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¿Qué es un anticuerpo desencadenante de funciones?

¿Qué es un anticuerpo desencadenante de funciones?


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Estoy leyendo un artículo de una revista sobre el efecto de una molécula de adhesión de células neurales en el desarrollo neuronal y en el resumen de este artículo me he encontrado con lo siguiente:

La autofosforilación y la actividad de Pak1 mejoraron cuando se incubaron conos de crecimiento aislados con anticuerpos desencadenantes de la función NCAM, que imitan la interacción entre NCAM y sus ligandos extracelulares.

En este artículo, la proteína NCAM se activa cuando se expone a anticuerpos desencadenantes de la función NCAM. Entiendo que los anticuerpos son moléculas producidas por el sistema inmunológico y se unen a los antígenos. Sin embargo, no estoy seguro de cómo la incubación de los conos de crecimiento con anticuerpos desencadenantes de NCAM realmente desencadenaría / activaría la proteína NCAM en sí.

¿No es el propósito de un anticuerpo unirse a un antígeno para que pueda ser eliminado del cuerpo? No estoy seguro de cómo la exposición de un antígeno a su respectivo anticuerpo desencadenaría su función. He leído varios otros artículos sobre moléculas de adhesión de células neurales en las que se utilizaron anticuerpos para activar su función. He buscado anticuerpos que activan funciones en Google, pero no he encontrado resultados útiles al respecto. Se agradece cualquier información.


El término "anticuerpos que activan la función" no es estándar, estos se conocen más ampliamente como anticuerpos de reticulación. Como sabrá, un anticuerpo tiene múltiples "brazos", con la región de unión al antígeno o Fab (Fragmento antigen Binding) al final. Los anticuerpos IgG tienen 2 brazos, los IgM pueden tener 10. La Fab La porción es generalmente idéntica en todos los brazos, aunque es posible diseñarlos de manera diferente. Esto permite que el anticuerpo se una a varios antígenos al mismo tiempo, acercándolos.

NCAM es una proteína de unión homofílica, con un dominio extracelular que se une a otras moléculas de NCAM, tanto en células vecinas como en la misma célula. Esa unión induce cambios estructurales en el dominio intracelular que promueve la unión y activación de quinasas, proteínas que fosforilan (y por lo tanto activan o inhiben) otras proteínas. Esto inicia una cascada de señalización que induce cambios en la célula, normalmente controlando la actividad de los factores de transcripción en el núcleo.

Los receptores generalmente no se distribuyen uniformemente sobre la superficie de la célula, a menudo existen agrupados en estructuras de membrana conocidas como balsas lipídicas. Cuando se acercan lo suficiente, las moléculas NCAM pueden comenzar sus cascadas de señalización por sí mismas, a medida que las proteínas adaptadoras unidas o reclutadas en los dominios intracelulares se activan; las quinasas y sus sustratos también están muy cerca. Para inducir este tipo de señalización en el laboratorio, las células pueden tratarse con anticuerpos de reticulación que unen a los receptores. En efecto, esto activa la función de los receptores, comenzando su señalización descendente.

Fuente


Los anticuerpos pueden funcionar como enzimas (consulte https://en.wikipedia.org/wiki/Abzyme).

Si usa el anticuerpo monoclonal correcto, el extremo variable puede tener la forma correcta para unirse al sitio que menciona.


Fisiología

3.Controlar el flujo de iones a través de las células secretoras y epiteliales y regular el volumen celular.

EX: canales iónicos activados por voltaje, cuando el Na despolariza la membrana celular

canales controlados por ligando
1. abierto o cerrado por hormonas
2. segundos mensajeros
3. neurotransmisores

El dióxido de carbono, el subproducto de la respiración celular, es lo suficientemente pequeño como para difundirse fácilmente fuera de la célula.

Es saturable, mediado por portador, estereoespecificidad, competencia.

más rápido que la simple difusión

2. P - la diferencia de presión parcial del gas y es inversamente proporcional al espesor de la membrana

3. A - área de la superficie de la membrana. Mas grande es mejor

líquido, los solutos disueltos quedan atrapados dentro de la vesícula, tomados del EXTERIOR

más pequeño que la fagocitosis
ocurre en casi todas las células
proceso constitutivo porque ocurre continuamente
no se requieren estímulos específicos
Pueden formarse hoyos revestidos en el borde de la membrana

cómo la célula puede absorber transferrina (transportador de hierro).

la toxina de la difteria y algunos virus entran así

se acumulan en una vesícula.
destino migran a los lisosomas dentro de las células. orgánulos de digestión.
traer proteínas, vesículas endoctíticas y proteasas en los lisosomas que las cortan
la forma de hacerlo selectivo:

las terminaciones de los axones usan exocitosis. estercolina dentro de las vesículas esperando. la membrana de mezcal se fusiona con la bicapa lipídica y se fusiona a través. desencadena contracciones musculares.

Endocrinología como insulina de células pancreáticas. almacenado dentro de la vesícula.

2. Vías constitutivas: proteínas mucosas producidas en el retículo endoplásmico. continúa todo el tiempo. Necesita mucosidad pegajosa constante. así que siempre está sucediendo. las células epiteliales de los cilios lo atraen. Las células respiratorias lo secretan.

3. Vía regulada: insulina liberada de las células pancreáticas después de ingerir una comida. o liberación de neurotransmisores en las sinapsis. controlarlo específicamente.

el colágeno entra para construir la matriz extracelular. actuar como un ancla como tejido conectivo. pero pueden dañarse. oxidado. necesita ser reciclado. de ahí la endocitosis.

absorbe Fe en GI, debe transportar Fe a través del torrente sanguíneo hasta la médula ósea. llevar por transferrina. y receptor de transferrina.

Envíelo a los lisosomas y tienen un ambiente de pH bajo. transferrina de la superficie y se fusiona con lisosoma y en pH bajo y cambia la forma de la molécula de transferrina y libera transferrina donde la célula puede usarla.
EJ: transporte de inmunoglobulinas

Glándula mamaria: produce leche. Lumen. Al producir leche, una molécula que puede llegar a la leche son las inmunoglobinas. importante para el sistema inmunológico. anticuerpos importantes.

2. Regulación por ligandos cerrados intracelulares. ej: canales cíclicos activados por nucleótidos. Importante en el corazón. Los canales & quotfunny & quot que unen cAMP en el interior.

el cuerpo tiene un & quotset Point & quot para la cantidad de Ca
mmmol / L es 1.0 es (un poco más) a 1.45 (un poco menos)

cálculos renales, calcificación del revestimiento de los vasos sanguíneos, endurecimiento de las arterias si hay demasiado Ca

debe saber cómo corregir esto y obtener los parámetros correctos.

ayudando al cuerpo a realizar sus funciones normales de control como un ND.

para la mayoría de los procesos de control, en la habitación o en el cuerpo, los controles de Ca deben ser un sistema sensorial que pueda monitorearlo.

El termómetro hace eso en el aula.
En el cuerpo humano, hay un receptor de Ca - proteína sp - aa grande - que reside en la superficie de algunas de nuestras células.

La glándula endocrina (glándula paratiroidea) controla los niveles de Ca en nuestra sangre. Necesita un receptor que pueda detectar la cantidad de Ca que hay. Se asienta sobre las células de la glándula paratiroidea y monitorea constantemente.
Si el Ca comienza a disminuir, se libera más PTH. Imp funciona en el riñón.
regula la cantidad de Ca que sale de su cuerpo y se excreta en la orina todos los días.

Nivel bajo de CALCIO en la sangre (demasiado bajo y morirás) - el receptor de ca reconoce que este b / c Ca no se une a la célula - tiene un bolsillo en el que cabe el Ca - La PTH atraviesa la sangre y llega a los riñones y produce riñones aferrarse a Ca. Contrario si tienes demasiado. La PTH es baja y los riñones dejan que el Ca salga del cuerpo en la orina.

cómo el cuerpo absorbe Ca de fuentes dietéticas.
Calcitonina - enzima.
Vit D es imp para la absorción de Ca


Introducción

La molécula de adhesión celular L1 (también llamada L1CAM o CD171), un miembro de la superfamilia de moléculas de adhesión celular de inmunoglobulinas, juega un papel importante en las interacciones célula-célula. En el sistema nervioso [1], [2], L1 se localiza preferentemente en axones y conos de crecimiento de neuronas en diferenciación, apoya la migración y supervivencia de las células neurales y promueve el crecimiento de neuritas, fasciculación axonal [3] & # x02013 [9], mielinización y plasticidad sináptica [10], [11]. Las mutaciones en el gen L1 localizado en el cromosoma X afectan gravemente las funciones del sistema nervioso en los varones afectados, incluidas las discapacidades mentales, la afasia, la marcha arrastrando los pies y los pulgares en aducción (síndrome MASA) [12] & # x02013 [14]. Además, las mutaciones en el gen L1 también se han relacionado con la esquizofrenia y la enfermedad de Hirschsprung [15]. Además de sus funciones en el sistema nervioso, L1 juega un papel importante en la progresión del tumor y la metástasis. L1 se expresa en un amplio conjunto de tumores que comprenden no solo tumor del estroma gastrointestinal, melanoma, neuroblastoma, schwannoma, paraganglioma, feocromocitoma de origen neuroepitelial y de la cresta neural [16], sino también tumores de origen no neural, como el tumor de células granulares , condrosarcoma y sarcoma de Kaposi, hemangioma capilar, linfoblastoma y cánceres de esófago, colon y ovario [17], [18]. Debido a su importancia fundamental en la reparación del sistema nervioso y en el comportamiento metastásico de los tumores, buscamos detectar anticuerpos que, al reaccionar con diferentes dominios de la molécula L1 humana, desencadenarían, por un lado, sus funciones beneficiosas y , por otro lado, inhiben las funciones perjudiciales de la molécula.


1. INTRODUCCIÓN

La molécula de adhesión celular L1 (L1) juega un papel funcional importante en el desarrollo del sistema nervioso y en el adulto, como lo demuestra su participación en la migración y supervivencia neuronal, la excrecencia y fasciculación de axones, la mielinización, la plasticidad sináptica, el aprendizaje y la memoria, así como en la regeneración posterior. lesión. 1-5 En humanos, L1 se asocia con trastornos neurales, como L1 y síndromes de alcoholismo fetal, enfermedad de Hirschsprung, esquizofrenia y enfermedad de Alzheimer. 1, 6-12

Las funciones beneficiosas de L1 dependen de su escisión proteolítica por diferentes proteasas, como tripsina, 13 plasmina, 14, 15 pro-proteína convertasa PC5A, 16 neuropsina, 17 catepsina E, 18 miembros de la familia ADAM (ad isintegrina y am etaloproteasa) , 19-24 β-secretasa, 25 γ-secretasa complejo, 23, 24 y las proteasas inusuales Reelin, 26 y proteína básica de mielina. 5, 27

La molécula L1 de 200 kDa de longitud completa consta de dominios extracelulares similares a inmunoglobulina y fibronectina tipo III, un dominio transmembrana y una cola citoplasmática. Escisión mediada por proteínas básicas de mielina en el dominio L1 extracelular en Arg687 conduce a la generación e importación nuclear de un fragmento sumoilado de 70 kDa. 5, 27, 28 Escisión mediada por catepsina E en el dominio intracelular en Asp1167 genera un fragmento nuclear sumoilado de 30 kDa. 18, 28 La escisión dentro del dominio transmembrana por el complejo γ-secretasa produce un fragmento nuclear de 28 kDa involucrado en la regulación de la señalización nuclear y la expresión génica. 23, 24 La L1 nuclear también puede ser importante para la reparación del ADN, ya que la translocación nuclear del dominio L1 intracelular regula las respuestas del punto de control del daño del ADN y la radiosensibilidad de las células de glioma similares a células madre. 29

Usando el dominio L1 intracelular recombinante para cromatografía de afinidad, identificamos posibles socios de unión a L1 en un extracto nuclear de cerebro de ratón postnatal temprano: factor de empalme rico en prolina / glutamina (SFPQ también conocido como factor de empalme asociado de unión al tracto de polipirimidina o PSF), no -Dominio POU que contiene proteína de unión al octámero (NonO) (también conocida como proteína de unión a ADN y ARN nuclear de 54 kDa o p54nrb), componente 1 paraspeckle (PSPC1), topoisomerasa I de ADN, importina-β, proteína de unión a metil-CpG 2 (MeCP2), proteína de repetición WD 5 (WDR5), las ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas A1 (hnRNP-A1), A2 / B1 (hnRNP-A2 / B1) y A3 (hnRNP-A3), histona H1.4, nucleoporina 93 kDa (Nup93), proteína análoga de choque térmico de 71 kDa (Hsc70) y sinaptotagmina 1. Verificamos la interacción directa entre los fragmentos nucleares L1 y las proteínas de unión a ARN y ADN NonO, SFPQ y PSPC1 de la Drosophila comportamiento / empalme humano (DBHS) y sugieren que los fragmentos nucleares L1 contribuyen al procesamiento y transporte del ARN, la transcripción, la estructura de la cromatina y la reparación del ADN, lo que incide en las funciones nucleares fundamentales del sistema nervioso.


Regulación de los niveles de adenosina en tejido sano versus tejido maligno

La adenosina extracelular, un nucleósido y derivado del ATP, participa en la regulación de diversos procesos fisiológicos que incluyen vasodilatación (4), reabsorción de agua ejercida por los riñones (5), percepción del dolor (6) y ajuste fino del ciclo de sueño y vigilia. (7). Aunque los niveles de adenosina extracelular dentro de los tejidos sanos son insignificantes (8 & # x0201311), tras la lesión, este nucleósido se acumula bruscamente en el intersticio, donde restringe potencialmente las respuestas inmunitarias (12) y promueve directamente la cicatrización de heridas (13). En condiciones homeostáticas en tejidos sanos, la concentración citosólica de ATP varía de 1 a 10 mM (14), mientras que sus niveles extracelulares son insignificantes (15). Sin embargo, este fuerte gradiente se puede interrumpir rápidamente tras las rupturas de la membrana plasmática inducidas por necrosis, apoptosis o estrés mecánico, así como por la salida de ATP regulada. Se ha demostrado que este último, inducido por una variedad de estímulos que incluyen hipoxia, isquemia e inflamación, ocurre ampliamente. vía exocitosis, transferencia transmembrana a través de transportadores de casete de unión a ATP (ABC), así como por difusión a través de una variedad de canales aniónicos o poros no selectivos de la membrana plasmática formados por conexinas, pannexina-1 o el receptor ATP P2X7R (16 & # x0201318). Por ejemplo, las células T estimuladas liberan ATP a través de los hemicanales de pannexina-1 y vía exocitosis (19, 20).

