimiento en 80 muestras de tumores de mama primarios. Los datos están disponibles como archivo de datos adicional 1 con la versión en línea de este artículo. Los gráficos de los niveles de expresión en bruto y en escala logarítmica (todos los logaritmos en este artículo son logaritmos de base natural (e)) se muestran en la Figura 1. Las muestras de tumores de mama se ordenan de acuerdo con la media de los niveles de expresión logarítmica de todos los genes . Es evidente a partir de la gráfica que para los datos brutos, la variabilidad de las mediciones dentro de la muestra aumenta con la expresión media, mientras que la variabilidad permanece aproximadamente igual para todas las muestras con la transformación logarítmica. Además, la transformación logarítmica nos permite modelar los cambios de pliegue en los niveles de expresión de forma aditiva.

Los niveles relativos de expresión determinados por RT-PCR cuantitativa en tiempo real se muestran para 6 genes ama de llaves en 80 tumores de mama. El panel superior muestra los datos sin procesar y el panel inferior muestra una escala logarítmica de los datos.

Para seleccionar las mejores amas de casa para normalizar los datos en un solo tipo de tejido, probamos tres variaciones de un modelo (Modelo 1, a-c) con datos de RT-PCR cuantitativos en tiempo real generados a partir de muestras primarias de mama (consulte Materiales y métodos para obtener más detalles).

Modelo 1a

Modelamos la expresión y ijdel gen j en la muestra I por

Iniciar sesión y ij= μ + T I+ GRAMO j+ ε ij, dónde ε ij

dónde μ es la expresión media general (log-), T Ies la diferencia de la Ia muestra de tejido del promedio general y GRAMO jes la diferencia de la jth gen del promedio general. La característica clave de este modelo que lo diferencia de un modelo ANOVA tradicional es que permite que los errores heteroscedásticos tengan en cuenta la variabilidad diferente en los genes [17]. La variabilidad en torno a la expresión logarítmica media específica del gen μ + T I+ GRAMO jse cuantifica por la desviación estándar del error σ j. Se utilizó el criterio de información bayesiano (BIC) para evitar sobreajustar los datos [18]. El modelo 1a tuvo el mejor valor BIC y se seleccionó de una gama de modelos competidores que incluían un método con variaciones de error iguales (Modelo 1b en Materiales y métodos) y un método más complejo con errores correlacionados (Modelo 1c en Materiales y métodos).

Utilizando el Modelo 1a, se determinaron las desviaciones estándar para seleccionar los mejores genes de control para el cáncer de mama. La Tabla 1 muestra que MRPL19 tiene la menor variabilidad entre las muestras de cáncer de mama y sería la mejor opción para un solo control de ama de llaves. Aunque algunos de los intervalos de confianza se superponen, una comparación directa entre los genes seleccionados de la micromatriz (MRPL19, PSMC4, PUM1, SF3A1) a las clásicas amas de casa (GAPD y ACTB) muestra una diferencia significativa (pag = 0.0014).

Como aún se desconoce la función biológica de muchos genes, es difícil predecir cómo las diferentes condiciones experimentales pueden afectar la expresión de genes de ama de llaves putativos. Por lo tanto, un enfoque más seguro es utilizar una expresión promedio de varios genes que muestran una pequeña variación entre las condiciones. Sobre la base del modelo seleccionado, se puede calcular la estimación de la varianza del promedio logarítmico de la expresión de varios genes (consulte Materiales y métodos para obtener más detalles). La Tabla 2 muestra las desviaciones estándar del promedio logarítmico del mejor conjunto de genes para cada tamaño de conjunto posible (es decir, 1-6). Estos valores de desviación estándar son aproximadamente iguales al coeficiente de variación en la escala original. De las estimaciones, el conjunto de cuatro genes de PSMC4, MRPL19, PUM1 y SF3A1 proporciona la variabilidad general más baja al elegir una combinación de genes. Sin embargo, este conjunto de cuatro genes es apenas diferente de la combinación de tres genes de MRPL19, PUM1 y PSMC4, que a su vez es mucho mejor que la mejor combinación de dos genes. Por economía y porque SF3A1 tenía una variabilidad individual relativamente alta en comparación con otros en el conjunto, nuestra elección para el conjunto de normalización es la media geométrica de las expresiones de MRPL19, PUM1 y PSMC4.

Estos hallazgos ilustran la importancia de realizar una búsqueda imparcial y en todo el genoma de las amas de llaves en lugar de confiar en los genes tradicionales de las amas de llaves. Usamos datos de microarrays para seleccionar genes con baja variabilidad en la expresión en tumores de mama y líneas celulares. Debido a que las diferencias cuantitativas entre las plataformas de microarrays y RT-PCR son relativas, los genes con baja variabilidad en la expresión entre tumores por microarrays también deberían mostrar una baja variabilidad en la expresión por RT-PCR. Aunque los datos cuantitativos de los microarrays tienden a tener un rango dinámico general más pequeño en comparación con la RT-PCR, esto se debe principalmente a la pérdida de información de los genes expresados ​​en niveles bajos. Nuestro conjunto de datos de microarrays se filtró para eliminar genes con señales cercanas al ruido de fondo.

El resultado es muy similar usando Vandesompele et al.'s METRO método de valor, con sólo las posiciones de PUM1 y PSMC4 cambio de rango de estabilidad. Cabe señalar que el METRO-El método de valor no ordena los dos mejores genes (MRPL19 y PSMC4). Su mejor enfoque de selección de conjuntos de genes sugeriría usar el promedio (en escala logarítmica) de estos dos mejores genes como control. Tal concordancia no es sorprendente dada la estrecha relación entre los METRO valor y nuestro modelo utilizando la variabilidad del promedio de varios genes (ver Materiales y métodos para más detalles). Un beneficio de nuestro enfoque es la capacidad de comparar la variabilidad de genes individuales con la de un promedio de varios genes.

Múltiples tipos de tejidos

Los genes con una variación mínima en la expresión a través de diferentes tipos de células sirven como buenos amas de llaves "universales". Un control universal puede ser un solo gen o una combinación de genes. Mientras que el primero debe mostrar una baja variabilidad dentro de un tipo de tejido dado y niveles basales consistentes de expresión entre los tipos de tejido, el último puede comprender un conjunto de genes con niveles de expresión basal individualmente diferentes, pero complementarios, entre los tipos de tejido.

Para probar nuestros modelos para seleccionar amas de casa universales, utilizamos datos publicados de Vandesompele et al. [13]. Midieron el nivel de expresión de 10 genes en líneas celulares de neuroblastoma (NB), fibroblastos normales cultivados (FIB), leucocitos normales (LEU) y células de médula ósea normal (BM). Además, también se perfilaron tejidos normales de órganos agrupados (mama, cerebro, cerebro fetal, corazón, riñón, útero, pulmón, tráquea e intestino delgado). En la Figura 2 se muestra un diagrama de estas amas de casa a través de los diferentes tejidos. Es notable que un gen puede tener una expresión estable dentro de un tipo de tejido dado, pero puede cambiar la posición de rango en comparación con otras amas de casa a través de los tejidos. Por ejemplo, GAPD tiene una expresión relativamente alta en fibroblastos en comparación con otras amas de casa, pero una expresión baja en leucocitos. Por lo tanto, GAPD puede ser un buen ama de llaves dentro de ciertos tipos de tejidos, pero puede que no sea un ama de llaves universal óptimo a menos que se use dentro de un conjunto de genes complementarios.

Conjunto de datos de Vandesompele et al. [13] en escala logarítmica que muestra los niveles de expresión de 10 genes de ama de llaves putativos por muestra y tipo de tejido. Los tipos de tejido analizados incluyeron médula ósea normal (MO), fibroblastos normales cultivados (FIB), leucocitos normales (LEU), líneas celulares de neuroblastoma (NB) y tejido normal combinado de mama, cerebro, cerebro fetal, corazón, riñón, útero, pulmón , tráquea e intestino delgado (PISCINA).

Modelo 2

Para comparar el desempeño de las amas de llaves dentro y entre diferentes tejidos, hicimos un Modelo 2 (ver Materiales y métodos para más detalles) que modela la expresión de genes j en el Ia muestra de tipo de tejido k por

Iniciar sesión y yo (k) j= μ + C k+ T yo (k)+ GRAMO j+ (CG) kj+ ε yo (k) j, dónde ε yo (k) j

dónde μ denota la expresión media general (log-), C kes la diferencia de la kel tipo de tejido del promedio general, TI(k) es el efecto específico de la Ia muestra de tipo de tejido k, GRAMO jes la diferencia de la jth gen del promedio general y (CG) kjes el efecto específico del tipo de tejido del gen j. La variabilidad en el cálculo proviene de dos fuentes: el gen específico (σ j) y el tipo de tejido (ς k). Las estimaciones de estos parámetros se dan en la Tabla 3. El gen único con la variabilidad más baja general dentro de cada tipo de tejido es GAPD, seguido de cerca por UBC (ubiquitina C), HPRT1 (hipoxantina fosforribosiltransferasa 1) y YWHAZ (proteína de activación de tirosina 3-monooxigenasa / triptófano 5-monooxigenasa, polipéptido zeta). Este resultado se correlaciona estrechamente con Vandesompele et al.enfoque de. Es decir, los cinco genes principales tienen exactamente el mismo orden cuando clasificamos los genes dentro de cada tipo de tejido de acuerdo con su METRO-valor. Aquí asignamos un rango de 1.5 al mejor par desordenado y luego promediamos los rangos para obtener un orden general de los genes.

El riesgo de normalizar los datos a un gen de ama de llaves con un nivel de expresión general variable en diferentes tejidos se puede representar matemáticamente como error de sesgo. Un ama de llaves que tiene un sesgo bajo para un tejido en particular tiene un nivel de expresión que está cerca de su expresión media en los tejidos. En nuestro segundo modelo, el término (CG) kjrepresenta este sesgo específico del tipo de tejido. La medida de variabilidad alrededor de un valor pretendido cuando hay sesgo se denomina error cuadrático medio (MSE): MSE = sesgo 2 + varianza. Por lo tanto, para encontrar un conjunto de genes para la normalización en los distintos tipos de tejido, utilizamos un criterio minimax MSE: minimizar el MSE más grande de la combinación. La Tabla 4 proporciona una lista del mejor conjunto de genes de cada tamaño junto con el valor minimax-MSE. A pesar de que GAPD tiene una variabilidad general relativamente baja dentro de cada tipo de tejido, su expresión basal cambia entre los tipos de tejido, lo que lo convierte en una mala elección para un único control universal. Los datos muestran que RPL13A (proteína ribosomal L13a) es el mejor ama de llaves universal, pero está claro que ningún gen es óptimo para un ama de llaves universal. En realidad, la elección de todos los candidatos proporciona el MSE más pequeño, lo que no es sorprendente ya que el conjunto de los 10 genes es imparcial por definición. Para la aplicación de rutina, es razonable limitar el número de genes de control, ya que el costo de analizar genes adicionales necesita equilibrar la precisión adicional obtenida. Teniendo esto en cuenta, es instructivo observar que el conjunto de tres miembros de HPRT1, RPL13A y UBC es una excelente opción porque mantiene una clasificación de prioridad incluso cuando la selección está abierta a incluir conjuntos de cuatro o cinco elementos. Los genes ama de llaves que probamos mediante RT-PCR en muestras de tumores de mama no se analizaron en otros tipos de tejidos y, por lo tanto, no pudieron evaluarse como controles universales. Sin embargo, es probable que nuestros resultados en el tejido mamario se mantengan en otros tipos de tejido, ya que nuestros genes se seleccionaron inicialmente a partir de datos de microarrays que incluían 17 líneas celulares diferentes y diversas, así como tumores de mama primarios [19].

La Figura 3 muestra el MSE de cada gen desglosado en los componentes de varianza y sesgo al cuadrado. La dirección de cada barra muestra el signo del sesgo. Es evidente que el gran sesgo domina los grandes valores de MSE. El uso de la media (logarítmica) de varios genes tiende a reducir la varianza, debido al efecto de la reducción del sesgo donde los sesgos opuestos se anulan entre sí. Por ejemplo, ambos ACTB y TBP (Proteína de unión a la caja TATA) tienen un gran sesgo en las muestras normales agrupadas, pero en direcciones opuestas. El error cuadrático medio del promedio (log-) de ACTB y TBP en estas muestras es solo 0.35, que es mucho más bajo que sus MPE individuales por encima de 6.

Error cuadrático medio (MSE) de cada gen por tipo de tejido. El signo está determinado por la dirección del sesgo. El MSE se divide en los componentes que contribuyen al sesgo al cuadrado (Sesgo 2) y la varianza (Sigma 2). Conjunto de datos de Vandesompele et al. [13]. Los tipos de tejido analizados incluyeron médula ósea normal (MO), fibroblastos normales cultivados (FIB), leucocitos normales (LEU), líneas celulares de neuroblastoma (NB) y tejido normal combinado de mama, cerebro, cerebro fetal, corazón, riñón, útero, pulmón , tráquea e intestino delgado (PISCINA).

En resumen, hemos modelado el desempeño de las amas de casa putativas para probar su bondad de ajuste al servir como controles de normalización para la cuantificación de inserción relativa. Una ventaja importante de un enfoque de modelo es que los términos se colocan dentro de un marco estadístico sólido y no ad hoc, lo que permite generalizar el algoritmo a una variedad de condiciones experimentales diferentes. Los genes y algoritmos que hemos seleccionado para la normalización deberían tener una amplia utilidad para el diagnóstico y la investigación.


Discusión

Los datos de venerables estudios de isoenzimas muestran que la compensación de la dosis en las hembras XX se logra mediante la inactivación de un cromosoma X en mamíferos marsupiales y euterios. Sin embargo, a diferencia de la inactivación aleatoria de X en humanos y ratones, se encontró que XCI era paterno en todas las especies marsupiales y en todos los loci probados. La observación de que algunos genes del X paterno se expresan total o parcialmente a nivel de proteína en algunos tejidos de canguro llevó a la conclusión de que el XCI marsupial es incompleto y específico de tejido (revisado en [19]). Es difícil generalizar estos hallazgos a todo el cromosoma X u otros marsupiales, porque los resultados se basan en solo tres genes que eran polimórficos en solo una o unas pocas especies de marsupiales (sin incluir nuestro canguro modelo, el ualabí de Tammar).

