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Problemas de transferencia de Western blot

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Tengo algunos problemas con la eficiencia de transferencia a las membranas de nitrocelulosa. Para sacar toda la información técnica del camino:

Método de transferencia: Húmedo, transferencia en tanque durante la noche a 30 V con tampón de transferencia de tris-glicina normal + metanol al 20%. Hago esto a temperatura ambiente con agitación. Nota: no he estado equilibrando recientemente mi gel en tampón de transferencia, ya que se informó que esto disminuía la transferencia de proteínas básicas debido a la eliminación de SDS (puedo proporcionar esta referencia si alguien está interesado).

Muestra: En todos los casos, se trata de nucleosomas reconstituidos in vitro con o sin ciertas enzimas; los principales problemas de transferencia son las histonas centrales, que son muy básicas (pI 10-11). No debe haber más de aproximadamente 100 ng de cada histona transferida por carril. La sal en la muestra es <25 mM. Se hierven antes de cargar. No hay un precipitado notable en las muestras antes o después de la ebullición, sin embargo, el volumen es bastante pequeño (20 ul), por lo que no necesariamente detectaría precipitación.

La nitrocelulosa es de 0,2 um y se preequilibra en tampón de transferencia antes de la transferencia.

El gel: yo uso un gel al 15%, de 1,0 a 1,5 mm de espesor. La acrilamida que utilizo es acrilamida: bis 37,5: 1. Aquí pueden surgir algunos problemas: la solución de acrilamida tiene aproximadamente 1 año y se ha almacenado a temperatura ambiente todo ese tiempo (que es lo que se recomienda en la etiqueta). Además, normalmente mantenemos un stock de 10% APS a 4C, por lo que no puedo garantizar que mi APS no haya salido mal.

En general, he tenido mucho cuidado para asegurarme de que no haya burbujas entre los componentes del sándwich y que el papel de filtro / las almohadillas de espuma estén empapadas en el tampón de transferencia.

Ahora al tema. Se adjuntan imágenes de la membrana después de la transferencia (y también después del procesamiento, por lo tanto, el fondo relativamente alto del tampón de bloqueo) así como el gel después de la transferencia. Como puede ver de un carril a otro, parece que tengo diferentes eficiencias de transferencia. Esto ha ocurrido con mis últimas tres manchas. Mi primer pensamiento fue la precipitación de la muestra, pero no había tenido este problema antes a pesar de haber ejecutado esencialmente la misma mancha muchas veces durante el año pasado.

¿Alguna idea? Bastante frustrante, ya que ha aparecido de repente con protocolos / reactivos idénticos a los de antes.


Lo primero que me viene a la mente es que la transferencia parece excesiva ... ¿no es la histona inferior a 20 kDa? A menudo he transferido proteínas de tamaño similar a 4 ° C durante 30 minutos, 30 V.

En general, la presencia de SDS inhibirá la eficiencia de transferencia y el aumento de alcohol en su tampón TG contrarrestará el efecto de SDS presente. ¿Quizás reducir el metanol al 10%? Sin embargo, tendría curiosidad por ver esa referencia con respecto a la SDS / pre-equilibrio. Eso ciertamente va en contra de cómo entiendo que funciona. (Nota: cambio entre equilibrar o no equilibrar mis geles sin diferencias observables).

Si su acrilamida o ACS se hubieran echado a perder, su gel no se endurecería.

Si aún no lo ha hecho, le sugiero que ejecute un Bradford o BCA en sus muestras para asegurarse de que está cargando la misma cantidad en cada pozo. El haber cargado más en cada pozo podría dar la apariencia de una transferencia desigual.

Para ser honesto, realmente no veo a qué te refieres con transferencia desigual, basado en Coomassie y Ponceau. Si observa un efecto de degradado en una gran parte del gel, le sugiero que lo inspeccione visualmente para asegurarse de que los geles que eche tengan un ancho uniforme en toda su extensión. Tener un gel más espeso en un lugar que en otro podría afectar la resistencia (calor) en esa parte del gel y la transferencia de impacto. Si está viendo un cambio en la eficiencia de transferencia carril por carril, sugeriría cambios localizados de pH o temperatura debido a una carga desigual de sales, concentración de proteínas o concentración de lípidos.

¡Espero que esto ayude!


Western blot: técnica, teoría y resolución de problemas

La transferencia Western es una técnica importante utilizada en biología celular y molecular. Mediante el uso de una transferencia Western, los investigadores pueden identificar proteínas específicas a partir de una mezcla compleja de proteínas extraídas de las células. La técnica utiliza tres elementos para lograr esta tarea: (1) separación por tamaño, (2) transferencia a un soporte sólido y (3) marcación de la proteína diana usando un anticuerpo primario y secundario adecuado para visualizar. Este artículo intentará explicar la técnica y la teoría detrás del Western Blot y ofrecerá algunas formas de solucionar problemas.

Palabras clave: Western blot de proteína de investigación biomédica.

Declaracion de conflicto de interes

Conflicto de intereses: Ninguno declarado.

Cifras

Gradilla ensamblada para solidificación de gel

Gradilla ensamblada para solidificación de gel

Agregue la solución de gel con una pipeta de transferencia.

Agregar búfer en ejecución a…

Agregue tampón de funcionamiento al electroforador

Agregue muestras y marcador molecular…

Agregue muestras y marcador molecular al gel, después de quitar los peines.