Una vez en el espacio extracelular, el ATP sufre una rápida desfosforilación escalonada por ecto-nucleotidasas (21, 22), incluida la E-NTPDase CD39, que convierte ATP o ADP en ADP o AMP, respectivamente, y la 5 & # x02032-nucleotidasa CD73, que desfosforila. AMP a adenosina (18, 23) (Figura 1). Otras enzimas cuya ectoactividad contribuye a la generación extracelular de adenosina son otras E-NTPDasas, miembros de la familia ecto-fosfodiesterasa / pirofosfatasa (E-NPP), dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD & # x0002B) glucohidrolasas, la fosfatasa de ácido prostático (PAP) y la fosfatasa alcalina (ALP) (21) (Figura 1). Brevemente, la coenzima NAD & # x0002B, otro componente celular clave cuya concentración extracelular aumenta significativamente en el tejido lesionado (24, 25), se convierte en adenosina difosfato ribosa (ADPR) por la NAD & # x0002B glicohidrolasa CD38 (26), mientras que ADPR y ATP son metabolizados a AMP por el E-NPP CD203a (27). Además, la PAP, que se expresa predominantemente, pero no exclusivamente, en el tejido prostático (28), es capaz de convertir el AMP extracelular en adenosina (29), mientras que la ALP cataliza la hidrólisis de ATP, ADP y AMP en adenosina (21). Por último, la adenosina también se puede producir intracelularmente por hidrólisis de S-adenosilhomocisteína (SAH), un metabolito de la vía de transmetilación, de S-adenosilhomocisteína hidrolasa (SAHH), o debido al catabolismo soluble mediado por CD73 de AMP, un nucleósido que participa en múltiples procesos celulares y cuya concentración aumenta dentro de células de baja carga energética (30) (Figura 1). La adenosina generada intracelularmente se puede secretar de manera limitada por difusión a través de transportadores de nucleósidos equilibrantes bidireccionales (ENT) (31). Sin embargo, aunque existe evidencia que sugiere que la hipoxia puede aumentar la producción de adenosina intracelular (32, 33), la contribución de esta vía a la acumulación de adenosina intersticial causada por lesiones se considera menor debido a la regulación a la baja de los transportadores antes mencionados inducida por hipoxia (34, 35). ). Dados sus diversos efectos, la presencia de adenosina en el espacio extracelular está sujeta a un estricto control espacio-temporal (12, 13, 36). Por ejemplo, la acumulación extracelular de adenosina es contrarrestada por su transferencia hacia adentro a través de ORL o simportadores concentrados, dependientes del gradiente de sodio (31), así como por la función de la adenosina desaminasa intra / extracelular (ADA) y de la adenosina quinasa citosólica (ADK). , que respectivamente convierten la adenosina en inosina o AMP (37) (Figura 1).

Figura 1. Regulación de los niveles de adenosina intersticial en tejido lesionado. La acumulación extracelular inducida por estrés de ATP o NAD & # x0002B alimenta las vías catabólicas generadoras de adenosina, como la mediada por CD39 y CD73. La actividad de otras ecto-nucleotidasas, incluidas CD38, CD203a, ALP y PAP, también contribuye a la acumulación extracelular de adenosina. La adenosina también se puede producir intracelularmente por hidrólisis de SAH ejercida por SAHH, así como por catabolismo de AMP mediado por CD73 soluble, y puede ser exportada por ENT de una manera limitada por difusión. Por otro lado, la combinación de la actividad de ADA unida a CD26 y de la captación celular de adenosina, ya sea a través de ENT equilibrantes o mediante CNT de concentración, limita los niveles de adenosina intersticial. Intracelularmente, la adenosina puede eliminarse mediante su conversión en SAH por SAHH, en AMP por ADK o en inosina por ADA. SAHH, S-adenosilhomocisteína hidrolasa SAH, S-adenosilhomocisteína ENT, transportadores de nucleósidos equilibrantes CNT, transportadores de nucleósidos concentrados ADK, adenosina quinasa ADA, adenosina desaminasa.

A diferencia de las condiciones homeostáticas, los niveles de ATP están muy elevados en la TME como resultado de necrosis, apoptosis, hipoxia e inflamación persistente (17, 18), y los niveles de adenosina intratumoral pueden alcanzar concentraciones micromolares (9, 10, 38). . El catabolismo del ATP en los tumores está mediado principalmente por CD39 y CD73 (39 & # x0201341), y la alta expresión de estas ecto-nucleotidasas está fuertemente asociada con un resultado clínico deficiente para los pacientes que padecen una variedad de tipos de cáncer (3, 42, 43). En particular, se ha detectado (sobre) expresión de CD39 y / o CD73 en la superficie de células tumorales (39, 44 & # x0201351), fibroblastos asociados al cáncer (CAF) (52 & # x0201354), células madre mesenquimales y células estromales (55 & # x0201351). # x0201357), células endoteliales (CE) (45, 46, 51), células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) (58 y # x0201360), macrófagos asociados a tumores (TAM) (53, 61), Tregs (46, 62 y # x0201364) , Th17 células (65) y de células T CD4 & # x0002B y CD8 & # x0002B convencionales experimentadas / agotadas con antígeno (64, 66 & # x0201368). Además, los exosomas que contienen CD39 / CD73 (69, 70), liberados por las células tumorales (71), Tregs (72) y MDSC (57, 73) contribuyen aún más a la generación de adenosina. Actualmente, la hipoxia y la inflamación incesante se consideran los principales impulsores de la sobreexpresión intratumoral de CD39 y CD73. Es decir, la actividad de HIF1 & # x003B1 (76 & # x0201379) y Sp1 (80) inducida por hipoxia (74, 75) promueve la expresión de estas ecto-nucleotidasas. En la misma línea, las vías de señalización iniciadas por moléculas asociadas a la inflamación, como IL-2 (81), IL-6 (66, 82), IL-1 & # x003B2 (83), TNF & # x003B1 (83 & # x0201385), IFN tipo I (86, 87), IL-27 (66, 88), TGF & # x003B2 (82, 89, 90) así como por inductores de Wnt (91, 92) o cAMP (83, 93 & # x0201395) Las vías de señalización también aumentan los niveles de CD39 (66, 81, 82, 88, 89, 95) y CD73 (81 & # x0201387, 89 & # x0201394).

Aunque se considera que el catabolismo del ATP extracelular mediado por CD39 y CD73 explica la mayor parte de la generación de adenosina intratumoral, los niveles de expresión de ectoenzimas que participan en vías alternativas de producción de adenosina también aumentan con la aparición del cáncer. Por ejemplo, CD38 se regula al alza con frecuencia dentro de los tejidos neoplásicos (26, 96, 97) y la evidencia esporádica sugiere que los niveles de CD203a también aumentan en los componentes de TME (98, 99). En la misma línea, la concentración sérica de PAP aumenta durante la progresión del cáncer de próstata (100), mientras que otros sugieren que también se regula al alza en el tejido canceroso (28). Finalmente, varios estudios han demostrado niveles elevados de ALP en las células cancerosas (101, 102), así como una correlación de los niveles de ALP en suero y el estadio de la enfermedad (103 & # x02013105). Críticamente, la contribución relativa de estas vías alternativas de producción de adenosina hacia la acumulación intratumoral de este nucleósido aún no se ha determinado. Finalmente, junto con la producción aberrante, la captación defectuosa resultante de la modulación a la baja de los transportadores de nucleósidos de equilibrio (106, 107) y de concentración (108 & # x02013110), también impulsados ​​por la hipoxia (34, 35, 111), contribuye aún más a la adenosina acumulación en el TME.


Resultados y discusión

Los ILC1 están ausentes en ratones deficientes en NKp46

Un modelo de ratón knockout (KO) NKp46, en el que Ncr1, el gen que codifica NKp46, fue reemplazado con proteína verde fluorescente (gfp) (Ncr1 gfp / gfp) [5,7]: se utilizó en este estudio. El desarrollo de poblaciones de ILC se evaluó en diferentes órganos y tejidos comparando el tipo salvaje (WT) (Ncr1 + / +), heterocigoto (Ncr1 gfp / +) y KO (Ncr1 gfp / gfp) ratones. La estrategia de activación para el análisis de citometría de flujo ILC1 se muestra en la Fig. 1A. Se observó una clara población NK1.1 + NKp46 ─ (más del 50%) dentro de la población NK1.1 + en el hígado (Fig. S1A), en consonancia con estudios previos [8,9]. La intensidad de la expresión de superficie de CD49a fue mayor en la población NK1.1 + NKp46 + CD49b ─ CD49a + ILC1 que en la población NK1.1 + NKp46 ─ CD49b ─ CD49a +, y esta última población mostró un fenotipo de CD3 ─ / dim (Figuras S1 y S2). Dadi y sus colegas definieron recientemente una población similar a ILC1, denominada receptor de células T (TCR) linaje de células T de tipo innato de tipo 1 (ILTC1), con un fenotipo de NK1.1 + NKp46 ─ CD49a + [10]. Además, NKp46 se considera un marcador fiable para las células ILC1 y NK [9-11]. Por lo tanto, en el estudio actual, el subconjunto ILC1 se definió como NK1.1 + NKp46 + (o GFP + para ratones KO) CD49b ─ CD49a + (Fig 1A), que no incluye NK1.1 + NKp46 ─ CD49b ─ CD49a + población. Fue sorprendente que, en comparación con Ncr1 + / + compañeros de camada, proporcionalmente el subconjunto ILC1 (CD49b ─ CD49a +) estaba casi completamente ausente en el hígado de Ncr1 ratones gfp / gfp y se redujo significativamente en el hígado de Ncr1 gfp / + ratones (Fig 1A, panel inferior Fig 1B, panel superior S2 Fig, panel superior), mientras que el porcentaje de la población NK1.1 + NKp46 ─ (o GFP ─ para ratones KO) CD49b ─ CD49a + población parece no ser diferente entre los Ncr1 gfp / gfp, Ncr1 + / gfp y Ncr1 Grupos + / + (S2 Fig, panel inferior). Además, la cuantificación del subconjunto ILC1 mostró que la cantidad absoluta de células también se redujo drásticamente en el hígado de la Ncr1 ratones gfp / gfp y moderadamente reducido en el hígado de Ncr1 ratones gfp / + en comparación con sus Ncr1 + / + compañeros de camada (Fig 1B, panel inferior). También usamos marcadores que incluyen CD62L, Eomesodermin (Eomes) y T-box expresados ​​en células T (T-bet) para confirmar nuestra observación con respecto a la dependencia de NKp46 para el desarrollo de ILC1 comparando Ncr1 ratones gfp / gfp y / o Ncr1 + / gfp ratones para Ncr1 + / + ratones (figuras S3 y S4). El desarrollo de poblaciones de ILC también se evaluó en otros órganos y tejidos utilizando el hígado como nuestro punto de referencia y comparando los resultados en WT (Ncr1 + / +) ratones para Ncr1 Ratones gfp / gfp (Fig. 1C y 1D). La cuantificación celular mediante citometría de flujo indicó que ILC1 (CD49b ─ CD49a +) estaban casi completamente ausentes en la médula ósea (MO), el bazo y el intestino delgado (SI) de Ncr1 ratones gfp / gfp (figura 1E). Por el contrario, el número absoluto de células NK, que son la población principal que expresa NKp46 en órganos o tejidos analizados, no cambió significativamente en Ncr1 ratones gfp / gfp en comparación con sus Ncr1 + / + compañeros de camada, de acuerdo con un informe anterior [7] (Fig. 1E, panel inferior).

(A) Estrategia de activación para ILC1. Las ILC1 se activaron en linfocitos y luego se definieron como Lin - NK1.1 + NKp46 + CD49b ─ CD49a +, con la excepción de que GFP + se usó para reemplazar NKp46 + cuando Ncr1 gfp / + o Ncr1 Se utilizaron ratones gfp / gfp. (B) Los porcentajes o cantidades de ILC1 se determinaron mediante análisis de citometría de flujo en el hígado de Ncr1 gfp / gfp, Ncr1 gfp / + y Ncr1 + / + ratones. (C) Las células NK se activaron en Lin ─ NK1.1 + NKp46 + (o GFP + para Ncr1 ratones gfp / gfp) CD49b + CD49a ─ entre los linfocitos. Los ILC1 se activaron en Lin ─ NK1.1 + NKp46 + (o GFP + para Ncr1 ratones gfp / gfp) CD49b ─ CD49a + entre linfocitos. (D) Cuantificación de ILC1 en diferentes órganos o tejidos en Ncr1 ratones gfp / gfp y Ncr1 + / + compañeros de camada, es decir, datos resumidos para (C). Cada línea muestra los porcentajes de ILC1 para un par de Ncr1 gfp / gfp y Ncr1 + / + compañeros de camada. (E) Cantidades de células NK o ILC1 en diferentes órganos de Ncr1 ratones gfp / gfp y sus Ncr1 + / + compañeros de camada (norte = 4). Barras de error, desviaciones estándar ***, pag & lt 0,001 **, pag & lt 0.01 *, pag & lt 0,05. Los datos numéricos de los paneles B, D y E se pueden encontrar en S1 Data. Lin ─, CD3 ─ CD19 ─ BM, médula ósea FSC-A, área de dispersión frontal FSC-H, FSC de altura FSC-W, FSC ancho GFP, proteína verde fluorescente ILC1, célula linfoide innata 1 NK, asesino natural Ncr1, receptor de citotoxicidad natural 1 SI, intestino delgado SSC-A, área de dispersión lateral SSC-H, altura SSC SSC-W, ancho SSC.

Los ratones Ncr1 gfp / gfp carecen del ligando inductor de apoptosis (TRAIL) relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF) + ILC1

El ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL) es una proteína funcional, expresada selectivamente en el subconjunto ILC1, que desempeña un papel esencial en la mediación de la citotoxicidad de esta población contra las células diana mediante la activación de la vía de señalización transducida por el receptor de muerte [12]. La expresión de TRAIL y la falta de expresión de CD49b también se pueden utilizar para distinguir las ILC1 de las células NK [13] porque las células NK en reposo en ratones WT no expresan TRAIL, mientras que las ILC1 sí lo hacen (Fig. 2A, izquierda). De acuerdo con los datos mostrados en la Figura 1 con respecto a la ausencia casi completa de CD49a + CD49b ─ ILC1, la población TRAIL + CD49b ─ de NKp46 + (o GFP +) NK1.1 + ILC tipo I era apenas detectable en el hígado (Fig. 2A y 2B) y otros órganos (Fig 2C) de Ncr1 ratones gfp / gfp en comparación con sus Ncr1 + / + controles de compañeros de camada.

