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¿Número constante o variable de quiasmas durante la recombinación?

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Durante la recombinación, ¿el número de quiasmas es consistente para cada gameto y las regiones de quiasmas son consistentes dentro de un solo organismo?


Existe una gran variación en la distribución y el número de quiasmas o cruces (CO). El número total de quiasmas por célula puede variar dentro del mismo organismo. Donde ocurren los quiasmas a lo largo del cromosoma tampoco es consistente de célula a célula. Los puntos calientes son regiones de 1-2 kb que experimentan una recombinación elevada en comparación con las regiones genómicas vecinas. Una forma de pensar en la distribución de CO es que ~ 80% de la recombinación ocurre en puntos calientes que comprenden ~ 10% del genoma.

La recombinación depende del contexto de la cromatina, por lo que los quiasmas son raros cerca del centrómero y la interferencia positiva da como resultado que los quiasmas estén espaciados a lo largo del cromosoma. Una buena predicción del número total de quiasmas por célula es al menos 1 por cromosoma. Algunos investigadores sostienen que un CO por brazo cromosómico es más preciso.

A continuación se muestra un enlace a un buen artículo que amplía algunas de las formas en que la recombinación varía en los seres humanos. http://www.nature.com/nrg/journal/v8/n1/abs/nrg1947.html


Los quiasmas y el componente del cinetocoro Dam1 son cruciales para la eliminación de las uniones cromosómicas erróneas y la oscilación del centrómero en la meiosis I

El establecimiento de uniones cromosómicas adecuadas al huso requiere la eliminación de uniones erróneas, pero el mecanismo de este proceso no se comprende completamente. Durante la meiosis I, las cromátidas hermanas se adhieren al mismo polo del huso (unión mono-orientada), mientras que los cromosomas homólogos se adhieren a polos opuestos (unión bi-orientada), lo que resulta en una segregación cromosómica homóloga. Aquí, mostramos que los quiasmas que enlazan los cromosomas homólogos y el componente de cinetocoro Dam1 son cruciales para la eliminación de las uniones erróneas y la oscilación de los centrómeros entre los polos del huso en la meiosis I en la levadura de fisión. En las células formadoras de quiasmas, la quinasa Mad2 y Aurora B, que proporciona tiempo para la corrección de la unión y desestabiliza las uniones erróneas, respectivamente, causó la eliminación de las uniones bi-orientadas de las cromátidas hermanas, mientras que en las células que carecen de quiasma, causaron la eliminación de las uniones monoorientadas. archivos adjuntos. En las células formadoras de quiasmas, además, se coordinó la oscilación del centrómero homólogo. Además, Dam1 contribuyó a la eliminación de la unión tanto en las células formadoras de quiasma como en las que carecen de quiasma, e impulsó la oscilación del centrómero. Estos resultados demuestran que los quiasmas alteran los patrones de corrección de la unión al permitir que los factores de corrección de errores eliminen la unión bi-orientada de las cromátidas hermanas, y sugieren que Dam1 induce la eliminación de las uniones erróneas. La contribución coincidente de los quiasmas y Dam1 a la oscilación del centrómero también sugiere un vínculo potencial entre la oscilación del centrómero y la eliminación del apego.

1. Introducción

La segregación fiel de los cromosomas durante la división celular es esencial para la integridad del genoma. Durante la división de una célula somática (mitosis), los cromosomas duplicados (cromátidas hermanas) se adhieren a los polos del huso opuestos (unión bi-orientada) a través de microtúbulos (MT) y se segregan entre sí (segregación ecuacional). Tal división genera dos células hijas genéticamente idénticas (figura 1a, mitosis) [2]. Por el contrario, durante la primera de dos divisiones consecutivas de una célula germinal (meiosis), los cromosomas homólogos se adhieren a los polos opuestos y se segregan, lo que lleva a la generación de gametos que contienen la mitad del número original de cromosomas (figura 1a, meiosis I).

Figura 1. Los efectos del deterioro de la corrección de errores en la segregación de cromátidas hermanas en la meiosis I. (a) Organización, unión del huso y segregación de cromosomas en mitosis y meiosis I. Se muestran. (B) Hipótesis sobre el papel del mecanismo de corrección de errores en la unión del huso de cromátidas hermanas en presencia y ausencia de quiasmas. Círculos de puntos, archivos adjuntos corregidos por el mecanismo de corrección de errores. (C) Patrones de segregación de centrómeros visualizados con GFP de cromátidas hermanas en cigotos y pat1 células haploides. (D,mi) Frecuencias de segregación ecuacional en la meiosis I en rec12 + (D) y rec12Δ células (mi). (F) Segregación ecuacional del cromosoma 2 en la meiosis I en pat1 células haploides. los pat1 Las células haploides se vieron obligadas a entrar en la meiosis mediante la activación de la vía de señalización de feromonas de apareamiento y la posterior inactivación de la quinasa Pat1 a la temperatura restrictiva, las cuales son necesarias para la inducción de la segregación de tipo reduccional de las cromátidas hermanas en las células haploides [1]. En (DF), se analizó la segregación cromosómica en más de 50 células y las barras muestran promedios de más de tres experimentos independientes. cen1, cromosoma 1 cen2, cromosoma 2 +, sin otras mutaciones. Líneas punteadas en (D,mi) distinguir resultados para cen1 y cen2. Las barras de error muestran errores estándar. *pag & lt 0.05 **pag & lt 0.005 (Estudiante t-prueba). Análisis estadístico de corrección de errores: competente (+) y corrección de errores defectuosa (mad2Δ y ark1-so) sgo1Δ se muestran las celdas.

Los apegos adecuados se establecen mediante un proceso dinámico [3–6]. Los cromosomas se unen al huso de forma aleatoria a través de cinetocoros, que son complejos de proteínas que se ensamblan en los centrómeros [7-9]. Los cinetocoros se adhieren inicialmente a los MT del huso en su lado lateral y, posteriormente, en sus extremos. Estudios recientes mostraron que Ndc80 y los complejos Dam1 / DASH (complejo Ska en vertebrados) forman uniones de extremo y acoplan el desmontaje de MT al movimiento del centrómero. Debido a la naturaleza aleatoria de la unión inicial, las cromátidas hermanas o los cromosomas homólogos a menudo se unen erróneamente al mismo polo (unión monoorientada) en la mitosis o la meiosis I, respectivamente. Estas uniones mono-orientadas erróneas son inestables y finalmente se eliminan los cromosomas para luego repetir los procesos de unión y desprendimiento hasta que se adhieren al huso correctamente. Además, durante el establecimiento de la unión, los centrómeros se mueven continuamente hacia adelante y hacia atrás entre los polos del huso por las fuerzas generadas por el desmontaje de MT en los cinetocoros [4-6,10]. Sin embargo, no está claro cómo se eliminan selectivamente las uniones erróneas durante la oscilación de los centrómeros.

Se cree ampliamente que el apego adecuado se establece a través de la tensión [11,12]. Durante la mitosis, las cromátidas hermanas bi-orientadas son empujadas hacia polos opuestos, y las fuerzas de tracción generan tensión porque las hermanas se mantienen unidas por un complejo proteico llamado cohesina [13]. En el modelo actual, esta tensión provoca la estabilización del apego bi-orientado, mientras que el apego mono-orientado sin tensión es inestable y está sujeto a eliminación. Asimismo, en la meiosis I, debido a que los cromosomas homólogos están unidos por productos de recombinación llamados quiasmas, su unión bi-orientada genera tensión, que se cree que estabiliza las uniones [2,11,12].

Se han identificado varios factores como componentes del mecanismo que corrige los adjuntos erróneos. Los factores del punto de control del ensamblaje del huso (SAC) inhiben el inicio de la anafase, lo que proporciona tiempo para la corrección de las uniones erróneas (p. Ej., [14]), y la quinasa Aurora B desestabiliza las uniones erróneas al fosforilar los componentes del cinetocoro, incluidos Ndc80 y Dam1 [3,15-17] . De manera constante, el deterioro de la vía SAC o de la quinasa Aurora B aumenta la frecuencia de uniones erróneas tanto en la mitosis como en la meiosis I [18-26]. El enriquecimiento de la quinasa Aurora B en la región del centrómero interno, debajo del cinetocoro externo, sugiere que la separación espacial dependiente de la tensión de los cinetocoros externos del centrómero interno impide la fosforilación del cinetocoro externo dependiente de Aurora, estabilizando así las uniones [3,19,27 ].

Aunque la estabilización dependiente de la tensión es actualmente el modelo ampliamente aceptado para la selección del apego, no puede explicar fácilmente la selección del apego en la meiosis. En la meiosis I, los cromosomas homólogos están unidos a polos opuestos, mientras que las cromátidas hermanas están unidas al mismo polo. La unión monoorientada de cromátidas hermanas también es crucial para la segregación de cromosomas homólogos. En la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe, los centrómeros hermanos son a menudo bi-orientados y sufren una división transitoria [28]. Aunque se supone que estos apegos generan tensión, eventualmente se eliminan. Además, en los ovocitos de ratón, el establecimiento de uniones correctas no se correlaciona con la tensión generada en los cinetocoros, además, la tensión no parece causar la separación espacial de los cinetocoros de la región enriquecida con Aurora [20]. Por tanto, la selección del apego en la meiosis I sigue siendo enigmática.