La disponibilidad de un mapa físico robusto del cromosoma X de tammar [31], y de la secuencia de ADN de tammar (proyecto del genoma de tammar, en preparación), nos permitió construir un mapa de actividad del cromosoma X completo en fibroblastos del ualabí de tammar para probar la generalidad de los datos antiguos y explorar cuestiones destacadas sobre el control del XCI marsupial a nivel molecular. Usamos qPCR para comparar el nivel de expresión de varios loci transmitidos por X en fibroblastos derivados de machos y hembras, y encontramos que la proporción hembra: macho era diferente para diferentes genes, pero que la mayoría de los genes se expresaban más en hembras que en machos. .

Nuestros hallazgos más sorprendentes se realizaron utilizando RNA-FISH para cuantificar la inactivación en una base celular individual. Este método proporcionó información única en una especie en la que se han identificado pocos polimorfismos en genes transmitidos por X. El RNA-FISH fue extremadamente eficaz en todos los loci, detectando la expresión de 94 a 99% de loci en células masculinas.

Marsupial XCI está regulado a nivel transcripcional

Las investigaciones de inactivación a nivel de proteínas dejaron abierta la cuestión de si XCI en marsupiales estaba a nivel transcripcional, como en euterios [32]. El presente estudio muestra que el control de XCI se ejerce a nivel transcripcional también en marsupiales, ya que RNA-FISH reveló que la mayoría de los núcleos femeninos mostraban sólo una única señal típica de las células activas 1X. Este resultado se confirma por la ausencia de ARN polimerasa del cromosoma X inactivo (Chaumeil J, Waters PD, Koina E, Gilbert C, Robinson TJ & amp Graves JAM, presentado).

La expresión de un cromosoma X se controla de forma coordinada

La coubicación de señales de genes vecinos en experimentos de ARN-FISH de fibroblastos femeninos nos llevó a concluir que los genes se transcriben de forma coordinada a partir del mismo cromosoma X activo. Por ejemplo, encontramos que STAG2 y PSMD10 se coexpresaron en todos los núcleos que mostraron una expresión activa única para cada locus, lo que demuestra que los genes ubicados muy juntos en el mismo X se expresan de forma coordinada. Las comparaciones por pares usando diferentes combinaciones de otros genes mostraron que todos los genes probados eran activos en el mismo cromosoma X activo, Xa. No tenemos forma de determinar el origen parental de este cromosoma activo, pero todas las investigaciones previas sobre poblaciones de células han demostrado que el alelo materno siempre se expresa, y el alelo inactivo siempre proviene del X paterno. Por lo tanto, concluimos que todos los alelos en los X maternos se expresan en todas las células.

La expresión de Xi es incompleta y específica del locus

Usamos ARN-FISH para examinar la expresión de loci distribuidos a lo largo del cromosoma X de tammar wallaby. Descubrimos que todos los genes escaparon de la inactivación hasta cierto punto, el porcentaje de escape de la inactivación (es decir, el porcentaje de células activas 2X) para diferentes genes varió entre el 5 y el 68%. Cada locus muestra una frecuencia de escape diferente, consistente entre animales, lo que implica que el escape es específico del locus. Este escape parcial, específico del locus, confirmó la indicación preliminar de los datos de qPCR de que la proporción mujer: hombre de la transcripción del gen X variaba desde la compensación completa de la dosis hasta el escape completo. Esto amplía enormemente los hallazgos de los estudios de isoenzimas que los padres PGK1 y G6PD se expresan en parte en fibroblastos canguro [28, 33].

El escape del marsupial XCI es estocástico

Los primeros estudios de inactivación parcial a nivel de proteínas [34] incluyeron la demostración de que los clones de células individuales mantenían el mismo nivel de expresión paterna que la población completa. Esto se interpretó en el sentido de que la expresión parcial equivalía a una regulación negativa uniforme de la expresión del alelo paterno en todas las células. Nuestra qRT-PCR de relaciones de expresión de mujeres: hombres también indicó grados variables de silenciamiento transcripcional en células femeninas. Sin embargo, ninguna técnica aplicada a poblaciones de células puede distinguir entre expresión parcial debido a la regulación a la baja de la transcripción de Xi en cada célula, o de diferentes frecuencias de células con expresión activa 1X y activa 2X.

Nuestra capacidad para detectar la transcripción a nivel de un solo núcleo utilizando RNA-FISH nos permitió, por tanto, descubrir que el control no se ejerce por la regulación a la baja del alelo paterno en todas las células, como se esperaba. Más bien, el nivel general de transcripción está regulado por la frecuencia de núcleos en los que se expresa el alelo del X inactivo. La regulación parece ser un proceso estocástico (probabilístico) ya que diferentes genes muestran una frecuencia característica de núcleos activos 2X y 1X activos en una población de fibroblastos de la misma hembra.

Una interpretación alternativa es que el control de la inactivación de X se ejerce mediante la regulación a la baja de la transcripción de Xi en cada célula, pero este bajo nivel de transcripción no es detectado por RNA-FISH. Sin embargo, consideramos que esto es poco probable porque RNA-FISH detecta la transcripción en casi el 100% de los loci en las células masculinas, y DNA-FISH detecta dos loci en casi todas las células femeninas. De hecho, RNA-FISH es más sensible que DNA-FISH, en el que se pueden detectar moléculas individuales en núcleos en interfase.

Además, encontramos que los genes ubicados muy juntos en el Xi generalmente se expresaban en diferentes frecuencias y en las proporciones esperadas de escape independiente de la inactivación. Esto implica que las probabilidades de transcripción de diferentes loci en el X inactivo están reguladas de forma independiente.

Por lo tanto, proponemos que la regulación del escape de XCI en marsupiales equivale al control de la probabilidad de expresión de un locus en Xi, en lugar de la cantidad de expresión del locus. Por lo tanto, la expresión de genes en el marsupial X inactivo está bajo un tipo de control epigenético previamente insospechado, quizás involucrando factores reguladores específicos del locus que causan cambios locales o regionales en la organización de la cromatina que determinan la probabilidad de que se transcriba un gen en el X paterno.

Esta regulación estocástica de XCI marsupial parece ser bastante diferente del control de XCI en ratones y humanos. Sin embargo, aunque los aspectos moleculares de XCI se han estudiado en detalle durante los últimos 50 años, no se han publicado datos de ARN-FISH comparables para XCI en euterios, y sigue siendo posible que el escape de genes en el X humano inactivo sea estocástico. Sería muy instructivo estudiar la distribución celular de núcleos activos 1X y 2X para genes que escapan parcialmente a la inactivación en el X humano.

La inactivación del marsupial X no muestra polaridad de un centro de inactivación

Construimos un mapa de actividad del ualabí de tammar X inactivo (presumiblemente paterno) para determinar si había polaridad en la frecuencia de expresión. No observamos correlación entre la ubicación del gen y la frecuencia con la que se expresaba el alelo en Xi. Por lo tanto, no hay evidencia de la polaridad que se hipotetizó [19] para revelar un centro de inactivación desde el cual podría emanar el control del cromosoma X completo. Los genes que son en gran parte inactivos no se agruparon, ni tampoco los genes que escaparon en gran medida a la inactivación.

Además, no encontramos correlación entre la expresión de Y y la compensación de dosis de los parálogos X. La mayor frecuencia de escape se observó para ATRX (60%) y el más bajo para RBMX (7%), ambos genes con parálogos Y que no se expresan en fibroblastos

RNA-FISH tiene la ventaja de que proporciona información sobre células individuales; sin embargo, no es cuantitativo y la intensidad de la señal no se correlaciona con el nivel de expresión. Estudios independientes sobre genes marsupiales transmitidos por Y utilizando qPCR muestran que los parálogos Y muestran una expresión específica de testículo o se expresan mucho más débilmente que sus socios X [35, 36] (Murtagh VJ, Sankovic N, Delbridge ML, Kuroki Y, Boore JL , Toyoda A, Jordan KS, Pask AJ, Renfree MB, Fujiyama A, Graves JAM & amp Waters PD, enviado).

Estos diferentes perfiles de expresión de parálogos transmitidos por X e Y, junto con una conservación de la secuencia XY baja (Murtagh VJ, Sankovic N, Delbridge ML, Kuroki Y, Boore JL, Toyoda A, Jordan KS, Pask AJ, Renfree MB, Fujiyama A, Graves JAM & amp Waters PD, presentado), sugiere que los genes Y tienen una función diferente o disminuida en comparación con la de sus socios X. Por tanto, es poco probable que el escape de estos genes de XCI sea el resultado de la complementación de un locus Y activo.

De hecho, la única característica que une los genes X marsupiales con una alta frecuencia de escape de la inactivación X es que sus ortólogos humanos se encuentran juntos en Xq22. Quizás esto refleje su disposición original en un therian X ancestral hace 145 millones de años, en una posición en la que la degradación de Y ocurrió más tarde y, por lo tanto, XCI sigue siendo menos completo.

Por lo tanto, el XCI marsupial se controla de una manera bastante diferente a la del humano y el ratón X. En euterios, XCI es un fenómeno X completo, en el que los dominios de actividad están controlados de manera coordinada por un centro de inactivación que contiene el XIST gene. El control independiente de la expresión de los loci en el X inactivo es consistente con la ausencia de un XIST gen del marsupial X [23, 24, 37].

Tolerancia a las diferencias de dosis.

El XCI se considera ampliamente como un mecanismo vital que asegura una compensación de dosis adecuada entre machos XY y hembras XX, y los resultados iniciales de estudios más antiguos de XCI en humanos y ratones indicaron que, con raras excepciones, los genes del Xi estaban completamente inactivos. Esta estricta adherencia a la equivalencia de dosis concuerda con las observaciones de los efectos desastrosos de las monosomías de una región autosoma o autosómica en pacientes humanos. Por tanto, puede parecer sorprendente que la compensación de dosis para muchos loci transmitidos por X sea incompleta o ausente en los fibroblastos marsupiales.

Sin embargo, ahora sabemos que muchos genes del cromosoma X humano escapan de la inactivación [38], particularmente en el brazo corto, que fue una adición relativamente reciente a los cromosomas X e Y [39-41]. Incluso en el ratón X, que parece representar un estado de inactivación casi completa, algunos genes se expresan a partir del Xi.Los primeros genes en el X humano que demostraron ser 2X activos fueron los que retuvieron parejas en el cromosoma Y [42], lo que sugiere que sus parejas Y son (o estaban hasta hace poco) activas y complementan la función de los genes X, que por lo tanto no necesitan compensación de dosis. De hecho, algunos de los genes que estudiamos con parálogos en el cromosoma Y escapan a XCI en el marsupial X (ATRX, UBA1) sin embargo, al menos algunos parálogos de Y (por ejemplo, UN INTENTO) son testículos específicos y no se complementan. Además, otros genes marsupiales X con un compañero Y, como RBMX, PHF6X y HUWE1X, no escapen a la inactivación.

Quizás, entonces, la compensación de la dosis no sea tan crítica para el desarrollo y la función como habíamos supuesto. Esta conclusión está respaldada por la evidencia reciente de que el cromosoma Z de las aves está compensado solo parcialmente, los 934 genes en el Z muestran un rango de relaciones de dosificación macho: hembra entre 1.0 y 2.0 [4, 43], y la demostración de que los cinco X los cromosomas del ornitorrinco (relacionados con el ave Z y que juntos representan más del 12% del genoma) parecen compartir esta característica.

Puede ser que los genes que requieren una compensación completa sean especialmente sensibles a los efectos de la dosis porque los cambios en su dosis se propagan a través de numerosas redes de genes posteriores. Las diferencias de dosis en algunos genes pueden ser críticas para el desarrollo de diferencias sexuales, como es el caso de la DMRT1 gen en aves [44]. Por el contrario, los genes no compensados ​​pueden participar en actividades catalíticas y de mantenimiento intracelular que están reguladas en muchos otros niveles, por lo que su función es menos sensible a la dosis de genes. Tales genes expresados ​​de forma ubicua están sobrerrepresentados en la lista de genes marsupiales que escapan en gran medida a la inactivación.

Proponemos aquí que, durante la diferenciación de los cromosomas sexuales, la pérdida gradual de genes del cromosoma proto-Y seleccionado para la inactivación del alelo paterno de los genes homólogos transmitidos por X que eran particularmente sensibles a las diferencias de dosis en un tejido u otro. Esto dio como resultado una inactivación gradual que era específica de tejido, como se observa para el XCI marsupial. Sugerimos que la naturaleza cooperativa de los cambios de cromatina reclutados para silenciar este locus en euterios involucró loci no críticos cercanos. Esta propagación de la inactivación de los loci sensibles a la dosis es casi completa en el ratón, pero ha dejado muchos huecos de escape en el X humano, especialmente en el brazo corto recién reclutado.

Evolución de la inactivación del cromosoma X

La diferencia fundamental entre XCI marsupial y euterio nos llevó a buscar similitudes con la compensación de dosis en mamíferos y vertebrados no mamíferos más distantes. De hecho, la inactivación estocástica que observamos en los marsupiales es similar a la que describimos recientemente para los genes de los cinco cromosomas X del ornitorrinco. Los genes específicos de X se expresan a partir de uno o ambos alelos en diferentes fibroblastos de la misma hembra, y la frecuencia de núcleos activos 1X y 2X activos es una característica constante de cada gen, que varía entre el 20% y el 53% de los núcleos activos 2X núcleos [7]. Sin embargo, es difícil imputar un vínculo evolutivo entre la compensación de dosis monotrema y marsupial ya que los cromosomas X del ornitorrinco no tienen homología con los de marsupiales y euterios, sino que comparten una homología considerable con el cromosoma Z de las aves [10]. Se sabe que la compensación de la dosis en el pollo es incompleta, que varía desde una relación ZZ macho: ZW hembra de 1,0 a 2,0 para diferentes genes [4]. Se informó de un RNA-FISH limitado para cinco genes [5], pero la baja eficiencia de detección hace que sea difícil evaluar si las diferencias en la expresión representan una regulación a la baja en cada célula o un control estocástico de la expresión.

Quizás, entonces, el XCI marsupial conserva características de un antiguo mecanismo de silenciamiento común a todos los cromosomas. La naturaleza estocástica de la expresión del cromosoma X marsupial y monotrema recuerda a la expresión monoalélica de muchos loci autosómicos, incluidos receptores olfativos y genes inmunes como inmunoglobulinas, receptores de células T y receptores de células asesinas naturales [45]. Es tentador especular que esto revela un mecanismo antiguo para controlar la expresión génica, que fue obligado a evolucionar hacia un sistema de compensación del cromosoma X de forma independiente en monotremas y terios [46].