(A) Los porcentajes de TRAIL + ILC1 se analizaron mediante análisis de citometría de flujo en el hígado de Ncr1 ratones gfp / gfp y sus Ncr1 + / + compañeros de camada. Los ILC1 se activaron en Lin ─ NK1.1 + NKp46 + (o GFP + para Ncr1 ratones gfp / gfp) TRAIL + CD49b ─ entre linfocitos. (B) Cuantificación de TRAIL + ILC1 en el hígado de Ncr1 ratones gfp / gfp y sus Ncr1 + / + compañeros de camada para (A) (norte = 5). (C) Cuantificación de TRAIL + ILC1 en otros órganos (bazo, norte = 5 BM, norte = 5 SI, norte = 4) de Ncr1 ratones gfp / gfp y sus Ncr1 + / + compañeros de camada. **, pag & lt 0.01 *, pag & lt 0,05. Los datos numéricos de los paneles B y C se pueden encontrar en S1 Data. Lin ─, CD3 ─ CD19 ─ BM, médula ósea GFP, proteína verde fluorescente ILC1, célula linfoide innata 1 Ncr1, receptor de citotoxicidad natural 1 NK, asesino natural SI, intestino delgado TRAIL, ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral.

La deficiencia de NKp46 no tiene un efecto adverso sustancial en los subconjuntos ILC2 e ILC3

Debido a nuestra observación de que la deficiencia de NKp46 restringió el desarrollo de ILC1, a continuación nos propusimos probar si este efecto también se produjo en otros subconjuntos de ILC. Sin embargo, utilizando la estrategia de activación como se describe en la Fig.3A, no observamos una diferencia significativa en las cantidades o frecuencias de Lin ─ CD127 + Gata3 + ILC2s y Lin ─ CD127 + RORγt + ILC3s cuando Ncr1 Se compararon los ratones gfp / gfp con sus Ncr1 + / + controles de compañero de camada (Fig. 3B y 3C). Había una cantidad insuficiente de células ILC1 de Ncr1 ratones gfp / gfp para estudiar cómo esta deficiencia de NKp46 afecta las funciones de ILC1, sin embargo, observamos que la producción de interferón γ (IFN-γ) por las células NK en respuesta a la coestimulación con IL-12 e IL-18 no se alteró entre celdas aisladas de Ncr1 ratones gfp / gfp versus los de Ncr1 + / + controles de compañero de camada (Fig 3D). Asimismo, la producción de IL-22 por células ILC3 aisladas de Ncr1 ratones gfp / gfp versus los de Ncr1 Los controles de + / + compañeros de camada no fueron significativamente diferentes (Fig. 3E). De acuerdo con nuestros resultados, Satoh-Takayama y sus colegas demostraron previamente que NKp46 no es necesario para que las células inmunitarias innatas intestinales mediadas por IL-22 en el intestino se defiendan contra Citrobacter rodentium [14]. Juntos, estos resultados sugieren que NKp46 no controla la homeostasis o la producción de citocinas ILC distintivas de ILC2, células NK o ILC3, pero participa selectivamente en la regulación del desarrollo de ILC1.

(A) Estrategia de activación de puertas para ILC2 e ILC3. Las ILC2 se activaron en CD45 + Lin ─ CD127 + Gata3 +, y las ILC3 se activaron en CD45 + Lin ─ CD127 + RORγt +. (B) Los porcentajes de ILC2 o ILC3 se analizaron mediante citometría de flujo en SI en Ncr1 ratones gfp / gfp y Ncr1 + / + compañeros de camada. Las ILC2 se activaron en linfocitos CD45 + Lin ─ CD127 + Gata3 + RORγt ─. Las ILC3 se activaron en linfocitos CD45 + Lin ─ CD127 + RORγt + Gata3 ─. (C) Las cantidades de ILC2 o ILC3 se determinaron en SI de Ncr1 ratones gfp / gfp y sus Ncr1 + / + compañeros de camada (norte = 4). (D) Lin ─ (o CD3 ─ CD19 ─) NK1.1 + NKp46 + (o GFP + para Ncr1 gfp / gfp) Se separaron células NK CD49b + del bazo de Ncr1 ratones gfp / gfp o Ncr1 + / + compañeros de camada y fueron coestimulados con IL-12 (10 ng / ml) e IL-18 (10 ng / ml) durante 16 h, seguido de la medición de la producción de IFN-γ mediante análisis de citometría de flujo intracelular (D, panel izquierdo, norte = 3) o ensayos ELISA (D, panel derecho, norte = 3). Se añadió Golgi Plug a una dilución de 1: 1.000 al cultivo 4 h antes de la recolección de células. (E) Células SI homogeneizadas aisladas de Ncr1 ratones gfp / gfp o Ncr1 Los compañeros de camada + / + se estimularon con IL-23 (10 ng / ml) durante 4 h, seguido de la medición de la producción de IL-22 mediante análisis de citometría de flujo después de la activación de ILC3 en CD45 + Lin ─ CD127 + RORγt +. Se añadió Golgi Plug a una dilución de 1: 1.000 al cultivo 3 h antes de la recolección de células. Barras de error, desviaciones estándar. Los datos numéricos para el panel C y D se pueden encontrar en S1 Data. ELISA, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas FSC-A, área de dispersión directa FSC-H, altura de FSC IFN, interferón IL, interleucina ILC, células linfoides innatas Ncr1, receptor de citotoxicidad natural 1 NK, asesino natural NS, sin importancia RORγt, receptor de ácido retinoico (RAR) relacionado con el receptor huérfano gamma t SI, intestino delgado SSC-A, área de dispersión lateral SSC-H, altura SSC SSC-W, ancho SSC.

NKp46 controla el desarrollo de ILC1 de manera intrínseca a la célula

Aunque las células NK y las ILC1 están estrechamente relacionadas, las ILC1 no se desarrollan a través de Lin ─ CD122 + NK1.1 ─ DX5 ─ precursores de células NK (NKP) pero pueden desarrollarse a través de Lin ─ c-kit low α4β7 + CD127 + CD25 ─ Flt3 ─ common helper precursores linfoides innatos (CHILP). Tanto los NKP como los CHILP se derivan de un progenitor linfoide común (CLP) [15]. La proporción de ambos tipos de precursores es similar en la BM de Ncr1 gfp / gfp y Ncr1 + / + ratones (figura S5). Para validar que la deficiencia de NKp46 da como resultado la ausencia casi completa de ILC1 y para probar si este fenómeno es intrínseco o extrínseco de la célula, se realizó un trasplante de BM. Para este propósito, los receptores de WT CD45.1 irradiados se injertaron con Ncr1 gfp / gfp (KO) o Ncr1 + / + (WT) células de médula ósea de donantes CD45.2 (figura 4A) o una mezcla 1: 1 de KO y WT (figura S6) mediante una inyección en la vena de la cola. Dos semanas más tarde, se llevó a cabo la cuantificación de varios subconjuntos de ILC mediante análisis de citometría de flujo. Las células del donante y las células huésped se distinguieron mediante la tinción de las células con un anticuerpo anti-CD45.2. Encontramos que había una ausencia casi completa de ILC1 en el hígado, el bazo y la MO de los receptores de WT cuando Ncr1 Como células donantes se utilizaron células de BM gfp / gfp. Sin embargo, la población ILC1 estaba presente en cantidades significativamente mayores cuando Ncr1 Se utilizaron células de BM + / + como células donantes (Fig. 4B y 4C y Fig. S6). Por el contrario, la cantidad de células ILC2 y células ILC3 en el SI no se vio afectada en los ratones receptores injertados con Ncr1 gfp / gfp o Ncr1 + / + Células donantes de BM (Fig. 4D y 4E). El aumento moderado en la proporción de células NK podría estar ocurriendo debido a la falta completa de ILC1 entre las ILC de tipo I NKp46 + NK1.1 + (Fig. 4B, arriba a la derecha, Fig. 4C, abajo a la derecha). En conjunto, estos resultados confirman además que el desarrollo de ILC1 depende de NKp46, y esta dependencia es intrínseca a la célula (Fig. 1).

(A) Esquema de trasplante de BM usando células de BM de CD45.2 Ncr1 ratones gfp / gfp o Ncr1 + / + el compañero de camada controla como células donantes para inyectar en los receptores CD45.1 a través de la vena de la cola. El desarrollo de subconjuntos de ILC se analizó 2 semanas después del trasplante. (B) Los porcentajes de células NK CD45.2 + o CD45.2 + ILC1 se analizaron mediante análisis de citometría de flujo en el hígado de receptores de CD45.1, que se injertaron con células de médula ósea de Ncr1 ratones gfp / gfp (norte = 5) o Ncr1 + / + compañeros de camada (norte = 4). (C) Se analizaron los porcentajes de células NK CD45.2 + o ILC1 CD45.2 + en el bazo o BM de ratones receptores de CD45.1, que se injertaron con células BM de Ncr1 ratones gfp / gfp (norte = 5) o su Ncr1 + / + compañeros de camada (norte = 4). (D y E) Los datos que se muestran son gráficos de puntos representativos del análisis de citometría de flujo (panel izquierdo) y datos resumidos (panel derecho) de CD45.2 + ILC2 (D) o CD45.2 + ILC3 (E) en SI en CD45.1 receptores, que fueron injertados con células BM de Ncr1 ratones gfp / gfp (norte = 4) o su Ncr1 + / + compañeros de camada (norte = 4). Barras de error, desviaciones estándar ***, pag & lt 0,001 **, pag & lt 0.01 *, pag & lt 0,05. Los datos numéricos de los paneles B, C, D y E se pueden encontrar en S1 Data. Lin ─, CD3 ─ CD19 ─ BM, ILC de médula ósea, células linfoides innatas Ncr1, receptor de citotoxicidad natural 1 NK, asesino natural RORγt, receptor huérfano relacionado con el receptor de ácido retinoico (RAR) gamma t SI, intestino delgado.

En conclusión, nuestros hallazgos proporcionan pruebas novedosas de que NKp46 desempeña un papel fundamental en el desarrollo de ILC1. Los estudios previos en esta área se centraron en el control transcripcional del desarrollo de ILC. Se sabe que T-bet y Eomes regulan el desarrollo de células NK, Gata3 controla el desarrollo de ILC2 y RORγt define el linaje ILC3 [15]. Se ha descubierto que varios factores de transcripción, como el factor nuclear regulado por interleucina 3 (Nfil3), el factor de transcripción relacionado con runt 3 (Runx3) y T-bet, controlan el desarrollo de ILC1; sin embargo, estos factores no juegan un papel selectivo en la determinación del desarrollo de ILC1. [15]. Es decir, estos factores de transcripción tienen algunos roles superpuestos en varios tipos de ILC y, por lo tanto, individualmente no pueden determinar el destino del desarrollo de ILC1. Por ejemplo, se ha demostrado que T-bet desempeña un papel no solo en el desarrollo de ILC1, sino también en el desarrollo de células NK e ILC3 [15]. Aquí, identificamos un receptor que determina selectivamente el destino de desarrollo de ILC1. Nuestro estudio también apoya la noción de que las células ILC1 y NK pertenecen a diferentes linajes, aunque ambos pertenecen a las ILC del grupo 1, y ambos pueden producir IFN-γ cuando se activan (por ejemplo, por citocinas). Nuestro estudio también muestra que Ncr1 Los ratones gfp / gfp pueden servir como un modelo animal útil para investigar las funciones fisiológicas o patológicas de las ILC1, dada su ausencia casi completa en varios órganos, mientras que el desarrollo y la función de otras ILC se mantienen casi intactos, con la excepción de las funciones relacionadas al papel de NKp46 en las células NK [7, 16].


Orientación inmunológica de la célula madre cancerosa

Cada vez hay más pruebas que sugieren que la falta de erradicación de las células madre malignas constituye la base de la recaída y la progresión del cáncer. En este sentido, las experiencias clínicas del tratamiento de la leucemia mielógena crónica (LMC), una enfermedad prototípica de células madre, han sido instructivas e ilustrativas de los desafíos que enfrenta el tratamiento del cáncer cuando se utilizan potentes agentes citorreductores que erradican por completo la enfermedad mínima residual. Por otro lado, varias décadas de experiencia clínica y de laboratorio han demostrado el potencial curativo del trasplante alogénico de células madre para la LMC y otras neoplasias malignas hematológicas. Como se revisó en este capítulo, estos estudios han demostrado claramente el potencial curativo del reconocimiento inmunológico de las células tumorales, incluida la población de células progenitoras malignas. Estos datos preparan el escenario para enfoques más nuevos que se centran en la focalización inmunitaria de los antígenos que están presentes en las células madre cancerosas.La focalización inmune racional de la población que inicia el tumor depende fundamentalmente de (1) identificar los marcadores de superficie únicos de estas células para que puedan aislarse, y de (2) definir los antígenos que se expresan única o preferencialmente dentro de las células malignas con células madre. funciones similares a las de las células en comparación con las células normales. Si bien continúa el debate sobre la naturaleza exacta y las características definitorias de la población celular que es capaz de propagar el tumor y, por lo tanto, la subpoblación de células tumorales crítica que se requiere para la focalización inmune, se están investigando varios enfoques prometedores para la inmunoterapia del cáncer. En última instancia, la terapia de combinación que incluye tanto agentes citorreductores farmacológicos junto con el direccionamiento inmunológico de poblaciones de células madre malignas puede proporcionar un enfoque curativo eficaz con una toxicidad aceptable para el tratamiento de enfermedades malignas.