En la meiosis I, los quiasmas son cruciales para la unión bi-orientada de cromosomas homólogos. Sin embargo, informamos anteriormente que en S. pombe, los chiasmas también contribuyen a la unión mono-orientada de las cromátidas hermanas al evitar su unión bi-orientada [28]. No está claro cómo los quiasmas previenen la unión bi-orientada de cromátidas hermanas. Aquí, examinamos la prevención dependiente del quiasma del apego bi-orientado con mayor detalle y descubrimos que los quiasmas permitían factores de corrección de errores para eliminar el apego bi-orientado de cromátidas hermanas y la oscilación coordinada del centrómero homólogo. Además, encontramos que la proteína del cinetocoro Dam1 contribuyó a la corrección de la unión y fue esencial para la oscilación del centrómero. Estos hallazgos demuestran la importancia de la organización de los cromosomas y la actividad del cinetocoro en la eliminación de apegos erróneos y revelan un vínculo potencial entre la oscilación del centrómero y la eliminación del apego.

2. Resultados

2.1. Los quiasmas cambian los efectos del mecanismo de corrección de errores en la segregación de cromátidas hermanas

Anteriormente informamos que las cromátidas hermanas con frecuencia se adhieren a los polos del huso opuestos y que los quiasmas previenen estas uniones [28]. Presumimos que los quiasmas cambian los tipos de apego que son eliminados por el mecanismo de corrección de errores de tal manera que, en presencia de quiasmas, el mecanismo elimina selectivamente el apego bi-orientado de cromátidas hermanas, reteniendo así el apego mono-orientado en contraste con la situación en la mitosis. (Figura 1B, con quiasmata). Si es así, el deterioro del mecanismo de corrección de errores debería aumentar la frecuencia de la unión bi-orientada en las células formadoras de quiasmas debido a la eliminación defectuosa. Por el contrario, en células que carecen de quiasmas, el mecanismo de corrección de errores eliminaría selectivamente la unión monoorientada de cromátidas hermanas, como en la mitosis (figura 1B, sin quiasmas), y la degradación de la corrección de errores debería aumentar su apego monoorientado.

Para probar esta idea, comprometimos el mecanismo de corrección de errores y evaluamos las uniones del huso de las cromátidas hermanas en las células que forman y que carecen de quiasmas. Para comprometer el mecanismo de corrección de errores, presentamos el mad2Δ mutación o la ark1-so mutación, que reprime la expresión meiótica de la arca1 gen que codifica la quinasa Aurora B de levadura de fisión [25]. los mad2Δ Se cree que la mutación reduce el tiempo disponible para corregir uniones incorrectas al comprometer la vía SAC, mientras que ark1-so la mutación afecta la eliminación del apego y previene la activación del SAC. Para evaluar las uniones, examinamos la segregación de cromátidas hermanas visualizando el locus centrómero-proximal de uno de los homólogos del cromosoma 1 (cen1) o 2 (cen2) utilizando el sistema de reconocimiento lacI / lacO (figura 1C) [1, 29]. En este análisis, eliminamos el sgo1 gen, que codifica una de las dos proteínas Shugoshin de la levadura de fisión que funciona específicamente como protector de cohesión del centrómero durante la meiosis y previene la separación de cromátidas hermanas unidas a polos opuestos [28, 30-33].

La segregación de cromátidas hermanas a los polos opuestos (segregación ecuacional) fue muy rara en todos los tipos de células en el sgo1 + fondo (figura 1D), lo que confirma que Sgo1 evita la separación de cromátidas hermanas [28,31,32]. Por el contrario, en el sgo1Δ antecedentes, aunque la segregación ecuacional fue rara en las células formadoras de quiasmas (figura 1D), fue muy frecuente en diploides rec12Δ células [28], que no forman quiasmas debido a la falta de Rec12 (un homólogo de Spo11 en la levadura de fisión), un factor necesario para la formación de roturas de doble hebra de ADN (figura 1mi, +) [34]. La segregación ecuacional frecuente no fue causada por una pérdida de funciones de Rec12, como lo demuestra la observación de que la segregación ecuacional también fue frecuente en las células meióticas haploides, que no forman quiasmas (figura 1).C y F, +) [28]. Es importante destacar que en el sgo1Δ antecedentes, introducción de la mad2Δ o ark1-so mutación aumentó significativamente los porcentajes de segregación ecuacional en células diploides formadoras de quiasma (figura 1D), pero disminuyó los porcentajes de segregación en diploides sin quiasma rec12Δ (Figura 1mi) o células meióticas haploides (figura 1F). Estos resultados indican que el mecanismo de corrección de errores disminuye la unión bi-orientada de las cromátidas hermanas en presencia de quiasmas, pero a la inversa aumenta la unión bi-orientada (disminuyendo así la unión mono-orientada) en ausencia de quiasmas. En nuestro estudio anterior, las frecuencias de segregación ecuacional de cen1 eran algo más altos en el rec12Δ antecedentes [28], aunque se desconoce el motivo. sin embargo, el mad2Δ La mutación también disminuyó la segregación ecuacional, siendo consistente con nuestros resultados actuales.

2.2. Los quiasmas cambian los efectos del mecanismo de corrección de errores en la división del centrómero hermano en metafase

A continuación, buscamos evaluar la unión bi-orientada de las cromátidas hermanas de una manera más directa examinando la división transitoria de los centrómeros hermanos, un resultado probable de su unión bi-orientada, que a menudo ocurre independientemente de la formación del quiasma [28]. Para evaluar con precisión la división del centrómero hermano durante la metafase, especificamos la etapa de metafase visualizando S. pombe securin Cut2, un marcador bioquímico de la etapa pre-anafase que se localiza en el huso prometa / metafase (figura 2a) [35]. Además, para seguir la dinámica fina del centrómero, determinamos posiciones tridimensionales de cen2 en el eje a alta resolución temporal mediante la adquisición de imágenes de cen2 y el cuerpo del polo del huso (SPB el centrosoma fúngico) en varios planos focales diferentes cada aproximadamente 3 s (figura 2B). Visualizamos el SPB usando un componente SPB etiquetado con GFP, Sid4 (Sid4-GFP) [36], pero dejamos una copia de Sid4 sin etiquetar en células diploides porque en nuestros análisis de células vivas, las células que contienen dos copias de Sid4 etiquetado con GFP exhibieron un alto frecuencias de segregación ecuacional de cromátidas hermanas incluso en el sgo1 + antecedentes (datos no mostrados), que probablemente se debió al deterioro de la función de Sid4 en la regulación de la salida de la anafase [37,38]. Dejar una copia de Sid4 sin etiquetar eliminó en gran medida las anomalías de segregación, como lo muestran los patrones de segregación de cromátidas hermanas en las células que contienen una copia de Sid4 sin etiquetar, que eran similares a los observados en las células que carecen de etiquetado de Sid4 (material complementario electrónico, figura S1).

Figura 2. Dinámica de centrómeros y SPB en la metafase I. (a) Localización de centrómeros y SPB visualizados con GFP y Cut2 visualizado con RFP en la metafase I (izquierda), y una imagen ampliada de los centrómeros y los SPB (derecha), mostrada por el cuadro blanco en la imagen de la izquierda. Barras, 2 µm. (B) Dinámica de centrómeros y SPB en metafase I en células de tipo salvaje. Las imágenes de proyección máxima de centrómeros y SPB tomadas cada aproximadamente 3 s se organizaron de izquierda a derecha. Las puntas de flecha indican la división de centrómeros hermanos. Bar, 2 µm. (C) Cambios en las posiciones del centrómero y SPB en la metafase I en varias células. Las imágenes de la izquierda muestran un quimógrafo de centrómeros (cen2) y SPB y los gráficos de la derecha muestran cambios en las distancias centrómero-SPB y SPB-SPB. Las barras verticales y horizontales de los quimógrafos muestran 2 µm y 30 s, respectivamente. Las flechas indican la co-localización de centrómeros con el SPB. (D) Frecuencias medias de observación de la división del centrómero por centrómero obtenidas por el método bootstrap. El gráfico muestra las frecuencias medias por centrómero. La línea de puntos distingue los resultados de rec12 + y rec12Δ células. Los números entre paréntesis en la parte superior del gráfico indican el número de centrómeros examinados. Las barras de error indican intervalos de confianza del 95%. *pag & lt 0.05 **pag & lt 0.01 (análisis bootstrap estudentizado). n.s., no significativo. pag-valores & gt 0.05 y menores que 0.1 se muestran entre paréntesis.

