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¿Cómo se inserta cas9 en células animales?

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¿Cómo podrían los investigadores que buscan editar un genoma podrían insertar cas9 en las células? Me imagino que para la ingeniería de sistemas bacterianos podría simplemente poner en la región de codificación cas9 en un vector de expresión, pero ¿es así como también se hace para las células eucariotas?


Si está hablando de la funcionalidad nucleasa de Cas9, entonces no está agregando el gen Cas9 al genoma, lo está transfectando en un plásmido. Por lo general, se realiza alguna forma de permeabilización de las células o la construcción se inserta en un vector viral para transfectar las células en cultivo de tejidos. En animales multicelulares, sería necesario utilizar la ruta del vector viral como se haría con cualquier técnica de terapia génica. Addgene es un repositorio de plásmidos sin fines de lucro que tiene muchas de las construcciones CRISPR / Cas9 que se han desarrollado, y tienen un excelente recurso en su sitio web.

Realmente no querría que Cas9 esté activo en la celda después de que haya hecho su trabajo, ya que aumenta la probabilidad de golpes fuera del objetivo. El objetivo no debería estar en el genoma de todos modos si ocurrió el evento de focalización, porque o lo ha sustituido en otra pieza de ADN o ha cortado el ADN y los mecanismos de reparación del ADN han introducido nucleótidos aleatorios para reparar la ruptura de la doble hebra.

Las células eucariotas, en su mayor parte, no pueden mantener plásmidos. El gen Cas9 se transcribirá junto con el ARN guía. El complejo de proteína / ARN resultante se dirige a la secuencia de interés y realiza un corte. Cuando la célula se replica, es probable que se pierda el plásmido, pero las células hijas heredarán la edición genómica realizada por el evento de direccionamiento.

Si está buscando insertar un gen diferente en el sitio de destino, digamos un reportero en el genoma, entonces cotransfecte una pieza lineal de ADN con brazos de homología alrededor del sitio de corte para que ese donante se inserte a través de una reparación de rotura homóloga.

Una de las construcciones de Cas9 que se ha desarrollado ha desactivado la actividad nucleasa, por lo que el complejo Cas9 / ARN termina actuando como una proteína de unión para suprimir la actividad que está buscando estudiar sin eliminar o reemplazar el gen. En este caso, puede buscar insertar el casete Cas9, en cuyo caso usaría un evento de recombinación como lo haría con cualquier otro tipo de incorporación al genoma.


¿Cómo funciona CRISPR Cas9?

Puede usarse para insertar secuencias genéticas en un locus de elección. Para comprender cómo es necesario comprender realmente el direccionamiento de genes mediante recombinación homóloga, y para comprenderlo, es necesario comprender la recombinación homóloga. Puede encontrar material para cubrir esto con más profundidad en línea, pero intentaré explicarlo en el nivel más simple.

El daño del ADN es bastante malo para las células, especialmente las roturas de doble hebra (DSB) donde se dividen ambas hebras de la doble hélice. Entonces, las células realmente necesitan repararlos y, de hecho, hay dos mecanismos que tienen para hacerlo:

a) Unión de extremos no homólogos, donde simplemente toman los dos bits rotos y los empalman, esto no es preciso y, a menudo, puede conducir a inserciones / eliminaciones con una posible mutación de cambio de marco.

b) recombinante homóloga: esto es cuando la célula usa el cromosoma homólogo como plantilla para fijar el DSB. Los detalles de cómo funciona no son importantes, pero solo comprenda que la célula busca secuencias homólogas aguas arriba y aguas abajo del DSB (brazos de homología 5 'y 3' respectivamente) y las compara con los brazos de homología en el ADN de la plantilla y las copias. todo entre ellos para llenar el vacío y reparar el DSB.

Lo que esto significa entonces es que podemos explotar este sistema para insertar genes simplemente colocando una plantilla de ADN falsa para que el ADN roto se use como copia de reparación. Todo lo que necesitamos son brazos de homología de 5 'y 3' pero con cualquier gen que queramos entre ellos. Esto se conoce como orientación genética:

Si tiene un marcador de selección (por ejemplo, resistencia a antibióticos), podemos seleccionar las células que han absorbido el gen en ese lugar. Pero realmente el sistema, tal como está, se basa en esperar a que los DSB ocurran por casualidad.

Aquí es donde entra en juego el sistema CRISPR / Cas9. Como usted dice, es básicamente un par de tijeras moleculares moleculares programables que pueden hacer un DSB en cualquier lugar. Esto se hace simplemente haciendo un ARN guía que sea complementario al lugar donde desea realizar el corte. Entonces, en general, si inyecta el ARN guía con la enzima cas9, obtendrá un DSB donde desee. También necesita inyectar una plantilla de reparación de recombinación homóloga con brazos de homología para insertar en su gen cuando el DSB intenta repararse a sí mismo.


Por cierto, también puede usar el sistema CRISPR / Cas9 en un modo de eliminación directa en lugar de un modo de inserción de genes. Aquí realiza los mismos pasos pero no tiene una plantilla de reparación. En su lugar, desea que la reparación se produzca a través de uniones finales no homólogas para crear mutaciones indel y, por lo tanto, de desplazamiento de marco. Esto creará un codón de parada prematuro y el producto de ARNm se degradará, por lo que habrá eliminado ese gen.


Edición de genes CRISPR-Cas9: verifique tres veces, corte una vez

Mapa de color bayesiano que representa el movimiento de partículas Cas9 en diferentes regiones del núcleo de una célula de mamífero. El rojo / naranja denota un movimiento más rápido y el azul denota un movimiento más lento. El movimiento de Cas9 generalmente está más restringido en regiones silenciadas / de baja expresión del genoma conocidas como heterocromatina. Crédito: UC Berkeley / HHMI

Dos nuevos estudios de la Universidad de California, Berkeley, deberían dar a los científicos que usan CRISPR-Cas9 para la ingeniería del genoma una mayor confianza en que no editarán inadvertidamente el ADN incorrecto.

La técnica de edición de genes, creada por la bioquímica de UC Berkeley Jennifer Doudna y su colega europea Emmanuelle Charpentier, ha revolucionado la investigación y las comunidades clínicas como una forma fácil y barata de realizar cambios precisos en el ADN para deshabilitar genes, corregir trastornos genéticos o insertar genes mutados en animales para crear modelos de enfermedades humanas.

Los dos nuevos informes del laboratorio de Doudna y el del colega de UC Berkeley, Robert Tjian, muestran con mucho más detalle cómo la proteína Cas9 busca a través de miles de millones de pares de bases en una célula para encontrar la secuencia de ADN correcta, y cómo Cas9 determina si unirse o unirse. y cortar, iniciando así la edición de genes. Según estos experimentos, Cas9 parece tener al menos tres formas de verificar para asegurarse de que encuentra el ADN objetivo correcto antes de dar el paso irrevocable de hacer un corte.

"CRISPR-Cas9 ha evolucionado para una orientación precisa del ADN y ahora comprendemos la base molecular de su actividad de búsqueda y escisión, que ayuda a limitar la edición de ADN fuera del objetivo", dijo Doudna, investigador del Instituto Médico Howard Hughes en UC Berkeley y profesor de biología molecular y celular y de química. Tjian es presidente del Instituto Médico Howard Hughes y profesor de biología celular y molecular de UC Berkeley.

Los estudios también ilustran qué tan bien funciona CRISPR / Cas9 en células humanas y animales (eucariotas) a pesar de que "la técnica fue inventada por bacterias para protegerse de la gripe", dijo Doudna.

CRISPR-Cas9 es un híbrido de proteína y ARN, el primo del ADN, que funciona como un sistema eficiente de búsqueda y recorte en bacterias. Surgió como una forma de reconocer y matar virus, pero Doudna y Charpentier se dieron cuenta de que también podría funcionar bien en otras células, incluidos los humanos, para facilitar la edición del genoma. La proteína Cas9, obtenida de la bacteria Streptococcus pyogenes, funciona junto con un ARN "guía" que se dirige a un tramo de ADN complementario de 20 nucleótidos. Una vez que el ARN identifica una secuencia que coincide con estos nucleótidos, Cas9 corta la hélice de ADN de doble hebra.

