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¿Pueden los neutrófilos matar bacterias dentro de otras células?

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¿Son los neutrófilos capaces de entrar en las células epiteliales para matar bacterias? Por lo tanto, incluso si una bacteria ingresa a las células epiteliales, ¿pueden los neutrófilos ingresar al epitelio para matar las bacterias?

Además, cuando las bacterias ingresan al torrente sanguíneo, ¿pueden los neutrófilos matar a las bacterias?

No tengo experiencia en biología. Entonces, una explicación simple será útil


¿Son los neutrófilos capaces de penetrar en las células epiteliales para matar bacterias? Por lo tanto, incluso si una bacteria ingresa a las células epiteliales, ¿pueden los neutrófilos ingresar al epitelio para matar las bacterias?

No. En primer lugar, porque las bacterias (excepto en casos muy especiales) no entran en las células epiteliales (u otras), eso es lo que hacen los virus. En segundo lugar, los neutrófilos reconocen las bacterias basándose en marcadores en su pared celular. Estos marcadores pueden provenir de las propias bacterias o del sistema inmunológico innato (ver sistema del complemento) que 'marca' las bacterias, en cualquier caso, estar dentro de otra célula protegería a las bacterias de los neutrófilos. Los casos son como estos son manejados por las células T CD8 + del sistema inmunológico adaptativo.

Además, cuando las bacterias ingresan al torrente sanguíneo, ¿pueden los neutrófilos matar a las bacterias?

, ese es su trabajo y los neutrófilos generalmente están dentro de la sangre (torrente), por lo que podrían encontrar y matar bacterias allí.


Matanza de neutrófilos humanos Bacillus Anthracis

Bacillus Anthracis las esporas causan infecciones naturales y se utilizan como armas biológicas. Infección por inhalación con B. anthracis, el agente etiológico del ántrax, casi siempre es letal, sin embargo, las infecciones cutáneas suelen permanecer localizadas y se resuelven espontáneamente. Los neutrófilos se reclutan típicamente para la piel, pero rara vez para otras formas de infecciones por ántrax, lo que aumenta la posibilidad de que los neutrófilos maten B. anthracis. En este estudio infectamos neutrófilos humanos con esporas o bacterias vegetativas de una cepa de tipo salvaje, o cepas, que expresan solo uno de los dos principales factores de virulencia. Los neutrófilos humanos engullidos B. anthracis esporas, que germinaron intracelularmente y luego fueron eliminadas de manera eficiente. Curiosamente, la muerte de neutrófilos fue independiente de la producción de especies reactivas de oxígeno. Fraccionamos un extracto de gránulos de neutrófilos humanos mediante cromatografía líquida de alto rendimiento e identificamos α-defensinas como el componente responsable de B. anthracis asesinato. Estos datos sugieren que el reclutamiento oportuno de neutrófilos puede controlar las infecciones cutáneas y posiblemente otras formas de B. anthracis infecciones, y que las α-defensinas juegan un papel importante en el potente anti-B. anthracis actividad de los neutrófilos.


Conceptos básicos de NET

Los neutrófilos son esenciales para la defensa inmunológica y la prevención del crecimiento excesivo de microbios. Son muy abundantes (se producen alrededor de 100 mil millones en la médula ósea de un ser humano en un solo día) y circulan en el torrente sanguíneo para infiltrarse rápidamente en los tejidos si los neutrófilos detectan una amenaza microbiana. Pertenecientes a una clase de glóbulos blancos llamados granulocitos, se caracterizan por un citoplasma lleno de gránulos que contienen proteínas antimicrobianas. Los neutrófilos pueden engullir patógenos y luego fusionar sus gránulos con sus fagosomas, que contienen los microbios internalizados. Alternativamente, las células pueden fusionar sus gránulos con la membrana plasmática para liberar antimicrobianos para atacar a los parásitos extracelulares.

La investigación sobre los neutrófilos se complica por el hecho de que son células de vida corta. Por ejemplo, a diferencia de otros tipos de células humanas, los neutrófilos no se pueden cultivar durante más de unas pocas horas y no son susceptibles de edición genética. Por esta razón, todavía carecemos de una imagen mecanicista detallada de cómo se forman exactamente las redes. Los primeros informes confirmaron la hipótesis original de que los NET no son el resultado de la necrosis pasiva de los neutrófilos. Estudios posteriores agregaron complejidad al demostrar que diferentes desencadenantes inflamatorios inducen varias vías que conducen a la liberación de NET, y que la liberación de NET no siempre da como resultado la lisis del neutrófilo.

Dicho esto, la mayoría de las vías de formación de NET matan a la célula inmunitaria, normalmente como resultado de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Los patógenos bacterianos o fúngicos hacen que los neutrófilos activen quinasas que inducen el ensamblaje de un complejo enzimático llamado nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa. La NADPH oxidasa luego produce grandes cantidades de superóxido, un compuesto de oxígeno altamente reactivo que transporta un electrón extra, durante un proceso llamado explosión oxidativa de neutrófilos. Los ROS resultantes del estallido oxidativo desencadenan la desintegración de un complejo multiproteico para liberar NE activo, un componente principal de los NET, en el citoplasma. (Vea la ilustración en la página 45.)

Luego, NE migra al núcleo de los neutrófilos, donde escinde las histonas y otras proteínas para descondensar la cromatina. Finalmente, la cromatina llena toda la célula hasta que la célula se lisa y extruye el NET en el espacio extracelular, un proceso conocido como NETosis. Recientemente identificamos un papel importante para la proteína formadora de poros gasdermin D tanto en la expansión nuclear como en los procesos de lisis, aunque los mecanismos aún no están claros. En el espacio extracelular, se cree que las redes atrapan y matan a los patógenos desencadenantes.


Revisar

Función de los neutrófilos frente a la infección microbiana

Los neutrófilos protegen el cuerpo en primera línea contra las infecciones microbianas. Una vez que se establece la infección bacteriana o fúngica, los neutrófilos se descargan de la médula ósea al torrente sanguíneo en cuestión de horas y luego migran al sitio infeccioso extravascular siguiendo a los quimioatrayentes. Los neutrófilos tisulares son activados por las citocinas inflamatorias, complementos y otros mediadores proinflamatorios. En el sitio infeccioso, los neutrófilos ingieren y digieren microorganismos, lo que se conoce como fagocitosis, y se cree que este proceso es el papel más importante de los neutrófilos en la defensa del huésped. Los neutrófilos fagocitan y engullen a los microbios en fagosomas que se fusionan rápidamente con los gránulos que contienen las moléculas tóxicas, fosfolipasas, ROS y proteasas, incluida la lisozima, la proteína bactericida que aumenta la permeabilidad (BPI), las defensinas y las catelicidinas [8] (Figura 1).

Vista microscópica de contraste de fase de la fagocitosis (objetivo × 40). Fagocitado Escherichia coli se visualizan dentro de vacuolas conocidas como fagolisosomas (flechas). Barra de escala representa una longitud de 10 μm.