Durante la metafase I, los centrómeros oscilaron entre los polos del huso tanto en el tipo salvaje que forma quiasma como en el que carece de quiasma. rec12Δ células diploides, como se informó anteriormente (figura 2C material complementario electrónico, películas S1 y S2) [28]. En ambos tipos de células, los centrómeros hermanos a menudo se sometían a una división transitoria, lo que confirma nuestro hallazgo anterior de que la unión bi-orientada de las cromátidas hermanas se produce independientemente de la formación del quiasma (figura 2).antes de Cristo) [28]. Las frecuencias de división del centrómero hermano variaron (material electrónico complementario, figura S2A), pero las frecuencias medias de división por centrómero obtenidas por el método bootstrap fueron significativamente más altas en rec12Δ células que en rec12 + células (la diferencia también fue significativa en el habitual t-prueba, pag & lt 0.01 figura 2D, +). En nuestro informe anterior, las frecuencias medias de división no fueron significativamente diferentes [28]. Esta discrepancia puede deberse a la presencia de una copia sin etiquetar de Sid4 en este estudio. La elevada frecuencia de división del centrómero hermano en las células que carecen de quiasma confirma que los quiasmas previenen la unión bi-orientada de las cromátidas hermanas.

En ark1-so rec12 + células, la frecuencia media de división fue significativamente mayor que en rec12 + células, apoyando la noción de que la unión bi-orientada de cromátidas hermanas se incrementó en estas células (figura 2D). Además, aunque las diferencias no fueron significativas en otros mad2Δ o ark1-so células, las frecuencias medias de división tendían a ser más altas en el rec12 + fondo y más bajo en el rec12Δ fondo (figura 2D material complementario electrónico, películas S3 – S6). Estas tendencias eran consistentes con la idea de que cuando se deteriora el mecanismo de corrección de errores, la unión bi-orientada de cromátidas hermanas aumenta en las células formadoras de quiasmas, pero a la inversa disminuye en las células que carecen de quiasma. El mecanismo que impulsa el movimiento del centrómero está intacto en estas células mutantes, como lo demuestra la falta de diferencias significativas en las velocidades medias del centrómero, las desviaciones estándar medias de las posiciones del centrómero y las gráficas del desplazamiento cuadrático medio (MSD) de los centrómeros (material complementario electrónico , figura S2B – D).

El apoyo adicional para una frecuencia más alta de unión bi-orientada de cromátidas hermanas en células formadoras de quiasmas defectuosas en la corrección de errores provino de un análisis de posiciones de centrómero homólogas (figura 3).a). En las células de tipo salvaje, los centrómeros homólogos se colocaron en su mayoría casi paralelos al eje del huso (en ángulos de menos de 10 ° con respecto al eje del huso), mientras que en mad2Δ o ark1-so celdas, sus posiciones a menudo estaban inclinadas y no paralelas (mayor o igual a 10 ° figura 3B). Además, los centrómeros homólogos tendían a colocarse más cerca, como lo demuestra una reducción en las distancias medias de los centrómeros homólogos (figura 3).antes de Cristo). En particular, se observó colocalización de centrómeros homólogos durante el 9.2% del tiempo total de observación en ark1-so células, pero nunca se observó en células de tipo salvaje (figura 3D material complementario electrónico, tabla S1). Estos fenotipos indican una reducción en las fuerzas opuestas hacia los polos ejercidas sobre los centrómeros homólogos, lo que probablemente refleja un aumento en la frecuencia de unión bi-orientada de cromátidas hermanas. En apoyo de este punto de vista, los centrómeros homólogos ocasionalmente cambiaron sus posiciones con respecto al SPB al oscilar independientemente entre sí en ark1-so celdas (6 interruptores durante 1643 s de tiempo de observación) (figura 3D material complementario electrónico, tabla S1), que indica el ejercicio directo de fuerzas opuestas en cada uno de los centrómeros homólogos.

Figura 3. Ángulos y distancias de los centrómeros homólogos y ángulos de los centrómeros hermanos de división. (a) Ángulo de centrómeros homólogos con respecto al huso y distancia entre ellos. La foto muestra la imagen representativa de centrómeros homólogos inclinados. Las líneas de puntos blancas y rojas en la foto muestran los ejes del huso y centrómeros homólogos, respectivamente. (B) Distribución de los ángulos del centrómero homólogos en relación con el huso (gráficos superiores) y gráficos 2D de los ángulos medios y las distancias de los centrómeros homólogos en cada celda (gráficos inferiores). (C) Medias de las distancias medias entre centrómeros homólogos por célula. Las barras muestran las medias de las distancias medias en cada celda. Los dibujos muestran la relación predicha entre los archivos adjuntos y la distancia del centrómero homólogo. Las flechas negras indican las fuerzas ejercidas sobre los cromosomas. *pag & lt 0.05 (Student's t-prueba). n.s., no significativo (el número entre paréntesis muestra pag-valor). Los números entre paréntesis en la parte superior del gráfico muestran el número de celdas examinadas. Las barras de error indican errores estándar. (D) Colocalización y cambio de posición de centrómeros homólogos en ark1-so células. Las fotos muestran quimógrafos de centrómeros homólogos (cen2) y los SPB. El cuadrado rojo punteado en la foto de la izquierda indica colocalización de centrómeros. Las flechas rojas en la foto de la derecha muestran el cambio de posiciones del centrómero homólogo en relación con los SPB. Barra horizontal: 30 s barra vertical: 1 µm. Tenga en cuenta que SPB # 2 estaba desenfocado hacia el final de la observación en la foto de la derecha. (mi) Ángulo de división de los centrómeros hermanos y la distancia entre ellos. La imagen muestra los centrómeros hermanos divididos (puntas de flecha) y los SPB. Las líneas de puntos indican los ejes del huso (blanco) y los centrómeros de división (amarillo y rojo). Barra, 1 µm. El dibujo superior muestra el ángulo de los centrómeros divididos con el eje del huso, "θ". El dibujo inferior muestra las uniones MT previstas de los centrómeros hermanos que se dividen inclinados. (F) Distribución de los ángulos de los centrómeros hermanos que se dividen. (gramo) Mayor inclinación de los centrómeros hermanos que se dividen en ark1-so células. Barras verdes: 0 ° ≤ θ & lt 20 ° barras marrones: 20 ° ≤ θ & lt 60 ° barras azules: 60 ° ≤ θ ≤ 90 °. +, sin otras mutaciones. Sesenta, 58, 132, 169, 22 y 109 centrómeros hermanos divididos fueron examinados en tipo salvaje, mad2Δ, ark1-so, rec12Δ, mad2Δ rec12Δ y ark1-so rec12Δ celdas, respectivamente.

Además de estos hallazgos, el análisis de las posiciones de los centrómeros hermanos que se dividen planteó la posibilidad de que, además de las cromátidas hermanas, a menudo se adhiera una sola cromátida a ambos polos. Notamos que los centrómeros hermanos divididos se inclinaban con frecuencia en una variedad de direcciones, a veces casi perpendiculares al eje del huso en ambos rec12 + y rec12Δ celdas (figura 3p.ej material complementario electrónico, figura S3), lo que sugiere que las uniones de husillo de estos centrómeros son frecuentemente diferentes de las uniones simples bi-orientadas. Introducción de la ark1-so La mutación aumentó la proporción de centrómeros hermanos divididos que se inclinaron hacia un ángulo perpendicular con respecto al eje del huso en ambos rec12 + y rec12Δ celdas (figura 3f, g material complementario electrónico, figura S3), lo que sugiere que el mecanismo de corrección de errores contribuye a la eliminación de estos apegos independientemente de la formación del quiasma. Dada la correlación entre la posición inclinada de los centrómeros homólogos y la unión bi-orientada de los centrómeros hermanos, las posiciones inclinadas de los centrómeros hermanos en división probablemente reflejaban las uniones bi-orientadas de un solo centrómero (unión merotélica) junto con la unión bi-orientada de los centrómeros hermanos (figura 3mi, dibujo inferior).

Considerando todos estos resultados juntos, llegamos a la conclusión de que los quiasmas alteran los patrones de corrección de la unión al permitir que los factores de corrección de errores eliminen la unión bi-orientada de las cromátidas hermanas.

2.3. Oscilación homóloga del centrómero coordenada de quiasmas

Debido a que se cree que las uniones sin tensión son eliminadas por los factores de corrección de errores, buscamos determinar si los quiasmas disminuyen la tensión a través de los centrómeros hermanos midiendo las distancias entre los centrómeros hermanos proyectadas en el eje del huso, que probablemente reflejan la tensión generada por las fuerzas de tracción hacia los polos. material, figuras S3 y S4). Las distancias proyectadas en las celdas de tipo salvaje revelaron dos grupos de distribución distintos que cubrían distintos rangos de distancia, mientras que las distancias en rec12Δ las celdas revelaron un solo grupo de distribución (material complementario electrónico, figura S4C). El grupo de distribución que cubrió el rango de distancia más largo en las celdas de tipo salvaje se originó principalmente a partir de un conjunto de datos de una sola celda que se muestra en la figura 2 (material complementario electrónico, figura S4C, WT w / o). Independientemente de la presencia o ausencia de este conjunto de datos en particular, sin embargo, la distancia media proyectada en las células de tipo salvaje no difirió significativamente de la de rec12Δ celdas (material complementario electrónico, figura S4D). Por lo tanto, no pudimos sacar una conclusión sobre si los quiasmas cambian la tensión a través de los centrómeros hermanos.