Un estudio, publicado en la edición del 13 de noviembre de Ciencias, rastreó moléculas de Cas9-RNA a través del núcleo de células de mamíferos mientras buscaban rápidamente en todo el genoma para encontrar y unirse solo a la región objetivo y no a otra.

La enzima Cas9 debe flexionarse y doblarse para unirse al ARN guía (naranja). Una vez que el complejo Cas9-ARN encuentra su ADN objetivo (rojo), la región de corte de Cas9 (amarillo) se colocará en su lugar en relación con su pareja (azul) solo cuando el ARN y el ADN coincidan correctamente. Solo entonces la enzima corta el ADN de doble hebra. Estos movimientos detallados fueron revelados por experimentos de fluorescencia reportados en un Naturaleza papel del laboratorio de Doudna. Crédito: Sam Sternberg / UC Berkeley

"Es una locura que el complejo Cas9 logre escanear el vasto espacio de genomas eucariotas", dijo el estudiante graduado Spencer Knight, primer autor de la Ciencias papel.

Estudios anteriores habían sugerido que hay muchas regiones de ADN de aspecto similar que Cas9 podría unir y cortar, lo que podría limitar su utilidad si la precisión fuera importante. Estas regiones fuera del objetivo podrían compartir tan solo cuatro o cinco nucleótidos con el cebador de 20 nucleótidos, lo suficiente para que Cas9 las reconozca.

"Hay una gran cantidad de enlaces fuera del objetivo por parte de Cas9, pero descubrimos que estas interacciones son muy breves, desde milisegundos hasta segundos, antes de que Cas9 continúe", dijo.

Debido a que estos enlaces exploratorios, tal vez hasta 300,000 de ellos, a menudo son de muy corta duración, unos pocos miles de complejos CRISPR-Cas9 pueden rastrear todo el genoma para encontrar un tramo de ADN específico. Cas9 también debe reconocer una secuencia corta de ADN de tres pares de bases inmediatamente después de la secuencia del cebador, denominada PAM, que ocurre aproximadamente 300 millones de veces dentro del genoma humano.

"Si Cas9 saltara durante decenas de segundos o minutos en cada sitio fuera del objetivo, nunca jamás podría encontrar un objetivo y cortar de manera oportuna", dijo Knight.

El último punto de control de Cas9

El otro estudio, publicado en línea el 28 de octubre en Naturaleza, mostró que una vez que Cas9 se une a una región de ADN, realiza otra verificación antes de que dos secciones distantes del complejo proteico Cas9 se unan, como las hojas de una tijera, para alinear con precisión los sitios activos que cortan el ADN de doble hebra.

"Descubrimos que Cas9 guiado por ARN puede unirse a algunas secuencias de ADN fuera del objetivo, que difieren del objetivo correcto por solo unas pocas mutaciones, muy estrechamente. Sorprendentemente, sin embargo, la región de Cas9 que realiza el corte está inhibida debido a la imperfección Pero cuando se encuentra el ADN que coincide correctamente, Cas9 sufre un gran cambio estructural que libera esta inhibición y desencadena el corte del ADN ", dijo el primer autor Samuel Sternberg, quien recientemente recibió su Ph.D. en UC Berkeley. Pudo observar estos cambios utilizando una versión etiquetada con fluorescencia del complejo Cas9.

"Creemos que este cambio estructural es el último punto de control, o etapa de corrección de pruebas, de la reacción dirigida al ADN", dijo. "Primero, Cas9 reconoce un segmento corto de ADN junto al objetivo, el PAM, luego el ADN objetivo se empareja con el ARN guía a través del emparejamiento de bases Watson-Crick. Por último, cuando se identifica una coincidencia perfecta, la última parte del la proteína se coloca en su lugar para permitir el corte e iniciar la edición del genoma ".

Una proteína Cas9 más pequeña de una especie diferente de bacteria, Staphylococcus aureus, probablemente explota la misma estrategia para mejorar la precisión de la selección de ADN, lo que sugiere que "esta característica importante se ha conservado a lo largo del tiempo evolutivo", agregó.

"Esta es una buena noticia, ya que sugiere que tiene más de un punto de control para garantizar la unión correcta de Cas9", dijo Knight. "No solo hay una regulación de la secuencia, también hay una regulación temporal: tiene que interactuar con el ADN y estacionarse el tiempo suficiente para que realmente pueda reorganizarse y cortar".

Los descubrimientos de Doudna, Tjian y sus equipos arrojan luz sobre la base molecular de los efectos fuera del objetivo durante las aplicaciones de edición del genoma y pueden guiar el diseño futuro de variantes Cas9 más precisas.


CRISPR / Cas9: BIOLOGÍA, MECANISMO DE ACCIÓN Y RETOS

La técnica CRISPR / Cas9 no solo ha mostrado un enorme crecimiento en la investigación científica, sino que también ha atraído mucha atención como una herramienta prometedora de edición de genes para el cáncer, los trastornos genéticos y las bacterias que causan enfermedades. De 13469 artículos que muestran la palabra & # 8220CRISPR & # 8221 como Best Match, se han publicado alrededor de 5665 artículos en PubMed desde 2018 hasta ahora.

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El floreciente campo de la tecnología CRISPR / Cas ha superado a otras herramientas de edición de genes debido a su facilidad de manejo y bajo costo.

CRISPR es la forma abreviada del nombre “Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas”. La proteína asociada a CRISPR se abrevia como proteína Cas. Por lo tanto, la técnica se denomina tecnología CRISPR / Cas en resumen.

Los sistemas CRISPR / Cas ocurren naturalmente en bacterias y arqueas (procariotas) para adquirir inmunidad contra infecciones virales y plásmidos. Más tarde, los científicos comenzaron a adoptar este sistema para editar genes tanto en procariotas como en eucariotas.

El primer signo del sistema CRISPR / Cas fue descubierto por un grupo de investigación japonés en 1987. Identificaron un patrón de secuencias de repetición cortas intercaladas con "espaciadores" cortos y no repetitivos en Escherichia coli genoma. En 2012, dos científicos (Doudna y Charpentier) programaron el sistema CRISPR / Cas9 para escindir secuencias específicas de ADN. Esto llevó a que surgiera CRISPR / Cas9 como una prometedora herramienta de edición de genes.

El sistema CRISPR / Cas se puede clasificar en dos clases como Class1 y Class2. Los sistemas Class 1 CRISPR / Cas emplean un complejo de proteínas Cas múltiple, mientras que los sistemas Class2 CRISPR / Cas logran una proteína Cas única. Además, dos clases se dividen en seis tipos según la presencia de genes distintivos específicos.

La técnica CRISPR / Cas9 ampliamente utilizada pertenece al sistema CRISPR / Cas Clase 2 tipo II. El sistema CRISPR / Cas9 ocurre naturalmente en Streptococcus pyogenes bacteria como un sistema inmunológico adaptativo para interrumpir el virus y el plásmido que invaden las bacterias. En este sistema, una secuencia corta de ADN extraño (virus o plásmido) se integra en el genoma de la bacteria para crear una "identidad" para reconocer invasiones similares antes de sus infecciones en el futuro. Una vez que un virus similar invade, las bacterias codifican la hebra de ácido ribonucleico (ARN) complementario de "identidad" que puede unirse a la secuencia de ADN complementaria del virus y luego escindirla.

El sistema CRISPR / Cas9 consta de tres componentes: crRNA (CRISPR RNA), tracrRNA (Transactivating CRISPR RNA) y proteína Cas9. Esta proteína Cas9 muestra actividad helicasa (desenrollar la doble hebra del ADN), así como actividad nucleasa (escindir la hebra del ADN). En el sistema bacteriano CRISPR / Cas9, el ARN guía (gRNAà crRNA + tracrRNA) dirige la proteína Cas9 que funciona como una enzima endonucleasa de ADN para escindir las cadenas de ADN viral.

Figura 1: Clasificación del sistema CRISPR / Cas

En lugar de dos moléculas de ARN separadas, los investigadores han sintetizado una molécula de ARN (ARNsg-ARN guía único) que se puede utilizar como una molécula similar a ARNcr + ARNtracr. Se ha simplificado el sistema CRISPR / Cas9 de tres componentes al sistema de dos componentes (ARNsg + Cas9).

