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Tipos de cinética enzimática?

Tipos de cinética enzimática?


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En las conferencias, hemos discutido la cinética de la enzima de Michaelis Menten, pero de las conferencias quedó claro que este no era el único tipo de cinética.

Después de investigar esto, encontré enzimas que dan una curva sigmoidea que relaciona la velocidad inicial de reacción con la concentración de sustrato.

Hasta ahora tengo:

  1. Cinética de Michaelis Menten

Para lo cual creo que las únicas condiciones son que la reacción enzimática sigue

y la enzima no se une a más de una molécula de sustrato (no se une alostéricamente)

  1. cinética 'sigmoidea'

Cuando la enzima es una enzima alostérica y la unión de más sustrato a la enzima aumenta la afinidad de la enzima por el sustrato.

¿Son estos los dos únicos tipos principales de cinética enzimática?


El problema con las curvas del mentor de Michaelis es que presumen que solo una vía por la que puede actuar la enzima. Por lo tanto, si una enzima tiene múltiples vías, las presunciones fallan. Un ejemplo de esto es la monoamino oxidasa, (Ramsay, RR, Olivieri, A. & Holt, A. Un enfoque mejorado para el análisis de estado estacionario de monoamino oxidasas. J. Neural Transm. 118, 1003-1019 (2011).) Este el papel tiene la cinética específica de la enzima para la monoamino oxidasa; el desarrollo de los modelos es increíblemente complicado, pero si observa las ecuaciones, puede ver cómo hay múltiples vías.

También presuponen un solo sustrato, por lo que las reacciones de múltiples sustratos deben tener la cinética modificada como tal. Para eso los mecanismos son: ping-pong, orden ternario y aleatorio, todos los cuales impactan en la cinética.Si se presume que la concentración del complejo intermedio no cambia con el tiempo, entonces otro modelo es el modelo de Briggs-Haldane, conocido como cinética de estado cuasi-estacionario.

Luego están los modelos cinéticos de inhibición. De los cuales el michaelis menten, donde la cinética varía según cómo se unen los inhibidores. Pero como se ve con el papel MAO anterior, puede variar según las vías y las afinidades de unión. Si una enzima es irreversible, la cinética también difiere (Mcdonald, A. G. y Dublin, T. C. Enzymes: Irreversible Inhibition. 1-17 (2012). Doi: 10.1002 / 9780470015902.a0000601.pub2).

También vale la pena señalar que es mejor utilizar la regresión no lineal para analizar la cinética, ya que la linealización de los datos puede conducir a errores de cálculo (a pesar de que, sin duda, es la opción más fácil y clara).


Cinética de la enzima Parte 2

Para continuar con el tema sobre la cinética de las enzimas, encontrará algunos buenos archivos PDF a continuación.

Los principales puntos a recordar sobre la cinética enzimática son los gráficos con varios tipos de inhibición.

Examinemos la cinética enzimática en función de la concentración de sustrato disponible para la enzima.

  • Configuramos una serie de tubos que contienen concentraciones graduadas de sustrato, [S].
  • En el momento cero, agregamos una cantidad fija de la preparación enzimática.
  • Durante los siguientes minutos, medimos la concentración de producto formado. Si el producto absorbe luz, podemos hacerlo fácilmente en un espectrofotómetro.
  • Al principio de la ejecución, cuando la cantidad de sustrato es sustancialmente superior a la cantidad de enzima, la tasa que observamos es la velocidad inicial de VI.

Graficado VI como una función de [S], encontramos eso

  • A valores bajos de [S], la velocidad inicial,VI, aumenta casi linealmente al aumentar [S].
  • Pero como [S] aumenta, las ganancias en VI nivelar (formando una hipérbola rectangular).
  • La asíntota representa la velocidad máxima de la reacción, designada Vmax
  • La concentración de sustrato que produce una VI eso es la mitad de Vmax se designa la constante de Michaelis-Menten, Kmetro (nombrado en honor a los científicos que desarrollaron el estudio de la cinética de las enzimas).

Kmetro es (aproximadamente) una medida inversa de la afinidad o fuerza de unión entre la enzima y su sustrato. Cuanto menor sea el Kmetro, cuanto mayor es la afinidad (por lo tanto, menor es la concentración de sustrato necesaria para lograr una velocidad determinada).