Dado que los cambios de tensión no se pudieron evaluar en nuestros análisis, a continuación examinamos la dinámica del centrómero con más detalle para obtener una pista sobre la eliminación dependiente del quiasma de la unión bi-orientada de cromátidas hermanas. Observamos que en las células de tipo salvaje formadoras de quiasmas, los centrómeros homólogos tendían a moverse en la misma dirección e invertir los movimientos de manera coordinada, mientras que esta tendencia no era evidente en las células sin quiasma. rec12Δ células. De hecho, los centrómeros homólogos se movieron en la misma dirección durante el 66,2% y el 46,7% del tiempo de observación en los tipos salvaje y rec12Δ celdas, respectivamente (figura 4a) este último porcentaje se acerca al del movimiento aleatorio. Además, en ark1-so células, los centrómeros a menudo alcanzaban el SPB sin invertir sus movimientos y se co-localizaban con él (la co-localización se observó durante el 6,4% del tiempo de observación en ark1-so células, pero nunca en células de tipo salvaje figura 2C, ark1-so, flechas), lo que indica que la inversión del centrómero se ve afectada por la disminución de las actividades de Aurora B. Estas observaciones sugieren una relación entre la oscilación del centrómero y la corrección del apego.

Figura 4. Relación entre los movimientos homólogos del centrómero y el análisis de correlación de la dinámica del centrómero en la metafase I. (a) Dirección de movimiento de centrómeros homólogos. Las barras azules y amarillas indican las proporciones de un par de centrómeros homólogos que se mueven en la misma dirección y en direcciones opuestas, respectivamente. (B) Autocorrelación (AC) y correlación cruzada (CC) de las velocidades del centrómero. Se muestra la relación entre los valores de correlación (AC o CC) y los movimientos del centrómero. Las flechas sobre los cromosomas muestran la dirección de los movimientos del centrómero. (C) ACF y CCF de las velocidades del centrómero en tipo salvaje y rec12Δ células. Las líneas azules y las líneas punteadas rojas, respectivamente, indican los valores de correlación medios y los intervalos de confianza del 95% obtenidos por el método bootstrap. (D) pag-valores de los valores de ACF y CCF en los puntos de tiempo indicados. (mi) pag-valores entre los valores CCF de tipo salvaje y rec12Δ celdas en los puntos de tiempo indicados. Asteriscos en (D,mi) indican diferencias significativas. El número de células examinadas y los tiempos totales de observación (mostrados entre paréntesis) son los siguientes. Tipo salvaje: 14 celdas (1326,8 s) rec12Δ: 11 celdas (1193,4 s).

Para confirmar la coordinación dependiente del quiasma de la oscilación homóloga del centrómero, caracterizamos los movimientos del centrómero de manera cuantitativa utilizando la función de correlación, que es útil para caracterizar la oscilación del centrómero (por ejemplo, [39-41]). Específicamente, recopilamos las velocidades del centrómero en relación con el SPB obtenido de todas las celdas observadas y calculamos los coeficientes de correlación entre las velocidades separadas por varios tiempos de retraso (figura 4B). El gráfico de autocorrelación de las células de tipo salvaje disminuyó y alcanzó un valor negativo aunque pequeño, el valor negativo fue estadísticamente significativo alrededor de 35 s (figura 4CD, PESO). Esto indica que los movimientos del centrómero tienden a revertirse alrededor de 35 s en las células de tipo salvaje formadoras de quiasmas (figura 4).B, superior derecha). Los gráficos de autocorrelación de rec12Δ Las células también exhibieron un patrón similar, lo que indica que los centrómeros oscilan en rec12Δ células de manera similar (figura 4C,D, rec12Δ). Por lo tanto, los centrómeros oscilan entre los dos SPB con una periodicidad débil pero significativa de una manera independiente del quiasma.

A continuación, examinamos la correlación entre las velocidades de centrómeros homólogos mediante análisis de correlación cruzada. La gráfica de correlación cruzada de células de tipo salvaje aumentó desde un valor negativo y alcanzó un pico con un valor positivo alrededor de 35 s (figura 4C), y tanto los valores negativos como los positivos fueron estadísticamente significativos (figura 4D, PESO). Esto muestra que los centrómeros homólogos tienden a moverse en la misma dirección (figura 4B, abajo a la izquierda) e invierten sus movimientos cada aproximadamente 35 s (figura 4B, inferior derecha). Por tanto, se coordina la oscilación homóloga del centrómero. Por el contrario, la trama de rec12Δ Las células diferían significativamente de la parcela de tipo salvaje y no mostraron una correlación significativa en ningún tiempo de retraso (figura 4Cmi, rec12Δ). Este resultado indica una falta de coordinación en los movimientos del centrómero homólogos. Estos resultados demuestran que los quiasmas coordinan la oscilación homóloga del centrómero.

También caracterizamos los movimientos del centrómero en ark1-so células. El valor de correlación cruzada a los 0 s fue negativo, como en las células de tipo salvaje, lo que indica que los centrómeros homólogos tendían a moverse en la misma dirección (material electrónico complementario, figura S5A, B). Sin embargo, la significación estadística de los valores de correlación de los gráficos de autocorrelación y correlación cruzada se perdió alrededor de los 35 s (material electrónico complementario, figura S5A-C). Esta observación sugiere una periodicidad debilitada de la oscilación del centrómero y es consistente con una inversión del centrómero alterada en ark1-so células. Por el contrario, no se observó tal alteración en mad2Δ células, cuyo principal defecto es la inhibición dependiente de SAC del inicio precoz de la anafase (material electrónico complementario, figura S5D-F). Los hechos de que los quiasmas coordinan la oscilación homóloga del centrómero y que la dinámica de la oscilación se altera en ark1-so las células aumentan la posibilidad de que la oscilación del centrómero esté relacionada con la eliminación del apego.

2.4. Se requiere Dam1 para la corrección del apego dependiente del quiasma

Para explorar más a fondo la relación entre la eliminación del apego y la oscilación del centrómero, a continuación buscamos mutantes del cinetocoro defectuosos en la eliminación del apego dependiente del quiasma. Entre las proteínas del cinetocoro, sospechamos que Dam1 podría contribuir a la corrección de la unión y la oscilación del centrómero porque Dam1 es un sustrato de Aurora B y un componente del complejo Dam1 / DASH que se cree que impulsa la segregación cromosómica al acoplar el acortamiento de MT con los movimientos del cinetocoro [42-50 ] descubrimos que la eliminación del apego dependiente del quiasma estaba alterada en las células que llevaban el dam1 eliminacióndam1Δ).

dam1Δ cells exhibited largely normal spore formation and only a slight decrease in spore viability (electronic supplementary material, figure S6A,B). This observation indicates that meiotic chromosome segregation is not severely impaired in dam1Δ cells, being consistent with the fact that Dam1 is not essential for chromosome segregation in mitosis [51]. In addition, both crossover and non-crossover recombination occurred at a wild-type level in dam1Δ cells (electronic supplementary material, figure S6C), indicating that recombination-dependent chiasma formation is normal in dam1Δ células.

Es importante destacar que el dam1Δ mutation impaired disjunction of homologous chromosomes (figure 5a), as seen in mad2Δ y ark1-so mutants [25,52]. Furthermore, the dam1Δ mutation increased equational segregation of sister chromatids in rec12 + cells (figure 5B, left) but it decreased equational segregation in sgo1Δ rec12Δ or haploid meiotic sgo1Δ cells (figure 5B,C). Consistent with the equational segregation frequencies, the mean splitting frequencies of sister centromeres decreased in dam1Δ rec12Δ cells, and although the difference was not significant, the mean splitting frequencies tended to be higher in dam1Δ cells (figure 5D,mi electronic supplementary material, figure S2A). In addition, opposing forces exerted on homologous centromeres decreased, as demonstrated by the increase in tilted, non-parallel positioning of homologous centromeres and the reduction in their distances (figure 5F,gramo). These phenotypes mirror those of error correction-defective mad2Δ y ark1-so mutants (figure 3B,C). Furthermore, as seen in ark1-so cells, the proportion of splitting sister centromeres that were tilted towards a perpendicular direction increased irrespective of chiasma formation (figure 5h,i electronic supplementary material, figure S3). These similarities to error correction-defective mutants strongly suggest that attachment correction is defective in dam1Δ células. los dam1Δ mutation significantly shortened the mean projected distances (electronic supplementary material, figure S4C,D), suggesting a reduction in opposing forces exerted on sister centromeres.