MECANISMO DE ACCIÓN

El mecanismo de defensa del sistema CRISPR / Cas9 en bacterias se puede dividir en tres fases:

Cada fase se describe a continuación con un diagrama.

Después de la infección viral, el operón cas produce (transcripción seguida de traducción) el complejo proteico cas1-cas2 que puede identificar la secuencia protoespaciadora / espaciadora ("identidad") del ADN viral y la integra a la matriz CRISPR flanqueada por secuencias repetidas.

Más tarde, el gen tracr y la matriz CRISPR transcriben (convierten el gen en la respectiva molécula de ARN) tracrRNA y pre-crRNA respectivamente, mientras que el gen cas9 transcribe y traduce (convierte la molécula de ARN en la proteína respectiva) en la proteína cas9.

Figura 2: Adquisición del espaciador del sistema CRISPR / Cas9

El tracrRNA se hibrida con la repetición pre-crRNA. Luego, tracrRNA: el dúplex pre-crRNA se une a la proteína cas9. Además, el complejo recluta la enzima RNaseIII que escinde el pre-crRNA en la repetición. Finalmente, una nucleasa desconocida recorta la porción 5 'derivada de la repetición del crRNA dejando una secuencia espaciadora de 20 nucleótidos de longitud para la fase final. Esto forma el complejo CRISPR / Cas9 final para la interferencia.

Figura 3: procesamiento de crRNA del sistema CRISPR / Cas9

El Cas9 del complejo efector identifica la secuencia de ADN diana a través del reconocimiento de PAM (Motivo adyacente de protospaciador) que se ubica en la hebra de ADN no diana (La secuencia de PAM reconocida por Streptococcus pyogenes es 5 & # 8217NGG 3 & # 8242). La secuencia espaciadora de 20 nucleótidos de largo del crRNA maduro se une a la hebra de DNA diana en el DNA viral. Permite que la proteína cas9 active sus dos dominios nucleasa, HNH y RuvC. Estos dos dominios HNH y RuvC escinden la hebra de ADN diana y la hebra de ADN no diana del virus, respectivamente, generando una rotura roma de doble hebra, 3 pares de bases delante de la PAM. Esto conduce a la destrucción del genoma viral.

Figura 4: Interferencia del sistema CRISPR / Cas9

Las bacterias emplean el sistema CRISPR / Cas9 para protegerlas de las invasiones. Sin embargo, el mismo sistema se puede aprovechar para editar el genoma de mamíferos, incluidos los humanos. A diferencia de las bacterias, da lugar a roturas de doble hebra en el ADN que luego se reparan mediante uniones de extremos no homólogos o un mecanismo de reparación dirigido por homología en células de mamíferos. Esto atrajo mucha atención de la comunidad científica por ser empleado en esta técnica de vanguardia para erradicar enfermedades humanas tales como trastornos genéticos de la sangre, enfermedades neurodegenerativas y cánceres. Hasta la fecha, se han reclutado varios ensayos clínicos para emplear la técnica CRISPR / Cas9 para tratar el cáncer y la beta talasemia según la base de datos ClinicalTrials.gov.

DESAFÍOS

Aunque el sistema CRISPR / Cas9 es muy prometedor para el tratamiento de enfermedades humanas, se enfrenta a desafíos técnicos.

El sistema CRISPR / Cas9 ocurre naturalmente en Streptococcus pyogene bacteria que es dañina para la salud humana. Una vez que se entrega a las células humanas, el cuerpo humano puede crear inmunogenicidad (provocando una respuesta inmune en el cuerpo humano por sustancia) que hace que el sistema CRISPR / Cas9 falle dentro del cuerpo.

Los investigadores a menudo emplean vectores de virus asociados a Adeno (AAV) para administrar el sistema CRISPR / Cas in vivo. Como la proteína Cas9 es de gran tamaño, el empaquetado en el vector AAV es un verdadero desafío. Por lo tanto, los investigadores deberían descubrir vectores alternativos que tengan baja inmunogenicidad o variantes cas9 que sean de menor tamaño para el envasado.

Un problema más es que el sistema CRISPR / Cas9 causa efectos fuera del objetivo al cortar la pieza incorrecta de ADN. Por lo tanto, es práctico descubrir variantes de cas9 que tengan una amplia compatibilidad con PAM y una alta especificidad de ADN para evitar este obstáculo.

Además, esta poderosa técnica debe emplearse de manera responsable y cuidadosa no solo para beneficiar a toda la humanidad, sino también para evitar conductas indebidas que pueden conducir a graves problemas éticos en la sociedad humana.


Edición de genes CRISPR-Cas9: verifique tres veces, corte una vez

Dos nuevos estudios de UC Berkeley deberían brindar a los científicos que usan CRISPR-Cas9 para la ingeniería del genoma una mayor confianza en que no editarán inadvertidamente el ADN incorrecto.

La técnica de edición de genes, creada por la bioquímica de UC Berkeley Jennifer Doudna y su colega, Emmanuelle Charpentier, directora del Instituto Max Planck de Biología de Infecciones en Berlín, ha revolucionado la investigación y las comunidades clínicas como una forma fácil y económica de realizar cambios precisos. en el ADN para inhabilitar genes, corregir trastornos genéticos o insertar genes mutados en animales para crear modelos de enfermedades humanas.

Los dos nuevos informes del laboratorio de Doudna y el del colega de UC Berkeley, Robert Tjian, muestran con mucho más detalle cómo la proteína Cas9 busca a través de miles de millones de pares de bases en una célula para encontrar la secuencia de ADN correcta, y cómo Cas9 determina si unirse o unirse. y cortar, iniciando así la edición de genes. Según estos experimentos, Cas9 parece tener al menos tres formas de verificar para asegurarse de que encuentra el ADN objetivo correcto antes de dar el paso irrevocable de hacer un corte.

"CRISPR-Cas9 ha evolucionado para lograr una orientación precisa del ADN y ahora comprendemos la base molecular de su actividad de búsqueda y escisión, que ayuda a limitar la edición de ADN fuera del objetivo", dijo Doudna, investigador del Instituto Médico Howard Hughes en UC Berkeley y profesor de biología molecular y celular y de química. Tjian es presidente del Instituto Médico Howard Hughes y profesor de biología celular y molecular de UC Berkeley.

Los estudios también ilustran qué tan bien funciona CRISPR / Cas9 en células humanas y animales (eucariotas) a pesar de que "la técnica fue inventada por bacterias para protegerse de contraer la gripe", dijo Doudna.

CRISPR-Cas9 es un híbrido de proteína y ARN, el primo del ADN, que funciona como un sistema eficiente de búsqueda y recorte en bacterias. Surgió como una forma de reconocer y matar virus, pero Doudna y Charpentier se dieron cuenta de que también podría funcionar bien en otras células, incluidos los humanos, para facilitar la edición del genoma. La proteína Cas9, obtenida de la bacteria. Streptococcus pyogenes, funciona junto con un ARN "guía" que se dirige a un tramo de ADN complementario de 20 nucleótidos. Una vez que el ARN identifica una secuencia que coincide con estos nucleótidos, Cas9 corta la hélice de ADN de doble hebra.

Un estudio, publicado en la edición del 13 de noviembre de Ciencias, rastreó moléculas de Cas9-RNA a través del núcleo de células de mamíferos mientras buscaban rápidamente en todo el genoma para encontrar y unirse solo a la región objetivo y no a otra.

"Es una locura que el complejo Cas9 logre escanear el vasto espacio de genomas eucariotas", dijo el estudiante graduado Spencer Knight, primer autor de la Ciencias papel.

Estudios anteriores habían sugerido que hay muchas regiones de ADN de aspecto similar que Cas9 podría unir y cortar, lo que podría limitar su utilidad si la precisión fuera importante. Estas regiones fuera del objetivo podrían compartir tan solo cuatro o cinco nucleótidos con el cebador de 20 nucleótidos, lo suficiente para que Cas9 las reconozca.