(a) Muestras que pasan por…

(a) Muestras que atraviesan el gel de apilamiento (voltaje más bajo). (b): Muestras pasando por…


Introducción

La transferencia de Western se utiliza generalmente en análisis para separar y establecer proteínas. En este sistema, una mezcla de proteínas se separa principalmente en función del peso molecular y, por tanto, por tipo, mediante electroforesis en gel. Estos resultados luego se transfieren a una membrana que produce una banda para cada proteína. A continuación, la membrana se incuba con marcadores de anticuerpos específicos de la proteína de interés.

El anticuerpo no unido se elimina dejando únicamente el anticuerpo determinado frente a la proteína de interés. A continuación, se detectan determinados anticuerpos haciendo crecer la película. Como los anticuerpos se unen únicamente a la proteína de la curiosidad, solo se necesita ver una banda. El grosor de la banda corresponde a la cantidad de corriente de proteína, por lo que una corriente normal puede indicar la cantidad de corriente de proteína. El artículo describirá primero el protocolo para Western Blot, acompañado de imágenes para ayudar al lector y la idea a racionalizar el protocolo. Esto se puede adoptar mediante la aclaración teórica del proceso y, en la parte posterior, sugerencias de solución de problemas para problemas generalizados.

Técnica

Lisis celular para extraer proteínas

La proteína se puede extraer de formas totalmente diferentes de muestras, que recuerdan a los tejidos o las células. A continuación se muestra el protocolo para extraer proteínas de células adherentes.

  1. Lave las células dentro del matraz o plato tradicional de tejidos incluyendo solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría y agitando suavemente. Deseche el PBS. (Consejo: mantenga el plato tradicional de pañuelos en hielo durante todo el proceso).
  2. Agregue PBS y use un raspador de células para desalojar las células. Pipetee la combinación en tubos de microcentrífuga.
  3. Centrifugar a 1500 RPM durante cinco minutos y desechar el sobrenadante.
  4. Agregue 180 μl de tampón de lisis celular helado con 20 μl de cóctel inhibidor de proteasa contemporáneo. (Consejo: si el enfoque en proteínas no es lo suficientemente excesivo en el acabado, se sugiere repetir el proceso con una mejor proporción de cóctel de inhibidores de proteasa).
  5. Incubar durante 30 minutos en hielo y luego aclarar el lisado girando durante 10 minutos a 12.000 RPM, a 4 ° C.
  6. Transfiera el sobrenadante (o combinación de proteínas) a un tubo contemporáneo y minorista en hielo o congelado a -20 ° C o -80 ° C.
  7. Mida el foco de la proteína utilizando un espectrofotómetro.

Preparación de la muestra

  1. Decidir la cantidad de extracto de proteína para asegurarse de 50 μg en cada eficacia.
  2. Agregue 5 μL de tampón de patrón al patrón y iguale la cantidad en cada carril utilizando H bidestilado2O (dd H2O). Mezclar eficazmente. (Consejo: normalmente se recomienda una cantidad total de 15 μL por carril).
  3. Calentar las muestras con placa seca durante cinco minutos a 100 ° C.

Preparación de gel

  1. Después de preparar la respuesta de gel de apilamiento al 10%, monte la gradilla para solidificación del gel [Figura 1]. (Consejo: 10% AP y TEMED solidifican la respuesta debido a este hecho, cada gel puede estar listo al mismo tiempo, si los reactivos mencionados anteriormente no se agregan hasta la parte superior).
  2. Agregue la respuesta de gel de apilamiento meticulosamente hasta que la extensión sea la misma que la barra sin experiencia que sostiene las placas de vidrio [Figura 2]. Agregar H2O al más alto. Espere de 15 a 30 minutos hasta que el gel se solidifique. (Sugerencia: el uso de una pipeta de succión podría simplificar el método de inclusión del gel en la placa de vidrio). Abrir en una ventana separada Figura 2 Agregar la respuesta del gel utilizando una pipeta de conmutación
  3. Cubra el gel de apilamiento con el gel separador, después de erradicar el agua. (Sugerencia: es más saludable inclinar el equipo y usar una toalla de papel para quitar el agua).
  4. Inserte el peine, asegurándose de que no haya burbujas de aire.
  5. Espere hasta que el gel se solidifique. (Consejo: la solidificación se puede comprobar simplemente dejando un poco de solución de gel en un tubo).

Electroforesis

  1. Vierta el tampón de trabajo en el electroforador [Figura 3]. Abra en una ventana separada Figura 3 Agregue el tampón de trabajo al electroforizador
  2. Coloque el gel contenido en el electroforador y conecte con una fuente de influencia. (Consejo: cuando te conectes al suministro de habilidades todo el tiempo, une el carmesí con el carmesí y el negro con el negro).
  3. Haga que el tampón positivo cubra completamente el gel y retire el peine con cuidado.
  4. Cargue el marcador (6 μL) adoptado por las muestras (15 μL) en todos los casos [Figura 4]. Abra en una ventana separada Figura 4 Agregue las muestras y el marcador molecular al gel, después de erradicar los panales
  5. Ejecute el gel con bajo voltaje (60 V) para separar el gel, use un voltaje mayor (140 V) para apilar el gel [Figura [Figura5a5a y andbb].Figura 5 (a) Muestras trabajando mediante el gel de apilamiento (disminución de voltaje). (b): Muestras trabajando mediante el gel separador (mayor voltaje)
  6. Ejecute el gel durante aproximadamente una hora, o hasta que la entrada del tinte se escurra por la parte inferior del gel [Figura 6]. Figura 6 Ejecute el gel hacia la parte inferior del electroforizador