Una base estocástica para la activación transcripcional puede verse como una secuencia de eventos que combina un elemento aleatorio, como la unión del factor de transcripción, con un paso selectivo, como el compromiso celular. Por ejemplo, un "factor promotor de probabilidad" identificado en células tetraploides de ratón permite que cada cromosoma X determine de forma independiente la probabilidad de iniciar XCI [47]. La probabilidad de inactivación de uno u otro cromosoma X en el ratón puede verse alterada por mutaciones en un locus cercano XIST [48]. La inactivación de una sola X está bloqueada por un mecanismo de retroalimentación, controlado por el centro XCI, que suprime la inactivación de la X activa [49]. La expresión alélica estocástica de genes da lugar a un repertorio diverso de células y crea diversidad, por lo que aunque los perfiles de expresión celular individuales varían, incluso dentro de un clon, el resultado neto para una población celular será un resultado estable.

¿Un sistema de inactivación paterno, estocástico e incompleto ancestral, todavía representado por marsupiales, evolucionó hacia la inactivación hiperestable de todo el cromosoma de los mamíferos euterios? Las similitudes del XCI marsupial con la primera ola de XCI en el tejido extraembrionario de roedores y bovinos (que también es paterno, incompleto e independiente de la metilación) sugiere que esto representa el sistema de inactivación en un antiguo mamífero therian, y que sufrió cambios para convertirlo en más completo y estable en euterios. Será muy interesante descubrir si el XCI en las membranas embrionarias de ratón es, como el XCI marsupial, específico de locus y estocástico.

¿Cómo evolucionó XCI a un sistema de cromosomas completos? La evolución del XIST gen temprano en el linaje euterio, quizás por inserción de secuencia repetitiva [24] y pseudogeneización de un antiguo gen tetrápodo [37], trajo dominios de inactivación vecinos bajo el control de todo el cromosoma. Vinculante con XIST El ARN permitió la unión de histonas modificadas e hizo más probable la metilación del ADN, lo que resultó en la estabilización de la inactivación. Quizás, entonces, la expresión estocástica sea también la base de la inactivación aleatoria en el embrión de mamíferos euterios.


Células estromales mesenquimales y células progenitoras específicas de tejido: su papel en la homeostasis tisular

Las células madre / estromales mesenquimales multipotentes (MSC) residen en muchos órganos humanos y comprenden una población heterogénea de células con capacidad de autorrenovación. Estas células pueden aislarse de diferentes tejidos y su morfología, inmunofenotipo y potencial de diferenciación dependen de su tejido de origen. Cada órgano contiene una población específica de células estromales que mantienen el proceso de regeneración del tejido donde residen, pero algunas de ellas tienen una plasticidad mucho más amplia y se diferencian en múltiples linajes celulares. Las MSC aisladas de tejidos humanos adultos son candidatos ideales para la regeneración de tejidos y la ingeniería de tejidos. Sin embargo, las MSC no solo contribuyen a la reparación estructural de los tejidos, sino que también poseen fuertes propiedades inmunomoduladoras y antiinflamatorias y pueden influir en la reparación de los tejidos mediante la modulación del entorno local. Este artículo presenta una descripción general del conocimiento actual de la biología de las células estromales y progenitoras mesenquimales residentes en tejidos (originadas a partir de la médula ósea, el hígado, el músculo esquelético, la piel, el corazón y los pulmones) asociadas con la regeneración y la homeostasis de los tejidos.

1. Introducción

Muchos órganos y tejidos humanos, incluida la piel, el hígado, los músculos, el páncreas, los pulmones, el tejido adiposo, la placenta, la médula ósea (MO) y la sangre periférica, entre otros, contienen una población indiferenciada de células residentes en los tejidos que facilitan la reparación y reparación de los tejidos. remodelación tisular durante la vida. Estas células se caracterizan por propiedades específicas: la capacidad de autorrenovación, la capacidad de dar lugar a células progenitoras descendientes, la multipotencia y la capacidad de diferenciarse en una variedad de tipos de células específicas para tejidos particulares. Las células estromales residentes en el tejido generalmente se localizan en microambientes tisulares locales específicos que mantienen y controlan un tipo particular de células o sus progenitores para la diferenciación y maduración.

Sin embargo, la función de las células estromales de muchos órganos disminuye con la edad, lo que reduce el potencial regenerativo de todos los órganos [1]. En la literatura, se describen diferentes tipos de células estromales mesenquimales (MSC) residentes en tejidos, sin embargo, no está claro si estas células son específicas solo para la regeneración del tejido del que se originan o si su heterogeneidad les permite diferenciarse en varios tipos de células. . Las MSC aisladas de varios tejidos comparten varios marcadores de células no hematopoyéticas, incluidos los antígenos CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 y MHC de clase I. Las propiedades no inmunogénicas de las MSC están permitidas por la falta de antígenos del MHC de clase II y la falta de moléculas coestimuladoras CD40, CD80 y CD86. Estas características hacen que las CMM sean candidatas prometedoras para nuevas estrategias terapéuticas en el trasplante y la medicina regenerativa.

Se han aislado células que tienen características de MSC de diferentes órganos y tejidos del cuerpo humano, incluidos BM, tejido adiposo, piel, músculos, tendones, huesos, cerebro, hígado, riñones, pulmones, bazo, páncreas, timo, membrana sinovial y cordón umbilical [2 ]. Se realizan estudios intensivos sobre las CMM desde hace años, sin embargo, la ubicación y el papel de las CMM nativas dentro de su propio entorno tisular. en vivo no se explican completamente, principalmente debido a la falta de marcadores específicos que permitan su reconocimiento preciso [3]. En los órganos autorrenovables, las células estromales residen en nichos específicos que constituyen el microambiente en el que las células progenitoras específicas de tejido se mantienen en un estado inactivo. Después de la entrega de la señal de activación, las células progenitoras proliferan y migran a los sitios de la lesión donde se diferencian y adquieren el fenotipo maduro [4]. La homeostasis del nicho de las células progenitoras específicas de tejido está regulada por la división de las células progenitoras, que mantienen la cantidad de células primitivas y comprometidas dentro del tejido [5].

Las MSC originadas en diferentes ubicaciones de tejidos exhibieron muchas características comunes, sin embargo, algunos marcadores se distinguen por el potencial de diferenciación de estas células. Esta revisión presenta las similitudes y diferencias entre las CMM originadas a partir de diferentes tipos de tejidos en función de sus marcadores de superficie y su potencial regenerativo en los órganos donde residen y su capacidad multipotencial para diferenciarse en otros linajes.

2. Célula madre mesenquimatosa de origen de la médula ósea

Hasta la fecha, las CMM originadas a partir del estroma de la médula ósea del adulto son las células estromales derivadas del mesodermo mejor caracterizadas con capacidad de diferenciación multipotente. El término MSC fue introducido por Caplan en 1991 como un tipo de células madre adultas con potencial natural para diferenciarse en diversos tipos de células mesenquimales, incluidos osteoblastos, condrocitos, adipocitos y otros [6]. Históricamente, las CMM fueron aisladas por primera vez de la médula ósea por Friedenstein como precursores fibroblásticos con una ubicación anatómica desconocida en el entorno de la BM [7]. Estas células se caracterizaron por su capacidad de adherencia al plástico con morfología similar a fibroblastos, capacidad de proliferación extensa y expansión clonal, según lo confirmado por el ensayo de fibroblastos de la unidad formadora de colonias (CFU-F). Además, el trasplante heterotópico de células de BM en diferentes sitios inmunoprivilegiados, incluida la cápsula renal, dio como resultado la formación de hueso ectópico, lo que sugiere que los precursores osteogénicos están presentes en el entorno de BM.

Desde ese momento, se realizó una extensa investigación sobre las MSC de origen de la médula ósea para caracterizar la biología y los epítopos de superficie de las MSC. Las MSC son poblaciones heterogéneas y expresan una variedad de epítopos de superficie, incluidos los receptores de integrina (CD29, CD49α), moléculas de adhesión celular (CD44, CD54, CD58, CD62L, CD105, CD106, CD146 y CD166), enzimas (CD39, CD73), receptores de factores de crecimiento (CD140b, CD271, CD340 y CD349), filamentos intermedios (nestina, vimentina, desmina y neurofilamento) y antígenos embrionarios (SSEA-1), pero ninguna de estas moléculas es específica de las CMM derivadas de BM (Tabla 1) [2, 8]. El aislamiento de las CMM basado en STRO-1 [9], el receptor del factor de crecimiento antinerve CD271 [10, 11] o la expresión de la molécula de adhesión celular CD146 [12, 13] documentó su heterogeneidad y capacidad clonogénica de estas células. Sin embargo, estudios posteriores documentaron que las CMM aisladas basadas en marcadores de superficie CD271 y CD146 constituyen dos poblaciones distintas de CMM de origen BM y estos subtipos pueden tener una función diferente durante el desarrollo y el envejecimiento [14].

La heterogeneidad de las CMM, los diferentes procedimientos de aislamiento de las células estromales nativas y las diversas condiciones de cultivo fueron un motivo para que el Comité de Células Madre Mesencimales y Tisulares de la Sociedad Internacional de Terapia Celular definiera los criterios mínimos que caracterizan a las células madre mesenquimales humanas como (i) células adherentes al plástico , (ii) con expresión de marcadores de superficie CD73, CD90 y CD105 y falta de expresión de marcadores hematopoyéticos CD34−, CD45−, CD14−, CD79α- y HLA-DR-, y (iii) potencial de diferenciación multilinaje en osteoblastos, adipocitos y condroblastos [15]. Si no se cumplen los criterios anteriores, el término "células madre mesenquimales" debe utilizarse para las células adherentes derivadas de la médula ósea u otras células similares a las MSC de diferente origen.

Se ha realizado una amplia investigación que describe el fenotipo y la biología de MSC en MSC derivadas de BM humana in vitro, pero todavía hay una pequeña evidencia sobre su fenotipo en su forma natural en vivo medio ambiente. Estudios recientes sobre muestras de biopsia de hueso trabecular documentaron la presencia de células con patrón de expresión del antígeno MSC con diferente morfología y localización microanatómica [8]. Las células estromales no reticulares, incluidas las células estromales redondas y las células del revestimiento óseo, expresan antígenos CD73, CD140b y CD271. Las células estromales redondas expresan adicionalmente CD10, mientras que las células del revestimiento óseo se distinguen por la expresión del gangliósido neural (GD2). Las células del estroma reticular, como las células reticulares fibroblásticas y las células del estroma adiposo (ASC), se superponen a los antígenos CD10 y CD146 y se distinguen por la presencia de GD2 (en células reticulares fibroblásticas) y CD73 (en ASC) [8]. En muchos estudios, la topografía de las CMM en el entorno de la BM se introduce como el revestimiento celular de las superficies externas de los vasos sanguíneos y las células perivasculares, y estas células expresan el antígeno CD146 [8, 16, 17]. Las MSC clasificadas según el fenotipo STRO-1 + CD146 + expresaron la actina alfa del músculo liso (αSMA) que también es específico para pericitos [18]. Los estudios de Tormin introdujeron que la fracción de células de BM CD146 + / CD271 + comprende tanto células perivasculares sinusoidales como células que residen en el entorno de BM, mientras que las MSC de revestimiento óseo expresan CD271 solo [19]. Todas estas observaciones sugirieron que las CMM que residen en la cavidad medular, el endostio y el estroma del BM representan fracciones distintas de las CMM que contribuyen al desarrollo de diferentes progenitores en el microambiente natural del BM.

En el entorno de BM, las CMM participan en la homeostasis tisular al contribuir a la formación del estroma hematopoyético y la producción de moléculas reguladoras, incluido el factor de células madre (SCF) y la quimiocina CXCL12, factores necesarios para la regulación y el mantenimiento del nicho de células madre hematopoyéticas (HSC). La regulación a la baja de la expresión de CXCL12 en células reticulares y osteoblastos da como resultado la movilización de HSC hacia la periferia y la pérdida de progenitores de células B, mientras que la deleción de Cxcl12 de células estromales en la región perivascular tiene influencia sobre la actividad de repoblación de HSC a largo plazo y los progenitores linfoides comunes [20]. Sin embargo, el nicho de las HSC perivasculares es más complejo y está respaldado por otros tipos de células, incluidas las células endoteliales de vasos, los nervios simpáticos, las células de Schwann no mielinizantes, los macrófagos y los osteoblastos, que en cooperación con las MSC perivasculares son responsables de la autorrenovación, la proliferación y el tráfico de HSC, manteniendo así el grupo de HSC [20]. Por lo tanto, el nivel de expresión de CXCL12 en MSC originado a partir de diferentes nichos de HSC confirmó la diversidad de MSC en el compartimento de BM y su influencia en la actividad de HSC y progenitores linfoides.

Estudios recientes documentaron que las células del estroma se originaron en diferentes tejidos (distintos del BM) y mostraron diferencias significativas en su diferenciación y fenotipo molecular y estos hallazgos sugieren que las células del estroma de otras fuentes pueden no ser capaces de sustituir las células del estroma de origen en la médula ósea [21].