"Hay una gran cantidad de enlace fuera del objetivo por parte de Cas9, pero descubrimos que estas interacciones son muy breves, desde milisegundos hasta segundos, antes de que Cas9 continúe", dijo.

Debido a que estos enlaces exploratorios, tal vez hasta 300,000 de ellos, a menudo tienen una vida muy corta, unos pocos miles de complejos CRISPR-Cas9 pueden rastrear todo el genoma para encontrar un tramo de ADN específico. Cas9 también debe reconocer una secuencia corta de ADN de tres pares de bases inmediatamente después de la secuencia del cebador, denominada PAM, que ocurre aproximadamente 300 millones de veces dentro del genoma humano.

“Si Cas9 saltara durante decenas de segundos o minutos en cada sitio fuera del objetivo, nunca jamás podría encontrar un objetivo y cortar de manera oportuna”, dijo Knight.

El último punto de control de Cas9

El otro estudio, publicado en línea el 28 de octubre en Naturaleza, mostró que una vez que Cas9 se une a una región de ADN, realiza otra verificación antes de que dos secciones distantes del complejo proteico Cas9 se unan, como las hojas de una tijera, para alinear con precisión los sitios activos que cortan el ADN de doble hebra.

“Descubrimos que el Cas9 guiado por ARN puede unir algunas secuencias de ADN fuera del objetivo, que difieren del objetivo correcto por solo unas pocas mutaciones, de manera muy estrecha. Sin embargo, sorprendentemente, la región de Cas9 que realiza el corte está inhibida debido a la coincidencia imperfecta. Pero cuando se encuentra el ADN que coincide correctamente, Cas9 sufre un gran cambio estructural que libera esta inhibición y desencadena el corte del ADN ”, dijo el primer autor Samuel Sternberg, quien recientemente recibió su Ph.D. en UC Berkeley. Pudo observar estos cambios utilizando una versión etiquetada con fluorescencia del complejo Cas9.

“Creemos que este cambio estructural es el último punto de control, o etapa de corrección de pruebas, de la reacción de focalización del ADN”, dijo. “Primero, Cas9 reconoce un segmento corto de ADN junto al objetivo, el PAM, luego el ADN objetivo se empareja con el ARN guía a través del emparejamiento de bases Watson-Crick. Finalmente, cuando se identifica una coincidencia perfecta, la última parte de la proteína se coloca en su lugar para permitir el corte e iniciar la edición del genoma ".

Una proteína Cas9 más pequeña de una especie diferente de bacteria, Staphylococcus aureus, probablemente explota la misma estrategia para mejorar la precisión de la selección de ADN, lo que sugiere que "esta característica importante se ha conservado a lo largo del tiempo evolutivo", agregó.

"Esta es una buena noticia, ya que sugiere que tiene más de un punto de control para garantizar la unión correcta de Cas9", dijo Knight. "No solo hay una regulación de la secuencia, también hay una regulación temporal: tiene que interactuar con el ADN y estacionarse el tiempo suficiente para que realmente pueda reorganizarse y cortar".

Los descubrimientos de Doudna, Tjian y sus equipos arrojan luz sobre la base molecular de los efectos fuera del objetivo durante las aplicaciones de edición del genoma y pueden guiar el diseño futuro de variantes Cas9 más precisas.

Los estudios fueron financiados por la Fundación Nacional de Ciencias (MCB-1244557) y el Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM, RB4-06016).

Coautores con Knight, Doudna y Tjian en el Ciencias los trabajos son Liangqi Xie, Benjamin Guglielmi, Lea Witkowsky, Lana Bosanac y Elisa Zhang de UC Berkeley Wulan Deng, Jean-Baptiste Masson y Zhe Liu del Campus de Investigación Janelia, ubicado en Ashburn, Virginia, del Instituto Médico Howard Hughes y Mohamed El Beheiry y Maxime Dahan del Laboratoire Physico-Chimie Curie del Institut Curie de París, Francia. Tanto Doudna como Tjian son miembros del Centro de Ciencias Biomédicas y de la Salud Li Ka Shing en UC Berkeley.

Coautores con Sternberg y Doudna de la Naturaleza Los papeles son Benjamin LaFrance y Matias Kaplan de UC Berkeley.

Doudna es director de la Iniciativa de Genómica Innovadora de UC Berkeley y científico de la facultad en el Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley.

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Figura 1: CRISPR-Cas9 (www.stockadobe.com)

Si bien el papel de los productos biológicos en el tratamiento de enfermedades humanas ha evolucionado drásticamente durante la última década, también lo ha hecho la ingeniería genética. La ingeniería genética racional para mejorar las proteínas bioterapéuticas se ha convertido en una realidad catalizada por la publicación de las secuencias del genoma de múltiples líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO). Las nuevas células CHO "de diseño" modulan las modificaciones postraduccionales (PTM) de proteínas recombinantes mediante la edición del genoma, y ​​ahora es posible eliminar genes de células de levadura y de mamíferos con precisión (dentro de un par de bases de ADN), rápidamente y eficientemente. Eventualmente, tales técnicas se usarán en el desarrollo de proteínas terapéuticas recombinantes rentables.

La herramienta de edición de genes basada en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR) - proteína asociada a CRISPR 9 (Cas9) ha mejorado la edición del genoma de forma espectacular, haciéndola más rápida, más fácil, menos costosa y más eficiente que antes. Este sistema necesita solo una proteína y una molécula de ARN para lograr la escisión del ADN programada por ARN. Esa capacidad ha permitido a los investigadores de CHO dilucidar la base mecanicista detrás de la producción de proteínas de alto nivel y los atributos de calidad del producto (PQA) de interés. Actualmente, el énfasis en la edición de genes CHO se dirige a expandir la diversidad de productos, así como a controlar y mejorar la calidad y los rendimientos del producto. Aunque la optimización rutinaria de PTM a través de la "maquinaria" de glicosilación de una célula aún no es una realidad, los investigadores esperan poder eventualmente combinar la expresión de huéspedes no mamíferos con la glicosilación de anticuerpos de tipo humano realizada en levaduras modificadas genéticamente o incluso en plantas.

Pero el uso de la ingeniería de promotores para lograr un control transcripcional de precisión para la biotecnología sintética de células CHO podría lograrse en un futuro próximo. De manera similar, la edición del genoma multiplexado (selección simultánea de múltiples blancos relacionados o no relacionados) podría permitir el examen y la manipulación de genomas completos o redes de proteínas. Por lo tanto, ha revolucionado los eventos de knockout y knockin y ha jugado un papel crucial en la comprensión de los genomas de células de mamíferos y el uso de levaduras para ingeniería metabólica. Dichas capacidades de edición también han permitido una expresión alta, estable y consistente de transgenes que codifican proteínas terapéuticas complejas como los anticuerpos monoclonales (MAb).

Modificaciones postraduccionales
Las tecnologías avanzadas de edición de genes como CRISPR-Cas9, las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALE) y las herramientas de interferencia de ARN (ARNi) se complementan con la combinación de secuenciación de próxima generación con biotecnología de sistemas para facilitar mejoras adicionales en el procesamiento de glicosilación celular. Dichas herramientas permitirán a los ingenieros de células realizar modificaciones altamente refinadas y específicas para acelerar la capacidad de procesamiento de las células. Eso traerá mejoras constantes en el rendimiento y la calidad de las células, así como una mayor eficiencia del proceso, lo que conducirá a una mayor asequibilidad para las futuras necesidades de atención médica.

Los ingenieros celulares están presenciando una proliferación de herramientas habilitadoras a medida que los biólogos celulares y moleculares continúan desarrollando técnicas sofisticadas para descifrar atributos que son críticos para la calidad de los medicamentos. La mejora de los perfiles de glicosilación de los productos biológicos mejora la bioactividad y la calidad del producto, y la glicosilación ligada a N juega un papel crucial en la eficacia de las proteínas terapéuticas. La eficacia terapéutica probada de muchas proteínas de glicoingeniería ha estimulado el desarrollo de nuevos sistemas de expresión optimizados (por ejemplo, células de mamífero) para producir anticuerpos no fucosilados.