1. Introducción

Hasta ahora, se ha demostrado la existencia de células que inician el cáncer en muchas neoplasias malignas (Al-Hajj et al., 2003 Bonnet y Dick, 1997 Jamieson et al., 2004 Singh et al., 2003) (Schatton et al., 2008) . Se trata de poblaciones de células inactivas poco frecuentes que pueden trasplantarse en serie, tienen capacidad de autorrenovación y, con frecuencia, son resistentes a los efectos citotóxicos de la quimioterapia estándar (Clarke et al., 2006). Estas características tienen claras implicaciones en la progresión de la enfermedad y los enfoques de la intervención terapéutica. La creciente evidencia ha sugerido que la falta de erradicación de las células madre malignas constituye la base de la recaída y la progresión de la enfermedad. En este sentido, las experiencias clínicas del tratamiento de la leucemia mielógena crónica (LMC), una enfermedad derivada de una población de células madre transformada, han sido instructivas (Sección 2) y también ilustran los desafíos que enfrenta el tratamiento de las neoplasias malignas de tumores sólidos. Estos estudios han demostrado la potente capacidad citorreductora de las terapias farmacológicas desarrolladas recientemente, pero también su incapacidad general para erradicar completamente la enfermedad residual. Por otro lado, una gran cantidad de experiencia clínica y de laboratorio durante las últimas tres décadas ha demostrado el potencial curativo del trasplante alogénico de células madre para la LMC y otras neoplasias malignas hematológicas. Como se revisó en la Sección 3, estos estudios han demostrado claramente que el injerto del donante da como resultado el reconocimiento inmunológico de las células tumorales, incluida la población de células progenitoras malignas. Estos datos preparan el escenario para enfoques más nuevos que se centran en la focalización inmunitaria de los antígenos que están presentes en las células madre cancerosas. Si bien continúa el debate sobre la naturaleza exacta y las características definitorias de la población celular que es capaz de propagar el tumor y, por lo tanto, la extensión de la población total de células tumorales que se requiere para la focalización inmune, se están investigando varios enfoques prometedores para la inmunoterapia del cáncer. Estos enfoques podrían incluir la inmunización y el direccionamiento de antígenos con expresión selectiva en células madre malignas, junto con reactivos que pueden regular la potencia del sistema inmunológico (Sección 4). En última instancia, la terapia de combinación que incluye ambos agentes citorreductores farmacológicos junto con el direccionamiento inmunológico de poblaciones de células madre malignas puede proporcionar un enfoque curativo eficaz con una toxicidad aceptable para el tratamiento de enfermedades malignas.

2. Lecciones de la CML, un trastorno de las células madre hematopoyéticas

La leucemia mielógena crónica (LMC) es una enfermedad mieloproliferativa asociada con la t(9 22) translocación cromosómica que codifica el oncogénico BCR-ABL proteína de fusión. Esta proteína quimérica tiene actividad tirosina quinasa y es esencial para la transformación maligna y la expansión celular mieloide excesiva que caracteriza a la CML. La historia natural de la LMC ha sido bien caracterizada.Los pacientes típicamente permanecen en la fase crónica (PC) durante varios años, pero inevitablemente se transforman en un síndrome clínico más agresivo (fase acelerada) y, finalmente, en una crisis blástica fatal (BC) (Faderl et al. , 1999).

Los estudios genéticos realizados hace más de 20 años demostraron que el clon maligno en la LMC es una célula madre hematopoyética pluripotente, capaz de diferenciarse en células mieloides, monocitos, eritrocitos y plaquetas (Bernstein et al., 1992 Douer et al., 1981 Fialkow et al. ., 1977 Koeffler y col., 1980 Martin y col., 1980 Singer y col., 1980 Singer y col., 1979). Estos estudios identificaron que en las células de todo el espectro de linajes hematopoyéticos de mujeres con LMC que eran heterocigotas para este gen, solo estaban presentes fenotipos de enzima única de la isoenzima G6PD ligada al cromosoma X. Por tanto, se determinó que el clon maligno se originaba a partir de la célula progenitora hematopoyética más temprana. Se han identificado características fenotípicas de células madre hematopoyéticas humanas, precursores y poblaciones progenitoras (Kondo et al., 2003) y, en general, estas subpoblaciones pueden identificarse basándose en la expresión de CD34 + en combinación con la expresión presente o ausente de marcadores inmunofenotípicos adicionales. Más recientemente, Jamieson et al. han demostrado la propiedad de autorrenovación dentro de la población de células madre de pacientes con LMC con enfermedad en fase crónica y dentro de las poblaciones de células madre y progenitoras mieloides en pacientes con crisis blástica, que se asocian con una mayor actividad de la vía de la β-catenina (Jamieson et al., 2004).

Inhibición de la ABL quinasa, que se activa constitutivamente en la CML como resultado de la BCR-ABL translocación, ha sido una estrategia exitosa desarrollada recientemente para el tratamiento de la CML. El inhibidor específico de la tirosina quinasa, mesilato de imatinib, inhibe competitivamente la unión de ATP al ABL dominio quinasa (Buchdunger et al., 1996), y por lo tanto tiene actividad inhibidora específica para la tirosina quinasa codificada por el BCR-ABL transcrito de fusión (Buchdunger et al., 1996 Deininger et al., 1997 Druker et al., 1996). Los estudios de fase I y II han demostrado una alta frecuencia de respuestas hematológicas y citogenéticas en pacientes con LMC en fase acelerada o BC, así como con PC recién diagnosticada (Druker et al., 2001a Druker et al., 2001b Kantarjian et al., 2002 ). (Kantarjian et al., 2002 Sawyers et al., 2002). Además, un ensayo controlado aleatorizado de fase III ha demostrado la superioridad del imatinib frente a la combinación de IFNα y citarabina en pacientes recién diagnosticados con CP-CML (ensayo IRIS) (O’Brien et al., 2003). Se observaron respuestas hematológicas y citogenéticas importantes en el 98% y el 84% de los pacientes, respectivamente, en el grupo de imatinib, y estos resultados se lograron con baja toxicidad. Estos impresionantes resultados llevaron a su rápida aprobación por la FDA en 2001, y el imatinib se ha convertido en una terapia estándar de primera línea para la leucemia mieloide crónica. En los últimos años, ABL Se han desarrollado inhibidores de quinasa de mayor potencia para el tratamiento de la enfermedad resistente al imatinib, e incluyen dasatinib (aprobado por la FDA en junio de 2006) y nilotinib (aprobado por la FDA en octubre de 2007) (Brave et al., 2008 Cortes et al. ., 2007 Guilhot et al., 2007 Hochhaus et al., 2008 Hochhaus et al., 2007 Kantarjian et al., 2007a Kantarjian et al., 2007b le Coutre et al., 2008). En conjunto, el tratamiento de la CML con ABL Los inhibidores de quinasa sirven como modelo para el éxito de la selección molecular de vías de señalización que son vitales para la supervivencia de la célula maligna. Este modelo ha inspirado el desarrollo de estrategias que interrumpen las vías de señalización esenciales en otros tumores, incluidos los tumores de células del estroma gastrointestinal (Blanke et al., 2008) y el cáncer de pulmón (Giaccone, 2005 Sequist et al., 2007).

A pesar de estos sorprendentes resultados clínicos, algunas observaciones son notas de precaución. Primero, en pacientes con enfermedad avanzada, las remisiones inducidas por fármacos en pacientes con LMC con enfermedad avanzada no son duraderas (Druker et al., 2001a) (Ottmann et al., 2002 Sawyers et al., 2002). Las investigaciones sobre los mecanismos de la resistencia a los fármacos imatinib han respaldado las nociones de que: (a) BCR-ABL conduce a una inestabilidad genómica general que puede inducir alteraciones genéticas secundarias (BCR-ABL amplificación de genes, nuevas mutaciones puntuales inactivantes) que contribuyen a BCR-ABL crecimiento independiente y / o supervivencia del clon maligno (Branford et al., 2002 Gorre et al., 2001 Hochhaus et al., 2002 Roche-Lestienne et al., 2002 Roumiantsev et al., 2002 Schindler et al., 2000 Shah et al., 2002) y (b) imatinib puede seleccionar el clon de enfermedad resistente en pacientes con enfermedad avanzada, según lo respaldado por el análisis mutacional del paciente (Bumm et al., 2003). En segundo lugar, incluso en pacientes con enfermedad menos avanzada, & lt5% se vuelven completamente negativos a la PCR para BCR-ABL a pesar del logro frecuente de respuestas citogenéticas completas (CCR) (Hughes et al., 2003). En el ensayo IRIS, del 68% de los pacientes que lograron CCR después de 1 año de terapia, el 30% logró una reducción de & lt2 log en la mediana BCR-ABL niveles de transcripción por BCR-ABL qPCR. Este bajo nivel de disminución en BCR-ABL La transcripción se asoció con una probabilidad de 5 a 15% de progresión de la enfermedad a los 24 meses. Por el contrario, los pacientes con una reducción logarítmica de & gt 3 permanecieron 100% libres de progresión a los 24 meses. Estudios más recientes han demostrado que con la terapia de primera línea prolongada, la probabilidad de lograr remisiones moleculares aumenta, pero el 50% de los pacientes todavía tienen enfermedad residual detectable (Branford et al., 2007).

De acuerdo con la persistencia de una enfermedad residual mínima detectable molecularmente después del tratamiento con imatinib, Bhatia et al. identificaron progenitores hematopoyéticos malignos en 15 de los 15 pacientes con LMC estudiados, que estaban en CCR después de imatinib (Bhatia et al., 2003). Graham y col. informó que las células progenitoras Ph + inactivas primitivas de pacientes con LMC son insensibles al imatinib in vitro (Graham et al., 2002). También se ha demostrado que dasatinib y nilotinib seleccionan para el crecimiento de clones que portan mutaciones de resistencia (Shah et al., 2007), y erradican de manera ineficaz la enfermedad residual (Copland et al., 2006 Jorgensen et al., 2007), a pesar de su aumento potencia en comparación con imatinib. Jiang y col. demostró recientemente que las células madre de CML recién aisladas de pacientes no tratados ya albergan una alta frecuencia de BCR-ABL mutaciones. Además, identificaron más de 70 diferentes BCR-ABL mutaciones en la progenie de cultivos de células madre de CML. Estos y otros estudios muestran que las células madre primarias de CML muestran inestabilidad del BCR-ABL gen de fusión, y que persiste un reservorio de células progenitoras malignas en pacientes tratados con ABL inhibidores de la cinasa, que tienen el potencial de convertirse en una enfermedad recidivante (Jiang et al., 2007). También se han identificado subpoblaciones de células inactivas resistentes a los fármacos con potencial clonogénico en otros cánceres (Abbott, 2003 Challen y Little, 2006 Hadnagy et al., 2006).

3. Trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas: una terapia curativa basada en el sistema inmunitario que da como resultado la erradicación de las células progenitoras malignas.

El trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (TCMH) es un enfoque de tratamiento curativo bien establecido para muchas neoplasias malignas hematológicas. Si bien la intensidad y la composición del régimen de acondicionamiento son importantes para el éxito del TCMH, la reconstitución de las células inmunitarias del donante desempeña un papel fundamental en la eliminación de las células tumorales del receptor, un proceso denominado injerto contra leucemia (GvL). Como se revisará en esta sección, más de 30 años de experiencia clínica y de laboratorio han proporcionado una clara demostración de que el direccionamiento inmunológico de poblaciones de células hematopoyéticas malignas puede generar de manera eficaz respuestas curativas duraderas. Este enfoque incluso se ha aplicado al tratamiento de tumores sólidos. Estos estudios ahora proporcionan el telón de fondo para el desarrollo de terapias que mejoran el beneficio terapéutico del trasplante alogénico al tiempo que minimizan los riesgos y las toxicidades asociadas con el tratamiento.

3.1. Evidencia que respalda la existencia del efecto injerto versus leucemia

Varias líneas de evidencia clínica, establecidas durante los últimos 30 años, han demostrado de manera convincente la existencia de GvL y su notable eficacia para proporcionar un rechazo inmunológico duradero de las células malignas. Como se resume en la Tabla 1, estos estudios clínicos comenzaron en las décadas de 1970 y 1980, en los que se encontró que el riesgo de recaída de la enfermedad después del TCMH estaba altamente correlacionado con el estado inmunológico del receptor. Por ejemplo, se encontró que la respuesta antileucemia (es decir, GvL) estaba fuertemente correlacionada con la presencia de una toxicidad inmunológica del trasplante, la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD). La recaída de la leucemia fue 2,5 veces más probable en los receptores de células madre singénicas en comparación con los receptores alogénicos con HLA compatible que desarrollaron GvHD (Weiden et al., 1979). Además, se encontró que los pacientes que experimentaron GvHD tenían un menor riesgo de recaída de la enfermedad, y esto parecía estar relacionado con el grado de compatibilidad de HLA entre el receptor y el donante (Fefer et al., 1987 Sullivan et al., 1989 Weiden et al. ., 1981) (Butturini y col., 1987 Gale y col., 1994 Jones y col., 1991 Weisdorf y col., 1987). También se han observado ejemplos de remisión de la leucemia en asociación con el empeoramiento de la EICH (Odom et al., 1978 Tricot et al., 1996), o después de suspender los medicamentos inmunosupresores utilizados para la prevención de la EICH (Collins et al., 1992 Libura et al. ., 1999). Tras los informes de una sola institución que describen la correlación positiva entre la disminución de la recaída y la EICH aguda y / o crónica, posteriormente se realizaron varios estudios de registro confirmatorios grandes en América del Norte (Horowitz et al., 1990) y en Europa (Ringden et al., 1996). . Algunos pacientes de estos estudios retrospectivos habían recibido injertos de células madre de los que se habían agotado las células T in vitro para prevenir la EICH. El agotamiento de las células T previno eficazmente la EICH grave, pero se observaron tasas más altas de recaída en estos pacientes en comparación con los receptores de células madre sin células T agotadas. Este efecto del agotamiento de las células T se observó con mayor frecuencia en pacientes con LMC. Tomados en conjunto, estos estudios demostraron que la GvHD se asoció con un efecto GvL muy significativo, que fue mediado por células T del donante en los productos de células madre (Champlin et al., 1990 Goldman et al., 1988 Horowitz et al., 1990 Martin et al. al., 1988).