3. Las células progenitoras del hígado

El potencial regenerativo del hígado se logra mediante hepatocitos y colangiocitos residentes cuando se produce una lesión hepática moderada. Sin embargo, la capacidad de autorrenovación de los hepatocitos es limitada cuando se produce un daño hepático masivo o una hepatectomía parcial. En estas determinadas condiciones, las células progenitoras / estromales del hígado en humanos [22, 23] y las células ovaladas en roedores [24, 25], llamadas así por su apariencia morfológica como células pequeñas con núcleos ovalados, pueden participar en la regeneración del hígado. Las células progenitoras hepáticas humanas son precursoras bipotentes de hepatoblastos y colangioblastos y residen en las placas ductales del hígado fetal y en los canales de Hering en las proximidades de las tríadas portales de los acinos en los hígados adultos [23]. Expresan marcador específico EpCAM (molécula de adhesión de células epiteliales) permitiendo su inmunoselección (Tabla 1). Las células positivas para EpCAM caracterizan una alta actividad clonogénica para duplicar la población por encima de 150. Además, la pluripotencia de las células positivas para EpCAM y la capacidad de diferenciarse en progenitores biliares y hepatoblastos permitieron la capacidad de autorrenovación de estas células. Excepto EpCAM, las células progenitoras hepáticas expresan moléculas CD29, CD133 y NCAM (CD56), y son negativas para marcadores hematopoyéticos (CD34, CD45, CD38 y CD14), marcadores de células endoteliales (VEGFR, vWF y CD31), y para los marcadores mesenquimales definidos por los autores como CD146, desmina y α-actina de músculo liso. Sin embargo, ex vivo La expansión clonogénica de células positivas para EpCAM reveló la presencia de células mesenquimales "compañeras", que penetran en las colonias y se encuentran a lo largo de ellas. Las células mesenquimales "compañeras" representan dos poblaciones distintas: angioblastos positivos para VEGFR, vWF, CD31 y CD117 (c-kit) y células estrelladas hepáticas que expresan CD146 +, desmina y α-actina de músculo liso. La inmunoselección rigurosa adicional para las células EpCAM + demostró que la señalización paracrina de las células mesenquimales "compañeras" es esencial para la supervivencia de las células EpCAM + [23]. Presumiblemente, entre las células mesenquimales "compañeras", los pericitos (CD146 +, CD90 + y CD140b +), normalmente localizados alrededor de los vasos sanguíneos periportales en el hígado humano fetal y adulto, contribuyen al potencial clonogénico de las células EpCAM [26]. Los estudios sobre el modelo de roedor introdujeron que EpCAM se expresa en células ovaladas y en colangiocitos, mientras que la proteína asociada a TROP2, un miembro de la familia EpCAM, se expresa exclusivamente en células ovaladas, lo que indica que TROP2 es un marcador valioso para las características de las células ovaladas. La expresión de TROP2, regulada al alza en células ovales en el hígado lesionado, aumenta la posibilidad de modular y / o aumentar la señalización intracelular de EpCAM para apoyar la proliferación y migración de células ovales en el parénquima hepático [27].

Las células ovaladas, reconocidas como células progenitoras facultativas en el hígado adulto que normalmente residen en el área portal del hígado, son proliferativas inactivas. Después de una lesión grave del hígado, las células ovaladas se activan y migran al parénquima hepático y se diferencian en hepatocitos y colangiocitos.Sin embargo, el origen de las células ovaladas es controvertido y los estudios documentaron que las células ovaladas se originan en la médula ósea [28]. En la lesión hepática grave, los hepatocitos regulan positivamente la expresión de SDF-1α, un potente quimioatrayente para las células hematopoyéticas CXCR4 +. Las células ovaladas expresan CXCR4, el único receptor para SDF-1α. Interacción de SDF-1α/ CXCR4 es esencial para iniciar la activación de células ovales, cuando la proliferación de hepatocitos está alterada, y mantener los nichos de células madre mediante el control de la migración de células progenitoras mediante el posible reclutamiento de una segunda ola de células progenitoras de origen de la médula ósea en el lado lesionado del hígado [ 25, 29].

La célula estrellada hepática representa la fracción de células residentes en el hígado con morfología en estrella, ubicada entre las células endoteliales sinusoidales del hígado y los hepatocitos. Las células estrelladas perisinusoidales representan las CMM del hígado y regulan los procesos fisiológicos y patológicos hepáticos esenciales. En condiciones normales, las células estrelladas están inactivas y tienen una tasa de proliferación baja, pero, después de una lesión hepática, estas células se activan progresivamente y cambian su fenotipo latente por un fenotipo activo similar a miofibroblástico. El fenotipo de tipo miofibroblástico se caracteriza por la expresión de α-actina de músculo liso (α-SMA) y filamentos intermedios de desmina. Además, las células estrelladas activadas expresan marcadores neurales que incluyen proteína ácida fibrilar glial (GFAP), nestina y N-CAM. Estas observaciones indican la posibilidad de un origen neural de las células estrelladas del hígado. Estas células expresan también CD271, conocido como p75NTRF (familia de receptores del factor de crecimiento nervioso), que es un marcador de células estromales mesenquimales y se utiliza para su aislamiento positivo. Sin embargo, el fenotipo celular de las células estrelladas hepáticas primarias depende de su origen hepático fetal o adulto y es altamente dinámico, dependiente del tiempo y dependiente de las condiciones de cultivo. En la etapa inicial, las células fetales positivas para CD271 en cultivo no expresaron α-SMA y CD90, pero después de un cultivo más prolongado, estas células CD271 cultivadas exhiben una fuerte expresión de estos marcadores. Por el contrario, las células CD271 recién aisladas de hígado adulto expresaron todos los marcadores de células estrelladas [30]. Sin embargo, ambos tipos de células CD271 expresaron el fenotipo característico de las MSC, incluidas CD73 y CD105, y fueron negativos para los marcadores hematopoyéticos CD34 y CD45. Nuestros propios estudios sobre células estromales residentes en tejidos documentaron la distribución tisular de células con capacidad de autorrenovación en el hígado, que expresan CD73, CD90 y c-kit, y estas células se localizan en el área periportal del hígado como se ilustra en la Figura 1. [31].

Por tanto, la capacidad regenerativa del hígado humano no está asociada con un tipo de células progenitoras hepáticas con potencial regenerativo. Más bien, la cooperación entre diferentes tipos de células madre del hígado es necesaria para mantener la integridad y la homeostasis de las células hepáticas.

4. Célula progenitora mesenquimatosa del músculo esquelético

El músculo esquelético, similar a la mayoría de los tejidos postnatales, contiene un conjunto natural de células progenitoras adultas residentes que mantienen el potencial regenerativo del músculo esquelético. Las principales células progenitoras responsables de la regeneración muscular son las células satélite, una población de células específicas de tejido bipotente en reposo ubicada entre la lámina basal y el sarcolema [32]. La activación de las células satélite se desencadena por una lesión muscular y está controlada por señales proximales del nicho muscular, la microvasculatura y las células inflamatorias [33], así como por factores sistémicos [34]. Las células satélite activadas actúan como células estromales / progenitoras que contribuyen a la reparación de las miofibras dañadas, o pueden generar nuevas miofibras después de la división celular y la fusión entre sí o con los miocitos existentes. Además, las células satélite tienen la capacidad de reponer una reserva de células progenitoras residentes en el tejido en el músculo esquelético a través de la capacidad de autorrenovación [35]. Las células satélite en reposo expresan antígenos de superficie CD34, CD56 y Myf5 y el factor de transcripción de caja pareada Pax7, sin embargo, la expresión de CD34 + disminuyó durante la diferenciación en mioblastos [36]. Nuestros propios estudios demostraron que los marcadores de MSC, CD73 y CD90, se expresaron en células madre individuales del músculo esquelético examinado y se localizaron en los compartimentos de tejido específicos entre la lámina basal y el sarcolema de las miofibras del músculo [31]. Además, las células progenitoras del músculo esquelético, pero no las células progenitoras presentes en la piel, el hígado o el corazón, expresan exclusivamente el factor transcripcional Pax7 (Figura 1).

El conjunto de células satélite es relativamente estable durante la vida, sin embargo, puede diferir en músculos específicos. Se ha sugerido que las células satélite constan de dos poblaciones distintas, una responsable de la regeneración muscular, pero su número disminuye con la edad, y la segunda, que se activa en respuesta a una lesión muscular grave y permanece en cantidad constante durante toda la vida [1, 37 ].

Además de las células satélite, una variedad de progenitores residentes en el tejido que existen en el músculo esquelético desempeña un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis del tejido [32]. Se identificó el potencial miogénico de las células progenitoras no satélites en una población celular que reside en el intersticio muscular del recién nacido [38]. Estas células demuestran un potencial multilinaje y pertenecen a células progenitoras / estromales mesenquimales (MSC), como lo confirma la amplia gama de expresión génica común a las MSC [39]. Estas células progenitoras musculares se caracterizan por la expresión de CD34, mediador del estrés PW1, pero son negativas para Pax7 (células intersticiales PW1 + / Pax7−, PIC). Los estudios demostraron que estas células contribuyen a la formación de nuevas miofibras y a la generación de células satélite, como se documenta. in vitro cuando se cocultiva con mioblastos o en vivo cuando se trasplanta a un entorno muscular en regeneración. Sin embargo, las poblaciones de PW1 + / Pax7− son negativas para los marcadores endoteliales, como lo demuestra la tinción negativa de CD31 [38].

Otra población residente en el músculo de células progenitoras no satélites son las progenitoras fibro / adipogénicas bipotentes (FAP) localizadas en el intersticio muscular y vecinas a los vasos sanguíneos asociados a los músculos. Estas células son fenotípicamente CD31− / CD45− y expresan fuertemente PDGFα y vimentina, marcadores asociados con progenitores mesenquimales [40]. La mayoría de los FAB (más del 90%) tienen capacidad adipogénica. Sin embargo, estas células se diferencian de las PIC porque no demuestran potencial miogénico directo. Los progenitores mesenquimales de FAP, pero no las células PW1 +, contribuyen a la regeneración muscular por factores paracrinos, secreción de IL-6, IGF-1 y Wnt1 que aumentaron notablemente los mioblastos hasta la diferenciación terminal [41, 42].

También se confirmó el potencial miogénico en progenitores mesodérmicos de tipo endotelial con características pericíticas [43]. Los pericitos, ubicados dentro de la membrana basal de los vasos, en el músculo esquelético humano representan precursores miogénicos distintos de las células satélite. Los pericitos residentes en el músculo son negativos para marcadores miogénicos, incluidos Myf5, MyoD y MyoG. Se identifican por la expresión de fosfatasa alcalina (AP) y expresan proteoglicano neuroglial 2 (NG-2), receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas. β (PDGFRβ), y la actina alfa del músculo liso (αSMA). Pericitos del músculo estimulados. in vitro son capaces de diferenciación miogénica. En vivo estudios sobre distrofia muscular en ratones documentaron que el pericito trasplantado en ratones scid-mdx coloniza el músculo del huésped y genera fibras musculares que expresan distrofina humana [43]. Estudios posteriores demostraron que la proporción de pericitos es capaz de fusionarse con las miofibras durante el período posnatal temprano y contribuir a la miogénesis.

Las células estromales / progenitoras mesenquimales residentes en el músculo constituyen una población heterogénea de células con diversas capacidades de diferenciación y desempeñan un papel importante en la homeostasis tisular. La mayoría de ellos, como las células satélite, los PIC y los pericitos, tienen capacidad de diferenciación miogénica directa. en vivo, mientras que los progenitores mesenquimales FAB / MSC apoyan eficazmente la miogénesis mediante la secreción de factores de crecimiento paracrinos. Por tanto, el potencial regenerativo eficaz del músculo esquelético dañado se asocia con interacciones colaborativas entre múltiples tipos de células progenitoras de músculo heterogéneas que residen en el tejido.

5. Las células estromales multipotentes derivadas de la piel

La presencia de células con potencial regenerativo en la piel puede atribuirse al mantenimiento de la homeostasis cutánea y la respuesta al daño. La piel está formada por capas de epidermis y dermis, que se encuentran en un proceso de regeneración constante y contienen una serie de células que se originan a partir del mesodermo y el ectodermo [44, 45]. La capacidad de autorrenovación de la epidermis y los folículos pilosos depende de las células precursoras que existen en la epidermis, las papilas dérmicas y el bulto. La presencia de células parecidas a progenitoras o MSC en la piel se confirmó mediante la identificación de varios tipos de células estromales o progenitoras de la piel adulta localizadas en ambas capas de la piel, incluidas las células estromales dérmicas y las células estromales epidérmicas [20, 45, 46]. Además, los precursores derivados de la piel localizados en varias otras estructuras de la piel, como folículos pilosos, vasos sanguíneos, receptores sensoriales y terminaciones nerviosas, contribuyen al proceso de regeneración y al mantenimiento de la integridad de la piel. Los precursores derivados de piel endógenos aislados tienen la capacidad de proliferar durante muchos pasajes con fenotipo no especializado, pero en condiciones específicas pueden diferenciarse en tipos de células específicas que incluyen linajes neuroectodérmicos y mesodérmicos. En la piel también están presentes diferentes tipos de MSC, y sus propiedades biológicas son diferentes en cultivo celular. Las CMM adherentes de origen cutáneo están creciendo en presencia de suero, expresan marcadores específicos para los linajes de células madre mesenquimales CD73, CD90 y CD105, son negativos para merkers hematopoyéticos, incluidos CD34, CD45, CD14, CD31 y HLA-DR, y son negativos para nestina y positivo para fibronectina, vimentina y colágeno tipo I. Por el contrario, los precursores derivados de la piel en cultivo sin suero forman esferas flotantes y expresan nestina, el marcador que las distingue de las células adherentes al plástico [20, 45, 47]. Además, las esferas flotantes expandidas sin suero representan precursores derivados de la piel con un potencial de diferenciación neurógeno mesodérmico limitado pero superior comparable al de las células madre de la cresta neural [45].

La diversidad de las CMM humanas de origen dermis también se confirmó en estudios sobre progenitores mesenquimales aislados de muestras de prepucio [48]. En el lugar El análisis realizado en muestras de piel reveló que los marcadores de MSC CD73, CD90 y CD105, así como CD271 y SSEA-4, se expresan en diferentes tipos de células dérmicas, incluidas las células endoteliales (CD31 +, CD34 +) y los leucocitos (CD45 +). Sin embargo, también se identificaron células positivas para CD73, CD90 y CD105 que carecían de marcadores endoteliales y leucocitarios y estas células se caracterizaron como células progenitoras mesenquimales potenciales. Los progenitores mesenquimales dérmicos aislados expresaron marcadores de superficie similares a las MSC derivadas de la médula ósea. Las células del estroma dérmico representan una población muy heterogénea y, excepto los progenitores mesenquimales, dentro de la población adherente al plástico dérmico, están presentes fibroblastos diferenciados. La inmunoselección de MSC basada en marcadores CD271 + y SSEA-4 de células dérmicas adherentes confirmó su capacidad de diferenciación mesenquimatosa y, por lo tanto, distinguió las MSC dérmicas de los fibroblastos diferenciados. Sin embargo, la población de células CD271 + reveló una mayor capacidad de diferenciación adipogénica, osteogénica y condrogénica en comparación con las células SSEA +, que representan la población celular de origen mesenquimatoso con un potencial de diferenciación limitado a la adipogénesis [48].