Ahora es factible producir material rápidamente para estudios de farmacología, formulación y toxicología sin tener que establecer una línea celular estable. Dicha capacidad puede acortar los plazos para el desarrollo de líneas celulares estables de más de seis meses a aproximadamente tres semanas, lo que permite la generación de clones estables en la etapa de investigación. Al mismo tiempo, ya se han diseñado diferentes sistemas de producción de proteínas glicooptimizadas (p. Ej., Levadura) para producir los pasos principales de la vía de N-glicosilación humana y, por lo tanto, han permitido versiones bio mejores de MAb terapéuticos.

La aplicación de herramientas CRISPR-Cas9 ha dado lugar a fenotipos knockout multiplexados. De manera similar, los próximos logros con ARN (pequeños) no codificantes en células CHO también podrían respaldar los esfuerzos de genómica funcional para mejorar las células productoras. Eso ampliaría la lista de objetivos de ingeniería de manera significativa (por ejemplo, como se logró con obinutuzumab, un MAb anti-CD20 humanizado y glicoingeniería, con carbohidratos de la región Fc afucosilados bisectados y tecnología GlycoMAb, de GlycArt-Roche).

No hace mucho, las células CHO se consideraban "cajas negras" porque los investigadores carecían de la información genómica de esas células. Eso obstaculizó los esfuerzos para comprender la base molecular de la producción de proteínas recombinantes de alta calidad en las células CHO. En particular, se ha logrado un progreso impresionante en la tecnología de cultivo de células CHO mediante enfoques empíricos como el cribado y la optimización del proceso, lo que permite altos rendimientos (10 g / L y más). Sin embargo, dichos rendimientos a menudo se logran solo mediante ciertos tipos de líneas celulares, y un alto grado de variabilidad en las células CHO recombinantes requiere procesos laboriosos y costosos para seleccionar el mejor clon para la producción de cada nuevo candidato terapéutico.

Las células recombinantes tradicionales se basan en la integración de plásmidos aleatorios de un casete de expresión en el genoma del huésped. Transgenes are likely to be inserted in heterochromatin regions, which results in very weak gene-expression levels. So a substantial number of clones (generally multiple hundreds to a few thousand) must be screened to find those rare cells with a stably integrated plasmid in highly transcriptionally active chromatin regions (“hotspots”).

Sequencing efforts have resulted in availability of additional genomic sequence data for different CHO cell lines. Moreover, an active effort is underway in the CHO cell-line community to refine the genome assembly and annotation for the Chinese hamster. In the past 20 years, several molecular and cellular biology tools have been developed for targeted-site gene integration for eventually minimizing the randomness of gene insertion and increasing the predictability of high transgene expression.

Genome Editing
First-Generation Genome-Editing Tools: Several recombinases have been used for targeted site approaches, with Cre–salmón ahumado and Flp–FRT being the most commonly used. Recombination-mediated cassette exchange (RMCE) technology also is attracting interest for targeted gene insertion. That technology has increased success rates and reduced timelines for the generation of stable industrial-grade CHO cell lines expressing MAbs reliably.

Second-Generation Genome-Editing Tools: This group includes endonucleases such as zinc finger nucleases (ZFN), meganucleases, transcription activator-like effectors nucleases (TALEN), and CRISPR-Cas9. Both ZFN and TALEN technologies rely on the ability to customize a DNA-binding domain for a specific sequence (the targeted sequence for cleavage) combined to a nuclease effector domain. CRISPR-Cas9 technology already has been validated for use with CHO cells and has been implemented to reduce production variability among clones. However, ZFN, TALEN and CRISPR-Cas9 technologies are used mostly for gene-specific knockout.
One critical challenge is to identify hotspots in a host genome that enable good expression levels and stability. Such specific integration might not be a one-size-fits-all approach because some therapeutic proteins could require a particular level of expression to fold correctly or to present adequate quality attributes (e.g., glycosylation and proteolytic processing). The discovery of additional naturally occurring RNA-guided nucleases offers increased targeting flexibility.

Some researchers also have engineered Cas9 enzymes to exhibit relaxed protospacer-adjacent motif (PAM) specificities. Such crucial advances expand the number of target loci that are amenable to RNA-guided genome editing. Other scientists have engineered Cas9 nuclease and managed to increase its DNA specificity dramatically. Thanks to the fusion of dead Cas9 (dCas9) to a cytidine deaminase enzyme that operates on ssDNA, “base editing” now can be used to generate point mutations in genomes.

Remarkably, CHO cells showed increased resistance to apoptosis after successful simultaneous (multiplex) disruption of fucosyltransferase 8 (FUT8), Bcl-2 associated X-protein (BAX), and Bcl-2 homologous antagonist killer (BAK) genes by CRISPR-Cas9 (1). The ZFN knockout approach achieved specific deletion of the glutamine synthetase (GS) and the dihydrofolate reductase (DHFR) genes in CHO cells, thus improving the selection stringency of the generated cell lines. Finally, both ZFN and a CRISPR-Cas9 approaches also were used for FUT8 gene-specific knockout. The resulting cell lines completely abolished fucosylation on the Fc domain of immunoglobulin G (IgG).

A less commonly used tool is mammalian artificial chromosome expression (ACE). This minigenome serves as an autonomous genetic element that replicates with cells. Its DNA sequence is customizable with different regulating elements that could help its expression.

The PiggyBac transposon system (System Biosciences) uses an efficient transposase purified from the cabbage looper moth (Trichoplusia ni) to integrate the gene of interest into a host genome. It has shown to improve yields for stable production of antibodies in CHO cell lines (2).

Genome-Editing Achievements: Introduction of additional N-glycan target sites into desired positions on the protein backbone by genetic mutation has been used to create glycoproteins with enhanced levels of glycosylation (overexpression of sialyltransferases and other glycosyltransferases, inhibition of sialidases) and sialylation. That has extended serum halflives and improved in vivo activity (3). (N-glycans also can be crucial for protein folding.) Thanks to a comprehensive ZFN knockout screen of glycosyltransferase genes and the identification of key genes that control decisive steps in N-glycosylation in CHO cells, it is now possible to provide homogeneous glycoforms.

Overexpression of B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) or B-cell lymphoma-extra large (Bcl-xL) has shown precise and efficient inhibition of apoptosis in recombinant CHO cell cultures by enhancing the culture’s longevity, cell viability, and endurance under environmental stresses. Consequently, that renders greater yields of therapeutic protein, which is a definite economic advantage in the biopharmaceutical industry. Similarly, down-regulation of caspases (e.g., caspase-8 and -9) and knockouts of proapoptotic genes (e.g., BAX and BAK) enhance the viability of both batch and fed-batch cultures. (Down-regulation of such genes can be achieved with various genome-editing techniques such as ZFNs, TALENs, and Cas systems).

One group that helped bridge those two technologies is the research team at the Memorial Sloan Kettering Institute Center for Cell Engineering. Directed by Michel Sadelain, the group has been an integral part of CAR-T therapy research, particularly targeting the CD19 molecule on white blood cells. CD19 is expressed on cells found in B-cell leukemia and resides on the cell surface, thereby making it available for antibody access. In 2017, Sadelain’s group published a study showing that directing a CD19-specific CAR to the T-cell receptor alpha constant (TRAC) locus increased T-cell potency. The modified cells “vastly outperformed conventionally generated CAR T-cells in mouse models of acute lymphoma leukemia,” with human trials planned (1).

CAR T-cells typically are made using retroviruses, but they insert CAR genes into random loci in genomes. CRISPR can be used to deliver CAR genes to specified targets in genomes. And current research is exploring the use of CRISPR–Cas9 editing to create next-generation CAR T-cell products, including “universal” CAR T-cells, making these cells more potent and controllable (2).

Referencias
1 Eyquem J, et al. Targeting a CAR to the TRAC Locus with CRISPR/Cas9 Enhances Tumour Rejection. Naturaleza 543(7643) 2017: 113–117 https://doi.org/10.1038/nature21405.

Therapeutic Protein Expression Regulation By Smart Promoters and Epigenomic Reprogramming
In the near future, research laboratories will be able to design transcriptional control systems and synthetic promoters, control the timing of gene expression at will by trigger-inducible transcription factors (TF), and protect against chromatin silencing. Researchers already have begun to edit the epigenome to alter regulation of a target gene. Moreover, effector fusions can be used to expand the repertoire of genome engineering modalities achievable using Cas9. And nonediting CRISPR tools are helping researchers to screen engineered cells for phenotypes of interest quickly and precisely.