Los neutrófilos son intrínsecamente de corta duración, de aproximadamente 5-6 días, y sufren apoptosis espontánea [9]. En los tejidos infectados, su apoptosis puede retrasarse tanto por componentes microbianos como por estímulos proinflamatorios [10, 11]. Generalmente, los neutrófilos tisulares mueren en apoptosis; sin embargo, si la infección es lo suficientemente grave, algunos sufren necrosis u otros estilos de muerte celular. A excepción de las muertes de células apoptóticas y autofágicas, la liberación incontrolada de sustancias tóxicas de los neutrófilos muertos puede propagar la respuesta inflamatoria que conduce al daño tisular. Por lo tanto, evitar la muerte no programada y la eliminación de los neutrófilos moribundos es crucial para el mantenimiento de la homeostasis [12, 13]. Para acabar con la inflamación, es necesario no solo atenuar la generación de mediadores antiinflamatorios, sino también eliminar las células inflamatorias junto con los microbios que han ingerido [14].

Necrosis

Inducción de necrosis

La mayoría de los neutrófilos sufren apoptosis después de salir de la circulación periférica sin infección [15]. Cuando la apoptosis se desarrolla de forma ordenada, los macrófagos tisulares y otros fagocitos ingieren los cuerpos apoptóticos que incluyen enzimas granulares potencialmente dañinas. Por el contrario, la necrosis es una muerte celular turbulenta. Si esta muerte celular accidental se desencadena por eventos inesperados, los componentes tóxicos, incluidas las enzimas proteolíticas y las enzimas generadoras de oxidantes, se liberan de las células necróticas de manera no regulada. La necrosis de neutrófilos es probablemente una de las principales causas de daño tisular durante la infección [16], pero se sabe poco acerca de cómo sufren necrosis y no existe un método simple que pueda detectar los neutrófilos que sufren necrosis.

Respuesta a la necrosis

Las células necróticas liberan una variedad de señales de peligro conocidas como patrones moleculares asociados al daño (DAMP), como el cuadro de grupo de alta movilidad 1 (HMGB1), ácido úrico, proteínas de choque térmico, complejos de ADN-cromatina y péptidos antimicrobianos. Muchas de estas sustancias son reconocidas por receptores específicos denominados receptores de reconocimiento de patrones (PRR) y estimulan la síntesis de mediadores proinflamatorios. Por ejemplo, HMGB1, una proteína nuclear que se une al ADN y regula la transcripción de genes, se libera de las células necróticas y se ha demostrado que estimula la secreción de citocinas inflamatorias por parte de los monocitos [17]. El ácido úrico y su forma activa, urato monosódico (MSU), se liberan al compartimento citosólico bajo estimulación inflamatoria. La MSU ha atraído recientemente la atención como un fuerte inductor de reacción inflamatoria [18]. También se ha demostrado que los complejos ADN-cromatina [19] y las proteínas de choque térmico [20, 21] estimulan la producción de citocinas proinflamatorias [22]. Dado que se sabe que los PRR reconocen los patrones moleculares de los microorganismos y sus productos relacionados, el estímulo intra y extrainflamatorio conocido como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) en la sepsis está mediado por receptores similares. Los PAMP son componentes comunes de muchos microbios, por ejemplo, lipopolisacárido, peptidoglicano y flagelina, que son de origen bacteriano, así como ARN y ADN, que pueden ser de origen viral o bacteriano. En cuanto a los PRR, el receptor tipo Toll (TLR) es el más conocido y se han identificado más de diez subtipos en humanos. Entre ellos, TLR-3 es un receptor de ARN de doble hebra viral, que permite a los macrófagos reconocer subproductos de neutrófilos necróticos, estimulando así la generación de citocinas proinflamatorias [23].

La aparición de neutrófilos necróticos.

Se especifica que los neutrófilos necróticos tienen un citoplasma inflamado con un núcleo no dispuesto. Bajo observación en serie, se observó el paso inicial del cambio morfológico en el núcleo, es decir, núcleos lobulados (Figura 2a) fusionados y convertidos en una gran estructura redonda (Figura 2b). En el segundo paso, se reconoció el abombamiento de la célula y la desintegración de la membrana (Figura 2c). Sin embargo, estos no fueron los cambios morfológicos primarios ya que muchos de los neutrófilos experimentan apoptosis inicialmente. Pero, si la agresión es lo suficientemente grave, algunos neutrófilos bajo la vía de la apoptosis se convierten en necrosis, y este estilo se conoce como "necrosis secundaria" [24]. En la etapa tardía de la necrosis, aunque la membrana nuclear parecía intacta, la cromatina se había descondensado y el contenido nuclear se había derramado hacia el citoplasma, y ​​este evento se reconoció como la tinción del citoplasma bajo la observación microscópica de inmunofluorescencia (Figura 3, centro ). La necrosis celular finalmente conduce a la permeabilización de la membrana citoplasmática y la desintegración celular (autólisis abierta) con pérdida de contenido celular [25].

Cambios morfológicos en neutrófilos necróticos. Imágenes de lapso de tiempo de los neutrófilos. La necrosis fue inducida por lipopolisacárido. in vitro. El núcleo lobulado (flecha) (a) se fusionó y se convirtió en una célula mononuclear redonda (B). Las células necróticas comprometen terminalmente la membrana celular que permite que las células se hinchen. (C). Barra de escala representa una longitud de 10 μm.

Tinción inmunofluorescente de neutrófilos necróticos. Campo Claro (panel izquierdo) y superposición (panel medio) imágenes que muestran la distribución del ADN en neutrófilos de ratón estimulados por lipopolisacárido. En los neutrófilos necróticos (flechas blancas), El ADN se esparce en el citoplasma y se tiñe con rojo ID (rojo), mientras que otras células mantienen los gránulos y el ADN reside en los núcleos (flechas negras). los panel derecho muestra la imagen combinada de las celdas seleccionadas. Se tomaron fotografías microscópicas 3 h después de la estimulación. Todos barras de escala representan una longitud de 20 μm.

Apoptosis

Inducción de apoptosis

En contraste con la necrosis, que es una secuencia pasiva de eventos que conducen a la desintegración de la envoltura nuclear y las membranas citoplasmáticas, la apoptosis representa una muerte celular programada altamente organizada [26]. La capacidad de eliminar células por apoptosis en lugar de necrosis es favorable para el huésped porque la eliminación celular de manera ordenada puede limitar el grado de muerte celular e inflamación causada por la liberación incontrolada de productos neutrófilos tóxicos durante la necrosis. La apoptosis se inicia por una vía intrínseca o extrínseca. La vía intrínseca es activada por diferentes estímulos nocivos e implica la liberación de citocromo C de las mitocondrias al citosol [27]. Esta liberación desencadena la activación de caspasas intracelulares responsables de la escisión del ADN y las proteínas citoplasmáticas estructurales [28]. La segunda vía extrínseca de la apoptosis se desencadena por la unión de ligandos extracelulares como el factor de necrosis tumoral (TNF) -α o el ligando Fas (FasL) a receptores específicos de TNF en la superficie celular [29]. La unión de estos ligandos genera una señal transmembrana para activar la secuencia de caspasa. En el caso de los neutrófilos, el momento de la apoptosis está estrictamente regulado. Los granulocitos neutrófilos, en particular, están preparados para sufrir apoptosis dentro de las 24-48 h después de haber abandonado la circulación sistémica, pero el momento exacto en el que esto ocurre está influenciado por varios factores [30, 31].