En la piel, tomada del muslo humano, identificamos marcadores asociados con el fenotipo de células estromales específicas de tejido, localizados en la capa basal de la epidermis y en el epitelio de la estructura anexial de la piel (c-kit, CD90). Las células CD73 positivas estaban bastante presentes en el área perivascular (Figura 1). Estas observaciones demostraron nuevamente la diversidad de células estromales residentes en tejidos asociadas con su nicho específico.

Por lo tanto, la piel, especialmente el prepucio y la piel extraída durante la cirugía estética, constituye un material de desecho biológico seleccionado y puede servir como una fuente alternativa de células parecidas a progenitoras para estas CMM de origen medular, que pueden aplicarse para estudios de reparación de tejidos. y terapia celular en medicina regenerativa.

6. Células madre cardíacas

El corazón humano contiene una población de células primitivas con propiedades de autorrenovación, clonogénicas y multipotentes, y estas células pueden diferenciarse en cardiomiocitos y vasos coronarios. Las células progenitoras cardíacas residentes representan una población heterogénea clasificada según sus propiedades biológicas y marcadores de superficie para la población lateral (SP), c-kit + (CD117 +), antígeno 1 de células madre (Sca-1 +), Islet 1+, SSEA-1 + y “cardiosferas” [49]. En el miocardio humano, las células progenitoras cardíacas se localizan dentro de los nichos cardíacos compuestos por miocitos y fibroblastos, que representan las células de soporte, lo que permite mantener el equilibrio entre la inactividad y la activación de las células madre cardíacas [5]. Las células progenitoras cardíacas, con fenotipo de CD73 +, CD90 + y c-kit +, conectadas a miocitos y fibroblastos en los nichos cardíacos, fueron identificadas en nuestros estudios sobre la distribución tisular de células estromales / progenitoras (Figura 1) [31].

Las células progenitoras cardíacas de la población lateral son heterogéneas y representan diferentes subpoblaciones identificadas por la expresión de VE-cadherina, CD31, CD34 y Sca-1 y consisten en células endoteliales vasculares, células de músculo liso y progenitores mesenquimales, incluidos los precursores cardiomiogénicos. En roedores, los progenitores cardíacos SP se describieron como células Sca-1 +, c-kit +, CD34 +, CD31− y CD45− que expresan el factor de transcripción específico cardíaco. Después del aislamiento y in vitro cultivo, las células progenitoras cardíacas SP adquirieron un fenotipo de cardiomiocitos documentado por la expresión de proteínas sarcoméricas, troponina y α-actinina cardíaca [49, 50]. Sobre in vitro Durante la estimulación, estas células mostraron una capacidad multipotente para diferenciarse no sólo en cardiomiocitos sino también en linajes típicos derivados de la cresta neural, incluidas las neuronas, la glía y el músculo liso [51]. En vivo estudios sobre el modelo de rata, documentaron la capacidad de las células progenitoras cardíacas SP de albergar el miocardio dañado y de diferenciarse en cardiomiocitos y células endoteliales después de la infusión intravenosa [52].

C-kit es un receptor de tirosina quinasa para el factor de células madre descrito principalmente en las células madre hematopoyéticas de origen de la médula ósea [53]. Beltrami et al informaron por primera vez de una población de células madre cardíacas residentes distinta que apoya la regeneración cardíaca, positiva para c-kit y negativa para los marcadores de linaje sanguíneo CD34−, Lin− y CD45−. [54]. Estudios posteriores confirmaron el potencial de las células progenitoras cardíacas positivas para c-kit para reducir el tamaño del infarto y mejorar la función cardíaca después de un infarto de miocardio [55]. Aislamiento y in vitro La expansión de las células positivas de c-kit del tejido cardíaco reveló un potencial de diferenciación a los cardiomiocitos como lo confirma la expresión de marcadores de cardiomiocitos que incluyen α-actinina cardiaca, miosina cardiaca, desmina y conexina [54, 55]. Sin embargo, como informaron Tallini et al., Las células positivas para c-kit actúan como progenitores cardíacos hasta la fase neonatal, pero en el miocardio adulto son más bien responsables de la neoangiogénesis [56]. Las células C-kit + CD45− aisladas de biopsias cardíacas humanas coexpresan los marcadores de células progenitoras endoteliales CD31, CD34, CXCR4 y FLK-1, lo que indica una mayor diferenciación en células endoteliales [57]. Observaciones recientes introdujeron la teoría de que las células positivas para c-kit constituyen dos poblaciones, en las que las células con alto nivel de c-kit + funcionan como progenitores cardíacos y la población con bajo nivel de c-kit + podría funcionar como MSC [58]. La pluripotencia de las células positivas para c-kit se confirmó mediante la capacidad de diferenciación en adipocitos y miocitos del músculo esquelético.

La hipoxia favorece la inactividad de las células progenitoras cardíacas, mientras que la normoxia es necesaria para su activación y el equilibrio entre las células progenitoras cardíacas hipóxicas y normóxicas puede estar presente en el corazón joven, mientras que los defectos en la oxigenación tisular que ocurren en el miocardio viejo pueden alterar el control homeostático. Estudios muy recientes informaron que en el miocardio senescente hay un mayor número de células progenitoras cardíacas positivas a c-kit inactivas con telómeros intactos que no pueden volver a entrar en el ciclo celular, mientras que la reparación de miocitos se controla dividiendo las células progenitoras cardíacas con telómeros acortados. Esta observación sugiere que un conjunto de células progenitoras cardíacas funcionalmente competentes, anidadas en nichos hipóxicos en el miocardio senescente, puede promover la regeneración de miocitos después de la activación por el factor de células madre [59].

Las células Sca-1 positivas dentro del miocardio representan una subpoblación heterogénea de células progenitoras cardíacas basadas en los diferentes subconjuntos de marcadores madre coexpresados. Se identificaron células progenitoras cardíacas que expresan Sca-1 + CD31 + y que carecen de los marcadores de linaje de células sanguíneas c-kit, FLT-1, CD45 y CD34 negativos en miocardio murino adulto [60]. Estas células pueden diferenciarse en cardiomiocitos con la expresión de genes cardíacos estructurales. Las células Sca-1 positivas estimuladas con oxitocina que expresa c-kit, CD45 y CD34 generaron cardiomiocitos latentes, mientras que las células Sca-1 + CD45− en las mismas condiciones revelaron una capacidad de diferenciación multipotente en linajes osteogénicos y adipogénicos [61].

Las células positivas para el islote 1 se consideran verdaderos progenitores de cardiomiocitos que aparecen durante la embriogénesis y contribuyen al ventrículo derecho y al tracto de salida, aunque no está claro si estas células existen en el miocardio adulto [62]. Dentro del miocardio, están presentes las células progenitoras cardíacas que expresan el antígeno embrionario 1 específico de la etapa (SSEA-1). Estas células representan una población de un grupo inmaduro de progenitores embrionarios que se diferencian en células miocárdicas y endocárdicas en la etapa neonatal del desarrollo del corazón. Se ha sugerido que las células madre cardíacas SSEA-1 + pueden dar lugar a progenitores cardíacos más comprometidos que expresen c-kit y Sca-1 [63].

Las células progenitoras cardíacas residentes están abundantemente presentes dentro del miocardio en nichos ubicados preferentemente en las aurículas y el ápice y en el ventrículo y conservan de manera eficaz la integridad del tejido en las condiciones fisiológicas. Sin embargo, el número de células progenitoras cardíacas residentes puede ser insuficiente para repoblar el tejido lesionado después de un infarto de miocardio extenso. Esto puede sugerir que la capacidad inherente del miocardio para regenerar miocitos dañados después de un infarto de miocardio es insuficiente. Esto puede explicarse por la acción de factores perjudiciales como (i) suministro de oxígeno privado en el área del infarto que conduce no solo a la necrosis de los cardiomiocitos sino también a la muerte de las células progenitoras residentes dentro del sitio del infarto, (ii) y el progenitor cardíaco residente células, que se acumulan de forma aguda en el borde del infarto y no pueden migrar del tejido viable al sitio lesionado porque se dificulta su translocación al miocardio dañado. Esto está asociado no solo con la barrera anatómica (formación de cicatrices) sino también con la producción limitada de factores de crecimiento (factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento de insulina y factor de crecimiento derivado del estroma) que facilitan el reclutamiento de células progenitoras cardíacas en el sitio de la lesión y con medio inflamatorio del miocardio lesionado que puede tener un efecto negativo sobre la viabilidad y diferenciación de las células progenitoras cardíacas [64, 65].

Por tanto, las células progenitoras cardíacas residentes autólogas, aisladas del miocardio adulto, pueden ofrecer distintas ventajas sobre otras células madre adultas para la terapia de enfermedades cardiovasculares, ya que son específicas de tejido y están precomprometidas con los linajes cardiovasculares.

7. Las células estromales y progenitoras del pulmón

El pulmón es un órgano que se renueva condicionalmente y el recambio de las células epiteliales de las vías respiratorias es inferior al 1% por día en condiciones de estado estacionario, y esta capacidad de regeneración del pulmón contrasta con el tejido que se renueva continuamente, como la médula ósea, con la capacidad para generar aproximadamente 109 células hematopoyéticas al día. Sin embargo, después de una lesión grave, el potencial de autorrenovación de las células progenitoras del estroma y del epitelio del pulmón aumenta rápidamente y el crecimiento compensatorio de las células multipotentes justifica la regeneración adecuada del pulmón [66]. Dentro del pulmón existen muchos tipos diversos de células epiteliales y se distribuyen en varios microambientes regionales diferentes a lo largo del tracto pulmonar. Muchos estudios sobre modelos de ratón y un número menor de informes bibliográficos sobre pulmones humanos describen presuntas poblaciones de células progenitoras del epitelio alveolar y de las vías respiratorias endógenas adultas; sin embargo, la caracterización y clasificación de estas células en una jerarquía sigue siendo controvertida [67].

La organización de las células progenitoras endógenas del estroma y del epitelio en el pulmón adulto es específica para su distribución regional y su función a lo largo del eje proximal-distal del árbol de las vías respiratorias. La parte proximal de la vía aérea comprende la tráquea cartilaginosa, revestida por células epiteliales columnares pseudoestratificadas con glándulas submucosas, e incluye células basales, secretoras, ciliadas y neuroendocrinas. Las células basales representan células progenitoras / estromales del epitelio bronquiolar y se caracterizan por la expresión del receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR), p63, citoqueratina-5, citoqueratina-14 y acuaporina 3. Después del aislamiento y ex vivo En cultivo, formaron estructuras clonales positivas para células ciliadas y club (conocidas como células de Clara) [68, 69]. Una población de células basales puede migrar desde el nicho bronquiolar al epitelio alveolar dañado y proliferar para reparar la región alveolar [69].

La parte distal de las vías respiratorias está revestida con células epiteliales cilíndricas y comprende una población diferente de células que incluyen células club, células ciliadas, células caliciformes y células neuroendocrinas [66]. Durante la homeostasis epitelial, las células club pueden autorrenovarse y generar células ciliadas, mientras que las células ciliadas no tienen la capacidad de autorregenerarse [70, 71]. Dentro de las células club, que residen a lo largo del eje distal del árbol de las vías respiratorias, está presente una población distinta de células conocidas como células club variantes y están ubicadas en la unión del conducto broncoalveolar. Las variantes de células club con potencial de autorrenovación y capacidad de diferenciación en células club son capaces de reparar las células epiteliales bronquiolares después de una lesión por naftaleno [71]. Otra población de células progenitoras y estromales de las vías respiratorias distales es una población rara de células llamadas células madre / progenitoras bronquioalveolares [66]. Las células progenitoras bronquioalveolares son positivas para el marcador de células madre Sca-1, positivas para EpCAM y negativas para marcadores de células hematopoyéticas (CD34, CD45) y endoteliales (CD31) [72]. In vitro Los estudios documentaron que las células progenitoras bronquioalveolares son capaces de diferenciarse en colonias bronquiolares y alveolares y tienen capacidad de autorrenovación. Además, su número aumenta después de una lesión bronquiolar, lo que sugiere su papel en la regeneración tisular [73].

La parte terminal del pulmón constituye los alvéolos con células progenitoras alveolares específicas, que se diferencian en células alveolares tipo II productoras de surfactante y células alveolares tipo I intercambiadoras de gas [71]. Una población de células progenitoras alveolares que expresan el receptor de laminina. α6β4, se encuentra en el epitelio alveolar y es capaz de contribuir a la regeneración de las vías respiratorias y los tejidos alveolares en un modelo experimental después de una lesión parenquimatosa [74].

Las células estromales mesenquimales pulmonares residentes constituyen un elemento clave de los nichos progenitores epiteliales a lo largo del eje proximal-distal del árbol de las vías respiratorias [71, 72, 75]. Las células del estroma mesenquimatoso del pulmón secretan FGF 10, un factor crítico necesario para dirigir la diferenciación en el pulmón en desarrollo [71]. Además, se ha documentado que las células estromales mesenquimales pulmonares, EpCAM negativas y Sca-1 positivas, cocultivadas con células progenitoras del epitelio pulmonar (EpCAM positivas), apoyan su proliferación y diferenciación y generan colonias que incluyen linajes de células epiteliales pulmonares mixtas, alveolares o de las vías respiratorias. [75].

Las células progenitoras y estromales regionales, como las células progenitoras de las glándulas submucosas / conductos, las células basales, las células tipo club variantes, las células madre / progenitoras bronquioalveolares y las células progenitoras alveolares que residen en distintos nichos del tracto respiratorio, son responsables del mantenimiento de linajes celulares epiteliales específicos. integridad en la región específica de las vías respiratorias. Diferentes poblaciones de células progenitoras y estromales residentes en el tejido están implicadas en la homeostasis específica de la región y la reparación del tejido después de la lesión del pulmón. Por tanto, la homeostasis del pulmón es un proceso altamente coordinado de proliferación y diferenciación del estroma pulmonar y las células progenitoras y requiere un equilibrio entre la regulación inmunitaria y la promoción de la regeneración tisular.

8. Resumen

Las MSC multipotentes residen en nichos de tejido específicos compuestos por células que crean un microambiente específico para las células progenitoras residentes en el tejido y les facilitan el mantenimiento de la homeostasis del tejido. Las células de nicho proporcionan señales que regulan y controlan el equilibrio de la capacidad de autorrenovación y diferenciación de las células madre / progenitoras que residen en ellas. El nicho también controla la división y la actividad de las células madre / progenitoras para preservar la formación de cáncer. El equilibrio de la inactividad y la actividad de las células progenitoras es un sello distintivo de un nicho funcional y está regulado por señales internas (p. Ej., Daño al ADN) y externas que conducen a la autorrenovación y diferenciación de las células progenitoras.