CRISPR Intellectual Property Landscape and the Gene-Editing Innovation Roadmap
There is some risk that patent filings by academic institutions claiming critical components of the CRISPR-Cas9 technology could deter or slow down the development and use of the technology. However, research organizations and universities can establish a workable balance between access and control for essential research tools through sound management of intellectual property (IP). (For example, when the Cohen–Boyer patents were granted, Stanford University created a pioneering licensing program that provided a predictable legal framework for using its inventions. Nonexclusive licenses were made available to both companies and academic institutions. In fact, patent protection has played a significant role in the development of the technology to produce recombinant DNA in bacteria).

It has been widely publicized that several organizations have been filing patents over fundamental parts of the CRISPR-Cas9 system. Commercial assignees Dow AgroSciences and DuPont Nutrition Science together hold 33 inventions, all of which are related to crop and animal agriculture (genome-editing crop and weeds) and food (dairy industry) applications of the technology. In addition, the French company Cellectis holds rights on a broad patent for gene editing of cells in vitro. Academic institutions, through their licensing and spinoffs, are primarily in control of medical applications of CRISPR-Cas (e.g., The Broad Institute of Harvard University and the Massachusetts Institute of Technology (MIT) to Editas) with commercial partners (University of California at Berkeley to Caribou Biosciences and sublicensed to Intellia and Novartis).

It’s interesting that most patent holders appear to be pursuing a strategy of keeping an international option open for their portfolios. Fortunately, signs indicate that the pace of discovery and development of CRISPR is likely to continue, with a high probability of further improvements. The Broad Institute and MIT are building a portfolio on those principles and diversifying it.

Other gene-editing technologies might emerge to compete with or possibly even displace CRISPR-Cas (see “Alternative Gene-Editing Methods” box). Follow-on breakthroughs are likely to take center stage. Current patent holders will have difficulty pursuing restricted access to CRISPR-Cas9 for research use because it already is widely used in academic laboratories. The Broad Institute, MIT, and UC Berkeley already offer free use of the technologies they control for academic research purposes through Addgene, a nonprofit organization. Addgene uses the general terms of the Uniform Biological Material Transfer Agreement (UBMTA), which indicates that discoveries are owned by the recipient of the biological material and can be licensed for commercial use.

Inevitably, some of those new commercial applications could fall within the broadly drafted claims of the original patent and therefore require a second, commercial license. Inventors of follow-on applications using a CRISPR-Cas technology are likely to need a commercial sublicense from the respective exclusive commercial licensee that controls that technology (e.g., Editas, Caribou, Intellia, CRISPR Therapeutics, and Cellectis/Calyxt) rather than from the originating university.

One group that helped bridge those two technologies is the research team at the Memorial Sloan Kettering Institute Center for Cell Engineering. Directed by Michel Sadelain, the group has been an integral part of CAR-T therapy research, particularly targeting the CD19 molecule on white blood cells. CD19 is expressed on cells found in B-cell leukemia and resides on the cell surface, thereby making it available for antibody access. In 2017, Sadelain’s group published a study showing that directing a CD19-specific CAR to the T-cell receptor alpha constant (TRAC) locus increased T-cell potency. The modified cells “vastly outperformed conventionally generated CAR T-cells in mouse models of acute lymphoma leukemia,” with human trials planned (1).

CAR T-cells typically are made using retroviruses, but they insert CAR genes into random loci in genomes. CRISPR can be used to deliver CAR genes to specified targets in genomes. And current research is exploring the use of CRISPR–Cas9 editing to create next-generation CAR T-cell products, including “universal” CAR T-cells, making these cells more potent and controllable (2).

Epigenetic Control of Therapeutic Proteins
Conferring an open chromatin state in targeted chromosome loci (DNA stretches composed of nucleosome-depleted regions) can benefit transgene expression. Indeed, cis-acting epigenetic regulatory elements can help to remodel the chromatin environment, maintaining an active transcriptional state around a transgene. One type of epigenetic regulatory element (ERE) is the scaffold/matrix attachment region (S/MAR), thanks to which recombinant proteins could improve their expression levels significantly. Another class of EREs is chromatin opening elements (UCOEs), which confer an unmethylated, open chromatin state for transgene expression. UCOEs also have helped to increase the productivity of cell line producers of recombinant proteins.

Nonetheless, S/MAR and UCOE decrease the variability of expression between the different clones. Some epigenetic elements not only can help to increase the expression level of biotherapeutics, but also can increase the number of clones that have integrated a transgene with a more defined copy number of transgenes per cell, thus accelerating the selection process.

Protein Folding and Secretion of Recombinant Cells
Secretory bottlenecks of CHO cells can be relieved by overexpressing soluble norte-ethylmaleimide–sensitive factor attachment protein receptors (SNAREs). New targets for cell-engineering approaches also can be identified based on metabolomics profiling. A bottleneck at the malate dehydrogenase II (MDHII) level was characterized for the tricarboxylic acid (TCA) cycle in CHO cells, and pyruvate metabolism was shown to vary between high-producing and low-producing anti-CD20 CHO clones (2). Over the years, many cell engineering strategies have been used in attempts to increase such titers by optimizing selection markers, gene expression, cell growth, proliferation, protein folding, and secretion. Among those engineering tools, CRISPR-Cas9 and RMCE technologies will contribute significantly to the advance of glycoprotein production shortly.

With remarkable advances in genome editing, technologies such as the CRISPR-Cas9 tool as well as the combination of next-generation sequencing with systems biotechnology exhibit extraordinary potential for discovery and modulation of novel cell engineering targets. Such efforts might finally pave the way for development of rationally designed host cells. Efforts now are ongoing to engineer PTMs in microbial, insect, and plant cell systems to make those systems more suitable for therapeutic protein production.

Referencias
1 Baek E, Noh SM, Lee GM. Antiapoptosis Engineering for Improved Protein Production from CHO Cells. Heterologous Protein Production in CHO Cells. Humana Press: New York, NY, 2017: 71–85.

2 Lalonde ME, Durocher Y. Therapeutic Glycoprotein Production in Mammalian Cells. J. Biotechnol. 251, 2017: 128–140 https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2017.04.028.

3 Wang Q, et al. Glycoengineering of CHO Cells to Improve Product Quality. Heterologous Protein Production in CHO Cells. Humana Press: New York, NY, 2017, 25–44.


The future of CRISPR/Cas9

The rapid progress in developing Cas9 into a set of tools for cell and molecular biology research has been remarkable, likely due to the simplicity, high efficiency and versatility of the system. Of the designer nuclease systems currently available for precision genome engineering, the CRISPR/Cas system is by far the most user friendly. It is now also clear that Cas9&rsquos potential reaches beyond DNA cleavage, and its usefulness for genome locus-specific recruitment of proteins will likely only be limited by our imagination.


Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system

Animals carrying exogenous genes integrated at specific genomic loci are versatile tools for biological research 1 . Zebrafish (Danio rerio), an emerging vertebrate animal model, is widely used in studies on genetics, developmental biology and neurobiology. Although loss-of-function genomic editing for zebrafish has been well developed 2,3,4 , lack of feasible methods for inserting a large exogenous DNA sequence into the zebrafish genome is becoming a bottleneck for zebrafish-relevant research. It was reported that the coding sequence of enhanced green fluorescent protein (EGFP) can be integrated at the zebrafish tyrosine hydroxylase (th) locus through TALEN-mediated double-stranded breaks and homologous recombination (HR) with a low efficiency 6 . However, the targeted gene was destroyed and EGFP failed to express 6 . Recently, by using the type II bacterial clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system (CRISPR/Cas9), two non-HR-based knockin approaches were developed to insert Gal4 (a transcriptional transactivator) and EGFP into zebrafish genomic loci with a relatively high efficiency 7,8 . However, the coding sequence of targeted endogenous genes was disrupted or the expression pattern of inserted exogenous genes could not well recapitulate the endogenous ones as insertion occurred within either the exon 7 or cis-regulatory elements of targeted genes 8 . These disadvantages will limit their application in neuroscience research. Here, using the CRISPR/Cas9 system, we developed an intron targeting-mediated and HR-independent efficient knockin approach for zebrafish, with which the intactness of the coding sequence and regulatory elements of targeted endogenous genes are maintained.