Tasa de recaída más baja después del trasplante de células madre alogénicas en comparación con las células madre autólogas o singénicas

Correlación positiva entre GVHD y GVL

Asociación temporal de remisión de leucemia con episodios de EICH aguda o crónica

Remisión de la enfermedad después de suspender los medicamentos inmunosupresores

Disminución de la recaída asociada con la EICH

El agotamiento de las células T del injerto de células madre del donante se asocia con mayores tasas de recaída

La infusión de linfocitos de un donante induce la remisión de las neoplasias hematológicas

El TCMH alogénico después del acondicionamiento no mieloablativo induce la remisión de neoplasias malignas hematológicas y algunas neoplasias malignas no hematológicas

La eficacia de las respuestas de GvL en la eliminación de tumores se demostró definitivamente a principios de la década de 1990 a través de la experiencia exitosa de usar infusiones de linfocitos de donantes (DLI) para tratar la LMC recidivante después de un TCMH (Kolb et al., 1990). La observación de que los linfocitos del donante por sí solos, sin más quimioterapia o radiación, podrían inducir la remisión de la enfermedad, demostró directamente la potente actividad antitumoral de las células efectoras inmunitarias derivadas del donante. Desde este informe inicial, las experiencias multicéntricas en Europa y América del Norte han confirmado la eficacia de DLI para inducir GvL (Collins et al., 1997 Kolb et al., 1995). A partir de estos estudios clínicos, queda claro que la DLI es especialmente eficaz en el tratamiento de la LMC en fase estable, en la que se producen respuestas duraderas en 75 a 80% de los pacientes. Por el contrario, las tasas de respuesta de los pacientes con mieloma múltiple y CLL han oscilado entre el 30 y el 50% (Lokhorst et al., 1997 Mandigers et al., 2003 Rondon et al., 1996 Tricot et al., 1996) y de los pacientes con enfermedad aguda leucemia, sólo del 10 al 15%. De acuerdo con estas observaciones, DLI es generalmente más eficaz en pacientes con menor carga de enfermedad (van Rhee et al., 1994). Sólo el 5-10% de los pacientes con CML avanzada (crisis blástica / fase acelerada) responden a DLI. Curiosamente, las respuestas clínicas después de DLI a menudo se retrasan hasta 2 a 4 meses después de una sola infusión. Este intervalo prolongado puede reflejar el tiempo necesario para montar una respuesta eficaz cuando la frecuencia de células T ingenuas capaces de responder es baja. Alternativamente, las respuestas retardadas pueden reflejar el tiempo necesario para demostrar el impacto de la lisis de las células que comprenden el clon maligno de origen. Las respuestas de DLI para al menos algunas enfermedades son muy duraderas (Mattei et al., 2001 Shimoni et al., 2001). Por ejemplo, Porter et al. informaron que la probabilidad de supervivencia a 1, 2 y 3 años después de la terapia con DLI era del 83, 76 y 73%, respectivamente (Porter et al., 1999).

Con la demostración de que GvL juega un papel importante en la eliminación de las células leucémicas después del trasplante, muchos estudios han comenzado a examinar la viabilidad de usar regímenes de acondicionamiento no mieloablativos menos intensivos para preparar a los pacientes para el TCMH alogénico. Se han desarrollado una variedad de regímenes de acondicionamiento no mielosupresores y una gran cantidad de estudios clínicos han demostrado la efectividad de este enfoque, especialmente en pacientes que no son elegibles para un acondicionamiento más intensivo (Khouri et al., 1998 McSweeney et al., 2001) (Alyea et al., 2005 Morris et al., 2004). Los regímenes de acondicionamiento de intensidad reducida se asocian con una toxicidad sustancialmente menor pero, no obstante, proporcionan una inmunosupresión suficiente del receptor para evitar el rechazo de las células madre hematopoyéticas alogénicas. Dado que los regímenes de acondicionamiento no mieloablativos son insuficientes para eliminar las células leucémicas en el receptor, las remisiones a largo plazo dependen principalmente de los mecanismos inmunológicos mediados por las células del donante. De manera similar a la situación mieloablativa, las respuestas de GvL después de un trasplante no mieloablativo a menudo se asocian con GvHD (Crawley et al., 2005). Con este enfoque, los ensayos clínicos recientes en pacientes con tumores sólidos sugieren que se pueden observar respuestas de injerto contra tumor en al menos algunos de estos pacientes (Childs et al., 2000 Demirer et al., 2008 Tykodi et al., 2004 Ueno et al. ., 2003)

3.2. Disección de la base inmunológica de GvL

Muchos estudios de laboratorio han buscado definir los mecanismos inmunológicos que contribuyen a GvL. Aunque los productos de células madre y DLI contienen una variedad de tipos de células mononucleares, generalmente se ha supuesto que las células T comprenden las células efectoras predominantes en estos productos. Sin embargo, estudios recientes también han implicado un papel para las respuestas B y NK en las respuestas GvL. En esta sección consideramos la evidencia del papel de cada una de estas poblaciones de células en GvL.

3.2.1. Células T del donante como mediadoras de GvL y sus antígenos diana

En modelos murinos, se ha demostrado que las poblaciones de células T CD4 + y CD8 + contribuyen a la actividad de GVL en vivo (Truitt y Atasoylu, 1991). La eliminación de cualquiera de estas poblaciones de células T da como resultado un compromiso de la reactividad de GvL, lo que indica que las células T CD4 + y CD8 + son necesarias para generar una GvL óptima.En pacientes que se han sometido a un TCMH alogénico, también se han identificado células T reactivas a la leucemia tanto CD4 + como CD8 +. En los últimos años, se ha dirigido mucha actividad a la identificación precisa de los antígenos diana de las células T del donante después de un TCMH alogénico, ya que una mejor comprensión de los epítopos peptídicos precisos reconocidos por las células T puede conducir potencialmente a la optimización de estrategias para distinguir GvL y Efectos de GvHD en vivo.

La mayoría de las estrategias para la identificación de epítopos de células T se han basado en el examen de la actividad citolítica de las células T derivadas del donante frente a los antígenos del hospedador, identificados mediante enfoques bioquímicos o mediante pruebas frente a bibliotecas de expresión de ADNc derivadas del tejido del hospedador. Usando estas estrategias, se han identificado muchos antígenos menores de histocompatibilidad (mHA). Los mHA son antígenos que se producen como resultado de polimorfismos genéticos que existen en todo el genoma humano (Mullally y Ritz, 2007) y, por lo tanto, son un reflejo de esos auto-péptidos polimórficos que distinguen a dos individuos cualesquiera. El trasplante de células T maduras durante el HSCT alogénico da como resultado la transferencia de un gran número de células capaces de reconocer estos mHA.

Como se representa esquemáticamente en la Figura 1, las consecuencias clínicas de la mHA parecen resultar completamente de su expresión en diferentes tipos de células y el reconocimiento de estos antígenos por las células T del donante (Akatsuka et al., 2003 Dickinson et al., 2002 Kloosterboer et al. , 2005). La mayoría de los mHA humanos identificados hasta el momento tienen una amplia expresión tisular y el direccionamiento de estos tipos de células variados por las células T del donante representa uno de los eventos iniciadores de GvHD (Dickinson et al., 2002). Por ejemplo, una clase bien caracterizada de mHA ampliamente expresada son los genes del cromosoma Y. Los machos son tolerantes a estas proteínas codificadas por el cromosoma Y (antígenos H-Y) pero las células T reactivas con péptidos H-Y no se eliminan en mujeres normales (Foote et al., 1992 Wang et al., 1995). Las hembras son tolerantes al homólogo del cromosoma X expresado y cuando se exponen a los antígenos H-Y a través del embarazo o una transfusión de sangre pueden desarrollar respuestas de células T de larga duración a estos mHA (James et al., 2003 Verdijk et al., 2004). De manera similar, el injerto de linfocitos T femeninos en receptores masculinos puede conducir a la expansión de linfocitos T donantes específicos de H-Y (Pierce et al., 1999 Takami et al., 2004 Vogt et al., 2000a). La evidencia de que estos son objetivos de la inmunidad derivada del donante incluye el descubrimiento de una mayor incidencia de EICH en receptores masculinos de injertos de células madre de donantes femeninas (Atkinson et al., 1986 Flowers et al., 1990 Gratwohl et al., 2001 Randolph et al. ., 2004). Se presume que esto se debe a la amplia expresión celular y tisular de las proteínas H-Y y la inmunogenicidad de estos antígenos. Muchos de los HY mHA contienen múltiples aminoácidos dispares en comparación con sus homólogos X y estos epítopos peptídicos se presentan en moléculas de MHC de clase I y de clase II (Spierings et al., 2003b Torikai et al., 2004 Vogt et al., 2002). Es probable que ambos factores contribuyan al alto nivel de inmunogenicidad de estos antígenos. La mHA no codificada por el cromosoma Y incluye la mHA autosómica que se genera sobre la base de polimorfismos de un solo nucleótido que difieren entre el donante y el receptor. Estas diferencias genéticas pueden conducir a la creación de transcripciones alternativas, diferencias en el procesamiento proteasómico (Brickner et al., 2001 Spierings et al., 2003a) y distintas modificaciones postraduccionales (Meadows et al., 1997), así como la simple sustitución de un solo aminoácidos en el péptido antigénico (den Haan y col., 1998 Mommaas y col., 2002 Pierce y col., 2001 Vogt y col., 2000b). Los polimorfismos de deleción de genes descritos recientemente también pueden desempeñar un papel importante en la generación de mHA (Murata et al., 2003).


Las células T y B derivadas del huésped pueden inducirse a reconocer antígenos asociados a tumores, mientras que las células B y T derivadas de donantes pueden reconocer tanto antígenos como aloantígenos asociados a tumores.

En la medida en que los mHA sean expresados ​​por células hematopoyéticas tanto malignas como normales en el receptor, pero no en otros tejidos, el direccionamiento de estos antígenos contribuirá a GvL y a la conversión a hematopoyesis completa del donante, pero no contribuirá a GvHD (Bleakley y Riddell, 2004). Por esta razón, se ha propuesto que la focalización de mHA con expresión hematopoyética restringida es un mecanismo importante para distinguir GvL de GvHD después de HSCT y DLI alogénicos (Hambach y Goulmy, 2005 Mutis y Goulmy, 2002 Riddell et al., 2003).

Otras categorías de dianas de GvL incluyen antígenos específicos de tumores, antígenos tumorales codificados viralmente, autoantígenos sobreexpresados, autoantígenos mutados o modificados y antígenos de cáncer de testículo. Para las neoplasias hematopoyéticas, hay muchos antígenos potencialmente importantes en estas categorías, incluidos los quiméricos BCR-ABL (Bocchia et al., 1995 Cathcart et al., 2004) y proteínas PML / RARa (Bocchia et al., 1995), antígenos latentes del VEB, proteinasa-3 (Molldrem et al., 2000), WT-1 (Azuma et al., 2000). al., 2002), survivina (Reker et al., 2004), ML-IAP (Schmollinger et al., 2003) y antígenos de cáncer de testículo como SLLP1 (Wang et al., 2004). En estos casos, la inmunogenicidad de estos objetivos no depende de la disparidad genética entre el receptor y el donante. Dado que no son dianas de alo-reactividad, representan posibles dianas de los efectores inmunitarios del huésped (Symons et al., 2008). Sin embargo, los receptores con leucemia pueden haberse vuelto tolerantes a estos antígenos, mientras que los donantes normales pueden no ser tolerantes a los antígenos y seguir siendo capaces de desarrollar respuestas inmunitarias eficaces después del trasplante.

3.2.2. Células B del donante como mediadores de GvL y sus antígenos diana

Varios estudios recientes han sugerido que es probable que las células B también desempeñen un papel importante en GvL. Como parte de la respuesta inmune adaptativa, las células B pueden mejorar la inmunogenicidad de los tumores mediante la secreción de citocinas y quimiocinas, y los complejos inmunes antígeno-anticuerpo facilitan el suministro de antígeno a las células presentadoras de antígeno y, por lo tanto, pueden mejorar la activación de las células T específicas de antígeno. Cuando se dirigen contra moléculas de superficie celular, anticuerpos específicos de antígeno que pueden lisar directamente las células tumorales mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y lisis mediada por complemento.

En cuanto a las células T, los antígenos asociados a tumores y mHA son objetivos potenciales de las células B del donante que pueden contribuir a GvL (y GvHD) después de un TCMH alogénico (Figura 1). Miklos y col. informaron que el DBY de mHA codificado por Y es frecuentemente dirigido por respuestas de anticuerpos después de HSCT femenino → masculino (Miklos et al., 2004). Es de destacar que el 50% de los pacientes masculinos que recibieron injertos de células madre de donantes femeninas desarrollaron inmunidad humoral a la proteína DBY recombinante en comparación con el 5% de los pacientes masculinos con donantes masculinos. Muy pocos de los pacientes desarrollaron anticuerpos contra el homólogo codificado por X, DBX, y las respuestas de anticuerpos se dirigieron principalmente contra áreas de disparidad de aminoácidos entre DBY y DBX. Cuando este análisis se extendió a un panel de 5 proteínas codificadas por HY recombinantes (DBY, UTY, ZFY, RPS4Y y EIF1AY) y sus homólogos del cromosoma X, el 89% de los pacientes con al menos un anticuerpo HY desarrollaron EICH crónica en comparación con solo el 31%. de pacientes sin anticuerpos contra este panel (p & lt .0001). Además, el 48% de los pacientes sin anticuerpos H-Y recayeron en comparación con el 0% de los pacientes con anticuerpos H-Y (p & lt .0001) (Miklos et al., 2005). Los estudios clínicos en nuestro centro y otros han sugerido recientemente que rituximab, una terapia dirigida a células B, puede mejorar algunas de las manifestaciones clínicas de la EICH crónica y se han iniciado ensayos más grandes que evalúan este enfoque (Ratanatharathorn et al., 2003) (Cutler et al., 2003). ., 2006). Sin embargo, la inhibición de las respuestas de las células B también puede reducir la actividad de GvL y esto debe vigilarse de cerca en estos pacientes.

También se han identificado respuestas de anticuerpos contra antígenos asociados a tumores en asociación con la actividad de GvL después de un TCMH alogénico (Bellucci et al., 2004 Hishizawa et al., 2005 Wu et al., 2000). En una serie de estudios previos, nos motivó a descubrir los antígenos diana de la respuesta inmune de células B asociada a DLI, basándonos en el hallazgo inesperado de linfocitosis de células B periféricas claras e infiltración de médula de células plasmáticas que se desarrollaba en el momento de la respuesta clínica (que no fue complicada por GvHD concurrente) (Bellucci et al., 2002) en una serie de pacientes inscritos en ensayos de DLI en DFCI (Alyea et al., 1998 Bellucci et al., 2002). Estos estudios han llevado a la detección de la presencia de una potente inmunidad humoral, a niveles comparables a las respuestas antivirales, que se correlacionó temporalmente con la regresión clínica del tumor en una serie de pacientes con LMC (Wu et al., 2000). Primero detectamos la presencia de inmunidad humoral antitumoral en asociación con DLI cuando inmunotransferenciamos lisados ​​generados a partir de una línea celular de CML, células K562 contra sueros derivados de un paciente tratado con DLI, y visualizamos nuevas bandas detectadas por DLI post pero no pre -Sueros DLI, que significan la detección de nuevas respuestas de anticuerpos a los antígenos diana de la CML después de DLI. Posteriormente, mediante la clonación de expresión basada en anticuerpos, en la que el plasma de los respondedores a la terapia DLI se utilizó como fuente de anticuerpo para seleccionar una biblioteca de expresión de cDNA de CML que generamos a partir de muestras de pacientes, una serie de antígenos diana candidatos contra los cuales se post-DLI pero no Se identificaron sueros pre-DLI o pre-BMT que eran reactivos (Sahin et al., 1997 Wu et al., 2000). Estos codifican una variedad de genes nuevos y conocidos involucrados en diversas funciones celulares, incluida la transcripción de genes, el ciclo celular y la señalización celular. Se encontró que un subconjunto de antígenos se expresaba en gran medida en una amplia gama de tumores, pero solo en una estrecha gama de tejidos normales. Dos de los nuevos antígenos asociados a CML en este grupo, CML66 y CML28, se han caracterizado en profundidad (Yang et al., 2002 Yang et al., 2001). Las respuestas de anticuerpos a estos dos objetivos no estaban presentes antes del trasplante o antes de DLI. Los anticuerpos de alto título se desarrollaron 2-3 meses después de DLI coincidiendo con el logro de la remisión citogenética y molecular de la CML. A diferencia de los genes H-Y, ninguno de estos genes parece codificar polimorfismos que distinguen los alelos expresados ​​en el donante y el receptor del trasplante. Además, los anticuerpos contra CML66 y CML28 no estaban presentes en pacientes con EICH crónica, pacientes con CML que se sometieron a TCMH alogénico con depleción de células T o donantes normales. Sorprendentemente, los anticuerpos contra estos 2 antígenos también estaban presentes en pacientes con LMC que habían respondido al tratamiento con interferón-α, pero no en pacientes tratados con hidroxiurea o imatinib. Estos estudios sugieren que la inmunogenicidad de ambas proteínas se deriva de su alto nivel de expresión en las células leucémicas y no porque representen nuevos aloantígenos.