Trazando los recíprocos de la mismos puntos de datos produce un gráfico & # 8220double-recíproco & # 8221 o Lineweaver-Burk. Esto proporciona una forma más precisa de determinar Vmax y Kmetro.

  • Vmax está determinado por el punto donde la línea cruza el 1 /VI = 0 eje (por lo que el [S] es infinito).
  • Tenga en cuenta que la magnitud representada por los puntos de datos en esta gráfica disminución de la parte inferior izquierda a la superior derecha.
  • Kmetro es igual a Vmax multiplicado por la pendiente de la línea. Esto se determina fácilmente a partir de la intersección en el eje X.

Cinética de las enzimas alostéricas

Muchos sistemas de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) agrupadas en agrupaciones bacterianas y asociadas a CRISPR (Cas) emplean la endonucleasa de ADN guiada por ARN dual Cas9 para defenderse de la invasión de fagos y plásmidos conjugativos mediante la introducción de sitios específicos. Lee mas

Materiales suplementarios

Vídeos suplementarios 1 y 2 Leer más

Figura 1: Interferencia de ADN mediada por CRISPR-Cas9 en la inmunidad adaptativa bacteriana. (a) Un locus CRISPR típico en un sistema CRISPR-Cas de tipo II comprende una serie de secuencias repetitivas (repeticiones, diámetro marrón.

Figura 2: El mecanismo de la ingeniería del genoma mediada por CRISPR-Cas9. La estructura sintética sgRNA o crRNA-tracrRNA dirige una endonucleasa Cas9 a una secuencia de ADN casi arbitraria en el genoma a través de a.

Figura 3: Estructura general de Streptococcus pyogenes Cas9 (SpyCas9) en estado apo. (a) Representación de cinta de la estructura cristalina de SpyCas9 (PDB ID 4CMP). Los dominios Cas9 individuales están coloreados.

Figura 4: La carga de ARN guía permite a Cas9 formar una conformación competente en el reconocimiento de ADN para la búsqueda de objetivos. (a) Diagrama de cinta que muestra la estructura apo de SpyCas9 alineada en la misma orientación que.

Figura 5: Estructuras de CRISPR-Cas9 unidas a sustratos de ADN, mostrando la misma vista que en la Figura 4c después de la superposición. (a) Estructura cristalina de SpyCas9 (representación de superficie) en complejo con sgRNA.

Figura 6: Representaciones esquemáticas de los mecanismos propuestos de reconocimiento y escisión del ADN diana mediado por CRISPR-Cas9. Tras la carga de sgRNA, Cas9 sufre un gran reordenamiento conformacional en r.

Figura 7: Las estructuras de los ortólogos Cas9 revelan las características estructurales conservadas y divergentes entre los sistemas ortólogos CRISPR-Cas9. Los dominios Cas9 individuales se colorean de acuerdo con el esquema de.


La cinética de enzimas

Enzimas son catalizadores biológicos capaces de aumentar la velocidad a la que se produce una reacción química.

En reacciones de un solo sustrato, una enzima @@ E @@ cataliza la conversión de un solo sustrato @@ S @@ en un solo producto @@ P @@:

La velocidad de reacción será proporcional a la concentración del complejo enzima / sustrato (@@ ES @@) dada por:

A bajas concentraciones de @@ S @@ la concentración de @@ ES @@ es directamente proporcional a @@ [S] @@ por lo tanto, la velocidad dependería de @@ [S] @@ en un aparente primer orden (lineal) conducta.

A concentraciones muy altas de S, prácticamente toda la enzima está en forma de complejo ES y la velocidad depende de la tasa de conversión de ES a EP y de la posterior liberación de producto y enzima libre. Agregar más sustrato no afectaría a un cambio en la velocidad de reacción, por lo que la pendiente de la gráfica de velocidad versus @@ [S] @@ se aproxima a cero.

La ecuación de velocidad que explica este comportamiento se conoce como ecuación de Michaelis-Menten:

Donde @@ V_@@ es la velocidad máxima de reacción (a una concentración de sustrato infinita):

Y donde @@ K_m @@ se conoce como la constante de Michaelis-Menten y se define como la concentración de sustrato a la que la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima (@@ V_@@) obtenido en condiciones de saturación del sustrato.