Electrotransferencia

  1. Corte 6 hojas de filtro para adaptarse a la medida del gel y una membrana de fluoruro de polivinilideno (PDVF) con las mismas dimensiones.
  2. Humedezca la esponja y el papel de filtro en tampón de cambio y humedezca la membrana de PDVF en metanol.
  3. Separe las placas de vidrio y recupere el gel.
  4. Cree un sándwich de cambio de la siguiente manera: Sponge3 Filter PapersGel PVDF3 Filter Papers (Consejo: asegúrese de que no haya burbujas de aire entre el gel y la membrana de PVDF, y exprima más líquido).
  5. Reubique el sándwich en el equipo de conmutación, que debe colocarse sobre hielo para cuidar los 4 ° C. Agregue el amortiguador de interruptores al equipo y asegúrese de que el sándwich esté cubierto con el amortiguador. Coloque los electrodos en la parte superior del sándwich, asegurándose de que la membrana de PVDF esté entre el gel y un electrodo optimista [Figura 7]. Figura 7 La transferencia debe ejecutarse en hielo
  6. Transfiera durante 90 minutos [Figura 8]. (Consejo: el tiempo de trabajo debe ser proporcional al grosor del gel, por lo que puede reducirse a 45 minutos para los geles de 0,75 mm). Abrir en una ventana separada Figura 8 Membrana después del cambio

Bloqueo e incubación de anticuerpos

  1. Bloquear la membrana con leche desnatada al 5% en TBST * durante 1 hora.
  2. Agregue el anticuerpo principal en albúmina de suero bovino (BSA) al 5% e incube en un solo día a 4 ° C en un agitador [Figura 9]. Figura 9 Utilice un agitador para incubar la membrana con el anticuerpo
  3. Lave la membrana con TBST durante cinco minutos. Haz esto en tres ocasiones. (Consejo: todos los pasos de lavado e incubación de anticuerpos deben ejecutarse en un agitador a temperatura ambiente para asegurarse de que la agitación sea uniforme).
  4. Agregue el anticuerpo secundario en leche desnatada al 5% en TBST e incube durante 1 hora.
  5. Lave la membrana con TBST durante cinco minutos. Haz esto tres ocasiones
  6. Prepare la combinación ECL (siguiendo la proporción de la respuesta A y B proporcionada por el productor). Incube la membrana durante 1 a 2 minutos [Figura 10]. (Consejo: Utilice una pipeta de 1000 μL para asegurarse de que la ECL cubra la parte superior y la parte posterior de la membrana). Figura 10 Incube la membrana con la cosechadora ECL utilizando una pipeta de 1000 μL para ayudar al método
  7. Visualice el resultado final en la oscuridad de la sala de noche [Figura 11]. (Sugerencia: si el fondo es demasiado sólido, reduzca el tiempo de publicidad) Figura 11 Utilice el casete para revelar la membrana en la oscuridad de la sala de noche

Receta

  1. Disolver el siguiente en 800 ml de H2 destilada.2O
    • 8.Ocho g de NaCl
    • 0,2 g de KCl
    • 3g de base Tris
  2. Agregue 500ul de Tween-20
  3. Ajusta el pH a 7,4
  4. Agregue H destilado2O a 1L
  5. Esterilizar por filtración o autoclave

Teoría

Preparación de la muestra

Los lisados ​​celulares son el tipo de patrón más común utilizado para la transferencia de Western. La extracción de proteínas intenta reunir todas las proteínas dentro del citosol celular. Esto debe realizarse a una temperatura fría con inhibidores de proteasa para detener la desnaturalización de las proteínas. Dado que el patrón de tejido muestra un mejor diploma de construcción, se requiere invención mecánica, que recuerda a la homogeneización o sonicación para extraer las proteínas.

Después de extraer la proteína, es muy importante tener una buena sugerencia del extracto y el enfoque. En última instancia, esto permite al investigador asegurarse de que las muestras estén contrastadas en igualdad de condiciones. El enfoque proteico generalmente se mide utilizando un espectrofotómetro. El uso de este enfoque permite medir la masa de la proteína que se está cargando de manera efectiva mediante la conexión entre el enfoque, la masa y la cantidad.

Después de determinar la cantidad adecuada del patrón, se diluye directamente en un tampón de carga, que comprende glicerol para que las muestras se hundan simplemente en los pocillos del gel. También puede haber un tinte de control (azul de bromofenol) dentro del tampón, lo que permite al investigador ver cuánto ha progresado la separación. El patrón se calienta después de ser diluido directamente en un búfer de carga, para desnaturalizar la construcción de orden superior, mientras retiene los puentes de sulfuro. La desnaturalización de la construcción excesiva asegura que el costo desfavorable de los aminoácidos simplemente no se neutralice, lo que permite que la proteína maniobre en un área eléctrica (utilizada durante la electrotransferencia).

También puede ser crucial tener controles optimistas y desfavorables para el patrón. Para un manejo optimista se utiliza un suministro identificado de proteína objetivo, que recuerda a la proteína purificada o un lisado de manejo. Esto ayuda a verificar la identificación de la proteína y el ejercicio del anticuerpo. Un tratamiento desfavorable es una línea celular nula, que recuerda a la β-actina, que se usa con la misma eficacia para verificar que la tinción no sea inespecífica.

Electroforesis en gel

Western blot utiliza dos tipos distintos de gel de agarosa: gel de apilamiento y gel de separación. El gel de apilamiento más grande es apenas ácido (pH 6,8) y tiene una concentración de acrilamida menor, lo que hace un gel poroso, que separa mal las proteínas, pero les permite formar bandas delgadas y delineadas. El gel de disminución, denominado gel de separación o resolución, es primario (pH 8,8) y tiene un mejor material de contenido de poliacrilamida, lo que hace que los poros del gel sean más estrechos. Por lo tanto, la proteína se separa por su medición más en este gel, porque las proteínas más pequeñas viajan más fácilmente y, por lo tanto, más rápido que las proteínas más grandes.