Se ha identificado que algunas dianas de la inmunidad humoral inducida por el tratamiento inmunológico son antígenos expresados ​​en la superficie. Por ejemplo, Bellucci et al. identificó BCMA, un miembro de la superfamilia de receptores de TNF que se expresa selectivamente en la superficie de células B maduras y células de mieloma, como una diana asociada a DLI en pacientes con mieloma (Bellucci et al., 2005). Anticuerpos que se desarrollaron en vivo después de DLI se encontró que era reactivo con el dominio de superficie celular de BCMA. Cuando se ensayaron en ensayos funcionales, estos anticuerpos IgG en el suero del paciente fueron capaces de mediar la lisis inducida por el complemento y la ADCC de células que expresan BCMA transfectadas de manera estable o células de mieloma que expresan BCMA primarias. Estos anticuerpos se detectaron en 2 de 9 respondedores DLI y persistieron durante largos períodos después de DLI. Otros estudios recientes han demostrado que los anticuerpos contra antígenos expresados ​​en la superficie pueden generar efectos receptores-ligandos específicos que mejoran la citotoxicidad tumoral (Jinushi et al., 2006) (Jinushi et al., 2008). Por otro lado, la gran mayoría de los antígenos identificados por cribado serológico son proteínas intracelulares. Si bien estos pueden representar simplemente el desarrollo de una respuesta inmune al contenido extruido de las células tumorales lisadas, los anticuerpos contra los antígenos intracelulares pueden facilitar la presentación cruzada de los antígenos diana a través de una vía mediada por FcγR en las células dendríticas, y pueden resultar en la estimulación de CD8 + Respuestas de las células T a los epítopos de péptidos dentro de la proteína diana (Amigorena, 2002 Dhodapkar et al., 2002 Kita et al., 2002) (Valmori et al., 2007) En conjunto, estas observaciones sugieren que las respuestas de las células B a la leucemia probablemente contribuir a la actividad de GvL en vivo a través de una variedad de mecanismos.

3.2.3. Células asesinas naturales (NK) del donante como mediadoras de GvL

Las células asesinas naturales (NK) son las primeras células de linaje linfoide en reconstituirse después del trasplante alogénico, y la recuperación adecuada del número de células NK en el período postrasplante temprano se ha asociado con un mejor resultado sin recaídas (Jiang et al., 1997) . El compromiso de los receptores de células NK da como resultado la estimulación o inhibición de la función efectora de las células NK, dependiendo de la señalización intracelular mediada a través de la cola citoplasmática o las moléculas adaptadoras asociadas con cada receptor (Chiesa et al., 2005 Moretta y Moretta, 2004). Aunque la respuesta de las células NK a una diana depende del efecto neto de los receptores activadores e inhibidores, está predominantemente regulada negativamente por KIR, o receptores inhibidores específicos del asesino (KIR) de clase I del MHC o receptores. La expresión adecuada de ligandos inhibidores apropiados del receptor NK protege a las células "propias" sanas contra la lisis de las células NK. Sin embargo, en ausencia de esta vía inhibidora, los objetivos se vuelven susceptibles a la lisis mediada por NK. En el contexto del TCMH alogénico, los resultados de la actividad NK dependen de la direccionalidad de la lisis (Hsu y Dupont, 2005 Ruggeri et al., 2005a). Cuando las células NK son derivadas del donante y las células receptoras carecen de expresión del ligando KIR afín, la lisis de células NK del donante de las células diana receptoras puede resultar en GvL y / o GvHD, dependiendo del origen tisular de la diana NK. Sin embargo, si la célula diana es de origen donante y la célula efectora NK es de origen receptor, la lisis de células NK puede resultar en el rechazo del injerto. Estudios recientes han demostrado que la capacidad efectora de las células NK está influenciada por la clase y cantidad de receptores inhibidores para los ligandos auto-HLA-B y HLA-C. (Pfeiffer et al., 2007 Yu et al., 2007) Se ha estimado que se puede esperar que la alorreactividad de las células NK ocurra en aproximadamente el 50% de los trasplantes de donantes no emparentados con uno o más desajustes de niveles de alelos HLA.

Los estudios realizados hace dos décadas demostraron la presencia de actividad de las células NK líticas contra las células leucémicas derivadas del huésped después de un TCMH (Hauch et al., 1990 Hercend et al., 1986). Estudios convincentes realizados más recientemente por Ruggeri et al. han examinado el papel de la actividad de las células NK en pacientes que recibieron trasplantes de células madre empobrecidas en células T de donantes no compatibles con HLA (Ruggeri et al., 1999 Ruggeri et al., 2002 Ruggeri et al., 2005b). En este contexto, los KIR en las células NK del donante están potencialmente mal emparejados con sus ligandos HLA inhibidores y son capaces de reconocer y matar las células leucémicas receptoras. Además, la alorreactividad de NK se predijo sobre la base de la tipificación de HLA-B y HLA-C, y los pares de donante-receptor se dividieron en dos grupos: aquellos con incompatibilidad del ligando KIR en la dirección del donante frente al huésped, y los que no. En un ensayo clínico que incluyó a 112 pacientes con leucemia aguda de alto riesgo, la alorreactividad prevista de NK estuvo altamente correlacionada con el resultado del trasplante en pacientes con AML. En particular, la supervivencia libre de eventos para los pacientes con AML en el grupo incompatible con el ligando KIR fue del 60%, en comparación con solo el 5% en el grupo compatible. Además, el cribado de clones NK derivados del donante para la lisis frente a las células receptoras confirmó que la incompatibilidad del ligando KIR se correlacionaba estrechamente con la detección de clones NK del donante que mataban a las dianas receptoras. Estos y otros estudios han demostrado que la incompatibilidad del ligando KIR en la dirección del donante frente al del huésped pareció proteger a los pacientes con AML contra el rechazo del injerto, la EICH y la recaída de la leucemia (Hsu et al., 2005 Savani et al., 2007). Se ha demostrado la viabilidad y seguridad de la transferencia adoptiva de células NK expandidas para el tratamiento de la leucemia recidivante, y los esfuerzos en curso están diseñados para evaluar la eficacia de este enfoque (Miller et al., 2005).

3.3. Evidencia de que las células progenitoras malignas son el objetivo de GvL

El potencial curativo del trasplante de células madre y DLI implica que las células progenitoras malignas se incluyen dentro del alcance de las células receptoras dirigidas por GvL. En esta sección, resumimos la evidencia de los estudios de monitoreo molecular de la respuesta de la enfermedad a la terapia y de la caracterización de los antígenos diana de las respuestas de las células T y B después del TCMH que respaldan este concepto. En la Figura 2 se muestran ejemplos representativos de estos estudios.


(A) La GvL eficaz se asocia con una enfermedad molecularmente indetectable. Resultados del seguimiento molecular de BCR-ABL transcripción (relativa a la transcripción de GUS de control) de 50 pacientes tratados en BWH / DFCI con enfermedad no tratada, después de la terapia con imatinib, después de un TCMH alogénico y de pacientes sin LMC. (B) La GvL eficaz está asociada a respuestas de células T que reconocen a los progenitores leucémicos (adaptado de Smit et al. 1998). El ensayo pCILp mide la frecuencia de precursores de células T en sangre periférica que son capaces de suprimir el crecimiento de células progenitoras de CML CD34 +. (C) La GvL eficaz está asociada con las respuestas de las células B contra los antígenos expresados ​​en los progenitores leucémicos. La respuesta clínica a DLI en un paciente con CML se asocia con respuestas de anticuerpos de alto título contra CML66 y CML28. La línea discontinua representa 250D por encima de la media de 10 normales. (D) CML66 se expresa en gran medida en las células progenitoras mieloides según la tinción inmunohistoquímica de la médula ósea de pacientes con compuesto de AML a médula ósea normal. (MI) CML28 y CML66 se expresan en gran medida en las células progenitoras del mieloide según los estudios de cuantificación de las transcripciones de ARN. Se midió el número relativo de copias de los transcritos de CML66 y CML28 en el ARN total derivado de células hematopoyéticas normales y malignas diferenciadas e indiferenciadas, medido mediante RT-PCR específica de genes. CML-SP = fase estable CML CML-BC = crisis blástica CML AML = leucemia mieloide aguda.

3.3.1. El GvL efectivo se asocia con una enfermedad molecularmente indetectable

La presencia de la translocación específica de la enfermedad. BCR-ABL ha facilitado el desarrollo de ensayos moleculares sensibles para detectar la expresión de la transcripción de este producto génico de fusión como una medida de la carga de morbilidad. El logro de un estado molecularmente indetectable consistente con respuestas curativas y eliminación de poblaciones malignas autorrenovables se ha demostrado de manera consistente en pacientes con LMC después del tratamiento con TCMH. La Figura 2A representa los resultados de la monitorización molecular de un grupo de 50 pacientes tratados en el Dana-Farber Cancer Institute / Brigham and Women's Hospital, Boston (datos no publicados). Nuestro laboratorio utiliza el GUS (β-glucuronidasa) como transcripción de control, que ha sido previamente validada (Muller et al., 2008). Como se muestra en esta figura, los pacientes con LMC no tratados expresan un%BCR-ABL / GUS relación entre el 10% y el 100% (nuestra línea de base de referencia estándar), mientras que los pacientes sin el BCR-ABL transcripción (es decir, pacientes sin LMC, como pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL)) tienen niveles de transcripción indetectables (%BCR-ABL / GUS = & lt0,001–0,0001%). De acuerdo con los resultados informados por otros investigadores, las muestras recibidas de pacientes tratados con imatinib durante & gt 1 año, BCR-ABL los niveles de transcripción disminuyeron de forma variable en un rango de 5 log, y muchos lograron una reducción de la transcripción de & lt 2 log desde la línea de base de referencia estándar después de la monoterapia con imatinib. Por el contrario, nuestro ensayo mide cantidades de enfermedad de bajas a indetectables en pacientes que han logrado la remisión inducida por inmunoterapia (BMT o DLI). Además, estos pacientes permanecen molecularmente indetectables durante años.

El alotrasplante exitoso para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica y el mieloma múltiple también ha tenido como resultado remisiones de enfermedades molecularmente indetectables (Corradini et al., 2003) (Esteve et al., 2001). La durabilidad de las respuestas clínicas después de DLI parece estar relacionada con el logro de la remisión molecular, lo que sugiere que la eficacia de DLI resulta de manera similar de la eliminación inmunológica del clon de células madre malignas (Dazzi et al., 2000).

3.3.2. Las respuestas de las células T asociadas a GvL reconocen a los progenitores leucémicos

Pichert y col. examinó las contribuciones relativas del régimen preparativo del trasplante y los mecanismos inmunológicos posteriores al trasplante sobre la eliminación de las células leucémicas en el receptor (Pichert et al., 1995). Los trasplantes se realizaron utilizando productos de médula ósea no manipulados o empobrecidos en células T. De 92 pacientes tratados con trasplante mieloablativo de TCD para CML, que demostraron supresión de la enfermedad sin EICH clínicamente aparente, los estudios de laboratorio indicaron que el BCR-ABL las células positivas detectadas en estos individuos representaban células progenitoras tempranas derivadas del clon de CML (Pichert et al., 1994). Por lo tanto, la persistencia de estas células de CML en la gran mayoría de los pacientes que recibieron terapia mieloablativa sugirió que los regímenes de acondicionamiento de dosis altas, por sí mismos, no eliminaban eficazmente las células leucémicas. Por el contrario, los mecanismos inmunológicos mediados por las células T del donante parecían ser más importantes para suprimir las células leucémicas después del trasplante y prevenir la recaída de la leucemia.

Otros investigadores han examinado las especificidades antigénicas de las líneas de células T en masa y los clones de células T expandidos a partir de pacientes con respuestas clínicas de GvL, y han demostrado que se dirigen a la población de células CD34 +. Como se muestra en la Figura 2B, Smit et al. detectaron porcentajes elevados de CTL que eran inhibidores de células CML CD34 + en pacientes que demostraron GvL clínicamente evidente después de la terapia DLI (Smit et al., 1998). Falkenburg y col. clones CTL aislados dirigidos contra mHA que son capaces de lisis específica de antígeno de células leucémicas recién obtenidas e inhibición de células precursoras leucémicas in vitro (Falkenburg et al., 1999). Bonnet y col. demostraron que los clones de CTL humanos específicos para mHA pueden dirigirse preferentemente a las células madre de leucemia y que los clones de células T con este tipo de especificidad podrían eliminar eficazmente las células de leucemia trasplantadas en ratones NOD / SCID (Bonnet et al., 1999). Rezvani y col. han detectado una asociación entre los efectos de GvL postrasplante y la detección de células T CD8 + citotóxicas contra WT-1, que está altamente expresada en células progenitoras hematopoyéticas malignas (Rezvani et al., 2007).