Utilice esta herramienta para calcular los parámetros cinéticos a partir de los datos cinéticos de la enzima.

Esta herramienta puede calcular la constante de Michaelis-Menten (@@ K_m @@), la tasa máxima (@@ V_@@) y el coeficiente de Hill (@@ h @@) de los datos de velocidad de reacción en función de la concentración del sustrato.

Actualmente, solo se admite la cinética de un solo sustrato.

Ingrese la velocidad de reacción (@@ v @@) en función de la concentración del sustrato [@@ S @@] en la tabla siguiente. ¡Solo se permiten números!

Puede escribir cada valor manualmente o pegar los valores de Excel o de otra hoja de cálculo.

Seleccione las unidades para la concentración de sustrato y para la tasa usando las listas desplegables. Tenga en cuenta que:

1 Unidad (U) = cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 micromol de sustrato por minuto en las condiciones especificadas del ensayo

1 unidad (u) = cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 nanomole de sustrato por minuto en las condiciones especificadas del ensayo

Puede agregar más filas o columnas según sea necesario.

Finalmente, seleccione el tipo de modelo a utilizar: Michaelis-Menten, ecuación alostérica / de Hill o ambas.


Se encuentran disponibles tres modelos simples de inhibición: competitivo, no competitivo y no competitivo. Estos tipos de inhibición son generados por el modelo que se muestra en el Esquema 6.

Kmetro, Kes, y Kii son constantes de disociación de los complejos ES, EI y EIS, respectivamente, y kgato es la constante de tasa que gobierna la tasa de ruptura del complejo ES. Se asume el equilibrio global y como consecuencia la constante Kmetro = Kmetro·Kii/Kes.

Inhibición competitiva-

En el caso de inhibición competitiva, el valor de Kes es finito y el de Kii es infinito: no hay formas complejas EIS pero el complejo EI existe en una concentración cinéticamente significativa. Las gráficas recíprocas dobles se interceptarán en el eje vertical.

Inhibición no competitiva—

En el caso de inhibición no competitiva, Kii tiene un valor finito mientras que para Kes es infinito: el inhibidor puede unirse solo al complejo ES. Las gráficas recíprocas dobles consistirán en conjuntos de líneas rectas paralelas correspondientes a la ecuación de tasa.

Inhibición no competitiva—


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PREGUNTAS MÁS FRECUENTES:
P1: ¿Puedo utilizar un protocolo "existente" para mi ensayo enzimático?

Cabe señalar que todas las enzimas alcanzan su actividad óptima en diferentes condiciones, mientras que en un cribado de alto rendimiento, a menudo se usa una sola condición de reacción. Como resultado, las diferencias en los niveles de actividad de las enzimas pueden ser ciertas solo en la condición actual y no pueden usarse para una comparación cuantitativa. Otro desafío que preocupa con frecuencia a los investigadores es que la detección de la formación del producto o el consumo del sustrato podría verse fuertemente alterado por otros ingredientes en la matriz de reacción, como solutos inactivos u otras enzimas. En tales casos, se debe considerar la relación señal / ruido para una medición precisa. La selección adecuada del método de detección y los parámetros a menudo brinda soluciones a tales problemas.

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¿Tipos de cinética enzimática? - biología

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Mecanismos mitocondriales para la importación y el ensamblaje de proteínas

Nils Wiedemann y Nikolaus Pfanner
Vol. 86, 2017

Abstracto

Las mitocondrias son orgánulos esenciales con numerosas funciones en el metabolismo celular y la homeostasis. La mayoría de las & gt1.000 proteínas mitocondriales diferentes se sintetizan como precursores en el citosol y se importan a las mitocondrias mediante cinco transportes. Lee mas

Figura 1: Descripción general de las cinco principales vías de importación de proteínas de las mitocondrias. Las preproteínas portadoras de presecuencia son importadas por la translocasa de la membrana mitocondrial externa (TOM) y el presequ.

Figura 2: La ruta de presecuencia hacia la matriz y la membrana interna mitocondrial (MI). La translocasa de la membrana externa (TOM) consta de tres proteínas receptoras, la proteína formadora de canales To.