La aparición de neutrófilos apoptóticos.

Habiendo cumplido su propósito en un sitio de infección, los neutrófilos se someten a apoptosis y eliminan las células de manera eficiente a través de la ingestión de los macrófagos [32, 33]. Las características morfológicas de la apoptosis incluyen la condensación de la cromatina (Figura 4a) y su migración a la periferia nuclear (Figura 4b), la fragmentación del ADN nuclear y la formación de ampollas en las membranas celulares, formando cuerpos apoptóticos (Figura 4c) listos para ser ingeridos por los vecinos. fagocitos [32, 34].

Cambios morfológicos en neutrófilos apoptóticos. Imágenes de lapso de tiempo de los neutrófilos. Morfología apoptótica temprana con un núcleo condensado inducido por lipopolisacárido (flecha) (a). Célula de rodeo con agregación de cromatina perinuclear pero integridad del citoplasma (B). En la etapa tardía de la apoptosis, el núcleo se colapsa y los gránulos citoplasmáticos se apiñan de manera apretada. Finalmente, las ampollas están formadas por la membrana plasmática. (C). Barra de escala representa una longitud de 10 μm.

Autofagia

La autofagia es un mecanismo homeostático involucrado en la eliminación de orgánulos dañados y en la supervivencia celular bajo ciertas tensiones o agotamiento de nutrientes para proporcionar nutrientes y proteínas esenciales a través del reciclaje de los orgánulos citosólicos [35]. La implicación de la autofagia en la inmunidad innata aún no se ha aclarado, pero una posible explicación de la autofagia activada durante la sepsis es que el proceso autofágico da como resultado la eliminación de patógenos intracelulares (xenofagia) durante la sepsis [36, 37]. Se ha informado de la regulación de la autofagia mediante la activación de ROS, TLR y citocinas inflamatorias como el TNF-α y los interferones [38-40]. La activación de TLR no da como resultado un exceso de explosión oxidativa, pero la inhibición de la apoptosis conduce a la inducción de autofagia [41, 42]. Teniendo en cuenta el papel regulador de la apoptosis en el proceso inflamatorio, la inducción de la autofagia a favor de la supervivencia en los neutrófilos mejora las respuestas inflamatorias al retrasar la muerte celular y podría estar involucrada en la patogénesis de la sepsis relacionada con la supresión de la apoptosis, lo que conduce a una lesión tisular. Como se mencionó anteriormente, la autofagia es básicamente el mecanismo de supervivencia de las células; sin embargo, cuando la agresión es excesiva, la autofagia da como resultado la muerte celular autofágica. Las características morfológicas de esta muerte celular incluyen vacuolización, degradación del contenido citoplasmático y falta de condensación de cromatina. Las células que experimentan muerte celular autofágica pueden ser internalizadas por células vecinas. Por tanto, este tipo de muerte celular se considera una forma no inflamatoria [43].

NETosis

Inducción de NETosis

El término "NETosis" para la muerte de células de neutrófilos conduce a la formación de NET. La NETosis es la tercera muerte celular programada de neutrófilos, que es bastante diferente de otros tipos de muerte celular. En las circunstancias de una infección bacteriana, micótica o parasitaria, los componentes microbianos como el lipopolisacárido y el ácido lipoteicoico y las ERO, incluido el peróxido de hidrógeno, pueden inducir cambios morfológicos peculiares en los neutrófilos [44]. La formación rápida de NET también es inducida por plaquetas activadas a través de TLR-4 [45]. De manera similar, las alarminas como las proteínas de choque térmico, HMGB1, así como el ARN y el ADN de origen del huésped se detectan como iniciadores de NETosis. Con respecto a los PRR, se informa que el ARN y el ADN son detectados por TLR-9 [46], mientras que se informa que las histonas se detectan a través de TLR-2 y TLR-4 [47].

Mecanismos de NETosis

Bajo cierta estimulación, ROS se activa como primer paso, luego la elastasa de neutrófilos (NE) y la mieloperoxidasa (MPO) migran de los gránulos al núcleo y, finalmente, el procesamiento de las histonas conduce a la ruptura de la célula. Uno de los inductores más comunes de NETosis es el acetato de miristato de forbol (PMA), que estimula directamente la proteína quinasa C (PKC) y posteriormente conduce a la producción de ROS. Uno de los aspectos distintivos de NETosis es el nucleoplasma homogéneo, y este cambio depende de la actividad de NE y MPO. El NE se almacena inicialmente en gránulos azurófilos en el citosol. Después de la estimulación, el NE se libera de los gránulos y entra en el núcleo, donde degrada la histona enlazadora H1 y procesa las histonas del núcleo [48]. La MPO también migra al núcleo y mejora la descondensación de la cromatina. Por lo tanto, NE y MPO cooperan para sufrir más modificaciones de histonas para descondensar la estructura de la cromatina. Finalmente, los NET se eliminan rápidamente una vez que se resuelve la infección. Los NET son susceptibles a la DNasa1 [49], y los macrófagos y los neutrófilos reclutados en el sitio inflamatorio eliminarán los restos dejados por la DNasa1 [50].

El papel de los TNE

Una de las funciones principales de los neutrófilos es la eliminación de microorganismos. Para ese propósito, se espera que los NET atrapen microbios y eviten su diseminación a la sangre circulante. También se solicita la inactivación de los factores de virulencia y el exterminio de patógenos. La captura de microbios, muy probablemente a través de la interacción de cargas [51], evita su diseminación y los encierra en el sitio inicial de infección. Curiosamente, Grupo A Streptococcus pyogenes[52], neumococo y Staphylococcus aureus[53] son ​​capaces de liberarse de los NET ya que codifican endonucleasas. De hecho, la expresión de DNasa es fundamental para que estas bacterias sean patógenas [52]. Además del ADN, los NET contienen varias proteínas tóxicas para los microbios. Estos incluyen lisozima, péptidos antimicrobianos, quelantes de iones (calgranulina) e histonas. La actividad antimicrobiana de los NET es probablemente el resultado de la combinación de estos componentes. Sus efectos se ven reforzados por el trabajo combinado y las altas concentraciones locales logradas en los NET. MPO en NET también es esencial para matar microbios. La actividad antifúngica de los NET se ha asignado a la calgranulina [51]. Las histonas son los principales componentes tóxicos de los NET; sin embargo, el mecanismo de toxicidad de las histonas no se conoce bien. En la sepsis grave, se pueden detectar histonas extranucleares en la sangre circulante, que se liberan abundantemente durante la NETosis [51]. Dado que las histonas circulantes también son perjudiciales para las células huésped [54], las histonas son el objetivo de la nueva estrategia terapéutica.