3.3.3. Las respuestas de las células B asociadas a GvL se dirigen a las células progenitoras hematopoyéticas

Como se muestra en la Figura 2C-E, CML66 y CML28, las dianas de células B asociadas con las respuestas de GvL después de DLI, se han encontrado altamente expresadas en células progenitoras mieloides pero no en células mieloides más maduras (Wu et al., 2005). Proponemos que la combinación de inmunodetección serológica con estudios de expresión génica puede identificar eficazmente antígenos prometedores para la selección inmunológica de células madre. Recientemente, con el descubrimiento de antígenos basado en serología expandido de dianas de GvL, hemos descubierto que la gran mayoría de antígenos asociados a DLI se expresan en células CD34 +. Probamos dos plataformas inmunoproteómicas complementarias, una biblioteca de expresión de bacteriófagos y una micromatriz de proteínas de alta densidad, utilizando inmunoglobulina plasmática posterior a la terapia de siete pacientes con LMC que demostraron una GvL clínicamente aparente sin enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) después de DLI. En total, 62 antígenos provocaron una mayor reactividad en el plasma post-DLI en comparación con el plasma pre-DLI. El análisis de la expresión génica en células mieloides normales y malignas usando microarrays HG-FOCUS y HG-U133A Affymetrix confirmó que & gt70% de los antígenos tienen expresión génica detectable en células CML CD34 +. Se expresaron cuatro antígenos (RAB38, TBCE, DUSP12 y VPS4B) a niveles más altos en CML en comparación con las células CD34 + normales (p & lt 0,002). Como colección, los antígenos identificados representan inmunógenos o reactivos potenciales para el seguimiento de estrategias inmunoterapéuticas diseñadas para eliminar las células madre de la leucemia mieloide (Biernacki et al., 2007).

De manera análoga, Spisek et al. describió recientemente la detección de respuestas de anticuerpos en pacientes con el trastorno precursor del mieloma, gammapatía monoclonal de significado desconocido (MGUS), pero no con mieloma contra SOX2, un gen necesario para la autorrenovación en las células madre embrionarias. Se descubrió que Sox2 se expresa en gran medida en las células progenitoras que marcan el compartimento clonogénico de la GMSI y provoca una inmunidad celular frecuente en pacientes con GMSI. Es de destacar que los CTL generados contra este antígeno inhibieron el crecimiento clonogénico de MGUS. in vitro. Además, la detección de CTL específicos de antígeno en pacientes con GMSI se asoció con una progresión disminuida a enfermedad maligna y un mejor resultado clínico (Spisek et al., 2007).

4. Estrategias para la focalización inmunológica de la población de células madre

Las secciones anteriores de esta revisión han resumido una gran cantidad de datos que demuestran la potencia del sistema inmunológico del donante para la eliminación y el control a largo plazo de las células malignas. Como se muestra esquemáticamente en las Figuras 3A y 3B, mientras que los regímenes preparativos de trasplante mieloablativo por sí mismos pueden reducir la carga de enfermedad, los estudios descritos en las secciones anteriores demuestran que las respuestas inmunes generadas a partir de células inmunes injertadas derivadas de donantes son fundamentales para la eliminación final de la enfermedad residual. que lleva a la curación. Aunque el HSCT y DLI continúan estando asociados con una toxicidad significativa y el control de la enfermedad no se logra en todos los pacientes, el trasplante alogénico representa un excelente ejemplo de los resultados clínicos que se pueden lograr mediante una terapia basada en mecanismos inmunológicos.


Muchos aspectos de GvL después de un TCMH alogénico no se comprenden bien. Sin embargo, el progreso constante en la caracterización de las dianas GvL de las respuestas de las células T y B ha revelado que las respuestas inmunitarias clínicamente eficaces parecen ser policlonales, están dirigidas a una amplia variedad de antígenos asociados tanto a alo como a tumores, incluidos aquellos con expresión en células progenitoras, y con frecuencia implican una inmunidad celular, humoral e innata coordinada. Además, las respuestas clínicas se generan más fácilmente en el contexto de una carga de enfermedad baja y de células tumorales de proliferación lenta, especialmente cuando se utilizan quimioterapia y radioterapia menos intensivas para preparar a los pacientes para el TCMH alogénico. Como se muestra en la Figura 3C, los efectos de GvL pueden potenciarse potencialmente incorporando la vacunación activa del receptor después del injerto de células del donante para inducir o mejorar las respuestas a mHA o antígenos asociados a tumores. Los sistemas modelo han sugerido que este enfoque es factible y potencialmente efectivo (Anderson et al., 2000 Durakovic et al., 2007 Luznik et al., 2003 Teshima et al., 2002) pero la selección de métodos de vacunación, así como el momento y La dosificación de las vacunas debe tener en cuenta la capacidad del sistema inmunológico del donante en reconstitución para responder al desafío antigénico y una variedad de factores del paciente.

O, como se sugiere en la Figura 3D, ¿se pueden aplicar los principios de la respuesta de injerto contra leucemia al desarrollo de una inmunoterapia específica de tumor eficaz en el entorno autólogo? Más específicamente, ¿pueden las respuestas inmunitarias humorales y celulares polivalentes dirigirse contra la población de células madre o progenitoras malignas? De manera óptima, esto requeriría el logro de un estado de enfermedad residual mínima y evitaría las células no malignas y, por lo tanto, minimizaría el riesgo de autoinmunidad. Como se discutió en esta sección, el direccionamiento inmune racional de la población que inicia el tumor depende fundamentalmente de (1) identificar los marcadores de superficie únicos de estas células para que puedan aislarse, y de (2) definir los antígenos que se expresan única o preferencialmente dentro de las células malignas con funciones similares a las de las células madre en comparación con las células normales. Sin embargo, lograr este objetivo es complicado debido a que el hecho de que el inmunofenotipo exacto de las células iniciadoras de muchos tipos de tumores (especialmente los tumores sólidos) es actualmente muy controvertido (LaBarge y Bissell, 2008). La aclaración de la identidad de la célula que inicia el tumor tiene importantes implicaciones sobre el alcance y la viabilidad de utilizar respuestas inmunitarias para atacar terapéuticamente el cáncer: p. Ej. si se requiere el direccionamiento contra toda la población de células tumorales, o solo una o una colección de subpoblaciones de células distintas. Se discuten las estrategias para la focalización inmune.

4.1. Definición de la célula iniciadora del tumor

Lograr el objetivo de apuntar inmunológicamente a la "célula madre cancerosa" requiere el conocimiento del inmunofenotipo preciso de esta población celular, de modo que se puedan identificar los antígenos exclusivos de esta población celular. Si bien esta noción es conceptualmente sencilla, y si bien existe un acuerdo general en que los tumores surgen inevitablemente de una población celular que puede autopropagarse y renovarse, los orígenes exactos de esta célula son objeto de un gran debate. Como se muestra en la Figura 4, se han propuesto al menos dos modelos diferentes para la propagación de tumores, basados ​​en evidencia experimental (Adams y Strasser, 2008 Shipitsin y Polyak, 2008). Por un lado, el “modelo jerárquico” o “hipótesis de las células madre cancerosas” se basa en el concepto de que solo una población celular rara es responsable de las propiedades de autorrenovación y autopropagación del cáncer (ver Figura 4A). Estas poblaciones de células especializadas se identificaron originalmente en la leucemia mieloide como células con fenotipo progenitor hematopoyético primitivo (CD34 + CD38-) que, cuando se inyectan en ratones inmunodeficientes, podrían injertarse y regenerar la misma leucemia humana. Además, se estableció que la leucemia resultante podría trasplantarse en serie a receptores secundarios, mientras que la inyección de células leucémicas más diferenciadas no podría (Bonnet y Dick, 1997 Lapidot et al., 1994). Utilizando este mismo enfoque metodológico, se han definido poblaciones de células con estas características para varios tumores sólidos. Por ejemplo, Al-Hajj et al. informó que las fracciones CD24 - / baja / CD44 + de derrames pleurales metastásicos y un tumor de mama invasivo primario tenían un mayor potencial tumorigénico cuando se inyectaban en la almohadilla de grasa mamaria de ratones hembra NOD / SCID que las fracciones de células CD24 + / CD44 +/− (Al- Hajj et al., 2003). En apoyo del modelo de células madre cancerosas en el cáncer de mama, Liu et al. identificó una firma genética distinta asociada con poblaciones de células CD24 - / baja / CD44 + tumorigénicas en comparación con el epitelio mamario normal y observó la correlación entre esta firma genética "invasiva" con una supervivencia general y sin metástasis a distancias más cortas. Estos estudios sugieren que la presencia y frecuencia de esta población celular tiene relevancia pronóstica (Liu et al., 2007). Otros investigadores han utilizado los marcadores de células madre CD133 o CD44 para purificar las supuestas células madre cancerosas en varios tipos de tumores (Collins et al., 2005 Li et al., 2007 Zhang et al., 2008). Es de destacar que el tratamiento de ratones trasplantados con células AML humanas con anticuerpo anti-CD44 activador redujo notablemente la repoblación leucémica, presumiblemente debido a la interferencia con las capacidades de injerto y repoblación de células madre AML (Jin et al., 2006).


(adaptado de Adams y Strasser 2008 con autorización).

Alternativamente, los defensores del modelo "estocástico" o "evolución clonal" proponen que no es una población rara, pero la mayoría de las células tumorales son capaces de autorrenovarse y pueden contribuir sustancialmente al mantenimiento del tumor. Como se muestra en la Figura 4B, sugieren que la adquisición de cambios genéticos, mutaciones o ciertas respuestas a señales ambientales puede resultar en células que adquieren programas y funciones similares a los de un tallo (Kelly et al., 2007). En primer lugar, cuestionan si el xenotrasplante exitoso, la piedra angular del modelo anterior, refleja con precisión en vivo biología de células madre humanas, o simplemente define una población de células cancerosas humanas que se adapta al microambiente del ratón. Por lo tanto, argumentan que el uso de esta metodología para definir "madre-ness" subestima el número de células iniciadoras de tumores. Varias líneas de argumentación apoyan esta hipótesis alternativa. Primero, Kelly et al. ha demostrado que en ausencia de las barreras del xenotrasplante, como en los modelos de linfoma murino y un modelo de ratón con LMA knockout PU.1, tanto las células con o sin fenotipo similar a las células madre pueden causar tumores en ratones receptores (Kelly et al., 2007). En segundo lugar, algunos investigadores han señalado que los marcadores celulares utilizados para definir las supuestas células madre, como CD133 +, pueden representar hasta el 20% del tumor. Del mismo modo, Shipitsin et al. encontraron que la población putativa de células madre de cáncer de mama, basada en el fenotipo de CD24 - / low / CD44 +, era bastante grande: 12-60% de las células tumorales (Shipitsin et al., 2007). Por tanto, estos y otros estudios sugieren que en los tumores poco diferenciados, las células con funciones de células madre pueden constituir la mayoría de las células tumorales. Finalmente, persiste la confusión con respecto a los marcadores exactos de la superficie celular que definen la población de células madre. Beier y col. demostraron que, dependiendo del tumor analizado, las células madre del cáncer de glioblastoma pueden ser CD133 + o CD133−, lo que sugiere que los marcadores de las células madre cancerosas no están bien establecidos, o que todas las células tumorales son tumorigénicas, pero en un grado variable (Beier et al. ., 2007). Recientemente se ha informado de una confusión similar de marcadores en el campo del cáncer de colon (LaBarge y Bissell, 2008).

En un intento por reconciliar estos dos modelos, Adams et al. sugieren que el comportamiento de los cánceres individuales puede seguir uno u otro modelo más de cerca (Adams y Strasser, 2008). Por lo tanto, el crecimiento de los cánceres hematopoyéticos, cuyas vías de diferenciación celular han sido bien caracterizadas, puede mostrar con mayor frecuencia un patrón jerárquico, mientras que el de los tumores sólidos, enfermedades típicamente heterogéneas y más dependientes de la infraestructura de apoyo de las células endoteliales y los fibroblastos que se forman. vasos sanguíneos intratumorales, y que proporcionan factores paracrinos (que estarían ausentes en un ratón inmunodeficiente), pueden ser más consistentes con un patrón estocástico. Otro modelo más, que también se muestra en la Figura 4C, fusiona los dos modelos y propone que puede existir una célula madre cancerosa originaria, pero que la adquisición de cambios genéticos por una célula cancerosa secundaria podría convertirla en una célula madre, lo que la convierte en la predominante. clon (Adams y Strasser, 2008).

4.2. Direccionamiento inmunológico de células iniciadoras de tumores

Las implicaciones de los diferentes modelos de células madre cancerosas, discutidos anteriormente, es que mientras que el modelo jerárquico sugiere que dirigirse a la población de células madre pequeñas es suficiente para la eficacia terapéutica, el otro requiere que todas las células tumorales estén dirigidas. Esto se debe a que el último modelo sugiere que cualquier célula tumoral puede adquirir las funciones de las células madre. Por lo tanto, centrarse en un pequeño subconjunto fenotípicamente definido dará como resultado el escape del tumor. Por lo tanto, incluso en la LMC, que puede considerarse el cáncer de células madre prototípico, se han identificado múltiples vías por las cuales las células malignas pueden adquirir características de células madre (Passegue et al., 2003). Como se muestra esquemáticamente en la Figura 5, estos incluyen cambios genéticos que se adquieren en la célula más temprana del programa de diferenciación, que pueden conducir a una mayor supervivencia y proliferación celular. Alternativamente, los cambios genéticos adquiridos aguas abajo de la célula madre, como la célula progenitora, pueden conducir a una mayor capacidad de autorrenovación. Por lo tanto, el desarrollo de inmunidad contra solo antígenos diana específicos de las HSC perderá la eliminación de las células progenitoras que se renuevan por sí mismas.


En el ejemplo de la LMC, el aumento de la capacidad de autorrenovación maligna puede surgir de la transformación de las células madre hematopoyéticas (HSC) para dar lugar a LMC en fase crónica o de células progenitoras más diferenciadas, para dar lugar a LMC de crisis blástica. La actividad de las células madre leucémicas puede resultar de una diferenciación alterada, una mayor supervivencia celular, una mayor proliferación, una mayor inestabilidad genómica y / o una mayor capacidad de autorrenovación. Se proporcionan ejemplos de estrategias de vacunación.

Dadas las incertidumbres sobre qué células apuntar y qué inmunógenos precisos resultan en la eliminación del tumor, el enfoque adoptado por varios grupos ha sido utilizar células tumorales completas para la vacunación (ver Figura 5). Este enfoque no se dirige únicamente a las células madre malignas o las células progenitoras, pero estas poblaciones de células se incluyen dentro de la gama de células vulnerables a los efectos de la inmunización. Este enfoque "más amplio" tiene la ventaja de inmunizar con antígenos específicos del tumor del paciente, incluidos los antígenos mutados y expresados ​​/ presentados diferencialmente. Esto se ha logrado mediante inmunización con células tumorales autólogas irradiadas transducidas por genes de citocinas (Soiffer et al., 1998 Zhou et al., 2005), lisados ​​tumorales (Jocham et al., 2004), proteínas de choque térmico unidas a péptidos derivados de células autólogas. tumores (Srivastava, 2006), o híbridos de fusión entre tumores autólogos y células dendríticas o ARN derivado de tumores amplificado (Su et al., 2003). Por ejemplo, en DFCI, la vacunación con células de melanoma autólogas irradiadas diseñadas para secretar el poderoso adyuvante de citocinas GM-CSF, mediante transferencia de genes mediada por adenovirus, probablemente se dirija a algunas células que inician el melanoma, ya que el 29% de los pacientes con melanoma metastásico sobreviven como mínimo. seguimiento de 36 meses (Soiffer et al., 2003).