The Th protein is a rate-limiting enzyme for synthesizing two important neuromodulators, dopamine and noradrenline. As dopamine and noradrenline are synthesized and released by dopaminergic and noradrenergic neurons, respectively, Th is a specific marker for these cells. We designed a short guide RNA (sgRNA) targeting the last intron of the zebrafish th and performed co-injection of sgRNA and mRNA of zebrafish codon-optimized Cas9 (zCas9) into one-cell-stage zebrafish embryo, which yielded a cleavage efficiency of ∼ 83% (Supplementary information, Table S1A and S1B). Next, we designed a donor plasmid th-P2A-EGFP consisting of three parts: a left arm, a P2A-EGFP coding sequence, and a right arm (Figure 1A). To retain the full coding sequence of th, the left arm begins from the upstream of the 5′ side of the sgRNA target site in the last intron, spans the whole last exon E13, and ends at the last base just before the stop codon of th. To keep the normal control of Th expression, the right arm includes the stop codon and 3′ regulatory elements of th. The P2A peptide is a linker for multicistronic expression 9 .

Intron targeting-mediated EGFP knockin at the zebrafish th lugar. (A) Schematic of the intron targeting-mediated strategy for generating EGFP knockin at the zebrafish th locus by using the CRISPR/Cas9 system. The sgRNA target sequence is shown in red and the protospacer adjacent motif (PAM) sequence in green. The left and right arm sequences of the donor plasmid are indicated by the brown lines with double arrows. The left arm is 1 298 bp, and the right arm is 671 bp. los th-P2A-EGFP cassette was integrated into the th locus after co-injection of the donor with the sgRNA and zCas9 mRNA. The zebrafish th has 13 exons, and E12 and E13 represent the 12th and 13th exons, respectively. Right: the schematic of the mRNA and protein of the targeted th gene. (B) Representative projected en vivo confocal images (dorsal view) of th-P2A-EGFP knockin F1 larvae at 3 dpf, showing specific EGFP expression in various dopaminergic (OB, Pre, PT, and HI) and noradrenergic neurons (LC and MO). The white arrowheads mark non-specific signaling on the skin. A, anterior D, dorsal R, right. Scale bar, 50 μm. (C) PCR analysis of the 5′ and 3′ junctions of F1 progenies from the 7# founder. The F1, R1, F2 and R2 primers are shown in A. (D) 5′ and 3′ junction sequences of F1 progenies of three th-P2A-EGFP knockin F0 founders. The indel mutations are highlighted in yellow, and the PAM and sgRNA target sequences are shown in green and red, respectively. (MI) Whole-mount en el lugar double immunostaining of th-P2A-EGFP knockin F1 larvae, showing that EGFP signaling (green) co-localizes with Th signals (red). The white arrowheads mark non-specific signaling on the skin. Scale bar, 20 μm. (F) Western blot of the Th expression in WT and heterozygous th-P2A-EGFP knockin F1 embryos. (GRAMO) Dopamine (DA) immunostaining of th-P2A-EGFP knockin F1 (top) and WT larvae (bottom left). Bottom right: DA intensity of DA-positive neurons in WT and knockin F1 larvae. The numbers on the bars represent the numbers of cells examined. Scale bar, 10 μm. (H) Bright-field image showing en vivo whole-cell recording of EGFP-expressing LC neurons in a homozygous th-P2A-EGFP knockin F2 larvae. The black arrow indicates the recording microelectrode. Scale bar, 10 μm. (I) Whole-cell currents of an EGFP-expressing LC neuron. Under voltage-clamp mode, the neuron was held at −60 mV and voltage pulses from −100 to 30 mV with an interval of 10 mV were applied. Action potential currents (arrow) appear near −30 mV.

We co-injected the donor plasmid, sgRNA and the zCas9 mRNA into one-cell-stage fertilized zebrafish egg. As both the donor plasmid DNA and the last intron of th contain sgRNA target site, concurrent cleavage by sgRNA/Cas9 would result in efficient and specific integration of the donor DNA into the th locus via non-HR. Indeed, we observed EGFP expression in the brain of injected larvae 3 days post fertilization (dpf) (33/139 Supplementary information, Figure S1A1 and Table S1B). Based on their location and morphology 10 , EGFP-expressing cells included dopaminergic neurons in the posterior tubercular (PT), intermediate hypothalamus (HI) and pretectum (Pre), and noradrenergic neurons in the locus coeruleus (LC) and medulla oblongata (MO) (Supplementary information, Figure S1A1). Successful non-HR-mediated insertion of the th-P2A-EGFP donor was then verified by PCR using target site- and donor-specific primers and junction sequencing analysis (Supplementary information, Figures S1A2 and S1A3). The specificity of knockin events was further confirmed by en el lugar immunohistochemistry staining, which revealed that EGFP was co-localized with Th in 46 out of 48 Th-positive cells in three larvae examined (Supplementary information, Figures S1A4 and S1A5).

To examine the germline transmission of knockin events, 25 embryos showing mosaic expression of EGFP were raised to adulthood. Each of them was then outcrossed to wild-type (WT) zebrafish, and their F1 progenies were screened for EGFP signal. Three F0 founders were identified, and EGFP-positive F1 progenies were produced at rates ranging from 15.5% to 21.1% (Supplementary information, Table S1C). As expected, in comparison with F0 (Supplementary information, Figure S1A1), more EGFP-expressing dopaminergic and noradrenergic neurons were observed in F1 progenies (Figure 1B), including neurons in the olfactory bulb (OB), Pre, PT, HI, LC and MO. PCR and junction sequencing analysis of F1 progenies confirmed the inheritance of the genomic integration of their corresponding F0 founders (Figure 1C and 1D). Immunostaining was also performed in the F1 embryos of th-P2A-EGFP knockin fish, and EGFP signal was found to be well co-localized with the Th protein (98% ± 1%, mean ± SEM, in 5 larvae Figure 1E), suggesting the high specificity of EGFP expression in the stable knockin lines.

As the full reading frame and regulatory elements of th were maintained by using this knockin strategy, both the integrity and expression pattern of the gene product should be normal. To examine these points, we extracted the total protein from F1 embryos carrying EGFP knockin at th and performed western blot analysis. F1 embryos were heterozygous because they were generated by crossing knockin F0 founders with WT fish. By using a Th antibody, two bands for knockin embryos were detected (Figure 1F). The lower band at around 56 kDa represents the WT Th protein derived from a WT th alelo. The P2A peptide is about 2 kDa and cleaved between the last two amino acids. If knockin events did not affect the integrity of the Th protein, the cleavage of the Th-P2A-EGFP protein will result in two products: Th-P2A fusion protein (58 kDa) and EGFP protein (Figure 1A). Therefore, the upper band at around 58 kDa indicates the integrity of the Th protein produced from a knockin th alelo. Furthermore, the expression levels of the WT Th protein and the knockin Th-P2A fusion protein were almost equal (Figure 1F), further suggesting that our knockin strategy does not impair the expression level of the targeted endogenous gene. To examine whether knockin events affect Th functions, we then performed immunostaining of dopamine, the level of which can reflect the activity of Th. The intensities of dopamine signals in dopaminergic neurons were not significantly different between knockin F1 and WT embryos (PAG = 0.4 Figure 1G), suggesting that Th function is not affected by knockin events.

To examine the physiological normality of neurons carrying targeted integration, en vivo whole-cell recording was subsequently performed in homozygous th-P2A-EGFP knockin F2 larvae (Figure 1H). EGFP-expressing neurons exhibited a normal intrinsic membrane property, as reflected by outwardly rectifying whole-cell currents (Figure 1I).