Figure 5. Effects of the dam1Δ mutation on chromosome attachment to the spindle at meiosis I. (a) Frequencies of non-disjunction of homologous chromosomes (cen2). (b,c) Equational segregation frequencies of sister chromatids (cen2) in diploid (B) y pat1 haploid cells (C) at meiosis I. In (a–c), chromosome segregation was analysed in more than 50 cells, and bars show averages of more than three independent experiments. Error bars show standard errors. *pag < 0.01 **pag < 0.005 ***pag < 0.0001 (Student's t-test). (D) Separated sister centromeres in dam1Δ células. Maximum projection images of centromeres and SPBs taken every approximately 3 s were arranged from left to right. Arrowheads show separated sister centromeres. Bar, 2 µm. (mi) Observation frequencies of centromere splitting obtained by the bootstrap method. Graph shows the mean frequencies per centromere. *pag & lt 0.05 **pag < 0.01 n.s., not significant (pag-value is shown in parentheses). Error bars show 95% confidence intervals. Numbers in parentheses at the top of the graph indicate the numbers of centromeres examined. +, no other mutations. Means of wild-type and rec12Δ cells were adopted from figure 2. Dotted line distinguishes results of rec12 + y rec12Δ células. (F) Distribution of angles of homologous centromeres relative to the spindle (upper graph), and 2D plots of the mean angles and distances of homologous centromeres in each cell (lower graph). (gramo) Distances between homologous centromeres. Graph shows means of the mean distances in each cell. Drawings show the predicted relationship between attachments and homologous centromere distances. Black arrows indicate forces exerted on chromosomes. Numbers in parentheses indicate the number of cells examined. *pag < 0.001 (Student's t-test). Error bars indicate standard errors. (h) Distribution of angles of splitting sister centromeres. Dotted red lines show the distributions of wild-type and rec12Δ células. (I) Increased tilting of splitting sister centromeres in dam1Δ células. Green bars: 0° ≤ θ < 20° brown bars: 20̊ ≤ θ < 60° blue bars: 60° ≤ θ ≤ 90°. +, no other mutations. Eighty-three and 56 splitting sister centromeres were examined for dam1Δ y dam1Δ rec12Δ cells, respectively.

The attachment changes did not result from premature anaphase onset or impaired Aurora B localization, as dam1Δ cells exhibited delayed anaphase onset (metaphase duration: 11.4 ± 0.7 min in wild-type cells (norte = 10) and 31.5 ± 2.3 min in dam1Δ cells (norte = 6)) and Aurora B localization patterns similar to those seen in wild-type cells (pre-anaphase punctate localization adjacent to kinetochores and anaphase spindle localization electronic supplementary material, figure S7A,B).

2.5. Dam1 is required for metaphase centromere oscillation and anaphase A

We also found that centromere oscillation was abolished in dam1Δ células. At metaphase I in both dam1Δ y dam1Δ rec12Δ cells, spindle length tended to increase (electronic supplementary material, figure S8A), perhaps reflecting the loss of inward pulling forces generate by kMT depolymerization [53], and although centromeres were on the spindle, as in wild-type cells, they remained largely still without undergoing oscillation (figure 6a,B electronic supplementary material, Movies S7–S11). Accordingly, centromere velocities and the standard deviation of centromere positions decreased markedly, and the MSD plots shifted downward (figure 6C electronic supplementary material, figure S8B,C). The auto- and cross-correlation plots exhibited different patterns from those in wild-type and rec12Δ cells (electronic supplementary material, figure S8D–F).

Figure 6. Centromere and spindle dynamics at meiosis I in dam1Δ células. (a) Behaviour of centromeres (cen2) and the spindle at meiosis I. Green indicates cen2 and SPB, and magenta indicates the spindle. Numbers indicate time (in minutes). Arrows and arrowheads indicate the SPB and cen2, respectivamente. White lines indicate cell outlines. Bar, 5 µm. (B) Changes in centromere and SPB positions at metaphase I in dam1Δ y dam1Δ rec12Δ células. Left images show kymograph of centromeres (cen2) and SPBs and right graphs show changes in centromere–SPB and SPB–SPB distances. Vertical and horizontal bars of kymographs show 2 µm and 30 s, respectively. (C) Mean centromere velocities. Dotted lines distinguish results of rec12 + and rec12Δ células. (D) Changes in centromere–SPB and SPB–SPB distances during anaphase I. (mi) Loss of anaphase A centromere movements in dam1Δ células. Photos show changes in centromere positions during anaphase I. Numbers show time in minutes from the start of anaphase. Dotted lines and arrowheads in photos show positions of SPB and cen2, respectivamente. Bar, 2 µm. Graph shows the mean centromere–SPB distances during metaphase I (Meta) and anaphase I (Ana). Numbers of centromeres examined are shown in parentheses. A dotted line in graph distinguishes results of wild-type and dam1Δ células. Error bars show standard error. *pag & lt 0.05 **pag < 0.01 ***pag < 0.0005 n.s., not significant (Student's t-test).

In addition to centromere oscillation, anaphase poleward centromere movements were impaired in dam1Δ células. Upon anaphase onset, homologous centromeres normally separate from each other by poleward movements (anaphase A), and then by spindle elongation (anaphase B) (figure 6a,D,mi, WT) [23]. En dam1Δ cells, however, anaphase poleward centromere movements rarely occurred, and their distances from the nearest SPBs were largely unchanged (figure 6a,d,e electronic supplementary material, figure S8G,H). Nonetheless, homologous centromeres successfully separated from each other as the spindle elongated (figure 6a,D), indicating that homologous centromeres undergo anaphase B without undergoing anaphase A. Notably in this regard, anaphase A movements were impaired in rec12Δ cells due to bi-oriented attachment of sister chromatids (electronic supplementary material, figure S8H) [28]. The lack of centromere oscillation and anaphase A are consistent with previously reported dam1Δ phenotypes: kinetochores remain at the MT ends for a long time (more than 20 min) and inhibit MT disassembly after kinetochore attachment to the MT ends [43,54], and chromosomes frequently fail to reach the SPB during mitotic anaphase [51,55]. The coincidental impairment of centromere oscillation, together with the attachment correction defect, provides further support for a link between attachment correction and centromere oscillation.

3. Discussion

3.1. Roles of chiasmata and Dam1 in attachment correction

In this study, we investigated whether chiasmata cause elimination of bi-oriented attachment via the error correction mechanism by analysing the attachments in mad2Δ o ark1-so cells forming or lacking chiasmata. Analysis of sister chromatid segregation, transient sister centromere splitting and homologous centromere positioning collectively revealed that in the mad2Δ y ark1-so backgrounds, bi-oriented attachment of sister chromatids increased in chiasma-forming cells, but mono-oriented attachment increased in chiasma-lacking cells. Presumably, sister chromatids are initially frequently bi-oriented irrespectively of chiasma formation, but the error correction mechanism eliminates bi-oriented attachment specifically in chiasma-forming cells. Less prominent impacts of the mad2Δ mutation on attachments than those of the ark1-so mutation probably resulted from distinct mutation-dependent defects. los mad2Δ mutation decreases the time available for correction but does not compromise attachment elimination unlike the ark1-so mutación en mad2Δ cells, despite attachment elimination, the shortage of the correction time probably resulted in incomplete attachment correction. Together, these observations indicate that chiasmata enable error correction factors to eliminate bi-oriented attachment of sister chromatids that are otherwise not eliminated.

A previous study reported that mad2 y ark1 mutations increased bi-oriented attachment of sister chromatids in the absence of chiasmata [31], contradicting the results of this study. los ark1-as mutation and a different centromere marker used in that previous study may have affected attachments. In addition, it is important to note that pairing of homologous centromeres, which occurs during meiotic prophase, may affect the initial kinetochore–MT interaction. However, the contribution of centromere pairing to the observed differences between chiasma-forming and chiasma-lacking cells is probably negligible because centromere pairing occurs at a largely normal level in rec12Δ cells [56] and equational segregation frequencies in haploid meiotic cells, which lack pairing, were almost the same as those in rec12Δ cells (figure 1mi,F).

In addition to bi-oriented attachment of sister chromatids, our analysis of sister centromere tilting suggested frequent occurrence of merotelic attachment and its elimination by the error correction mechanism, irrespective of chiasma formation. Indeed, merotelic attachment is frequently observed in chiasma-forming meiotic cells as well as in chiasma-lacking mitotic cells [57,58]. Tilted centromere positioning may have resulted from only one of the sister centromeres interacting with MT (monotelic attachment) or from detachment of sister centromeres from MTs after separation. However, given the active mobilities of splitting sister centromeres (electronic supplementary material, figure S2B–D) and the stable end-on attachment seen in dam1Δ cells [43,54], these events are likely to be rare. It is also possible that both sister centromeres interact with MTs extending from the same pole (syntelic attachment), one laterally and the other at the ends, as in vertebrate cells [59], and that bi-directional lateral sliding of one of the centromeres causes tilted positioning. However, the consistency of the frequencies of sister centromere splitting with those of equational segregation suggests that syntelic attachment is probably transient, if it occurs at all.