La limitación obvia de las vacunas autólogas de tumores completos es que, si bien su uso asegura que los inmunógenos estén personalizados, por definición también están compuestas por miles de autoantígenos normales que están presentes en muchos tejidos. Por tanto, a medida que aumenta la potencia de las vacunas de tumores completos para inducir la inmunidad, se anticipa que una fuerte inmunidad antitumoral se asociará con una autoinmunidad concurrente y potencialmente mortal. Esto puede considerarse análogo a la inducción de EICH en el contexto del trasplante.Los primeros signos de esta posibilidad se han observado en los estudios de un nuevo agente, el anticuerpo bloqueante CTLA4-Ig, que puede inducir una autoinmunidad significativa cuando se administra conjuntamente con antígenos tumorales (Attia et al., 2005 Beck et al., 2006 Maker et al., 2006). al., 2006 Phan et al., 2003 Ribas et al., 2005 Sanderson et al., 2005). Por otro lado, las modificaciones recientes del programa de dosificación de CTLA4-Ig han dado lugar a niveles de inflamación más aceptables (Hodi et al., 2008 Hodi et al., 2003). En particular, la dosificación secuencial de manera que la vacunación sea seguida por el bloqueo de CTLA4 ha dado como resultado la disociación clínica de la inmunidad y autoinmunidad tumoral, aunque todavía se observan violaciones de la tolerancia, como lo demuestra la aparición frecuente de erupciones cutáneas transitorias, linfoadenopatía hiliar bilateral asintomática y baja frecuencia. colitis de grado. Por tanto, sigue existiendo un riesgo significativo de autoinmunidad al inmunizar a pacientes con grandes cantidades de antígenos ampliamente expresados, especialmente a medida que los métodos para estimular la inmunidad se vuelven más eficaces.

Dados estos riesgos, un enfoque alternativo es generar vacunas que se dirijan de manera más selectiva a las células que inician el cáncer. Como ejemplo de este enfoque, Pellegatta et al. utilizaron células dendríticas cargadas con neuroesferas, que están enriquecidas en células madre de glioma, para vacunar ratones con tumores compuestos por células de glioma GL261. La vacunación con estas CD cargadas resultó en la cura del 80% de los ratones con estos tumores, lo que sugiere que esta es una estrategia altamente protectora (Pellegatta et al., 2006).

Otros investigadores han intentado desarrollar vacunas de antígenos definidos, utilizando inmunógenos que se sobreexpresan constantemente en las células progenitoras malignas. Estos inmunógenos pueden administrarse como proteína completa o como péptidos. En general, un enfoque metodológico utilizado con frecuencia para identificar dianas candidatas para inmunoterapia ha sido identificar antígenos que demuestran una expresión preferencial restringida al tumor y luego predecir bioinformáticamente péptidos derivados del antígeno candidato que pueden unirse a alelos HLA comunes. Luego, se evalúa la reactividad de las células T citotóxicas frente a las células presentadoras de antígeno que expresan el péptido predicho. De esta manera, el WT-1 se ha caracterizado bien como un antígeno con expresión casi exclusiva en las células madre o progenitoras CD34 + leucémicas, y se ha probado en ensayos clínicos (Rezvani et al., 2008). Además de la alta expresión en células progenitoras, también se sabe que provoca respuestas de anticuerpos (Elisseeva et al., 2002 Gaiger et al., 2001 Ling et al., 1998). Además, los CTL específicos de WT1 pueden matar específicamente BCR-ABL + células madre transformadas por leucemia sin daño a las células madre hematopoyéticas normales in vitro o en ratones en vivo (Gao et al., 2000 Oka et al., 2000). Recientemente, se realizó un estudio de fase I en el que 26 pacientes con mama, pulmón, MDS o AML fueron vacunados con inyecciones intradérmicas de péptidos WT1 de 9 meros naturales o modificados restringidos por HLA-A24 (Oka et al., 2004). Dieciocho de 26 completaron 3 o más inyecciones, y 12 de 20 mostraron respuestas clínicas como la reducción de células blásticas de leucemia o tamaños y marcadores de tumores, que se correlacionó claramente con un aumento en la frecuencia de CTL específicos de WT1 después de la vacunación. No se observó daño a los tejidos normales. Otros posibles antígenos asociados a la leucemia de esta categoría que están bajo evaluación en ensayos clínicos incluyen los antígenos asociados a la leucemia RHAMM, PRAME, survivina y proteinasa 3 (Greiner y Schmitt, 2008). Este enfoque general de "inmunología inversa" se ha aplicado para identificar antígenos candidatos prometedores asociados a tumores para vacunación también en tumores sólidos (Curigliano et al., 2006 Gnjatic et al., 2006 Purcell et al., 2007).

Una posible tercera clase de antígenos tumorales rara vez se ha utilizado en vacunas debido a las dificultades técnicas para identificarlos (Parmiani et al., 2007 Sensi y Anichini, 2006). Esta clase consta de proteínas con mutaciones específicas de tumores que dan como resultado secuencias de aminoácidos alteradas. Dichas proteínas mutadas tienen el potencial de: (a) marcar de forma única un tumor (en relación con las células no tumorales) para que el sistema inmunitario lo reconozca y destruya (Lennerz et al., 2005) (b) evitar la tolerancia de las células T centrales y, a veces, periféricas , y así ser reconocidos por receptores de células T de alta avidez más eficaces (Gotter et al., 2004). Recientemente, los esfuerzos de secuenciación tradicional a gran escala han demostrado que los tumores contienen una pequeña cantidad de mutaciones conductoras y una gran cantidad de mutaciones pasajeras, y que un tumor promedio puede tener decenas a cientos de mutaciones no sinónimas en regiones codificantes de proteínas (Greenman et al. , 2007 Sjoblom et al., 2006 Thomas et al., 2007). Es más, en silico El análisis de secuencias derivadas de células tumorales y normales en el mismo paciente sugiere que estas mutaciones somáticas proporcionan varios neoantígenos potenciales para el desarrollo de vacunas tumorales, estimados en ~ 10 nuevos epítopos por tumor que pueden unirse a HLA-A * 0201 (Segal et al., 2008 ). Variantes de empalme alternativas de BCR-ABL en pacientes con CML se han identificado que son inmunogénicos (Volpe et al., 2007), y sugieren que también son posibles dianas inmunitarias para esta enfermedad. Se desconoce en qué etapa de la jerarquía de la LMC se adquieren estas variantes. Sin embargo, basado en el análisis de BCR-ABL mutaciones después de la exposición a ABL inhibidores de quinasa (Sección 2), estas variantes tienen una alta probabilidad de ser detectadas en células madre de CML.

Para terminar, muchos de los conceptos descubiertos en los estudios de la LMC son generalmente aplicables a la concepción de estrategias terapéuticas análogas en pacientes con otras neoplasias malignas. La identificación reciente de células malignas que poseen potencial clonogénico sugiere la posibilidad de que dirigirse a subpoblaciones de células específicas pueda contribuir a generar respuestas curativas. La exquisita especificidad de la respuesta inmune adaptativa presenta la oportunidad de apuntar a esta población de células sin daño colateral a otras poblaciones de células no malignas. El progreso reciente en eludir adyuvantes eficaces y en la disección de los mecanismos que controlan la inmunorregulación negativa despierta la posibilidad de desarrollar vacunas eficaces contra el cáncer. En el futuro, podemos esperar estrategias de tratamiento que aprovechen esta información junto con la estimulación antigénica adecuada para apuntar a las células que inician el cáncer para desarrollar terapias curativas con una toxicidad mínima para el cáncer.

1. Agradecimientos

CJW reconoce el apoyo del Programa Claudia Adams Barr en Investigación del Cáncer, el NCI (5R21CA115043-2), el Premio Médico-Científico de Carrera Temprana del Instituto Médico Howard Hughes, la Sociedad de Leucemia y Linfoma, y ​​es un Investigador Clínico Damon-Runyon apoyado (en parte) por la Fundación de Investigación del Cáncer Damon-Runyon (CI-38–07).


CONTRIBUCIONES DE AUTOR

M. Schachner concibió el estudio R. Kleene, G. Loers, D. Lutz, M. Schachner y M.K.E. Schäfer diseñó la investigación D. Appel, L. Congiu, G. Loers y M.K.E. Schäfer analizó los datos D. Appel, L. Congiu, R. Kleene, G. Loers, D. Lutz e I. Hermans-Borgmeyer realizaron la investigación G. Loers, M. Schachner y M.K.E. Schäfer escribió el artículo.

Tenga en cuenta: El editor no es responsable del contenido o la funcionalidad de la información de apoyo proporcionada por los autores. Cualquier consulta (que no sea contenido faltante) debe dirigirse al autor correspondiente del artículo.


4. Anfibios

7 meses después de los cuales la IgX se convierte en el principal isotipo de Ig en las mucosas [101,102]. El tritón ibérico expresa al menos tres isotipos de cadena pesada, IgM, IgY e IgP (para Pleurodeles) [101,103] que posteriormente se ha identificado como el ortólogo IgD [95] como IgM e IgY de anfibios, las cadenas pesadas de IgP tienen 4 dominios constantes y transcripciones tanto para formas unidas a la membrana como secretoras. La expresión de IgP parece estar limitada al bazo del tritón larvario y disminuye significativamente después de la metamorfosis [103]. Hasta ahora, se ha demostrado que la salamandra gigante china expresa IgM, IgD e IgY y se han identificado múltiples isoformas para cada una mediante análisis de transcripción y transferencia de Western [95].

10 veces durante una respuesta humoral en Xenopus, en contraste con el aumento de & gt10.000 veces observado con el mismo antígeno en mamíferos. El análisis de secuencia de las cadenas pesadas de Ig muestra que aunque la tasa de mutaciones somáticas no es muy diferente entre ranas y ratones, las mutaciones en Xenopus tendían a ocurrir preferentemente en pares de bases guanina-citosina (GC) [110] y la relación R / S en el Las CDR fueron muy bajas. En conjunto, esto sugiere que, al igual que los peces óseos, es la selección de mutantes lo que es subóptimo en Xenopus, nuevamente debido a la organización más simple de sus órganos linfoides y la ausencia de centros germinales organizados [107,109,110]. A pesar de esto, se ha observado una respuesta de anticuerpos en Xenopus en respuesta al hongo quítrido Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), el agente causante de la enfermedad letal de la piel, la quitridiomicosis que se ha relacionado con anfibios en todo el mundo. cantidades significativas de IgX específicas de patógenos y, en menor medida, IgM e IgY. Además, la inmunización con patógenos muertos por calor indujo anticuerpos IgM e IgY específicos en el suero [111]. Queda por determinar si estos anticuerpos son protectores.


(ADCC). Mecanismo mediante el cual las células asesinas naturales (NK) se dirigen a las células recubiertas de IgG, lo que da como resultado la lisis de las células recubiertas de anticuerpos. El receptor Fc de baja afinidad para IgG (FcγRIII también conocido como CD16) se expresa en la superficie de las células NK y media en la ADCC.

Talidomida y lenalidomida

La talidomida (α-N-ftalimidoglutarimida) es un derivado del ácido glutámico. Se clasifica farmacológicamente como un fármaco inmunomodulador debido a su capacidad para cambiar la expresión de varias citocinas y coestimular las células efectoras inmunitarias, incluidas las células asesinas naturales. La lenalidomida es un análogo 4-aminoglutaramida de la talidomida con efectos inmunomoduladores mejorados y un perfil de toxicidad favorable en comparación con su compuesto original.

Complejos de ADN inmunoestimuladores

Oligonucleótidos de ADN sintético que contienen motivos CpG no metilados (CpG-ODN) que proporcionan una señal de peligro para el sistema inmunológico al imitar la actividad del ADN bacteriano. El CpG-ODN desencadena respuestas rápidas de las células inmunitarias innatas, incluidas las células dendríticas plasmocitoides y las células asesinas naturales.

Un proceso de maduración funcional de las células NK que implica el reconocimiento de las moléculas del MHC de clase I del huésped por los receptores inhibidores de las células NK. Se ha sugerido que la falta de tal maduración funcional es un mecanismo detrás de la hiporreactividad de las células NK que no expresan receptores inhibidores para hospedar moléculas de clase I del MHC.

Un estado de detención del crecimiento finalmente alcanzado por las células que han sufrido una proliferación repetitiva. in vitro o en vivo, que se caracteriza por células funcionalmente activas que carecen o tienen una capacidad proliferativa reducida. Las células inmunes senescentes son más comunes en personas mayores y en pacientes con enfermedades inflamatorias crónicas.

(TReg células). Una pequeña población de células T CD4 + que expresa el factor de transcripción forkhead box P3 (FOXP3) y tiene actividad reguladora (es decir, supresora) hacia la activación de las células T y de las células asesinas naturales. Una ausencia de T funcionalReg-celdas se asocia con autoinmunidad severa.

Un agente alquilante de ADN que se usa ampliamente como agente antitumoral o agente inmunosupresor. Se ha demostrado que la ciclofosfamida destruye preferentemente ciertos subconjuntos de linfocitos, incluidas las células B y las células reguladoras.

Análogo de purina que actúa como sustrato inhibidor de la ribonucleótido reductasa, ADN polimerasas, ADN ligasa I y ADN primasa. Afecta la síntesis y transcripción del ADN. La fludarabina induce la muerte celular, particularmente en las células leucémicas, y se usa comúnmente en el tratamiento de la leucemia y el linfoma indolentes. La fludarabina también se ha incorporado a regímenes preparativos de intensidad reducida para el trasplante de células madre hematopoyéticas.

(ARNip). ARN bicatenarios cortos de 19 a 23 nucleótidos que inducen la interferencia del ARN, un proceso postranscripcional que conduce al silenciamiento génico de una manera específica de secuencia.

Estos son anticuerpos que se derivan de la recombinación de dominios variables de dos anticuerpos con diferentes especificidades. Se han utilizado anticuerpos biespecíficos para redirigir células inmunes citotóxicas a células tumorales.


Ver el vídeo: Función de anticuerpos y antígenos (Julio 2022).


Comentarios:

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