Las proteínas cuando se cargan en el gel tienen un costo desfavorable, ya que han sido desnaturalizadas por calentamiento y viajarán hacia el electrodo optimista cuando se utiliza un voltaje. Los geles a menudo se elaboran vertiéndolos entre dos placas de vidrio o plástico, utilizando la respuesta descrita en la parte del protocolo. Las muestras y un marcador se cargan en los pocillos y los pocillos vacíos se cargan con tampón de patrón. A continuación, el gel se relaciona con la capacidad que proporciona y se deja correr. El voltaje es fundamental, ya que un voltaje excesivo puede sobrecalentar y distorsionar las bandas.

Secando

Después de separar la combinación de proteínas, se transfiere a una membrana. El cambio se completa utilizando un área eléctrica orientada perpendicular al piso del gel, haciendo que las proteínas se muevan fuera del gel y sobre la membrana. La membrana se coloca entre el piso de gel y el electrodo optimista en un sándwich. El sándwich presenta una almohadilla de fibra (esponja) en cada acabado y papeles de filtro para proteger el gel y la membrana secante [Figura 12]. Aquí dos cuestiones son cruciales: (1) el contacto cerrado del gel y la membrana para asegurar una imagen transparente y (2) la posición de la membrana entre el gel y el electrodo optimista. La membrana debe colocarse como tal, para que las proteínas cargadas negativamente puedan migrar del gel a la membrana. Este tipo de interruptor se denomina interruptor electroforético y puede ejecutarse en situaciones semisecas o húmedas. Las situaciones húmedas suelen ser más confiables, ya que es mucho menos probable que seque el gel y es más popular para proteínas más grandes.

Montaje de un sándwich en Western Blot

La membrana, la ayuda fuerte, es una parte vital de este proceso. Hay dos tipos de membranas: nitrocelulosa y PVDF. La nitrocelulosa se utiliza por su excesiva afinidad por las proteínas y su capacidad de retención. Sin embargo, es frágil y no permite que la membrana se utilice para reprobar. En este sentido, las membranas de PVDF presentan una mayor asistencia mecánica y permiten reprobar y guardar la mancha. Sin embargo, el fondo es mayor dentro de las membranas de PVDF y debido a este hecho, el lavado meticuloso es fundamental.

Lavado, bloqueo e incubación de anticuerpos.

El bloqueo es un paso vital de la transferencia Western, porque evita que los anticuerpos se unan a la membrana de manera inespecífica. El bloqueo generalmente se hace con 5% de BSA o leche en polvo descremada diluida en TBST para reducir el fondo.

La leche en polvo descremada suele ser la más popular, ya que es barata y se puede obtener ampliamente. Sin embargo, las proteínas de la leche no suelen ser adecuadas para todas las etiquetas de detección, por lo que se debe tener cuidado al decidir cuál es la respuesta de bloqueo adecuada. Por ejemplo, las opciones de bloqueo de BSA son más populares con las etiquetas de anticuerpos de biotina y AP, y los anticuerpos antifosfoproteína, ya que la leche contiene caseína, que en sí misma es una fosfoproteína y biotina, lo que interfiere con los resultados del ensayo. Por lo general, es una muy buena técnica incubar el primer anticuerpo con BSA, ya que a menudo se desea en mayores cantidades que el anticuerpo secundario. Ponerlo en la respuesta BSA permite que el anticuerpo se reutilice, si la mancha no da un buen resultado final.

El enfoque del anticuerpo se basa en las instrucciones del productor. El anticuerpo se puede diluir en un tampón de lavado, que recuerda a PBS o TBST. El lavado es esencial porque minimiza el fondo y elimina los anticuerpos no unidos. Sin embargo, la membrana no debe dejarse limpia durante mucho tiempo, ya que también puede recortar el letrero.

Luego, la membrana se detecta utilizando el anticuerpo marcador, a menudo con una enzima que recuerda a la peroxidasa de rábano picante (HRP), que se detecta por el signo que produce similar al lugar de la proteína objetivo. Este signo se captura en una película que a menudo se revela en una habitación oscura.

Cuantificación

Es esencial recordar que a menudo se piensa que la información producida con un western blot es semicuantitativa. Esto se debe a que proporciona una relativa comparabilidad de los rangos de proteínas, pero no una medida absoluta de la cantidad. Hay dos causas para esto primero, hay variaciones en la carga y los cargos de cambio entre las muestras en carriles separados que son totalmente diferentes en transferencias separadas. Estas variaciones deben estandarizarse antes de que se pueda realizar una comparación más exacta. En segundo lugar, el signo generado por la detección simplemente no es lineal en todo el rango de enfoque de las muestras. Por lo tanto, debido a que el letrero producido simplemente no es lineal, no debe usarse para maniquíar el foco.

Solución de problemas

Aunque el proceso de Western Blot es sencillo, pueden surgir muchos problemas que provoquen resultados repentinos. El inconveniente puede agruparse en 5 clases: (1) bandas poco comunes o repentinas, (2) ninguna banda, (3) bandas débiles o signo débil, (4) fondo excesivo en la mancha y (5) manchas irregulares o irregulares en la mancha.