We also found that the dam1Δ mutation increased bi-oriented attachment of sister chromatids in chiasma-forming cells and increased mono-oriented attachment in chiasma-lacking cells. This suggests that Dam1 plays a crucial role in the attachment correction. The increased tilting of splitting sister centromeres seen in rec12 + dam1Δ cells further supports this notion. Porque dam1Δ cells exhibited delayed anaphase onset, Dam1 must contribute to attachment elimination via an SAC-independent pathway. Given that Dam1 plays a crucial role in kinetochore–MT interaction and is a substrate of Aurora B [42,51,60], we speculate that the Dam1 complex is directly involved in the attachment elimination process as a component of the Aurora B regulatory pathway.

3.2. Functions of chiasmata and Dam1 in centromere oscillation

Using the correlation functions, we showed that centromeres oscillated irrespectively of chiasma formation and that chiasmata coordinated homologous centromere oscillation. Various experimental- and/or simulation-based studies demonstrated that coordinated oscillation of sister chromatids depends on the tension generated by sister centromere cohesion [10,61–71]. Given this notion, it is likely that coordinated homologous centromere oscillation similarly depends on tension generated by chiasmata. During oscillation of mitotic sister centromeres, kinetochore-interacting MT bundles (kMTs) extending forward of the moving centromeres (leading kMTs) drive centromere movements by their disassembly, whereas those extending rearward (trailing kMTs) assemble (electronic supplementary material, figure S9A, centromere movement and kMT dynamics) [4–6,10], and switching of either the leading or trailing kMTs induces reversal of centromere movements (electronic supplementary material, figure S9A, centromere movement and kMT dynamics) [72]. In fission yeast, Kinesin-8 motors, Klp5 and Klp6, that promote disassembly of longer kMTs induce kMT switching in the proximity of the equator [41,71,73,74]. The kMT switching causes transient centromere relaxation or stretching (electronic supplementary material, figure S9A, mitosis, transition state), which likely induces coordinated assembly/disassembly switching of the other kMTs through force-dependent changes in MT dynamics [75–78]. During homologous centromere oscillation, the kMTs probably undergo assembly and disassembly in a similar manner, and the chiasma-dependent link generates a temporal tensile change that coordinates assembly/disassembly switching of the kMTs (electronic supplementary material, figure S9A, meiosis I).

We also found that Dam1 was essential for centromere oscillation and anaphase A poleward centromere movements. This finding indicates that centromere oscillation and anaphase A depend on the same mechanism. The Dam1 complex probably drives centromere movements by coupling MT disassembly to centromere movement [49,50]. It may also promote MT disassembly, as kMT shortening is inhibited after kinetochore capture in dam1Δ cells [43,54,79]. Despite the lack of centromere oscillation and anaphase A, kinetochore–MT interactions were not eliminated in dam1Δ cells, as demonstrated by sister centromere splitting and anaphase B centromere movements. Therefore, a factor(s) in addition to Dam1 may cooperatively drive centromere movement. The factors that are likely to mediate kinetochore–MT interaction in dam1Δ cells include the Ndc80 complex, a distinct kinetochore–MT interface factor and the Klp5/Klp6 complex, which can couple MT disassembly to cargo movement like the Dam1 complex and play crucial roles in centromere oscillation and/or chromosome segregation [71,73,74,80–87]. Indeed, kinesin-8 motors are essential in dam1Δ cells [51] and contribute to stable kinetochore–MT interaction during centromere oscillation [73].

3.3. Functions of chiasma and Dam1 in attachment elimination

The precise mechanism of chiasma-dependent attachment elimination and the mechanism of Dam1-dependent attachment elimination itself remain unclear. It was previously proposed that chiasmata eliminate bi-oriented attachment of sister chromatids by generating a chromosome configuration that arranges sister kinetochores outward and the Aurora B-enriched region inward [31,88]. In this model, poleward pulling brings improper attachment sites close to the Aurora B-enriched region, leading to the elimination of the attachments. However, this configuration requires firm association of sister centromeres. When sister centromeres separate as seen in our study, improper attachment sites would barely approach the Aurora B-enriched region (electronic supplementary material, figure S9B). Therefore, the validity of this model remains debatable.

It is possible that chiasmata eliminate bi-oriented attachments by reducing tension across sister centromeres. Indeed, although we could not observe significant difference between projected inter-sister centromere distances of rec12 + y rec12Δ cells, a subset of the distances in the rec12 + cells covered a slightly shorter distance range than those covered in rec12Δ cells, suggesting a reduction in tension. However, in a rec12 + cell shown in figure 2, the projected centromere distances were comparable to or greater than those in rec12Δ cells (electronic supplementary material, figure S4C), suggesting that at least in this particular cell, tension was probably not reduced. Nonetheless, the bi-oriented attachment was eliminated as demonstrated by re-association of the splitting sister centromeres (figure 2B,C, WT). Therefore, we speculate that chiasma-dependent attachment elimination is not solely dependent on the reduction in overall tension.

Our finding that both chiasmata and Dam1 contribute to centromere oscillation raises the possibility that attachment elimination is coupled to centromere oscillation. This possibility is supported by our finding that homologous centromere oscillation dynamics are altered in the error correction-defective ark1-so mutante. One possible explanation is that centromere oscillation causes elimination of erroneous attachments. In chiasma-forming cells, when improperly attached homologous centromeres undergo oscillation via coordinated disassembly and assembly of the leading and the trailing kMTs (electronic supplementary material, figure S9C, Meiosis I), stochastic and/or length-dependent initiation of assembly/disassembly MT switching may give assembling kMT ends a chance to experience a chiasma-dependent minus end-directed load at improper attachment sites. The minus end-directed load applied to the assembling kMT ends may bring attachment sites close to the inner centromere region, inducing Aurora kinase-dependent kMT detachment. Alternatively, the minus end-directed load may cause kMT detachment due to the intrinsically weak resistance of the interaction between assembling MTs and the kinetochore to a minus end-directed load. Indeed, attachment of Stu2, a XMAP215/Dis1 family kinetochore component in budding yeast, to assembling MT ends can withstand a tensile force of approximately 4 pN under plus end-directed load [89], whereas attachment of Xenopus XMAP215 can withstand a force of only approximately 1 pN force under minus end-directed load [90]. In this model, chromosome oscillation actively eliminates improper attachments by applying a load to the improper attachment sites, and the lack of chiasmata or centromere oscillation impairs attachment elimination.

An alternative, but not mutually exclusive, possibility is that attachment elimination requires an attachment property that enables centromere oscillation. We found that centromere oscillation is impaired in ark1-so células. In addition, expression of mutant forms of the kinetochore component Ndc80 that cannot be phosphorylated by Aurora B inhibits centromere oscillation [81,83]. These observations indicate that centromere oscillation requires Aurora B-dependent kinetochore phosphorylation. In addition, variants of Dam1 or Ndc80 bearing Aurora B-phosphomimetic mutations form diffusible attachment to the MT lattice and exhibit diffusion-like movements on the MT [44,46,91]. Therefore, centromere oscillation probably depends on Aurora B-dependent diffusible attachment. Because diffusion activities of kinetochore components increase as their MT affinities decrease, only diffusible attachments may allow attachment elimination. In the absence of Dam1, attachment may become non-diffusible and non-eliminable, resulting in impairment of both centromere oscillation and elimination of erroneous attachments. Further close investigation of the effects of the phospho-mutant forms of Dam1/Ndc80 on attachment correction and centromere oscillation would be important to verify this possibility.

The chromosome oscillation-dependent mechanism can also account for the elimination of merotelic attachment of a single chromatid in a chiasma-independent manner and in both mitosis and meiosis. Perhaps, cohesin-dependent coordinated oscillation of sister chromatids eliminates merotelic attachment in the same way that coordinated homologous chromosome oscillation eliminates bi-oriented attachment of sister chromatids (electronic supplementary material, figure S9C, mitosis). Consistently, a loss of sister chromatid cohesion causes merotelic attachment in mitosis [92,93], and in dam1Δ cells, impaired centromere oscillation was accompanied by increased sister centromere tilting, a probable outcome of merotelic attachment, irrespectively of chiasma formation (figure 5I). Furthermore, the oscillation-dependent mechanisms likely contribute to attachment elimination in vertebrates, although the mechanisms are not completely the same, as demonstrated by additional contribution of Aurora A kinase to centromere oscillation and attachment correction [94,95].