To extend the application of our knockin strategy to other exogenous genes, we generated knockin fish carrying the transactivator protein Gal4 en el th locus by using the same strategy, in which only the EGFP coding sequence was replaced with the Gal4 sequence (th-P2A-Gal4 Supplementary information, Figure S1B1). After injection of Gal4 knockin-relevant elements into fertilized eggs of Tg(UAS:GCaMP5) transgenic zebrafish, integration events were visualized by the expression of GCaMP5 in dopaminergic or noradrenergic neurons (Supplementary information, Figure S1B2). As GCaMP5 is a genetically encoded calcium indicator, we could observe mechanical stimulus-induced calcium responses in neurons by puffing water to the fish tail through a micropipette. We also injected the Gal4 knockin-relevant elements into WT fish to screen for th-P2A-Gal4 knockin founders. As the Gal4 protein has no fluorescence, we raised the injected knockin embryos to adulthood without prior selection and crossed these adults with Tg(UAS:Kaede) transgenic fish. Two founders were identified among the total of 28 injected fish (Supplementary information, Table S1D), as evidenced by the fact that dopaminergic neurons were labeled by Kaede in their progenies, which were produced at a mean rate of ∼ 7% (Supplementary information, Figure S1B4 and Table S1D). Successful insertion of the th-P2A-Gal4 donor was then verified by PCR and junction sequencing analysis in F1 progenies (Supplementary information, Figures S1B5 and S1B6).

It was reported that the CRISPR/Cas9 system shows a high frequency of off-target (OT) cleavage in human cell lines, and the specificity of Cas9 targeting can tolerate up to three base pair (bp) mismatches between a sgRNA and its target DNA 11 . We therefore searched all zebrafish genomic loci containing up to 3-bp mismatches in comparison with the coding sequence of the th sgRNA, and found three potential OT sites. PCR and sequencing analysis of those potential OT sites in the genome of injected WT embryos or th-P2A-EGFP knockin F1 embryos did not reveal indels (Supplementary information, Table S1E), suggesting a low OT rate associated with our knockin strategy.

The applicability of our knockin strategy was further validated by targeting other endogenous genes specifically expressed in different types of cells, as exemplified by the integration of EGFP into the zebrafish tryptophan hydroxylase 2 (tph2), glial fibrillary acidic protein (gfap), and flk1 loci. Estas EGFP insertions resulted in the specific labeling of serotoninergic neurons, glia and vascular endothelial cells, respectively (Supplementary information, Figures S1C-S1E, and Table S1A and S1B). It is worth noticing that, in the case of the tph2 knockin, the second last intron was selected for targeting, indicating that the last intron is the first but not the only choice for targeting. Furthermore, by replacing the P2A en el gfap-P2A-EGFP plasmid with a flexible serine-serine linker sequence, we succeeded in fusing an EGFP tag to endogenous Gfap (Supplementary information, Figure S1F), demonstrating that our knockin strategy can also be used to tag endogenous proteins.

Taking advantage of both the HR for donor design and the non-HR for donor integration, we developed a novel CRISPR/Cas9-mediated intron-targeting knockin strategy, by which knockin zebrafish can be efficiently generated without disruption of targeted endogenous genes. Compared with HR, error-prone non-homologous end joining (NHEJ)-involved non-HR knockin for zebrafish has two advantages. First, NHEJ is at least 10-fold more active than HR during early zebrafish development 12 . Second, unlike HR, NHEJ does not need the precise homology between the parent zebrafish and the targeting donor, avoiding time-consuming screening and genotyping of parent animals. More importantly, to maintain the integrity of targeted endogenous genes, we designed sgRNAs targeting introns, so that NHEJ-mediated indel mutations do not change the reading frame of targeted genes. In addition, intron targeting also theoretically increases the rate of in-frame insertion up to 3-fold in comparison with exon-based targeting. Furthermore, we artificially added the endogenous genome sequence spanning from the sgRNA target site to the 3′ intergenic region into donor plasmids. Therefore, the predicted forward ligation of the donor into the targeted locus retains the original reading frame and both 5′ and 3′ regulatory elements of targeted genes. Taken together, this strategy has two advantages: (1) inserted exogenous genes can faithfully recapitulate the expression pattern of targeted endogenous genes (2) the expression and function of targeted endogenous genes are maintained. Thus, the readiness, high efficiency and targeted gene integrity maintenance make our strategy an applicable knockin approach for zebrafish and even other organisms.


1. Introducción

For many years, molecular biologists have sought ways to use cellular repair mechanisms to manipulate DNA through genome editing. In this way, they would have the power to change the genome by correcting a mutation or introducing a new function (Rodriguez, 2016). For this purpose, genome editing technologies were developed (Memi et al., 2018). In recent years, clustered regularly interspaced short palindromic repeats technology (CRISPR-Cas9) has become the most preferred method of gene editing. This technology has advantages such as high accuracy, easy handling, and relatively low cost compared to previous technologies, such as zinc-finger nuclease (ZFN) and transcription activator-like effector nuclease (TALEN). Thanks to these benefits, CRISPR-Cas9 technology can be easily applied in any molecular biology laboratory.

Genome editing technologies are used in the formation of human disease models in experimental animals and for the understanding of basic gene functions. They also have great therapeutic potential for future treatment of untreated diseases such as certain cancers, genetic disorders, and HIV/AIDS. Today, genome editing in somatic cells is one of the promising areas of therapeutic development (Otieno, 2015). However, various bioethical issues have arisen due to the potential impact of these technologies on the safety of food stocks and clinical applications (Hundleby and Harwood, 2018 Hirch et al., 2019). This review discusses the challenges, possible consequences, and bioethical issues of CRISPR-Cas9 in detail.


Chickens and pigs with integrated genetic scissors

Researchers at the TUM have demonstrated a way to efficiently study molecular mechanisms of disease resistance or biomedical issues in farm animals. Researchers are now able to introduce specific gene mutations into a desired organ or even correct existing genes without creating new animal models for each target gene. This reduces the number of animals required for research..

CRISPR/Cas9 enables desired gene manipulations

CRISPR/Cas9 is a tool to rewrite DNA information. Genes can be inactivated or specifically modified using this method. The CRISPR/Cas9 system consists of two components.

The gRNA (guide RNA) is a short sequence that binds specifically to the DNA segment of the gene that is to be modified. The Cas9 nuclease, the actual "gene scissors," binds to the gRNA and cuts the respective section of the target DNA. This cut activates repair mechanisms that can inactivate gene functions or incorporate specific mutations.

Healthy chickens and pigs with integrated gene scissors

"The generated animals provide the gene scissors, the Cas9 protein, right along with them. So all we have to do is to introduce the guide RNAs to get animals which have specific genetic characteristics," explains Benjamin Schusser, Professor of Reproductive Biotechnology at the TUM. "The initial generation of these animals took about three years. Cas9 can now be used at all stages of animal development, since every cell in the body permanently possesses the Cas9 protein. We have been successfully able to utilize this technique in chicken embryos as well as in living pigs."

The healthy chickens and pigs produced by the researchers thus possess the Cas9 nuclease in all organs studied. This is particularly useful in biomedical and agricultural research.

Analytical tool to fight viral or cancer diseases

Pigs are used as disease models for humans because their anatomy and physiology are much more similar to humans in comparison to mice (currently a common disease model). Thus, a modified pig may help to better understand the mechanism of carcinogenesis in humans. Potential new treatments for humans can also be tested in animal models.

"Due to the presence of Cas9 in the cells the processes are significantly accelerated and simplified," says Angelika Schnieke, Professor of Livestock Biotechnology at the TUM. "Cas9-equipped animals make it possible, for example, to specifically inactivate tumor-relevant genes and to simulate cancer development."

Cas9 pigs and chickens enable researchers to test which genes might be involved in the formation of traits, such as disease resistance, directly in the animal. "The mechanism of the CRISPR/Cas9 system may also be useful for combating infections using DNA viruses. Initial cell culture experiments showed that this already works for the avian herpes virus," says Prof. Schusser.

Important resource for biomedical and agricultural research

Prof. Schnieke notes, "Our Cas9-expressing chickens and pigs represent an innovative resource for genome editing in the biomedical and agricultural sciences, but beyond that, these animals are also available to other research groups. Hence, efficient genome editing in living animals has the potential to significantly advance biomedical and agricultural research."


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