Las MSC pueden aislarse fácilmente de diversas fuentes de tejido, expandirse en el cultivo y diferenciarse de manera apropiada en las condiciones adecuadas. Dependiendo de su tejido de origen, las CMM están predispuestas a dar lugar al tipo de células tisulares de donde proceden. Por lo tanto, las MSC de tejidos humanos adultos son candidatos ideales para la regeneración de tejidos y la ingeniería de tejidos. Sin embargo, las CMM no solo contribuyen a la reparación estructural del tejido, sino que poseen potentes efectos inmunomoduladores y antiinflamatorios y, a través de la interacción directa célula-célula o la secreción de varios factores bioactivos, pueden tener un efecto sobre la reparación local del tejido mediante la modulación del entorno local. .

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses con respecto a la publicación de este artículo.

Reconocimiento

Este trabajo cuenta con el apoyo de la Beca del Centro Nacional de Ciencias N N407 121940.

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Derechos de autor

Copyright & # xA9 2016 Aleksandra Klimczak y Urszula Kozlowska. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la licencia de atribución de Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que el trabajo original se cite correctamente.


Laboratorio de tejido conectivo

A diferencia de los epitelios, el tejido conectivo está escasamente poblado por células y contiene una matriz extracelular extensa que consta de fibras proteicas, glicoproteínas y proteoglicanos. La función de este tipo de tejido es proporcionar soporte estructural y mecánico a otros tejidos y mediar en el intercambio de nutrientes y desechos entre la circulación y otros tejidos. Estos tejidos tienen dos componentes principales, una matriz extracelular y una variedad de células de soporte. Estos dos componentes serán el foco de este laboratorio.

Con mayor frecuencia, los diferentes tipos de tejidos conectivos se especifican por su contenido de tres tipos distintivos de fibras extracelulares: fibras colágenas, fibras elásticas y fibras reticulares.

Fibras de colágeno

Las fibras de colágeno consisten en colágeno de los tipos I, II o III y están presentes en todos los tipos de tejido conectivo. El tejido conjuntivo colágeno se divide en dos tipos, según la proporción de fibras de colágeno a sustancia fundamental. La sustancia fundamental es un gel acuoso de glicoproteínas y proteoglicanos que ocupa el espacio entre los elementos celulares y fibrilares del tejido conectivo.

  • Lo suelto (tejido conjuntivo areolar) es la forma más abundante de tejido conjuntivo colágeno. Ocurre en haces pequeños y alargados separados por regiones que contienen sustancia fundamental.
  • El tejido conectivo denso está enriquecido en fibras de colágeno con poca sustancia fundamental. Si los haces de fibras muy compactos están ubicados en una dirección, se denomina regular si se orienta en múltiples direcciones, se denomina irregular. Un ejemplo de tejido conectivo denso regular es el de los tendones; un ejemplo de tejido conectivo denso irregular es el de la dermis.

Fibras reticulares

Las fibras reticulares están compuestas de colágeno tipo III. A diferencia de las fibras colágenas gruesas y gruesas, las fibras reticulares forman una red reticular delgada. Estas redes están muy extendidas entre diferentes tejidos y forman estructuras de soporte en el hígado, los órganos linfoides, el endotelio capilar y las fibras musculares.

Fibras elásticas

Las fibras elásticas contienen la proteína elastina, que se copolimeriza con la proteína fibrilina. Estas fibras a menudo se organizan en láminas lamelares, como en las paredes de las arterias. El tejido denso, regular y elástico caracteriza los ligamentos. Las fibras elásticas se pueden estirar porque normalmente están desorganizadas; estirar estas fibras hace que adquieran una estructura organizada.

Células de tejido conectivo

Fibroblasto

Los fibroblastos son, con mucho, el tipo de tejido conectivo de células nativas más común. El fibroblasto sintetiza el colágeno y la sustancia fundamental de la matriz extracelular. Estas células producen una gran cantidad de proteínas que secretan para construir la capa de tejido conectivo. Algunos fibroblastos tienen una función contráctil y se denominan miofibroblastos.

Macrófago

El macrófago es el tejido conectivo representativo del sistema reticuloendotelial o fagocito mononuclear. Este sistema consta de una serie de células fagocíticas móviles específicas de tejido que descienden de los monocitos; entre ellas se incluyen las células de Kupffer del hígado, los macrófagos alveolares del pulmón, la microglía del sistema nervioso central y las células reticulares del hígado. bazo. Encontrará cada uno de estos más adelante en el curso por ahora, asegúrese de reconocer que todos descienden de los monocitos y que el macrófago es la versión del tejido conectivo. Los macrófagos son indistinguibles de los fibroblastos, pero pueden reconocerse cuando internalizan grandes cantidades de sustancias trazadoras visibles como tintes o partículas de carbono. Los macrófagos fagocitan el material extraño en la capa de tejido conectivo y también juegan un papel importante como células presentadoras de antígenos, una función sobre la que aprenderá más en Inmunobiología.

Mastocito

Los mastocitos son células granuladas que se encuentran típicamente en el tejido conectivo. Estas células median las respuestas inmunes a las partículas extrañas. En particular, liberan grandes cantidades de histamina y enzimas en respuesta al reconocimiento de antígenos. Este proceso de desgranulación es protector cuando los organismos extraños invaden el cuerpo, pero también es la causa de muchas reacciones alérgicas.

Célula de grasa blanca

Los glóbulos blancos o adipocitos están especializados para el almacenamiento de triglicéridos y se presentan de forma individual o en pequeños grupos dispersos por todo el tejido conectivo laxo. Son especialmente comunes a lo largo de los vasos sanguíneos más pequeños. Cuando las células grasas se han acumulado en tal abundancia que desplazan o reemplazan los elementos celulares y fibrosos, la acumulación se denomina tejido adiposo. Estas células pueden crecer hasta 100 micrones y generalmente contienen una vacuola de lípido ubicada en el centro: el citoplasma forma un anillo circular alrededor de esta vacuola y el núcleo se comprime y se desplaza hacia un lado. La función de la grasa blanca es servir como fuente de energía y aislante térmico.

Célula de grasa marrón

Las células grasas pardas están altamente especializadas en la regulación de la temperatura. Estas células abundan en los recién nacidos y los mamíferos en hibernación, pero son raras en los adultos. Tienen numerosas gotas de lípidos más pequeñas y una gran cantidad de mitocondrias, cuyos citocromos imparten el color marrón del tejido. La cadena de transporte de electrones de estas mitocondrias es interrumpida por una proteína desacoplante, que provoca la disipación del gradiente de iones de hidrógeno mitocondrial sin producción de ATP. Esto genera calor.

Cartílago

El cartílago es una forma especializada de tejido conectivo producido por células parecidas a fibroblastos diferenciadas llamadas condrocitos. Se caracteriza por una matriz extracelular prominente que consta de varias proporciones de fibras de tejido conectivo incrustadas en una matriz similar a un gel. Los condrocitos se encuentran dentro de lagunas en la matriz que han construido a su alrededor. Las lagunas individuales pueden contener múltiples células derivadas de un progenitor común. Las lagunas se separan unas de otras como resultado de la actividad secretora de los condrocitos. Se clasifican tres tipos de cartílago según la abundancia de ciertas fibras y las características de su matriz.

Cartílago hialino

El cartílago hialino tiene una matriz compuesta de colágeno tipo II y condromucoproteína, un copolímero de condroitín sulfatos A y C con proteína. Su alta concentración de grupos sulfato cargados negativamente hace que parezca intensamente basófilo bajo H & ampE. Este cartílago se encuentra en la nariz, los anillos traqueales y donde las costillas se unen al esternón.

Fibrocartílago

El fibrocartílago se distingue por su alto contenido y disposición ordenada de fibras de colágeno tipo I. Por lo general, se encuentra en regiones donde los tendones se unen a los huesos, los discos intervertebrales y la sínfisis púbica.

Cartílago elástico

El cartílago elástico se caracteriza por la presencia de abundantes fibras elásticas y es bastante celular. Está formado por colágeno tipo II y se localiza en el pabellón auricular y la epiglotis.


Tejido conectivo

El cuerpo humano está compuesto por solo cuatro tipos básicos de tejido: tejido nervioso, muscular, epitelial y conectivo. El tejido conectivo es el tipo más abundante, ampliamente distribuido y variado. Incluye tejidos fibrosos, grasa, cartílago, hueso, médula ósea y sangre. Como su nombre lo indica, los tejidos conectivos a menudo unen a otros órganos, mantienen los órganos en su lugar, los protegen y llenan el espacio.

El tejido conectivo se distingue de los otros tipos en que el material extracelular (matriz) suele ocupar más espacio que las células y las células están relativamente separadas. La grasa es una excepción, ya que tiene células en estrecho contacto entre sí, pero con grandes, sin vida, lípido intracelular gotitas, la grasa contiene mucho más material inanimado que material vivo.

los matriz de tejido conjuntivo se compone típicamente de fibras y una sustancia fundamental sin rasgos distintivos. La fibra más abundante en los tejidos conectivos es una dura proteína llamado colágeno. Los tendones, ligamentos y el tejido fibroso blanco (fascia) que se ve en algunos cortes de carne están compuestos casi en su totalidad de colágeno, al igual que el cuero, que consiste en la capa de tejido conectivo (dermis) de pieles de animales. El colágeno también fortalece los huesos y los cartílagos. Elástico y reticular las fibras son proteínas del tejido conjuntivo menos abundantes con una distribución más limitada.

La sustancia fundamental puede ser líquida, como en sangre gelatinosa, como en areolar tejido gomoso, como en el cartílago o calcificado y pedregoso, como en el hueso. Consiste principalmente en agua y pequeñas cantidades disueltas iones y orgánico moléculas, pero la consistencia gelatinosa a gomosa de algunos tejidos resulta de enormes complejos de proteína-carbohidrato en la sustancia fundamental. La consistencia dura del hueso se debe principalmente a las sales de fosfato de calcio en la sustancia fundamental.

Algunas de las células del tejido conectivo son fibroblastos (que producen fibras de colágeno y son el único tipo de células en los tendones y ligamentos) adipocitos (células grasas) leucocitos (glóbulos blancos, que también se encuentran fuera del

Tipo y características del tejido conectivo Funciones Ubicaciones
Tejido conectivo areolar (suelto). Matriz suelta de fibras aleatorias con una amplia variedad de tipos de células Nutre y amortigua los epitelios, proporciona un espacio para la defensa inmunitaria contra las infecciones, une los órganos, permite el paso de los nervios y los vasos sanguíneos a través de otros tejidos. Debajo de todos los epitelios que recubren los vasos sanguíneos, nervios, esófago y otros órganos fascia entre los músculos sacos pleurales y pericárdicos
Tejido adiposo (grasa). Grandes adipocitos llenos de grasa y escasa matriz extracelular. Almacena energía, conserva el calor corporal, amortigua y protege muchos órganos, llena el espacio, da forma al cuerpo Debajo de la piel alrededor de los riñones, el corazón y los ojos, membranas abdominales (mesenterios) del seno
Tejido conectivo irregular denso. Fibroblastos y fibras densamente espaciados y dispuestos aleatoriamente. La dureza protege a los órganos de lesiones proporciona cápsulas protectoras alrededor de muchos órganos Dermis de las cápsulas cutáneas alrededor del hígado, el bazo y otros órganos Vaina fibrosa alrededor de los huesos
Tejido conectivo regular denso. Fibroblastos y fibras de colágeno paralelas y densamente espaciadas. Une los huesos y une el músculo al hueso transfiere la fuerza del músculo al hueso Tendones y ligamentos
Cartílago (cartílago). Células muy espaciadas en pequeñas cavidades (lagunas) de matriz gomosa. Facilita los movimientos de las articulaciones Resiste la compresión en las articulaciones Mantiene las vías respiratorias abiertas Formas del oído externo Mueve las cuerdas vocales Precursor del crecimiento del esqueleto fetal Zona de los huesos de los niños Oído externo, laringe, anillos alrededor de la tráquea, superficies articulares y zonas de crecimiento de los huesos, entre las costillas y el esternón, discos intervertebrales
Hueso (tejido óseo). Células muy espaciadas en lagunas, gran parte de la matriz en capas concéntricas parecidas a cebollas, matriz mineralizada dura. Apoya físicamente el cuerpo, proporciona movimiento, encierra y protege los órganos blandos, almacena y libera calcio y fósforo & # 160 esqueleto
Sangre. Eritrocitos, leucocitos y plaquetas en Transporta nutrientes, gases, desechos, hormonas, Circula en el sistema cardiovascular.

torrente sanguíneo en los tejidos conectivos fibrosos) macrófagos (células fagocíticas grandes que descienden de ciertos leucocitos) eritrocitos (glóbulos rojos, que se encuentran solo en la sangre y la médula ósea) condrocitos (células del cartílago) y osteocitos (células óseas).

La tabla anterior enumera las ubicaciones y funciones representativas de los principales tipos de tejido conectivo. Se pueden encontrar más detalles sobre el tejido conectivo en los libros de texto de histología y anatomía humana.


NUEVAS CARACTERÍSTICAS

Estadísticas de los datos de TSS recién incluidos

En esta actualización, hemos incluido un total de 330 533 354 nuevas etiquetas TSS de lectura de un solo extremo de 36 pb. Estas etiquetas se obtuvieron de una serie de bibliotecas con tapa de oligp construidas a partir de ocho tipos de tejidos humanos normales (cerebro, riñón, corazón, cerebro fetal, riñón fetal, corazón fetal, timo fetal e hígado fetal) y seis líneas celulares cultivadas (cáncer de colon DLD1, linfocito B Ramos, células epiteliales bronquiales BEAS2B, riñón embrionario HEK293, adenocarcinoma de mama MCF7 y pulmón fetal TIG3 en humanos) y células de fibroblasto NIH3T3 en ratones para obtener detalles sobre el origen de las células, consulte http://dbtss.hgc.jp /cgi-bin/cell_type.cgi. Construimos las bibliotecas del extremo 5 'usando seis tipos de células cultivadas en diferentes condiciones, como hipoxia o normoxia, y con o sin tratamiento con IL4. En total, el DBTSS actual incluye 31 tipos de células o condiciones de cultivo diferentes, cada uno de los cuales contiene aproximadamente 10 millones de etiquetas TSS (Tabla 1). Los números de acceso para cada conjunto de datos se dan en http://dbtss.hgc.jp/cgi-bin/accession.cgi. Los detalles de los procedimientos experimentales también se describen en http://dbtss.hgc.jp/docs/protocol_solexa.html.