The oscillation-dependent mechanism does not deny the importance of overall tension across sister centromeres in attachment elimination. It is clear that as the number of properly attached kMTs increases, tension across sister centromeres increases. Gradual elevation of tension may incrementally decrease kinetochore phosphorylation levels, resulting in an incremental increase in MT binding affinity of kinetochores, as in the case of Ndc80 phosphorylation [91]. An alternative, but not mutually exclusive, possibility is that tension greater than some threshold alters the kinetochore phosphorylation state. Kinetochore phosphorylation is regulated by phosphatases in addition to Aurora B [96], and the antagonistic actions of these enzymes may robustly maintain the kinetochore phosphorylation state during metaphase, as suggested for antagonistic regulatory systems [97]. However, once tension exceeds the threshold, the kinetochores may be completely dephosphorylated by the kinetochore regulatory system [96,98,99]. In either case, tension converts the metaphase-type diffusible, correctable attachments to the anaphase-type non-diffusible, non-correctable attachments, linking establishment of proper attachments with the metaphase-to-anaphase transition. This scenario is consistent with the well-established relationship between tension and loss of Aurora-dependent phosphorylation and attachment stabilization (e.g. [12,27,100, 101]). In addition, in this scenario, a reduction in tension leads to an increase in kinetochore phosphorylation, making the kinetochore state preferable for attachment correction this can account for correction of merotelic attachment induced by reduced tension [102].

In this study, we showed that chiasmata and Dam1 differentially contribute to the elimination of erroneous attachments and centromere oscillation. These findings raise the possibility that attachment elimination is coupled with centromere oscillation. The precise mechanisms of chiasma-dependent or Dam1-dependent attachment elimination, as well as the relationship between centromere oscillation with attachment elimination, remain to be elucidated. However, our findings and the suggested relationship will undoubtedly shed new light on understanding of the mechanisms of attachment correction and centromere oscillation. Because chromosome missegregation is associated with various diseases or disorders, including tumorigenesis and birth-related Down's syndrome, our findings may be of clinical importance.

4. Material and methods

4.1. Yeast strains, media and basic genetical methods

Strains used in this study are shown in electronic supplementary material, tables S2 and S3. Media and basic genetical methods used in this study were described previously [103]. los dam1 deletion strain was generated by replacing the entire dam1 gene with the G418-resistance gene by a PCR-based method [104,105].


Introducción

Although the number of reciprocal recombination events at meiosis is similar for organisms with widely different genome sizes such as the mouse and lily (which have between 20 and 50 events), the number of DNA-DNA interactions that are recognized by RAD51/DMC1p immunocytology at prophase of meiosis is much higher (250 for the mouse and more than 2000 for lily)(Anderson et al., 2001). It follows that most or all of these early interactions do not necessarily function in the formation of reciprocal events. Conceivably, the numbers relate to genome size, 3.3 pg for the mouse and 141 pg for lily. However, the genome sizes differ by a factor of 43, whereas the number of RAD51/DMC1 foci in the mouse differs only by a factor of 10 from the lily. A better correlate appears to be the length of paired prophase chromosomes, as measured by the total length per nucleus of the synaptonemal complexes, SCs, which are the axes of the bivalents (about 200 μm for the mouse and about 3000 μm for lily). The tentative conclusion is that these foci, which are associated with the chromosome cores and SCs, function in SC formation(Anderson et al., 2001). Synaptic failure in the absence of RAD51/DMC1 foci in SPO11 -/- mice also suggests a role for early nodules in synapsis(Baudat et al., 2000Romanienko and Camerini-Otero,2000).

Molecular models for the resolution of DNA-DNA interactions without reciprocal recombination have been discussed by Gilbertson and Stahl(Gilbertson and Stahl, 1996)and involve helicase-topoisomerase activity to resolve joint molecules. The acquisition of replication protein A, RPA and Bloom mutated protein, BLM, at the RAD51/DMC1 sites might be the physical manifestation of the models —RPA may stimulate BLM-RecQ helicase activity(Brosh et al., 2000) in concert with topoisomerase IIIa (Johnson et al., 2000) to resolve the early DNA-DNA interactions at the RAD51/DMC1 sites.

The development of reciprocal genetic exchange events at meiosis in many fungi, plants and animals can be monitored at several levels: (1) at the chromosomal level by chiasmata, which are the sites of reciprocal recombination (Jones, 1987)(2) by the recombination nodules, RNs, which correlate with genetic and cytological patterns of recombination(Carpenter, 1975Carpenter, 1979Albini and Jones, 1988) and(3) by the MLH1p sites, which are associated with crossover sites(Anderson et al., 1999)

Nodules are SC-associated, electron-microscope-defined structures that have been reported in the meiocytes of protists, fungi, plants and animals. In early meiotic prophase, `nodules' refer to the several hundreds of small dense bodies about 100 nm in diameter that are associated with chromosome cores and SCs and contain the RAD51/DMC1 proteins in lily(Anderson et al., 1997), mouse and human (Haaf et al., 1995Moens et al., 1997Barlow et al., 1997). Since the correlation of these structures with reciprocal recombination is tenuous, they are usually referred to as `early nodules', EN. The late RNs, as originally defined by Carpenter (Carpenter,1975) in Drosophila melanogaster oocyte SCs, correspond in number and location to reciprocal recombinant events in normal and mutant D. melanogaster. In the rat, `late RNs' are well defined electron-dense bodies of variable shape and size, 100 to 200 nm, located on the mature SC at pachytene stage VII of the spermatogenic pathway but not in earlier pachytene stages I to V (Clermont,1972 Moens,1978). Cross-sectioned SCs and whole-mount, shadow-cast EM preparations show that RNs are located on the surface of the SC either along the central element or obliquely across the SC(Fig. 7). The reported number of late RNs (19 to 22 per nucleus) in complete EM-reconstructed rat-pachytene nuclei, their non-random distribution and their association with MLH1 (Mut L homolog) protein in rat and mouse (this report), agree with their proposed function in reciprocal recombination by Carpenter(Carpenter, 1975Carpenter, 1979). A number of publications have assigned various proteins to RNs but the assignments have not previously been verified by EM demonstration of these proteins on the RNs.

Definition of a rat recombination nodule, RN, in a shadow-cast preparation of an SC. (A) The SC consists of two lateral elements, le, and a median central element. (B) Occasionally RPA can be detected at these RNs. Mouse RNs are somewhat smaller and less distinct and are therefore visualized with PTA in the other illustrations. The width of the SC is about 200 nm.

Definition of a rat recombination nodule, RN, in a shadow-cast preparation of an SC. (A) The SC consists of two lateral elements, le, and a median central element. (B) Occasionally RPA can be detected at these RNs. Mouse RNs are somewhat smaller and less distinct and are therefore visualized with PTA in the other illustrations. The width of the SC is about 200 nm.

We report the events in individual mouse and rat spermatocyte nuclei from early to late meiotic prophase in terms of chromosome core behavior and associated protein complexes. The immunofluorescence observations are refined and detailed by immunoelectron microscopy of the recombination-related proteins and by EM visualization of RNs. These observations are interpreted in the context of the chromosome synapsis and reciprocal recombination and discussed in relation to reports by others on these events.


Perspectives and Future Aims

The mechanisms behind inverted meiosis in holocentric organisms are currently unknown. The occurrence of inverted meiosis demands modification in the conserved mechanisms of meiotic cohesion and chromosome segregation. New adaptations and differential regulation of meiotic cohesions such as REC8 and centromere cohesion guardians such as shugoshins are expected to have happened. Additionally, modification of the spindle attachment machinery also should be expected due to an alternative centromeric organization. Furthermore, the observed chiasmata formation between holocentric chromosomes demands adaptations of the mechanisms that prevent recombination at or around centromeres. The limited knowledge of holocentromeres and close relatives of Cyperaceae limits us to speculate about what to expect in terms of adaptations of the meiotic recombination machinery to holocentricity. Future studies aiming the molecular characterization of such mechanisms will be of interest for evolutionary and comparative biology studies.


Afiliaciones

Division of Evolutionary Biology, LMU Munich, Planegg-Martinsried, Germany

Joshua V. Peñalba & Jochen B. W. Wolf

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Contribuciones

J.V.P. wrote the manuscript. J.B.W.W. edited the manuscript before submission. Both authors researched data for the article and substantially contributed to the discussion of content.

Corresponding authors


Variability of Chiasma Frequencies in Different Tomato Species

This article presents the results of comparative studies of the frequency and distribution of chiasmata in pollen mother cells (PMCs) in five diploid tomato species, Solanum lycopersicum, S. pimpinellifolium, S. peruvianum, S. habrochaites, y S. neorickii, and one autotetraploid species, S. pimpinellifolium. It was established that under the same growing conditions, the total chiasma frequency in the cell depended on the species. At the same time, the green-fruited species S. peruvianum, S. neorickii, y S. habrochaites differed in distal chiasma frequency, while the red-fruited species S. lycopersicum y S. pimpinellifolium differed in interstitial chiasma frequency. It was shown that the total chiasma frequency in PMCs of plants of one species is a stable index of recombination potential that does not depend on the growing conditions. The redistribution between distal and interstitial chiasmata was found to be more variable, depending on the species, year, geographic growth conditions. In autotetraploid, the chiasma frequency per bivalent was lower than that in diploid S. pimpinellifolium plants, primarily due to interstitial chiasmata, the frequency of which remained at the level characteristic for diploid plants. It was concluded that the recombination plasticity of the tomato genomes was due to the redistribution of chiasmata along bivalents, and not to the change in their number in the cell.