La aparición de los TNE

Los NET apenas se ven en el microscopio óptico. Simplemente parecen restos de células muertas (Figura 5, panel superior izquierdo). En general, la NETosis se caracteriza morfológicamente por la pérdida de membranas intracelulares antes de que la integridad de la membrana plasmática se vea comprometida [55]. La estructura de los NET observada por microscopía electrónica es bastante singular. Los NET consisten en filamentos de nucleosomas en forma de red con un diámetro de aproximadamente 17 nm y componentes en forma de espárragos de proteínas granulares con un diámetro de aproximadamente 50 nm [51]. Esta morfología en la microscopía electrónica de barrido diferencia fácilmente los NET de otras estructuras fibrosas como la fibrina. Bajo microscopía inmunofluorescente, los NET se visualizan como estructuras en forma de nube que rodean a los neutrófilos muertos (Figura 5, paneles inferiores). El curso temporal de NETosis es el siguiente: minutos después de la activación, los neutrófilos se aplanan y se adhieren firmemente al sustrato durante la siguiente hora, el núcleo pierde sus lóbulos (Figura 6a) y la cromatina se descondensa (Figura 6b) después de varias horas, el núcleo la envoltura se disgrega en vesículas (Figura 6c) y el nucleoplasma se vuelve homogéneo (Figura 6d) y finalmente, la membrana celular se rompe y el interior de la célula es expulsado al espacio extracelular (Figura 6e), formando NET (Figura 6f).

Tinción inmunofluorescente de NET. El campo brillante (panel superior izquierdo) vista de NETosis inducida por 10 nM de PMA. La tinción inmunofluorescente con yodo de propidio visualiza el ADN expulsado de los neutrófilos (panel inferior izquierdo, mismo campo que el anterior). Vista de contraste de fase de los neutrófilos estimulados por PMA (panel superior derecho) y la imagen superpuesta (panel inferior derecho) que muestra la distribución del ADN (rojo). Flechas indican el ADN expulsado. Todos barras de escala representan una longitud de 20 μm.

Cambios morfológicos en NETosis. Imágenes de lapso de tiempo de los neutrófilos. El núcleo pierde sus lóbulos (a), la cromatina descondensa (B), la envoltura nuclear se desagrega (C), el nucleoplasma se vuelve homogéneo (D), la membrana celular se rompe y el interior de la célula es expulsado (punta de flecha) (mi)y cromatinas (flechas) son expulsados (F). La NETosis fue inducida por 10 nM de PMA. Barra de escala representa una longitud de 10 μm.

Muerte y coagulación de células de neutrófilos

Existe un acuerdo universal de que la disfunción en la coagulación se desarrolla durante la sepsis y conduce a la formación de trombos intravasculares inapropiados. Por el contrario, todavía se debate si la coagulopatía tiene un papel patógeno en el progreso de la sepsis o es una mera respuesta a la agresión. Este debate aún no es concluyente, ya que los resultados de los ensayos clínicos que utilizan anticoagulantes son inconsistentes [56-59].

Uno de los propósitos de esta revisión es dilucidar que la muerte de los neutrófilos se relaciona con la activación de la coagulación. De hecho, el hecho de que la activación del sistema de coagulación representa una respuesta inmune innata esencial que limita la propagación microbiana es un consenso global [60]. Los monocitos / macrófagos son ampliamente aceptados como los principales actores en el proceso pro-coagulante, sin embargo, evidencias recientes han sugerido que los neutrófilos también juegan un papel importante. Uno de los mecanismos se explica por el factor tisular expuesto en la superficie de los neutrófilos moribundos [61], así como en las micropartículas derivadas de los neutrófilos [62]. Las proteinasas derivadas de neutrófilos como la elastasa y la catepsina G de los neutrófilos muertos son otro contribuyente. Estas proteasas escinden el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) [63] y anticoagulantes como la antitrombina y la proteína C activada [64]. Aparte de estas fuentes, los NET también proporcionan actividades pro-coagulantes. Durante la sepsis, los neutrófilos se acumulan y se adhieren firmemente al endotelio. Allí, los neutrófilos expulsan los NET que sirven como andamio para la formación de trombos [65] (Figura 7). Las serina proteasas en los neutrófilos, como la NE y la catepsina G, degradan los inhibidores fisiológicos de la coagulación como la antitrombina y aceleran la coagulación. Los principales componentes de los NET, la cromatina y las histonas, son los fuertes iniciadores de la coagulación [54, 66]. Estos fenómenos indican que los TNE potencian la formación de coágulos. Aparte de esos, los NET expresan grandes cantidades de factor tisular. La liberación de NET que contienen factor tisular en los sitios de inflamación puede dar lugar a la activación localizada de la cascada de la coagulación [67]. Ahora sabemos que se reclutan numerosos neutrófilos y se adhieren al endotelio vascular y juegan un papel importante en la formación de trombos. Allí, las plaquetas activadas cooperan con los neutrófilos para formar TNE también [68, 69].

NETosis y formación de microtrombos en la sepsis. Los microbios activan los neutrófilos. Los neutrófilos activados activan las plaquetas y el sistema de coagulación al expulsar micropartículas, componentes nucleares y proteínas granulares. Al mismo tiempo, los neutrófilos se acumulan y se adhieren al endotelio en colaboración con las plaquetas durante la sepsis. Allí, los neutrófilos expulsan los NET que matan las bacterias y activan el sistema de coagulación. Los NET sirven como andamio para la formación de trombos. Los trombos conducen sustancialmente a daño microcirculatorio y luego a disfunción orgánica en la sepsis.

La formación de trombos causa obstrucción en la microvasculatura e induce isquemia y lesión tisular, lo que contribuye a la insuficiencia orgánica múltiple y la muerte. Por lo tanto, si se previene o interrumpe la formación de microtrombos, se debe preservar la función del órgano. Pero, en la práctica, existen factores de confusión de múltiples capas en tales contextos, incluida la heterogeneidad de la población, las comorbilidades y las contraindicaciones para los tratamientos de atención estándar. Además, como se indica en esta revisión, dado que la formación de trombos es una parte esencial del mecanismo de defensa del huésped, ni la aplicación incondicional de la terapia anticoagulante ni la modulación de la muerte de los neutrófilos serán beneficiosas para el huésped.