Las bandas inusuales o repentinas pueden ser el resultado de la degradación de la proteasa, que produce bandas en posiciones repentinas. En este caso, es aconsejable utilizar un patrón contemporáneo que se haya almacenado en hielo o alterar el anticuerpo. Si la proteína parece estar en un lugar demasiado excesivo, recalentar el patrón podría ayudar a interrumpir la construcción de la proteína cuaternaria. De manera similar, las bandas borrosas a veces se pueden atribuir a un voltaje excesivo o a la corriente de burbujas de aire a lo largo del interruptor. En este caso, debe asegurarse de que el gel funcione a un voltaje más bajo y de que el interruptor sándwich esté listo correctamente. Además, alterar el búfer de trabajo también puede ayudar con el problema. Las bandas no planas pueden ser el resultado de un viaje demasiado rápido por medio del gel, como resultado de una baja resistencia. Para reparar esto, el gel debe optimizarse para adaptarse al patrón. Finalmente, las bandas blancas (desfavorables) en la película son el resultado de una cantidad excesiva de proteínas o anticuerpos.

Otro inconveniente: tampoco pueden aparecer bandas como resultado de muchas causas asociadas al anticuerpo, antígeno o tampón utilizado. Si se usa un anticuerpo inadecuado, tanto mayor como secundario, la banda no se presentará. Además, el foco del anticuerpo debe ser aceptable de la misma manera que si el foco es simplemente demasiado bajo, no se verá el signo. Es esencial tener en cuenta que, por lo general, algunos anticuerpos no se utilizan para la inmunotransferencia. Otro propósito de las bandas no visibles es el foco inferior o la ausencia del antígeno. En este caso, el antígeno de otro suministro se puede utilizar para verificar si el problema radica o no en el patrón o en diferentes partes, como el anticuerpo. Además, el lavado prolongado también puede reducir la señal. Los búferes también pueden contribuir al problema. Es necesario asegurarse de que los búferes como el búfer de conmutación, TBST, búfer de trabajo y ECL sean todos nuevos y no estén contaminados. Si los tampones están contaminados con azida de sodio, bien puede inactivar HRP.

De manera similar, los indicadores débiles podrían atribuirse a un foco bajo de anticuerpos o antígenos. Aumentar el tiempo de publicidad también puede ayudar a aclarar la banda. Otro propósito podría ser la leche en polvo descremada que enmascara el antígeno. En este caso utilice BSA o reduzca la cantidad de leche utilizada.

El fondo alto suele atribuirse a un foco demasiado excesivo del anticuerpo, que podría unirse a las membranas de PVDF. Otro inconveniente pueden ser los búferes, que pueden ser demasiado anteriores. Aumentar el tiempo de lavado también puede ayudar a reducir el fondo. Además, una publicidad demasiado excesiva también puede resultar en este inconveniente. Por lo tanto, es recomendable verificar diferentes ocasiones de publicidad para lograr un momento óptimo.

Las manchas irregulares e irregulares en la mancha a menudo se atribuyen a un cambio incorrecto. Si hay burbujas de aire atrapadas entre el gel y la membrana, parecerá más oscuro en la película. También puede ser imprescindible utilizar un agitador para toda la incubación, para que no exista una agitación desigual durante la incubación. Una vez más, el lavado es tan importante como la limpieza del fondo. Este inconveniente también puede atribuirse a los anticuerpos que se unen a los agentes de bloqueo, en este caso es necesario probar otro agente de bloqueo. Filtrar el agente de bloqueo también puede ayudar a eliminar algunos contaminantes. Finalmente, este inconveniente también puede atribuirse a la agregación del anticuerpo secundario, en este caso, el anticuerpo secundario debe centrifugarse y filtrarse para eliminar el agregado.


Tampones de transferencia

Los tampones de transferencia contienen un agente tampón conductor fuerte (por ejemplo, Tris, CAPS o carbonato) para mantener la conductividad y el pH del sistema durante la transferencia. Además, se puede incluir alcohol (metanol o etanol) en el tampón de transferencia para promover la unión de proteínas a las membranas, y se puede agregar SDS para promover la elución de proteínas de los geles.

Tampón de transferencia compatible por tipo de gel

Tipo de gel Buffer de transferencia Sistema de transferencia de Western Blot
SDS-PAGE Towbin con o sin SDS, CAPS, carbonato, Bjerrum Schafer-Nielsen Secado de tanque o secado semiseco
Tris-Tricina Towbin, CAPS Se recomienda el secado en el tanque, necesita una membrana de alta capacidad y tamaño de poro pequeño. El pH del tampón puede ser crítico
Nativo, no desnaturalizante Depende del pH del tampón de gel y del pI de la proteína de interés Es posible que sea necesario regular la temperatura recomendada para el secado del tanque para mantener la actividad
Urea ácida 0,7% de ácido acético Utilice el protocolo de transferencia de gel ácido (membrana hacia el cátodo)

SDS y alcohol

El SDS y el alcohol juegan papeles opuestos en una transferencia. El SDS promueve la elución de la proteína del gel y, en los casos en que ciertas proteínas son difíciles de eluir del gel, se puede añadir SDS al tampón de transferencia. Sin embargo, el SDS en el tampón de transferencia disminuye la eficacia de unión de la proteína a la membrana de nitrocelulosa. La membrana de PVDF puede sustituirse si se desea.

El alcohol, por otro lado, elimina el SDS de los complejos SDS-proteína y mejora la unión de la proteína a la membrana de nitrocelulosa. Pero el alcohol puede causar una reducción en el tamaño de los poros del gel, la precipitación de algunas proteínas y algunas proteínas básicas para que se carguen positivamente o sean neutrales.