Las etiquetas TSS en cada conjunto de datos se agruparon en contenedores de 500 pb para separar grupos de inicio de transcripción (TSC), cada uno de los cuales puede representar promotores independientes [ver también Ref. (3) para más detalles]. Los grupos del extremo 5 'se dividieron aún más según si se mapearon en la vecindad de un gen RefSeq (desde -50 Kb en sentido ascendente desde el extremo 5' de una transcripción de RefSeq hasta el extremo 3 'de la misma) o más allá de 50 Kb de distancia, en lo que llamamos una región intergénica. Como se resume en la Tabla 1, en promedio, hubo alrededor de 100 000 grupos de inicio de transcripción de RefSeq y 40 000 intergénicos por célula y por condición de cultivo. A pesar de la gran cantidad de grupos de extremos 5 ′ que son consistentes con observaciones previas de nosotros mismos (3) y de otros (5), la mayoría de los grupos estaban compuestos por uno o dos TSS. Las TSC que tienen niveles de expresión significativos, que pueden priorizarse para caracterizaciones funcionales biológicas adicionales, fueron relativamente raras. El número de TSC que tienen niveles de expresión de & gt 5 ppm (parte por millón de etiquetas, tenga en cuenta que 1 ppm corresponde a 1 copia por celda, asumiendo que cada celda contiene 1 millón de copias de ARNm) se resume en la Tabla 1. Estadísticas detalladas sobre cada sub-secuencia de TSS Seq. El conjunto de datos se muestra en http://dbtss.hgc.jp/cgi-bin/cell_type.c. Todos los datos se pueden descargar en nuestro sitio de descarga (ftp://ftp.hgc.jp/pub/hgc/db/dbtss/dbtss_ver7/).

Estadísticas de los nuevos datos de TSS Seq

Panel A
Nombre de la muestra Tipo de célula Condición Curso del tiempo Recuento de etiquetas
DLD1 (hipoxia con ARNi no marcado) Fibroblasto 1% de O2 24 h 7 723 359
DLD1 (hipoxia con HIF1A RNAi) Fibroblasto 1% de O2 24 h 7 727 105
DLD1 (Normoxia con HIF1A RNAi) Fibroblasto 21% O2 24 h 7 410 902
DLD1 (hipoxia con HIF2A RNAi) Fibroblasto 1% de O2 24 h 8 737 554
DLD1 (Normoxia con ARNi no dirigido) Fibroblasto 21% O2 24 h 8 644 835
DLD1 (Normoxia con HIF2A RNAi) Fibroblasto 21% O2 24 h 8 353 702
Beas2B sobreexpresa STAT6 IL4 + Bcell IL4 4 h 22 954 017
Beas2B sobreexpresa STAT6 IL4− Bcell 21 127 774
Beas2B padre IL4 + Bcell IL4 4 h 15 166 848
Beas2B padre IL4− Bcell 11 628 747
Beas2B stat6 siARN− IL4 + Bcell IL4 4 h 8 243 100
Beas2B stat6 siRNA− IL4− Bcell 7 857 509
Beas2B stat6 siARN + IL4 + Bcell IL4 4 h 5 879 777
Beas2B stat6 siARN + IL4− Bcell 5 931 745
Ramos IL4 + Bcell IL4 4 h 15 268 493
Ramos IL4− Bcell 15 759 413
MCF7 O2 1% Adenocarcinoma de mama 1% de O2 24 h 7 531 326
MCF7 O2 21% Adenocarcinoma de mama 21% O2 24 h 13 609 932
TIG O2 1% Pulmón fetal 1% de O2 24 h 8 848 737
TIG O2 21% Pulmón fetal 21% O2 24 h 9 235 808
293 O2 1% Riñón embrionario 1% de O2 24 h 10 590 128
293 O2 21% Riñón embrionario 21% O2 24 h 8 162 101
Corazón fetal Tejidos fetales normales 10 182 282
Riñón fetal Tejidos fetales normales 8 424 482
Hígado fetal Tejidos fetales normales 4 741 889
Timo fetal Tejidos fetales normales 7 122 556
Cerebro fetal Tejidos fetales normales 11 285 710
Cerebro Tejidos adultos normales 11 561 960
Corazón Tejidos adultos normales 9 378 901
Riñón Tejidos adultos normales 11 196 359
Ratón 3T3 Fibroblasto 20 246 303
Total 330 533 354
Panel: B
Clústeres de extremo 5 'promedio por celda Número promedio de TSC y gt 5 ppm por celda Número de genes representados (cobertura frente a los genes RefSeq totales)
Región de RefSeq 105 134 6972 17879/18001 (99%)
Región intergénica 40 537 1083 DAKOTA DEL NORTE
Panel A
Nombre de la muestra Tipo de célula Condición Curso del tiempo Recuento de etiquetas
DLD1 (hipoxia con ARNi no marcado) Fibroblasto 1% de O2 24 h 7 723 359
DLD1 (hipoxia con HIF1A RNAi) Fibroblasto 1% de O2 24 h 7 727 105
DLD1 (Normoxia con HIF1A RNAi) Fibroblasto 21% O2 24 h 7 410 902
DLD1 (hipoxia con HIF2A RNAi) Fibroblasto 1% de O2 24 h 8 737 554
DLD1 (Normoxia con ARNi no dirigido) Fibroblasto 21% O2 24 h 8 644 835
DLD1 (Normoxia con HIF2A RNAi) Fibroblasto 21% O2 24 h 8 353 702
Beas2B sobreexpresa STAT6 IL4 + Bcell IL4 4 h 22 954 017
Beas2B sobreexpresa STAT6 IL4− Bcell 21 127 774
Beas2B padre IL4 + Bcell IL4 4 h 15 166 848
Beas2B padre IL4− Bcell 11 628 747
Beas2B stat6 siARN− IL4 + Bcell IL4 4 h 8 243 100
Beas2B stat6 siRNA− IL4− Bcell 7 857 509
Beas2B stat6 siARN + IL4 + Bcell IL4 4 h 5 879 777
Beas2B stat6 siARN + IL4− Bcell 5 931 745
Ramos IL4 + Bcell IL4 4 h 15 268 493
Ramos IL4− Bcell 15 759 413
MCF7 O2 1% Adenocarcinoma de mama 1% de O2 24 h 7 531 326
MCF7 O2 21% Adenocarcinoma de mama 21% O2 24 h 13 609 932
TIG O2 1% Pulmón fetal 1% de O2 24 h 8 848 737
TIG O2 21% Pulmón fetal 21% O2 24 h 9 235 808
293 O2 1% Riñón embrionario 1% de O2 24 h 10 590 128
293 O2 21% Riñón embrionario 21% O2 24 h 8 162 101
Corazón fetal Tejidos fetales normales 10 182 282
Riñón fetal Tejidos fetales normales 8 424 482
Hígado fetal Tejidos fetales normales 4 741 889
Timo fetal Tejidos fetales normales 7 122 556
Cerebro fetal Tejidos fetales normales 11 285 710
Cerebro Tejidos adultos normales 11 561 960
Corazón Tejidos adultos normales 9 378 901
Riñón Tejidos adultos normales 11 196 359
Ratón 3T3 Fibroblasto 20 246 303
Total 330 533 354
Panel: B
Clústeres de extremo 5 'promedio por celda Número promedio de TSC y gt 5ppm por celda Número de genes representados (cobertura frente a los genes RefSeq totales)
Región de RefSeq 105 134 6972 17879/18001 (99%)
Región intergénica 40 537 1083 DAKOTA DEL NORTE

Estadísticas de los nuevos datos de TSS Seq

Panel A
Nombre de la muestra Tipo de célula Condición Curso del tiempo Recuento de etiquetas
DLD1 (hipoxia con ARNi no marcado) Fibroblasto 1% de O2 24 h 7 723 359
DLD1 (hipoxia con HIF1A RNAi) Fibroblasto 1% de O2 24 h 7 727 105
DLD1 (Normoxia con HIF1A RNAi) Fibroblasto 21% O2 24 h 7 410 902
DLD1 (hipoxia con HIF2A RNAi) Fibroblasto 1% de O2 24 h 8 737 554
DLD1 (Normoxia con ARNi no dirigido) Fibroblasto 21% O2 24 h 8 644 835
DLD1 (Normoxia con HIF2A RNAi) Fibroblasto 21% O2 24 h 8 353 702
Beas2B sobreexpresa STAT6 IL4 + Bcell IL4 4 h 22 954 017
Beas2B sobreexpresa STAT6 IL4− Bcell 21 127 774
Beas2B padre IL4 + Bcell IL4 4 h 15 166 848
Beas2B padre IL4− Bcell 11 628 747
Beas2B stat6 siARN− IL4 + Bcell IL4 4 h 8 243 100
Beas2B stat6 siRNA− IL4− Bcell 7 857 509
Beas2B stat6 siARN + IL4 + Bcell IL4 4 h 5 879 777
Beas2B stat6 siARN + IL4− Bcell 5 931 745
Ramos IL4 + Bcell IL4 4 h 15 268 493
Ramos IL4− Bcell 15 759 413
MCF7 O2 1% Adenocarcinoma de mama 1% de O2 24 h 7 531 326
MCF7 O2 21% Adenocarcinoma de mama 21% O2 24 h 13 609 932
TIG O2 1% Pulmón fetal 1% de O2 24 h 8 848 737
TIG O2 21% Pulmón fetal 21% O2 24 h 9 235 808
293 O2 1% Riñón embrionario 1% de O2 24 h 10 590 128
293 O2 21% Riñón embrionario 21% O2 24 h 8 162 101
Corazón fetal Tejidos fetales normales 10 182 282
Riñón fetal Tejidos fetales normales 8 424 482
Hígado fetal Tejidos fetales normales 4 741 889
Timo fetal Tejidos fetales normales 7 122 556
Cerebro fetal Tejidos fetales normales 11 285 710
Cerebro Tejidos adultos normales 11 561 960
Corazón Tejidos adultos normales 9 378 901
Riñón Tejidos adultos normales 11 196 359
Ratón 3T3 Fibroblasto 20 246 303
Total 330 533 354
Panel: B
Clústeres de extremo 5 'promedio por celda Número promedio de TSC y gt 5 ppm por celda Número de genes representados (cobertura frente a los genes RefSeq totales)
Región de RefSeq 105 134 6972 17879/18001 (99%)
Región intergénica 40 537 1083 DAKOTA DEL NORTE
Panel A
Nombre de la muestra Tipo de célula Condición Curso del tiempo Recuento de etiquetas
DLD1 (hipoxia con ARNi no marcado) Fibroblasto 1% de O2 24 h 7 723 359
DLD1 (hipoxia con HIF1A RNAi) Fibroblasto 1% de O2 24 h 7 727 105
DLD1 (Normoxia con HIF1A RNAi) Fibroblasto 21% O2 24 h 7 410 902
DLD1 (hipoxia con HIF2A RNAi) Fibroblasto 1% de O2 24 h 8 737 554
DLD1 (Normoxia con ARNi no dirigido) Fibroblasto 21% O2 24 h 8 644 835
DLD1 (Normoxia con HIF2A RNAi) Fibroblasto 21% O2 24 h 8 353 702
Beas2B sobreexpresa STAT6 IL4 + Bcell IL4 4 h 22 954 017
Beas2B sobreexpresa STAT6 IL4− Bcell 21 127 774
Beas2B padre IL4 + Bcell IL4 4 h 15 166 848
Beas2B padre IL4− Bcell 11 628 747
Beas2B stat6 siARN− IL4 + Bcell IL4 4 h 8 243 100
Beas2B stat6 siARN− IL4− Bcell 7 857 509
Beas2B stat6 siARN + IL4 + Bcell IL4 4 h 5 879 777
Beas2B stat6 siARN + IL4− Bcell 5 931 745
Ramos IL4 + Bcell IL4 4 h 15 268 493
Ramos IL4− Bcell 15 759 413
MCF7 O2 1% Adenocarcinoma de mama 1% de O2 24 h 7 531 326
MCF7 O2 21% Adenocarcinoma de mama 21% O2 24 h 13 609 932
TIG O2 1% Pulmón fetal 1% de O2 24 h 8 848 737
TIG O2 21% Pulmón fetal 21% O2 24 h 9 235 808
293 O2 1% Riñón embrionario 1% de O2 24 h 10 590 128
293 O2 21% Riñón embrionario 21% O2 24 h 8 162 101
Corazón fetal Tejidos fetales normales 10 182 282
Riñón fetal Tejidos fetales normales 8 424 482
Hígado fetal Tejidos fetales normales 4 741 889
Timo fetal Tejidos fetales normales 7 122 556
Cerebro fetal Tejidos fetales normales 11 285 710
Cerebro Tejidos adultos normales 11 561 960
Corazón Tejidos adultos normales 9 378 901
Riñón Tejidos adultos normales 11 196 359
Ratón 3T3 Fibroblasto 20 246 303
Total 330 533 354
Panel: B
Clústeres de extremo 5 'promedio por celda Número promedio de TSC y gt 5ppm por celda Número de genes representados (cobertura frente a los genes RefSeq totales)
Región de RefSeq 105 134 6972 17879/18001 (99%)
Región intergénica 40 537 1083 DAKOTA DEL NORTE

Visor de dinámica de TSS

Dado que los datos de DBTSS expandidos contienen cientos de millones de datos de TSS recopilados de docenas de diferentes tipos de células en diversas condiciones de cultivo, es esencial representar los datos de TSS para satisfacer los intereses de los usuarios. De lo contrario, la base de datos se convierte en una compilación confusa de datos TSS masivos. Primero, enmascaramos los grupos con niveles de expresión muy bajos (& lt5 ppm en la configuración predeterminada, aunque hay una opción para mostrar todos los TSS), considerando que podrían derivarse del ruido transcripcional intrínseco de las células (10) u otros errores experimentales. . En segundo lugar, clasificamos los TSC en una serie de datos de TSS Seq para que los usuarios puedan comprender empíricamente el uso diferencial de los TSS en diferentes tipos de células o condiciones de cultivo. Para la representación gráfica, desarrollamos una serie de nuevas interfaces como se muestra en las Figuras 1 y 2. Se pueden recuperar los TSS correspondientes a un gen particular de interés para el usuario (Figura 1B) y se puede representar su uso diferencial en diferentes circunstancias celulares. La Figura 1D ejemplifica el promotor alternativo específico de tejido. En el gen de la proteína 622 del dedo de zinc (NM_033414), el segundo promotor alternativo corriente arriba (verde musgo) se usó selectivamente en el corazón fetal, mientras que se usó un promotor alternativo diferente (verde claro) en los otros tejidos, incluido el adulto. Además, utilizando nuestra nueva página de búsqueda como se muestra en la Figura 1C, los usuarios pueden buscar promotores que muestren cambios de expresión significativos en respuesta a cambios ambientales particulares.