Subpoblaciones de neutrófilos en salud

La descripción anterior del ciclo de vida de los neutrófilos da la idea de que estas células se producen en la médula ósea, van a la circulación, migran a sitios de infección o inflamación, ejecutan sus funciones antimicrobianas y luego son eliminadas silenciosamente por macrófagos residentes en los tejidos. Esta visión simple de que los neutrófilos son solo células que matan patógenos, está lejos del comportamiento complejo que realmente muestran los neutrófilos. Ya se mencionó que de hecho los neutrófilos son células transcripcionalmente activas con el potencial de cambiar la expresión de varias moléculas de membrana y producir citocinas (Tecchio et al., 2014 Tecchio y Cassatella, 2016), y en consecuencia los neutrófilos son capaces de realizar diferentes funciones celulares en función de los tejidos donde se encuentran (Borregaard, 2010 Mayadas et al., 2014 Nauseef y Borregaard, 2014). Así, los neutrófilos no parecen ser una población homogénea que siempre se comporta igual. De hecho, se ha sugerido la existencia de varias subpoblaciones de neutrófilos en diversas condiciones de salud y enfermedad.

Subpoblaciones de neutrófilos en la circulación.

En condiciones normales, los neutrófilos permanecen en circulación durante unas pocas horas (la vida media se estima en 6 & # x0201312 h) antes de que se vayan a los tejidos (Summers et al., 2010). Durante este tiempo, los neutrófilos parecen cambiar su fenotipo. Al observar los neutrófilos en circulación de ratones sanos cada 4 h durante el transcurso de un día, se encontró que estas células cambian su morfología y fenotipo (Casanova-Acebes et al., 2013). Los neutrófilos recién liberados de la médula ósea sufren varios cambios que se acumulan hasta que las células comienzan a pasar de la circulación a los tejidos. Estos cambios en el fenotipo de los neutrófilos desde el momento en que se liberan de la médula ósea (neutrófilos frescos) hasta que abandonan la circulación (neutrófilos envejecidos) en ausencia de inflamación se denominan envejecimiento (Adrover et al., 2016). El número de neutrófilos totales oscila de forma circadiana. Los neutrófilos frescos se liberan en la sangre cuando los ratones comienzan su fase de actividad, y los neutrófilos envejecidos se eliminan al final de su etapa de reposo (Casanova-Acebes et al., 2013).

Anterior in vitro Los estudios sobre el envejecimiento de los neutrófilos indicaron que existe una regulación positiva espontánea del receptor CXCR4 en las células que se mantienen en cultivo. Los neutrófilos en sangre recién aislados presentan este aumento en la expresión de CXCR4 después de solo 4 h en cultivo (Nagase et al., 2002). Como se mencionó anteriormente, la quimiocina CXCL12 producida por las células del estroma de la médula ósea funciona como una señal de retención para los neutrófilos. Por tanto, se cree que la reexpresión de CXCR4 en neutrófilos estimula a los neutrófilos & # x0201csenescentes & # x0201d a regresar a la médula ósea (Martin et al., 2003). Sin embargo, en ratones con células mieloides deficientes en CXCR4, no se observaron cambios en el aclaramiento de neutrófilos (Eash et al., 2009), lo que sugiere que otros órganos además de la médula ósea también contribuyen al aclaramiento de neutrófilos (Adrover et al., 2016). Además, los neutrófilos en cultivo también regulan negativamente la expresión de CXCR2, que tiene efectos opuestos a CXCR4 y promueve la liberación de células de la médula ósea (Eash et al., 2010). Por lo tanto, parece que estos cambios fenotípicos preparan a los neutrófilos para dejar la circulación hacia los tejidos.

En vivo Los estudios han identificado otros cambios fenotípicos en los neutrófilos. En ratones, los neutrófilos que fueron forzados experimentalmente a permanecer más tiempo en la circulación presentaron menor expresión de L-selectina (CD62L), junto con una mayor expresión de CXCR4 (Casanova-Acebes et al., 2013). Estos neutrófilos envejecidos aparecieron en la circulación siguiendo oscilaciones circadianas a lo largo del tiempo. Aumentaron en número durante el día (cuando los ratones están en reposo) y desaparecieron por la noche, cuando los ratones comienzan su fase activa (Casanova-Acebes et al., 2013). Otras moléculas también se expresan a niveles más altos en la membrana celular de estos neutrófilos envejecidos, incluido CD11b (& # x003b1METRO) y CD49d (& # x003b14), las subunidades alfa de las integrinas Mac-1 y VLA4, respectivamente. Estas integrinas están involucradas en la adhesión a células endoteliales activadas en sitios de inflamación. Por el contrario, la expresión de la molécula CD47, una señal de & # x0201cdon't eat me & # x0201d para células apoptóticas (Jaiswal et al., 2009), se redujo en la membrana de estos neutrófilos. Esto sugeriría que los macrófagos fagocitan más fácilmente los neutrófilos envejecidos. Sin embargo, en un estudio más reciente, la expresión de CD47 no se redujo (Zhang et al., 2015). Más recientemente, también se ha encontrado aumentada la expresión superficial de otras moléculas en neutrófilos envejecidos. Algunas de estas moléculas incluyen TLR4, ICAM-1, CD11c, CD24 y CD45 (Zhang et al., 2015) (Figura & # x200B (Figura3). 3). Frente a esto, el marcador de neutrófilos de ratón Ly6G también se redujo en células envejecidas (Zhang et al., 2015) (Figura & # x200B (Figura 3). 3). Junto a los cambios en la expresión superficial de estas moléculas, las células presentaron cambios morfológicos. Los neutrófilos envejecidos son más pequeños, contienen menos gránulos y presentan un núcleo multilobullar granular (Casanova-Acebes et al., 2013 Figura & # x200B Figura3 3).

Fenotipo de neutrófilos envejecidos. Tras la liberación de la médula ósea, un neutrófilo (PMN) de & # x0201cfresh & # x0201d expresa las moléculas de superficie CD62L y CXCR4. Después de varias (4 & # x020136 h) horas en la circulación, los neutrófilos cambian la expresión de muchas moléculas de superficie. El nuevo fenotipo se describe como neutrófilos & # x0201caged & # x0201d. Estos neutrófilos envejecidos luego se eliminan de la sangre por migración a los tejidos o regresando a la médula ósea.

Además, el análisis transcriptómico de los neutrófilos envejecidos reveló que varias vías de señalización son diferentes de las vías activas en los neutrófilos frescos. Se altera la señalización relacionada con la activación celular, la detección microbiana, la adhesión, la migración y la muerte celular (Zhang et al., 2015). These changes in aged neutrophils are similar to changes in neutrophils at inflammation sites. Thus, it might be that aged neutrophils are in an activated state (Adrover et al., 2016). Together these reports suggest that neutrophils spontaneously change their phenotype in circulation, such that different surface molecules may facilitate migration into tissues. At present, it is not known how these differences in receptor expression may control neutrophil clearance into particular tissues, but a similar mechanism to the one controlling neutrophil exit from and return to the bone marrow is likely to be at work. Identifying particular neutrophil phenotypes will certainly help us understand how these cells are directed to various parts of the body.