Tampón de transferencia recomendado por aplicación

Solicitud Tampón de transferencia recomendado
Proteínas de alto peso molecular Towbin con SDS
Pequeñas proteínas y péptidos Towbin, CAPS
Proteínas básicas (pI & gt 9) en geles desnaturalizantes CAPS, carbonato, Bjerrum Schafer-Nielsen
Proteínas básicas (pI & gt 9) en geles nativos o no desnaturalizantes 0,7% de ácido acético
Glicoproteínas Towbin con o sin SDS, CAPS, carbonato, geles no desnaturalizantes de Bjerrum Schafer-Nielsen
Proteoglicanos Towbin, Bjerrum Schafer-Nielsen

Sugerencias de búfer de transferencia

  • No utilice el mismo lote de tampón de transferencia más de una vez, ya que es probable que el tampón pierda su capacidad para mantener un pH estable durante la transferencia.
  • No diluya los búferes de transferencia, esto también disminuirá la capacidad de almacenamiento.
  • No ajuste el pH de los tampones de transferencia cuando no esté indicado, ya que esto aumenta la conductividad del tampón, que se manifiesta por una mayor salida de corriente inicial y una menor resistencia.

Actividad constitutiva en receptores y otras proteínas, parte B

Mercedes Dosil, James B. Konopka, en Métodos en enzimología, 2010

7.2 Análisis de transferencia de Western de la producción de proteínas receptoras

El análisis de transferencia Western es otro método muy conveniente para detectar proteínas Ste2 producidas en levadura. Usamos una etiqueta triple HA, que proporciona un nivel de detección muy sensible (Dosil et al., 2000). La preparación de extractos de células de levadura requiere la alteración de la pared celular. La disrupción mecánica por agitación de células con perlas de vidrio es la más simple y se describirá aquí. Se pueden analizar extractos de células enteras, pero la sensibilidad se puede aumentar analizando una fracción de membrana bruta. Los métodos para separar el extracto de proteína mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y transferirlo a nitrocelulosa son prácticas comunes que se describen en detalle en otra parte (Sambrook et al., 1989 ).

Perlas de vidrio de 450 μm tratadas con ácido (por ejemplo, Sigma cat. # G8772).

Tampón TE / PP: 100 metrosMETRO NaCl, 50 mMETRO Tris – HCl (pH 7,5), 1 mMETRO EDTA, 100 μg / ml de PMSF, 2 μg / ml de pepstatina A.

Tampón de muestra PAGE (8 METRO urea, 3% SDS, 25 mMETRO Tris (pH 6,8), azul de bromofenol al 0,01%, cianol de xileno al 0,01%).

Haga crecer un cultivo de levadura de 50 ml hasta una densidad de aproximadamente 1 × 10 7 células / ml (OD660 = 0,5-1). Se puede utilizar YPD o medio sintético.

Enfriar los tubos de centrífuga y los tampones en hielo.

Transfiera aproximadamente 2,5 × 108 células a un tubo cónico de 50 ml y recolecte el sedimento celular mediante centrifugación a 1000 ×gramo durante 5 min.

Lave el sedimento celular con 10 ml de agua estéril y luego sedimente las células nuevamente por centrifugación durante 5 min.

Resuspender el sedimento celular en 1 ml de agua estéril y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.

Centrifugar a 14.000 ×gramo durante 30 s en una microcentrífuga y luego retire el sobrenadante. (Las células pueden almacenarse a -70 ° C en este punto o colocarse en hielo hasta que se necesiten).

Resuspenda 2,5 × 108 células en 250 μL de tampón TE / PP y agregue 250 μL de perlas de vidrio.

Agite las células en un vórtex a muy alta velocidad durante 1 min. Incline el tubo para que exista la máxima acción de aplastamiento de las perlas de vidrio para romper las paredes de las células de levadura. Incubar en hielo durante 1 minuto para mantener la muestra fría y evitar la proteólisis. Repite tres veces.

Transfiera el extracto celular a un tubo nuevo (dejando las perlas de vidrio).

Centrifugar a baja velocidad (330 ×gramo) durante 5 min a 4 ° C para eliminar las células intactas.

Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Centrifugar a velocidad máxima durante 15 min a 4 ° C en una microcentrífuga para sedimentar las membranas.

El gránulo de membrana crudo se puede utilizar inmediatamente o se puede almacenar a - 70 ° C.

Disuelva el sedimento de la membrana en bruto en 100 μL de tampón de carga 2 × PAGE. Caliente los tubos a 37 ° C durante 10 min antes de cargar el gel. No hierva las muestras de GPCR o se agregarán.

Centrifugar a máxima velocidad en una microcentrífuga durante 3 minutos antes de la carga y luego realizar la electroforesis en gel y Western blot de acuerdo con los procedimientos estándar.


Paso 5: detección

El método de detección utilizado depende de la enzima a la que se conjuga el anticuerpo secundario. La enzima más común utilizada en Western Blot es HRP, y el sustrato utilizado para la detección se conoce como sustrato quimioluminiscente.

Una vez que se ha agregado el sustrato, la luz que se emite se puede detectar con una película o una cámara fotográfica.

Tenga en cuenta que la película no contiene información sobre dónde se encuentran las bandas iluminadas en relación con la membrana. Por lo tanto, es muy importante utilizar un método que permita alinear la película con la membrana exactamente de la misma manera que cuando se expuso la película. La membrana generalmente se tiñe después del paso de detección, de modo que la proteína presente se pueda visualizar y comparar con la película.


Detección quimioluminiscente

Siga las instrucciones del fabricante.