Interfaces del "visor de etiquetas TSS" recientemente implementado. La información de la etiqueta de secuencia TSS se puede recuperar desde la página superior (A) siguiendo cualquiera de los enlaces. Los espectadores correspondientes a cada enlace están representados en las figuras indicadas. (B) En el formulario "Búsqueda de base de datos", los usuarios pueden especificar directamente las etiquetas del extremo 5 'de un gen o tipo de célula que desean ver. (C) En el formulario "Búsqueda de etiquetas TSS", los usuarios pueden buscar etiquetas TSS especificando tipos de células, inducción de pliegues y / o recuentos de etiquetas. También pueden elegir qué categoría de etiquetas deben considerarse (por ejemplo, si las etiquetas de diferentes promotores alternativos deben contarse por separado o no). (D) Un ejemplo de promotores alternativos específicos de la etapa de desarrollo. En el gen de la proteína 622 del dedo de zinc (NM_033414), el promotor indicado en verde musgo (segundo panel) se usa selectivamente en el corazón fetal. Los paneles superior e inferior representan los usos de la etiqueta TSS en tejidos adultos y fetales, respectivamente. La altura de las barras verticales representa el número de etiquetas TSS Seq ubicadas en las regiones genómicas correspondientes. Los diferentes promotores alternativos están representados por diferentes colores. Cada línea horizontal representa la condición experimental de la que se derivaron las etiquetas TSS. Las leyendas de los tejidos y la suma de los recuentos de etiquetas TSS se muestran en el margen derecho. (mi) Ejemplo del caso en el que se observó una inducción alternativa específica de promotor en respuesta a la estimulación de IL-4 en células de Ramos. En el gen de la proteína LOC746 hipotética (NM_ 014206), el promotor alternativo indicado en rojo (primer panel) se induce selectivamente mientras que el otro promotor alternativo indicado en azul (segundo panel) permanece sin cambios. Las regiones de TSS indicadas se amplían al nivel de nucleótidos en los paneles inferiores inferiores.

Interfaces del "visor de etiquetas TSS" recientemente implementado. La información de la etiqueta de secuencia TSS se puede recuperar desde la página superior (A) siguiendo cualquiera de los enlaces. Los espectadores correspondientes a cada enlace están representados en las figuras indicadas. (B) En el formulario "Búsqueda de base de datos", los usuarios pueden especificar directamente las etiquetas del extremo 5 'de un gen o tipo de célula que desean ver. (C) En el formulario "Búsqueda de etiquetas TSS", los usuarios pueden buscar etiquetas TSS especificando tipos de células, inducción de pliegues y / o recuentos de etiquetas. También pueden elegir qué categoría de etiquetas deben considerarse (por ejemplo, si las etiquetas de diferentes promotores alternativos deben contarse por separado o no). (D) Un ejemplo de promotores alternativos específicos de la etapa de desarrollo. En el gen de la proteína 622 del dedo de zinc (NM_033414), el promotor indicado en verde musgo (segundo panel) se usa selectivamente en el corazón fetal. Los paneles superior e inferior representan los usos de la etiqueta TSS en tejidos adultos y fetales, respectivamente. La altura de las barras verticales representa el número de etiquetas TSS Seq ubicadas en las regiones genómicas correspondientes. Los diferentes promotores alternativos están representados por diferentes colores. Cada línea horizontal representa la condición experimental de la que se derivaron las etiquetas TSS. Las leyendas de los tejidos y la suma de los recuentos de etiquetas TSS se muestran en el margen derecho. (mi) Ejemplo del caso en el que se observó una inducción alternativa específica de promotor en respuesta a la estimulación de IL-4 en células de Ramos. En el gen de la proteína LOC746 hipotética (NM_ 014206), el promotor alternativo indicado en rojo (primer panel) se induce selectivamente mientras que el otro promotor alternativo indicado en azul (segundo panel) permanece sin cambios. Las regiones de TSS indicadas se amplían al nivel de nucleótidos en los paneles inferiores inferiores.

Interfaz del "visor ncRNA" actualizado y "visor genómico comparativo". (A) Ejemplo de las etiquetas TSS identificadas en las regiones circundantes de pequeños ARN notificados. Se muestra el resultado de la búsqueda de un ncRNA pequeño, miR9-2. El ADNc completo (AK091356) identificado en la misma región también está representado por recuadros naranjas. (B) Conservación evolutiva de los promotores alternativos de los genes de la proteína quinasa C zeta (PRKCZ) (NM_002744). Los diferentes promotores alternativos están marcados con diferentes colores. Los paneles superior e inferior representan la información de TSS en humanos y ratones, respectivamente. Las secuencias genómicas correspondientes se alinearon de acuerdo con la información de UCSC Genome Browser.

Interfaz del "visor ncRNA" actualizado y "visor genómico comparativo". (A) Ejemplo de las etiquetas TSS identificadas en las regiones circundantes de pequeños ARN notificados. Se muestra el resultado de la búsqueda de un ncRNA pequeño, miR9-2. El ADNc completo (AK091356) identificado en la misma región también está representado por recuadros naranjas. (B) Conservación evolutiva de los promotores alternativos de los genes de la proteína quinasa C zeta (PRKCZ) (NM_002744). Los diferentes promotores alternativos están marcados con diferentes colores. Los paneles superior e inferior representan la información de TSS en humanos y ratones, respectivamente. Las secuencias genómicas correspondientes se alinearon de acuerdo con la información de UCSC Genome Browser.

También, por ejemplo, los usuarios pueden buscar todos los promotores alternativos con una inducción de más de 5 veces después de la estimulación con IL-4 en células Ramos y con un nivel de expresión & gt5 ppm. La figura 1E muestra el resultado de dicha búsqueda. En el gen de la proteína LOC746 hipotética (NM_014206), se indujo selectivamente el segundo promotor alternativo (rojo), mientras que el nivel de expresión del otro promotor alternativo corriente abajo (azul) permaneció sin cambios. Cabe señalar que el análisis de expresión mediante micromatrices o RT-PCR podría pasar por alto dichos cambios de expresión específicos del promotor según las posiciones de las sondas de ADN diseñadas o los cebadores de PCR.Hasta donde sabemos, no existe una base de datos que represente el uso diferencial de cada uno de los promotores en diferentes condiciones experimentales de manera cuantitativa. Estudios recientes han sugerido que las regulaciones transcripcionales tan diversas dan una base molecular para producir una red funcional compleja de genes humanos mediante un número limitado de genes totales (7-9). Además, la identificación precisa de los cambios en la expresión génica asociados a cada promotor alternativo es esencial para interpretar la acumulación de datos de ChIP-Seq (11), por ejemplo, para atribuir la inducción de la transcripción a la unión proximal de un factor de transcripción particular. El DBTSS actualizado cumplirá los requisitos versátiles del análisis de la red transcripcional de genes humanos en la era de secuenciación de la próxima generación.

Información de TSS para ARN no codificantes

La información de TSS recopilada de manera imparcial en todo el genoma humano también es útil para identificar y caracterizar transcripciones no identificadas hasta ahora. En particular, la nueva versión de DBTSS puede ser un recurso único e importante para identificar transcripciones primarias de miRNA y otros RNA no codificantes (ncRNA) que se encuentran en regiones intergénicas (12). Aunque se han identificado cientos de ncRNA putativos y se ha llevado a cabo su caracterización biológica, ha habido sólo unos pocos casos en los que se identificaron los TSS de las transcripciones primarias de los ncRNA y se aclararon sus estructuras promotoras. El nuevo DBTSS contiene información de la base de datos miRBase (13) e información de transcripción NR de la base de datos RefSeq (14), y se pueden recuperar los TSS dentro de una distancia definida arbitraria de los ncRNA. Como se muestra en la Figura 2A, se encontró un posible TSS de una transcripción primaria de un miRBase miRNA miR9-2 (miRBase http://microrna.sanger.ac.uk/cgi-bin/sequences/mirna_entry.pl?acc=MI0000467) en regiones aguas arriba de 6 Kb de miR9-2. Además, nuestros datos de secuencia de ADNc también sugirieron que este miARN existe en la región terminal del extremo 3 'de una transcripción putativa no codificante, AK091356.

Visor de genómica comparativa actualizado

Aunque DBTSS ahora incluye una cantidad de datos sin precedentes, nos preocupaba que muchos promotores y ncRNAs pudieran ser productos de "ruido de transcripción", que podría ocurrir en el genoma humano y, por lo tanto, no tener relevancia biológica. Para abordar esta preocupación, actualizamos nuestro visor genómico comparativo para que los usuarios puedan examinar la conservación evolutiva de las secuencias genómicas circundantes y la información de la etiqueta TSS frente a otros mamíferos. La Figura 2B ejemplifica el caso en el gen de la proteína quinasa C zeta (PRKCZ) (NM_002744). Este gen contiene al menos tres promotores alternativos resaltados en azul, rojo y verde. El promotor más ascendente y el tercero (azul y verde) se utilizan en el riñón y el corazón fetal, mientras que el segundo promotor (rojo) se utiliza de forma selectiva en el cerebro fetal. La secuencia genómica de los dos primeros promotores (azul y rojo) está bien conservada entre humanos y ratones y se observaron las correspondientes etiquetas TSS en ambas especies. Por el contrario, la secuencia genómica que rodea al tercer promotor (verde) no se conserva y este promotor no parece utilizarse en ratón. Para delinear las regulaciones transcripcionales complejas de este gen, es esencial considerar diferentes usos y diferentes niveles de conservación evolutiva de cada uno de los promotores como se representa aquí.

De manera similar, examinamos la conservación evolutiva de las CET intergénicas de & gt5ppm y descubrimos que al menos la mitad no se conserva entre humanos y ratones (el análisis detallado se publicará en otra parte). Todavía no está claro si estos grupos intergénicos de inicios de transcripción corresponden a ARN codificantes o no codificantes de proteínas que realizan funciones biológicas específicas para humanos o no. Pero la información proporcionada en la pantalla comparativa debería proporcionar pistas útiles para priorizar los objetivos y diseñar experimentos futuros con el objetivo de realizar más estudios funcionales.


Resultados

Efectos genéticos sobre la expresión génica y la metilación del ADN

Anteriormente informamos del descubrimiento de cis asociaciones entre la variación genética y la expresión génica (loci de rasgos cuantitativos expresados ​​eQTL) y entre la variación genética y la metilación del ADN (QTL de metilación mQTL) en fibroblastos primarios, líneas de células linfoblastoides transformadas por EBV (LCL) y células T primarias de recién nacidos, que son se muestra en la Tabla 1 [37]. Aquí, hemos evaluado el nivel de replicación de los eQTL de LCL con los eQTL de LCL informados en un estudio de RNA-seq de mayor potencia utilizando líneas celulares más antiguas de individuos adultos [5]. Esto produce una replicación de aproximadamente el 70% basado en la proporción de verdadero positivo de una distribución de valor P [38] y la comparación del tamaño del efecto (Fig. S1). En este estudio también hemos analizado la ubicación de los eQTL y mQTL previamente descubiertos. Como se observó en estudios previos de microarrays, eQTLs altamente significativos se agrupan cerca del TSS [39]. Además, cuando los genes eQTL se clasifican por si se denominan significativos en uno, dos o tres tipos de células, observamos que los eQTL significativos en todos los tipos de células tienden a estar menos distantes del TSS que los eQTL significativos en dos tipos de células. , y estos están menos distantes que los significativos en un solo tipo de célula (Fig. S2). Se observa el mismo patrón para los eQTL de LCL que se replicaron en un conjunto de datos independientes, así como para un análisis similar que se ocupa mejor de la maldición del ganador (S2C-D Fig.). Esto replica los patrones observados en estudios anteriores [6, 22], y aunque algunos eQTL pueden clasificarse erróneamente debido a la maldición del ganador, este patrón puede reflejar la importancia de elementos reguladores distantes, como los potenciadores, en la regulación específica de tejido. Además, también encontramos una gran proporción de eQTL muy cerca del sitio final de la transcripción (TES S3 Fig.), Similar a las observaciones anteriores [4, 40]. También confirmando estudios previos con arreglos de resolución más baja [20], los mQTL altamente significativos están sobrerrepresentados cerca del sitio CpG interrogado (PAG & lt 1.3E-14 S4 Fig.). En todos los tipos de células, observamos que los mejores eQTL por gen están significativamente enriquecidos en sitios hipersensibles a ADNasa I, exones e islas CpG (Fig. 1A, ver también Fig. S5). También en todos los tipos de células, los mQTL se enriquecen significativamente en potenciadores y aislantes, y se reducen en los últimos exones e intrones (Fig. 1B; véase también la Fig. S6). Varios de estos QTL implican SNP que se ha informado que están asociados con diversas enfermedades y rasgos según la literatura de estudios de asociación del genoma amplio [41] (GWAS) - 8, 3 y 4 eQTL, y 32, 51 y 74 mQTL, en fibroblastos , LCL y células T, respectivamente, aunque este enriquecimiento no es significativo y no implica necesariamente una relación causal entre estos eQTL o mQTL y la enfermedad. En conclusión, las variantes genéticas que afectan la expresión génica y los niveles de metilación del ADN a menudo se superponen con elementos genómicos funcionales. Esto también indica que la variación de la secuencia de ADN influye en gran medida en el nivel de metilación. Las variantes genéticas que afectan a la metilación del ADN se encuentran predominantemente en regiones reguladoras distantes, como se muestra aquí, o en los promotores de islas no CpG como se muestra antes [37], en lugar de dentro de los genes. Estos resultados son compatibles con las observaciones de metilación diferencial a través de tejidos que se encuentran predominantemente distantes a los sitios de inicio de la transcripción [31], y enriquecidos por la variación de metilación interindividual asociada a la variación genética [37].


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