Neutrophil subpopulations in tissues

In normal homeostasis, neutrophils are found in many tissues (von Vietinghoff and Ley, 2008, 2009), where they perform specialized functions. For the most part, there is very little knowledge on how neutrophils are directed to the different organs, and the particular functions they perform in each tissue. Evidence suggests that indeed neutrophils display different phenotypes in various organs. For example, in the lung a large number of neutrophils accumulate adhered to the vascular lumen and in the interstitial space. These neutrophils are kept in the tissue by a CXCR4-dependent mechanism (Devi et al., 2013). Because aged neutrophils express more CXCR4 it is possible that they preferentially migrate to the lungs (Adrover et al., 2016). Similarly, in the spleen many neutrophils are found in the marginal zone, producing cytokines that induce somatic hypermutation and antibody production by marginal B lymphocytes (Puga et al., 2011). Also, neutrophils in spleen display the phenotype CD62L low CD11b hi ICAM-1 hi , and have a tendency to produce NETs (Cerutti et al., 2013), similar to aged neutrophils in the circulation (Summers et al., 2010 Casanova-Acebes et al., 2013).

Another subpopulation of neutrophils has been found to preferentially move into lymph nodes to interact with T lymphocytes, carrying antigens to the lymph nodes and mediate T cell activation (Duffy et al., 2012 Hampton and Chtanova, 2016). These neutrophils can selectively migrate to the lymph node because they express the CCR7 receptor (Beauvillain et al., 2011), as well as the integrin LFA-1 and the chemokine receptor CXCR4. These receptors are also involved in neutrophil trafficking through afferent lymphatics (Gorlino et al., 2014).

Yet another subtype of neutrophils in tissues is capable of inducing angiogenesis. These neutrophils display the phenotype CD49d hi CXCR4 hi VEGFR1. The latter is the receptor for vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A). These neutrophils are efficiently recruited to non-vascularized tissues under hypoxia conditions, and promote angiogenesis (Massena et al., 2015). Interestingly, this proangiogenic subset of neutrophils is similar to neutrophils that support tumor vascularization (Jablonska et al., 2010 see later).

The examples described above indicate that indeed neutrophils can display great phenotypic and functional heterogeneity, and support the idea that at least some of the neutrophil subtypes may derive from aging neutrophils migrating into tissues.

Migrating neutrophil subpopulations

Some neutrophils have been observed to perform reverse transendothelial migration (rTEM) or reverse interstitial migration (rIM), depending on their initial location (Nourshargh et al., 2016). Neutrophils doing rTEM have been observed in mice (Woodfin et al., 2011), whereas neutrophils doing rIM have been seen only in the transparent zebra fish model (Mathias et al., 2012). Neutrophils performing rTEM present the phenotype ICAM-1 hi CXCR1 low , which is different from the phenotype ICAM-1 low CXCR1 hi of circulatory neutrophils and the phenotype ICAM-1 low CXCR1 low of neutrophils in tissues (Buckley et al., 2006).

Neutrophil subpopulations induced by the microbiota

Neutrophils can modify their functional responses after being exposed to multiple factors, through the process named neutrophil priming (Downey et al., 1995 El-Benna et al., 2016). Recent studies in mice suggest that microbial products derived from the microbiota can induce neutrophil diversity. For example, diaminopimelic acid-bearing peptides, which are recognized by the nucleotide𠅋inding oligomerization domain containing 1 (NOD1) receptor, modify the lifespan of neutrophils (Hergott et al., 2016) and prime neutrophils for improved antimicrobial function (Clarke et al., 2010). In addition, endotoxins from the gut microbiota can enter the blood circulation and influence neutrophil aging (Zhang et al., 2015) and also the development of B cell-helper neutrophils in the spleen (Puga et al., 2011). Thus, neutrophils can display different phenotypes after priming by the microbiota.


Sinopsis

Bacillus Anthracis is the bacterium that causes anthrax, a disease that can occur through natural infections and also through intentional release. B. anthracis makes spores, which are in a dormant state, similar to seeds of a plant, and are extremely resistant to the environment. B. anthracis spores can infect through the skin or the lung. Lung infections disseminate through the body and are lethal. In contrast, skin infections often remain localized, and patients survive even without treatment. It is not well understood why these bacteria cause a localized infection through the skin and a lethal disease through the lung.

Little is known about how B. anthracis is controlled. Neutrophils are the first white blood cells recruited to a site of infection and are specialized in killing microbes. Previous studies show that neutrophils are abundant in the skin form, but not in the lung form of anthrax. The researchers report that human neutrophils can take up B. anthracis esporas. Once inside, the spores germinate to form vegetative bacteria. The vegetative bacteria are extremely susceptible to neutrophil-killing mechanisms. los B. anthracis virulence factors (molecules that make bacteria cause diseases) manipulate other human cells but do not deter neutrophils. B. anthracis is indeed exquisitely sensitive to the neutrophil protein α-defensin. These data support a new model where B. anthracis skin, but not lung, infections are controlled by the antimicrobial activity of neutrophils.

Citación: Mayer-Scholl A, Hurwitz R, Brinkmann V, Schmid M, Jungblut P, Weinrauch Y, et al. (2005) Human Neutrophils Kill Bacillus Anthracis. PLoS Pathog 1(3): e23. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0010023

Editor: John Young, The Salk Institute for Biological Studies, United States of America

Recibió: April 4, 2005 Aceptado: October 3, 2005 Publicado: November 11, 2005

Derechos de autor: © 2005 Mayer-Scholl et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de Atribución Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se acredite el autor y la fuente originales.

Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.

Abreviaturas: CFU, colony forming unit DPI, diphenyleneiodonium hNGE, human neutrophil granule extract MOI, multiplicity of infection NADPH, nicotinamide adenosine dinucleotide phosphate PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate PMF, peptide mass fingerprinting ROS, reactive oxygen species production RP-HPLC, reverse phase high-performance liquid chromatography TEM, transmission electron microscopy


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Structured Abstract

INTRODUCCIÓN

The collective behavior of cells and insects often relies on self-organizing processes. By releasing attractant signals, a few individuals can initiate the accumulation and aggregation of a whole population. Neutrophils, key players in the innate immune response, infiltrate inflamed and infected tissues in large numbers. These cells make use of such positive feedback amplification to find and kill bacteria in tissues. By secreting attractants that act through cell surface–expressed G protein–coupled receptors (GPCRs) on neighboring cells, neutrophils use this form of intercellular communication and coordinate their hunt for pathogens as a swarm. How this swarming response is terminated to avoid uncontrolled neutrophil accumulations and prevent excessive inflammation is currently unknown.