Introducción

Historically, chromosomal rearrangements have long been recognized as a major driving force promoting divergence (White, 1978), but it was only recently that the role of rearrangements as recombination modifiers has been recognized and formalized in the recombination suppression models of chromosomal speciation (Noor et al., 2001 Rieseberg, 2001 Navarro and Barton, 2003 Ayala and Coluzzi, 2005). Thus, the emphasis is no longer on the decrease in fitness of chromosomal hybrids, but on the suppression of recombination between the rearranged chromosomes, resulting in a partial barrier to gene flow between populations. The association with speciation events lies in the tight linkage between the rearrangements and reproductive isolation or locally adaptive genes owing to the suppression of recombination in chromosomal heterozygotes. Thus, rearrangements can contribute to the persistence of reproductive isolation genes in the face of gene flow for a longer time than if they were absent (Noor et al., 2001), and extend the action of linked isolation genes over larger genomic regions than if no rearrangements were present (Rieseberg, 2001 Butlin, 2005). The emergence of the recombination suppression models stimulated a considerable amount of both empirical (for example, Lowry and Willis, 2010 Ayala et al., 2011 MacGaugh and Noor, 2012 Farré et al., 2013) and theoretical (for example, Kirkpatrick and Barton, 2006 Feder and Nosil, 2009 Faria and Navarro, 2010) studies exploring the operational conditions, mechanisms and processes involved. Most, if not all, of these analyses have focused on inversions and reciprocal translocations, whereas the most widespread rearrangement, Robertsonian (Rb) fusion/fission, has received considerably less attention (King, 1993).

The aim of the present study is to assess the effect of heterozygosity for Rb fusions on recombination patterns. These rearrangements consist of the joining of two nonhomologous acrocentric chromosomes by the centromere to form one biarmed chromosome. The house mouse, Mus musculus domesticus, was chosen as the biological model for several reasons. First, extensive chromosomal diversity through fixation of Rb fusions occurs throughout its distribution and all chromosomes, except the sex pair, are involved in Rb fusions in wild populations (Piálek et al., 2005). Second, underdominance levels of simple Rb heterozygotes, that is, carrying trivalents formed by the pairing of Rb fusions with the two homologous acrocentrics, are well documented in this subspecies. In particular, the data indicate that heterozygosity for a single-Rb fusion has a limited effect on hybrid fitness (Hauffe and Searle, 1998 Sans-Fuentes et al., 2010) in this case, there will be almost no constraint on its fixation probability, but conversely, its contribution to postmating isolation will be extremely reduced unless it is associated with changes in recombination pattern. Finally, several studies have indicated a reduction in crossover rates in wild homozygous Rb vs standard mice in the proximal centromeric regions (Bidau et al., 2001, Castiglia and Capanna, 2002 Dumas and Britton-Davidian, 2002 Merico et al., 2003, 2013). Analyses of recombination rates in wild Rb heterozygotes have also been assessed but involve, in most cases, polymorphic individuals, that is, carrying variable numbers of Rb bivalents and trivalents, making it difficult to disentangle the effect of each meiotic type of configuration (Wallace et al., 1992 Bidau et al., 2001 Castiglia and Capanna, 2002 Capilla et al., 2014). In contrast, extensive analyses of recombination patterns in single-Rb heterozygotes have been performed by genetic assays in crosses between different laboratory strains (Davisson and Akeson, 1993). Recombination suppression was recorded in almost all of the Rb fusions tested, but the extent of the suppression varied between chromosomes and crosses, suggesting an influence of the genetic background on this trait. The present analysis is performed on male and female laboratory-bred F1 hybrids (2norte=31) between two chromosomal races of the house mouse (2norte=40 and 2norte=22) from Tunisia, as well as wild-caught mice spanning the hybrid zone between two North Italian races (2norte=40 and 2norte=22). In both cases, structural genomic differences exist between races, as all chromosomes except two pairs (a small acrocentric pair and the sex chromosomes) are involved in Rb fusions. The Tunisian F1 hybrids exhibit a homogeneous meiotic architecture in which all Rb chromosomes are present as trivalents, whereas the number of Rb fusions (heterozygous and homozygous) was variable in the Italian mice. Although recent cytogenetic estimates of recombination rely on the analysis of MLH1 foci (mismatch repair protein) on synaptonemal complexes (Anderson et al., 1999), recombination was assessed in the present study by meiotic chiasma analyses permitting direct comparisons with previously published data (Dumas and Britton-Davidian, 2002). The effects of Rb heterozygosity on recombination patterns were identified by comparing the chiasma-based assessment of the Tunisian F1 mice with those previously recorded for the Tunisian parental standard and Rb races from which they originated (Dumas and Britton-Davidian, 2002). An estimate of variation in recombination rates was approached by comparison with the data from the Italian samples. From this, we infer the extent and genomic distribution of the barrier to gene flow between chromosomal races and discuss the relevance of Rb rearrangements to reproductive isolation and divergence processes.


Genome and Gene Structure∗

4.2.4 Meiotic Recombination

Meiotic recombination [1] refers to the reciprocal physical exchange of chromosomal DNA between the parental chromosomes and occurs at meiosis during spermatogenesis and oogenesis, serving to ensure proper chromosome segregation. During the four-strand stage of meiosis, two duplex DNA molecules (one from each parent) form a hybrid, and a single strand of one duplex is paired with its complement from the other duplex. Single-stranded DNA is exchanged between the homologous chromosomes, and the process involves DNA strand breakage and resealing, resulting in the precise recombination and exchange of DNA sequences between the two homologous chromosomes. This process is highly efficient and does not usually result in mutations at the sites of recombination. Recombination thus shuffles genetic material between homologous chromosomes, generating much of the genetic diversity that characterizes differences between individuals, even within the same family.

The frequency of recombination between two loci along a chromosome is proportional to the physical distance between them, and historically, this provided the basis for defining the genetic distance between loci, allowing genetic maps to be constructed. The genetic proximity of two loci is measured by the percentage of recombination between them a map distance of 1 centimorgan (cM) indicates 1% recombination frequency between the two loci. The human genome sequence has made it possible to compare genetic and physical distances and to analyze variations in recombination frequency in different chromosomal regions. On average, 1 million bp (1 Mb) correspond to 1 cM (1% recombination frequency). However, there is a tremendous local variation between individual chromosomes and among particular chromosomal regions. For example, the average recombination rate is higher in the short arms of chromosomes and at the distal segments of the arms but overall is suppressed near the centromeres. There is also a significant variation in the recombination rates between the sexes, with 1.6-fold more recombination on average in females relative to males. On average, female recombination is higher at the centromeres and male recombination is higher at the telomeres [2] .


Variación de anticuerpos

En las células B, la región variable del gen de la cadena ligera tiene 40 segmentos variables (V) y cinco segmentos de unión (J). Una enzima llamada ADN recombinasa escinde al azar la mayoría de estos segmentos del gen, empalmando un segmento V en un segmento J. Durante el procesamiento del ARN, todos los segmentos V y J menos uno se empalman. La recombinación y el empalme pueden resultar en más de 10 6 combinaciones posibles de VJ. Como resultado, cada célula B diferenciada en el cuerpo humano típicamente tiene una cadena variable única. El dominio constante, que no se une a un anticuerpo, es el mismo para todos los anticuerpos. La gran diversidad de la estructura de los anticuerpos se traduce en la gran diversidad de antígenos que los anticuerpos pueden unirse y reconocer.

De manera similar a los TCR (receptores de células T) y BCR (receptores de células B), la diversidad de anticuerpos se produce mediante la mutación y recombinación de aproximadamente 300 segmentos de genes diferentes que codifican los dominios variables de cadena ligera y pesada en células precursoras que están destinadas a convertirse en células B. Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera interactúan para formar el sitio de unión a través del cual un anticuerpo puede unirse a un epítopo específico en un antígeno. El número de dominios constantes repetidos en las clases de Ig (discutidos a continuación) es el mismo para todos los anticuerpos correspondientes a una clase específica. Los anticuerpos son estructuralmente similares al componente extracelular de las BCR. La maduración de las células B en células plasmáticas ocurre cuando las células adquieren la capacidad de secretar la porción de anticuerpo de su BCR en grandes cantidades.


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Ver el vídeo: RECOMBINACIÓN GENÉTICA: ENTRECRUZAMIENTO ENTRE HOMÓLOGOS. (Agosto 2022).