  1. Prepare el sustrato de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Coloque la mancha en un recipiente y agregue sustrato para cubrir completamente la membrana.
    Incubar durante 1 minuto.
  3. Drene el exceso de sustrato.
  4. Coloque la mancha en un pedazo de vidrio limpio y envuélvala en una envoltura de plástico.
    Nota: También se puede utilizar un protector de hojas cortado a medida o una bolsa para congelador.
  5. Suavemente alise las burbujas de aire.
  6. En una habitación oscura, coloque la membrana envuelta en un casete de película.
  7. Coloque una hoja de película de autorradiografía encima y cierre el casete.
  8. Exponer la película. Se deben realizar exposiciones múltiples de 15 segundos a 30 minutos para determinar el tiempo de exposición óptimo. Es común que entre 1 y 5 minutos.

Western Blot Doctor & # 153 - Problemas de fondo de Blot

28/02/23 09:30 AM AE, AI, AL, AM, AR, AT, AU, AZ, BA, BD, BE, BF, BG, BH, BN, BO, BR, BW, CA, CH, CL , CM, CN, CO, CR, CY, CZ, DE, DK, DO, DZ, EC, EE, EG, EH, ER, ES, ET, FI, FM, FO, FR, GA, GE, GF, GH , GP, GR, GT, GU, HK, HN, HR, HT, HU, ID, IE, IL, IN, IS, IT, JM, JO, JP, KE, KH, KR, KW, KZ, LB, LI , LK, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, ML, MO, MQ, MS, MT, MU, MX, MY, NG, NI, NL, NO, NP, NZ, OM, PA, PE , PF, PG, PH, PK, PL, PR, PS, PT, PW, PY, QA, RO, RS, RU, SA, SB, SE, SG, SI, SK, SN, ST, SV, TG, TH , TN, TO, TR, TT, TW, TZ, UA, UG, Reino Unido, EE. UU., UY, UZ, VA, VE, VU, XK, YE, ZA, VN y LSR / LSR / Technologies / Western_Blotting N 0

Western Blot Doctor es una guía de autoayuda que le permite solucionar sus problemas de Western Blot. En esta sección, puede encontrar soluciones a problemas con la señal de fondo de transferencia.

Otras secciones del Western Blot Doctor:

Problemas y soluciones

Haga clic en la miniatura que sea más representativa de su propia mancha para descubrir las causas probables y encontrar soluciones específicas al problema.

Problema: manchas o regiones blancas en la mancha

Almohadillas de espuma para sistemas de secado en tanque húmedo Bio-Rad:

  • Mini Trans-Blot & Reg System (1703933)
  • Papel secante de criterios y comercio (1704086)
  • Sistema Trans-Blot (1703914)
  • Trans-Blot Plus System (1703995)

As a diagnostic test, you can check transfer quality by imaging proteins on the gel and blot. If planning to use the blot in downstream steps, make sure that your stain can be removed or is compatible with antibody detection. For example, Coomassie and colloidal gold are not compatible with downstream steps (see Bio-Rad Protein Stains and the Protein Stain Selection Guide).

  • High-intensity transfers in tank blotting sample can cause buffer heating, leading to bubble formation ensure that buffer remains cool
    • Reduce current, and increase transfer time to compensate
    • Perform transfer in tank apparatus placed in ice or a temperature-controlled (4°C) room
    • Chill buffers before use
    • Use a cooling coil or &ldquoblue ice&rdquo insert in the cell
    • Mini Trans-Blot System (1703919)
    • Criterion Blotter (1704076, 1704087)
    • Trans-Blot System (1703912)
    • Trans-Blot Plus System (1703990)
    • Nitrocellulose: White regions on the nitrocellulose membrane indicate dry areas where protein will not bind. If wetting does not occur immediately by immersion of the sheet in transfer buffer, heat distilled water until just under boiling point and soak the membrane until completely wet. Equilibrate in transfer buffer until ready to use
    • PVDF: White regions on PVDF membrane indicate areas where the membrane was either inappropriately prewetted or allowed to dry out. Because of the hydrophobic nature of PVDF, the membrane must be prewetted in methanol prior to equilibration in aqueous transfer buffer. Once wet, do not allow membrane to dry out. If the membrane dries, rewet in methanol and re-equilibrate in TBS-T (caution: may adversely affect downstream detection processes)