RATIONALE

The stop signals for neutrophil swarming in mammalian tissues have not yet been defined. They may be derived from cells of the surrounding inflammatory environment or from neutrophils themselves. We reasoned that the attractants released by neutrophils may become highly concentrated at sites where these cells cluster in larger numbers. It is well established that high chemoattractant concentrations can attenuate cellular responses by a process termed GPCR desensitization. We hypothesized a self-limiting mechanism for swarming: The local accumulation of the same neutrophil-expressed attractants that amplify swarming during early stages would cause desensitization of their respective GPCRs at later stages of neutrophil clustering. This led us to investigate the role of GPCR desensitization in neutrophil tissue navigation and host defense.

RESULTADOS

We generated mouse strains whose neutrophils were deficient in GPCR kinases (GRKs), critical enzymes for mediating the GPCR desensitization process. Of the four GRK isoforms tested, in vitro experiments identified GRK2 as the kinase necessary to desensitize GPCRs activated by swarm-released attractants (LTB4 and CXCL2). When neutrophils sense high concentrations of swarm attractants in vitro, GRK2 desensitizes the corresponding receptors to induce migration arrest. Two-photon intravital imaging of injured skin and infected lymph nodes of mice showed that GRK2 and GPCR desensitization play critical roles during neutrophil swarming in physiological tissue. At sites where swarming neutrophils accumulate and self-generate local fields of high swarm attractant concentration, GPCR desensitization was crucial to stop neutrophil migration arrest. Desensitization-resistant neutrophils moved faster and explored larger areas of lymph node tissue infected with the bacterium Pseudomonas aeruginosa. Such behavior suggested more effective bacterial sampling throughout the infected organ. Surprisingly, mice with GRK2-deficient neutrophils showed impaired rather than improved bacterial clearance. This finding could not be explained by altered antibacterial effector functions. In vitro assays for the detailed analysis of swarming behavior and bacterial growth revealed that GPCR desensitization to swarm attractants is required to induce neutrophil arrest for optimal bacterial phagocytosis and containment in swarm clusters.

CONCLUSIÓN

We describe a cell-intrinsic stop mechanism for the self-organization of neutrophil collectives in infected tissues, which is based on sensing the local accumulation of the same cell-secreted attractants that amplify swarming during early stages. GPCR desensitization acts as a negative feedback control mechanism to stop neutrophil migration in swarm aggregates. This navigation mechanism allows neutrophils to self-limit their dynamics within forming swarms and ensures optimal elimination of bacteria. Desensitization to a self-produced activation signal as a principle of self-organization is important for immune host defense against bacteria, and likely informs other categories of collective behavior in cells and insects.

Top: Swarming neutrophils self-amplify their highly chemotactic recruitment toward sites of tissue injury or bacterial invasion by releasing attractants that act on neighboring neutrophils. Neutrophils are displayed as spheres with migration tracks (right). Bottom: The local accumulation of the same cell-secreted attractants stops neutrophils when they accumulate and form clusters, a process important for the containment of bacteria in infected tissues.


CONTRIBUTION OF OXIDANTS TO BACTERIAL KILLING BY NEUTROPHILS

Oxidative and nonoxidative mechanisms.

Efficient control of a multitude of microorganisms is so important for host survival that the neutrophil does not rely on a single antimicrobial weapon. This review concentrates on oxidative mechanisms, but as discussed elsewhere,120-122 this is complemented by nonoxidative killing by granule proteins that are released into the phagosome. The mechanism that predominates may vary depending on the microbial species, its metabolic state, and the prevailing conditions.61

Optimal killing of many species of bacteria requires products from the oxidative burst. This is best exemplified in CGD, where affected individuals have an impaired or completely absent oxidative burst and suffer from recurrent and life-threatening infections.9,10The strains of bacteria that are killed poorly in vitro are responsible for the infections that are characteristic of CGD.10 Normal neutrophils tested in anaerobic environments, or in the presence of the NADPH oxidase inhibitor diphenyleneiodonium, are also impaired in their ability to kill these bacteria.123-126 Other species are killed normally, either because they are catalase-negative and able to supply an alternative source of hydrogen peroxide,127,128or because they can be disposed of effectively by nonoxidative mechanisms.

Myeloperoxidase and HOCl.

Myeloperoxidase appears critical for oxidative killing in experimental systems. Neutrophils isolated from the blood of myeloperoxidase-deficient individuals kill a variety of microorganisms poorly,129-131 and inhibitors of myeloperoxidase such as azide, cyanide, and salicylhydroxamic acid impair killing by normal cells.106,130,132,133 Neutrophil cytoplasts that lack granule enzymes but generate hydrogen peroxide only kill bacteria if they are coated with myeloperoxidase before ingestion.134

Measurements of rates of killing of S. aureus by neutrophils isolated from human blood reinforce the importance of myeloperoxidase.106,126 Inhibition of the oxidative burst with diphenyleneiodonium, or removal of oxygen, decreases the rate constant for killing by 80%, enabling separation of the oxidative and nonoxidative components (Fig 4). Killing rates are substantially decreased in the presence of the myeloperoxidase inhibitors azide and 4-aminobenzoic acid hydrazide, and with myeloperoxidase-deficient neutrophils. Only the oxidative component is affected, and is six times slower when myeloperoxidase is not active. These results indicate that, at least with S. aureus, the normal mechanism for oxidative killing uses myeloperoxidase. Direct killing by hydrogen peroxide, or other alternative oxidative mechanisms, are poor substitutes.

Rate constants for killing of S. aureus by human neutrophils. Opsonized bacteria were mixed with neutrophils in a 1:1 ratio. Numbers of extracellular and viable intracellular bacteria were measured at 0, 10, 20, and 30 minutes, and from these independent first-order rate constants for phagocytosis and killing were measured. Superoxide dismutase was conjugated to IgG (IgG-SOD) and attached to the bacteria through binding to the protein A on their surface. ABAH, the myeloperoxidase inhibitor 4-aminobenzoic acid hydrazide. The shaded area represents the contribution of nonoxidative killing measured in the presence of diphenyleneiodonium (DPI) or anaerobically (N2). The data are taken from Hampton,117 and show the mean and SD of at least three experiments.

Rate constants for killing of S. aureus by human neutrophils. Opsonized bacteria were mixed with neutrophils in a 1:1 ratio. Numbers of extracellular and viable intracellular bacteria were measured at 0, 10, 20, and 30 minutes, and from these independent first-order rate constants for phagocytosis and killing were measured. Superoxide dismutase was conjugated to IgG (IgG-SOD) and attached to the bacteria through binding to the protein A on their surface. ABAH, the myeloperoxidase inhibitor 4-aminobenzoic acid hydrazide. The shaded area represents the contribution of nonoxidative killing measured in the presence of diphenyleneiodonium (DPI) or anaerobically (N2). The data are taken from Hampton,117 and show the mean and SD of at least three experiments.