Figura 3: Papel de la translocasa del ensamblaje de oxidasa (OXA) en la clasificación de proteínas. Las proteínas sintetizadas por los ribosomas mitocondriales son exportadas a la membrana interna (MI) por el OXA que transloca los ribos.

Figura 4: Vía del portador hacia la membrana interna. Los precursores de los portadores de metabolitos hidrófobos se sintetizan sin una presecuencia escindible. Los precursores se unen al chaperón citosólico.

Figura 5: Maquinaria de ensamblaje e importación de espacio intermembrana mitocondrial (MIA). Muchas proteínas del espacio intermembrana (IMS) contienen motivos de cisteína característicos. Los precursores se mantienen en un formato reducido.

Figura 6: Biogénesis de proteínas de barril β de la membrana mitocondrial externa. Los precursores de las proteínas de barril β son inicialmente importados por la translocasa de la membrana externa (TOM), se unen a los pequeños.

Figura 7: El papel dual de la distribución mitocondrial y la morfología de la proteína 10 (Mdm10) en el ensamblaje de proteínas y los sitios de contacto de los orgánulos. Mdm10 se asocia con la maquinaria de clasificación y ensamblaje (SAM).

Figura 8: Múltiples vías de importación para proteínas integrales α-helicoidales de la membrana externa mitocondrial. Los precursores de proteínas con una secuencia de anclaje de señal N-terminal se insertan típicamente en.

Figura 9: El sitio de contacto mitocondrial y el sistema organizador de crestas (MICOS) interactúa con translocas de proteínas. MICOS consta de dos subunidades principales, Mic10 y Mic60. Mic10 forma oligómeros grandes th.


Cinética enzimática: principios y métodos, segunda edición

“En general, este es un tratamiento excelente y completo de un tema difícil. Además de atraer a los bioquímicos, también hay elementos de interés para los que estudian la farmacología y la distribución farmacocinética de los fármacos. La naturaleza matemática y la cobertura avanzada significa que es más adecuado para investigadores que ya tienen una base sólida en el tema. Sin duda lo consultaré durante mi investigación ". (Bioquímico, 29 de mayo de 2013)

“Esta edición nueva, ampliada y actualizada del tratado completo y fácil de usar sobre cinética enzimática equilibra de manera experta la teoría y la práctica. Esta es una ayuda indispensable para estudiantes avanzados y profesionales que trabajan con enzimas, ya sean bioquímicos, biotecnólogos, biólogos químicos, farmacólogos o bioingenieros en la academia, la industria y la investigación clínica..” (Comunidad de biología, 29 de noviembre de 2012)

La cinética enzimática no es un área nueva en bioquímica. Hace treinta años, la cinética enzimática era una de las herramientas más importantes para deconstruir los mecanismos enzimáticos. Con los avances en la determinación de la estructura enzimática y la genética molecular, la cinética enzimática ya no es tan prominente. Sin embargo, la cinética enzimática sigue siendo útil para comprender mejor las enzimas que son demasiado grandes para los estudios de RMN y que no se pueden cristalizar. Muchas enzimas que encajan en esta categoría están unidas a la membrana, cuya cinética es mucho más complicada. En esta nueva edición (1ª ed., 2002), Bisswanger (Univ. De Tübingen, Alemania) hace un buen trabajo al extender la cinética de las enzimas en solución a las enzimas unidas a la membrana. Distinguiéndolo de otros trabajos sobre el tema, La cinética de enzimas no trata simplemente de la unión del sustrato como parte de la cinética de la reacción, sino que dedica aproximadamente un tercio del texto a la unión en equilibrio entre macromoléculas y ligandos en los que no hay catálisis de reacción después de la unión. Esta unión luego se conecta directamente con la cinética de reacción catalizada por enzimas. La cinética de enzimas fue escrito para servir como un recurso de curso de nivel de posgrado y serviría bien a esta población. La inclusión de problemas de los estudiantes sería una mejora. Resumiendo: Recomendado. Estudiantes de posgrado, investigadores y profesores. - L. J. Liotta, Stonehill College (Elección, Febrero de 2009)


Sobre el método de estado estable de cinética enzimática

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