    Problem: High background on blot

    • Increase the concentration of blocker (e.g., 3&ndash5% BSA, casein, or nonfat dry milk)
    • Increase the duration of the blocking step (overnight at 4°C instead of 1 hour at room temperature, or a longer incubation at room temperature)
    • Increase temperature at which blocking is performed, (up to room temp)
    • Use a different blocking reagent (albumin, gelatin, BSA, casein, or nonfat dry milk)
    • More blocking reagents:
    • Use a pure protein such as BSA or casein as a blocker (see Detergents and Blocking Reagents)
    • Do not reuse blocking buffers
    • Reduce incubation time with detection substrate
    • If using colorimetric reagent, remove the blot from the substrate solution when the signal-to-noise level is acceptable, and immerse in deionized water
    • Reduce/optimize primary and/or secondary antibody concentrations
    • Use a dot-blotting trial to optimize antibody concentrations
    • Reduce/optimize incubation times
    • Make sure all incubation trays are fully cleaned between experiments
    • Use disposable trays
    • Excessive protein loading
    • Too much SDS in transfer buffer
    • Excess protein loading:
    • Reduce the amount of protein on gel
    • Optimize sample loading see Determining the Appropriate Sample Load for Western Blots Protocol
    • Reduce concentration of SDS in transfer buffer
    • Add second membrane sheet to bind excess protein
    • Try other blocking reagents, e.g., albumin, gelatin, BSA, casein, or nonfat dry milk (see Bio-Rad Detergents and Blocking Reagents and more Blocking Reagents)
    • Do not use milk to block membranes when using avidin-biotin system because milk contains biotin
    • Increase length and/or number of washing steps (minimum of 5 x 5 min)
    • Use larger volume of wash buffer
    • Use a shorter exposure time
    • Use multi-acquisition feature on data acquisition software
    • Film users:
      • Wait 5&ndash10 minutes and then re-expose blot to film (film)
      • Reduce exposure and/or development time (film)
      • Consider switching to a digital imaging system such as Bio-Rad&rsquos ChemiDoc&trade Imaging Systems
      • Make sure membrane is thoroughly wetted when beginning procedure
      • Repeat procedure taking care that the blot does not dry out during any step by using sufficient volumes and agitation throughout
      • Make sure membrane remains submerged in incubation and wash buffers throughout all steps
      • Use a fresh aliquot of antibody that has been stored at &ndash20°C or below
      • If storing an antibody for a very long period of time may want to store at &ndash80°C
      • Make aliquots of antibody and only thaw one at a time as needed for blots
      • Avoid repeated freeze-thaw cycles
      • Try a lower incubation temperature such as 4°C
        Note: will need to increase incubation time
      • Try nitrocellulose instead (see Western Blotting Membranes)
      • Increase stringency of washing steps:
      • Use TBS containing 0.05&ndash0.1% Tween 20
      • Try a stronger detergent such as NP-40
      • Use fresh buffers
      • Filter all buffers through a 0.2 µm filter before using for washing or blocking and before adding antibody

      Problem: Blotchy or patchy background

      • Use a shaker during all incubation steps
      • Make sure membrane is thoroughly wetted when beginning procedure
      • Repeat procedure taking care that the blot does not dry out during any step by using sufficient volumes and agitation throughout. Make sure blot is always submerged
      • Do not handle membrane with bare hands. Always wear clean gloves, and handle blots with clean forceps whenever possible
      • Make sure electrophoresis equipment, blotting equipment, and incubation trays are clean and free of contaminants
      • Avoid touching the blot to surfaces
      • Increase washing buffer volume
      • Use a shaker during all incubation and wash steps
      • Avoid stacking blots in a single incubation container
        • When stacking blots in a single incubation container, ensure that sufficient flow of buffer exists between blots. The blots should move freely past each other with agitation during incubation and wash steps

        Problem: Uneven spots on blot or speckled background

        • Spin secondary antibody and/or filter to remove aggregates
        • Make sure blocking reagent is fully dissolved in buffer prior to use
        • Make fresh buffers if making blocking buffer from dry reagents
        • Check premade blocking buffers for precipitates before use
        • Add 0.05&ndash0.1% Tween 20 to blocking buffer
        • Filter blocking buffer through 0.2 µm filter before use
        • Wash blot with washing buffer before incubation with antibodies
        • Try a different blocking reagent, e.g., albumin, gelatin, BSA, casein, or nonfat dry milk (see Bio-Rad Detergents and Blocking Reagents and more Blocking Reagents)
        • Remove all residual acrylamide gel traces from surface of membrane following transfer before proceeding with downstream steps
        • Check that scanning and cassette surfaces are clean
        • Use fresh buffers. Make a new batch of buffer and repeat blot
        • Filter buffers for blocking and washing through 0.2 µm filter
        • Wrapping blots in plastic wrap or heat-sealed bags is a good safeguard against both particulate contamination and blot dehydration at the image acquisition step

        Problem: Gel cassette shadow transferred to blot (tank blotters)

        • Clean or replace foam pads
          • Foam pads for Bio-Rad wet tank blotting systems:
            • Mini Trans-Blot ® System (1703933)
            • Criterion&trade Blotter (1704086)
            • Trans-Blot System (1703914)
            • Trans-Blot Plus System (1703995)
            • Reduce amount of protein on the gel
            • Optimize sample loading see Determining the Appropriate Sample Load for Western Blots Protocol
            • Reduce the amount of SDS in transfer buffer
            • Add second membrane sheet to bind excess protein
            • Prepare fresh transfer buffer. Make a new batch of buffer and repeat blot
            • Filter buffers for blocking and washing through 0.2 µm filter

            02/28/23 09:30 AM AE,AI,AL,AM,AR,AT,AU,AZ,BA,BD,BE,BF,BG,BH,BN,BO,BR,BW,CA,CH,CL,CM,CN,CO,CR,CY,CZ,DE,DK,DO,DZ,EC,EE,EG,EH,ER,ES,ET,FI,FM,FO,FR,GA,GE,GF,GH,GP,GR,GT,GU,HK,HN,HR,HT,HU,ID,IE,IL,IN,IS,IT,JM,JO,JP,KE,KH,KR,KW,KZ,LB,LI,LK,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,ML,MO,MQ,MS,MT,MU,MX,MY,NG,NI,NL,NO,NP,NZ,OM,PA,PE,PF,PG,PH,PK,PL,PR,PS,PT,PW,PY,QA,RO,RS,RU,SA,SB,SE,SG,SI,SK,SN,ST,SV,TG,TH,TN,TO,TR,TT,TW,TZ,UA,UG,UK,US,UY,UZ,VA,VE,VU,XK,YE,ZA,VN en LSR /LSR/Technologies/Western_Blotting N 0


            Ver el vídeo: Técnica de Western blot (Agosto 2022).