Although HOCl stands out as the prime candidate for the lethal agent produced by myeloperoxidase, there is currently insufficient evidence to exclude other products of the enzyme. We recently observed that the fraction of tyrosyl residues converted to chlorotyrosine in phagocytosed S. aureus (0.5% ± 0.2%, SEM of 10 experiments) was similar to that for S. aureus treated with a lethal amount of HOCl (Fig 5). This suggests that enough HOCl is generated in the phagosome for it to be responsible for killing. A similar conclusion was reached by Jiang et al119 measuring fluorescein chlorination. Inhibition of killing of Candida pseudohyphae by scavengers of HOCl and chloramines also supports the involvement of chlorinated oxidants.135 However, more direct evidence is necessary to confirm this role for HOCl.

Chlorotyrosine formation and loss of viability for S. aureus exposed to reagent HOCl. Bacteria (1 × 10 8 /mL) were treated with a range of concentrations of HOCl and then analyzed for tyrosine and chlorotyrosine content,165 and the number of remaining viable colony-forming units. The results are taken from Hampton.117 The means and SD of three experiments are reported.

Chlorotyrosine formation and loss of viability for S. aureus exposed to reagent HOCl. Bacteria (1 × 10 8 /mL) were treated with a range of concentrations of HOCl and then analyzed for tyrosine and chlorotyrosine content,165 and the number of remaining viable colony-forming units. The results are taken from Hampton.117 The means and SD of three experiments are reported.

Role of superoxide.

Neutrophils must generate superoxide to kill oxidatively. Its role could simply be as a precursor of hydrogen peroxide, or it could participate directly in the killing process. Distinguishing between these possibilities experimentally is complicated by the difficulty of getting sufficient superoxide dismutase (SOD) into the phagosome to scavenge all the superoxide generated. Adding SOD to phagocytosing neutrophils136 or modifying the expression of SOD in target bacteria137-142 has generally had little effect, but this could be because the SOD did not gain access to the phagosome. The few studies where this has been achieved indicate a direct role for superoxide in killing. Johnston et al136 showed that the killing of S. aureus was impeded when SOD-coated latex beads were co-ingested with the bacteria. The accessibility problem has also been overcome by attaching SOD to the surface of S. aureus.106 The SOD was covalently crosslinked to IgG that then bound to protein A in the cell wall. The bacteria were ingested normally, but the rate constant for killing was decreased by 30% (Fig 4). This represents a decrease in rate of oxidative killing to almost a half. SOD had no effect in the presence of peroxidase inhibitors, which suggests that it acts on a myeloperoxidase-dependent process.

The effect of SOD could be explained on the basis of its inhibiting hydroxyl radical production.136 If the route to hydroxyl radicals was via superoxide and HOCl, this could also explain the apparent involvement of a myeloperoxidase-dependent process. However, as argued above, the hydroxyl radical is unlikely to be a major player in the phagosome. An alternative explanation, which is consistent with the modeling studies of oxidant production, is that superoxide prevents reversible inactivation of myeloperoxidase, thereby optimizing killing by HOCl. More direct analyses are needed before firm conclusions can be drawn on the mechanism.

In the context of superoxide having a direct role in killing, it is of interest that Tuberculosis micobacteriana,143,Nocardia asteroides,144,Helicobacter pylori,145 and Actinobacillus pleuropneumoniae 146 all secrete SOD. Antibodies to the superoxide dismutase of N asteroides enhanced both bacterial killing by neutrophils147 and clearance upon inoculation of mice.148 It is possible that this surface-associated superoxide dismutase could slow down intraphagosomal killing and be a factor in their pathogenicity.


Modulation of inflammatory and immune responses by short-chain fatty acids

17.3.1 Neutrophils

Neutrophils are the first cells that migrate into tissues in response to invading bacteria and other micro-organisms, and are the predominant infiltrating cell types in the cellular phase of the acute inflammatory response. These cells are recruited and migrate from the bloodstream to inflamed tissue in a multistep and highly controlled process ( Ley et al., 2007 ).

The effect of SCFAs on recruitment of neutrophils has, in particular, attracted the attention of several groups. In part, this reflects the interest in understanding the actions of these compounds in the GI tract and at sites of anaerobic bacterial infections such as periodontal tissue and abscess, where concentrations of 10–50 mM of SCFAs have been described ( Ladas et al., 1979 Rotstein et al., 1985). In this context, SCFAs induce chemotaxis of neutrophils ( Le Poul et al., 2003 Maslowski et al., 2009 Sina et al., 2009 Vinolo et al., 2009b ), an effect dependent on activation of GPR43 receptor, and modulate the expression of adhesion molecules on neutrophils ( Vinolo et al., 2009b ) and endothelial cells ( Zapolska- Downar et al., 2004 Miller et al., 2005 Zapolska-Downar and Naruszewicz, 2009 ), indicating that these compounds may be important for neutrophil migration.

Once in the inflammatory site, neutrophils internalize, kill and digest bacteria and fungi through effector mechanisms such as production of reactive oxygen species (ROS) and release of granule enzymes. SCFAs affect the phagocytic capacity of neutrophils, but both inhibition and stimulation of neutrophil phagocytosis by SCFAs have been described ( Eftimiadi et al., 1990 Mills et al., 2006 Vinolo et al., 2009a). The effects of SCFAs on the production of ROS by neutrophils are also inconsistently reported: some groups have found that SCFAs increase ROS production ( Stringer et al., 1996 Nakao et al., 1998 ), while others have found inhibition ( Eftimiadi et al., 1987 Tonetti et al., 1991 Liu et al., 2001 Sandoval et al., 2007 Vinolo et al., 2009a). These discrepancies probably result from differences in the protocols used such as concentration of SCFAs, measurement of ROS with different methodologies (i.e. lucigenin-amplified chemiluminescence and reduction of cytochrome c), stimulus used to elicit ROS production (i.e. PMA or fMLP), source and state of neutrophil activation (i.e. neutrophils isolated from human blood or elicited rat neutrophils).

Neutrophils are important sources of cytokines such as tumour necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-1β, IL-8 (the rat analogue is CINC-2αβ) and transforming growth factor (TGF)-β ( Cassatella, 1995 ) that, together with other mediators such as nitric oxide (NO) and eicosanoids, are released in the inflammatory site and coordinate different steps of the inflammatory process. SCFAs modify the production of inflammatory mediators by neutrophils: Tedelind et al. (2007) have shown that acetate, propionate and butyrate at 30 mM reduce TNF-α production by lipopolysaccharide (LPS)-stimulated human neutrophils. We have found that SCFAs (propionate and butyrate) inhibit the production of pro-inflammatory mediators (TNF-α, CINC-2αβ and NO) by rat neutrophils ( Vinolo et al., 2011). In agreement with previous studies performed in macrophages ( Park et al., 2007 Usami et al., 2008 ) and other cell types such as endothelial cells ( Ogawa et al., 2003 Zapolska-Downar et al., 2004 ), we have found that propionate and butyrate inhibit NF κ B activation ( Vinolo et al., 2011). Our hypothesis is that by inhibiting HDAC activity and thus modifying the acetylation status of proteins, SCFAs modulate the activation of transcription factors such as NF κ B and consequently the expression of genes involved in the inflammatory response.