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¿La inmunidad a las proteínas CRISPR limita su eficacia?

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El uso de sistemas crisper-cas se aplica actualmente a células cultivadas in vitro. A medida que mejora el control de los efectos "fuera del objetivo" de Crispr y Crispr se usa in vivo, ¿por qué el sistema inmunológico no lo neutraliza?


Usualmente no. las proteínas Crispr / Cas se pueden entregar a la célula como ADN / ARN y las proteínas solo existirán dentro de la célula en cantidades reducidas.

Incluso en sistemas que entregan la proteína desde el exterior en vivo casi siempre las proteínas se encapsulan en un sistema de suministro para asegurar que ellas y los ácidos nucleicos acompañantes necesarios entren en la célula. Hacer que Crispr / Cas ingrese a una celda es difícil de hacer y no solo aparecen por sí mismos. También requieren ARN guía, que no se mantendrá completo fácilmente en el torrente sanguíneo y los tejidos durante mucho tiempo.

Si solo desea inyectar un líquido en la sangre con proteínas CRISPR / CAS desprotegidas, una reacción inmunológica podría detenerlas. No todas las proteínas producen una reacción inmunológica. A veces, solo 2-3 proteínas de una bacteria completa producen una reacción inmunitaria (anticuerpos). Pero, de nuevo, es poco probable que las proteínas hayan editado algún genoma en cualquier célula huésped aun así.


CRISPR-Cas9 en la edición del genoma: su función y aplicaciones médicas

La modificación dirigida del genoma utilizando nucleasas guiadas por ARN se asocia con varias ventajas, como un método rápido, fácil y eficiente que no solo proporciona la manipulación y alteración de genes y estudios funcionales para los investigadores, sino que también aumenta su conocimiento de la base molecular de la enfermedad y el desarrollo de enfoques terapéuticos nuevos y específicos. Hasta ahora, han surgido diferentes técnicas como las tijeras moleculares que median la edición del genoma dirigido, incluida la nucleasa de dedo de zinc, las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción y las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) - proteína asociada a CRISPR 9 (Cas9). CRISPR-Cas9 es un sistema inmunológico bacteriano contra virus en el que la nucleasa Cas9 guiada por ARN monocatenario está vinculada a las secuencias complementarias dirigidas para aplicar cambios. Los avances realizados en la transferencia, modificación y aparición de soluciones específicas han llevado a la creación de diferentes clases de CRISPR-Cas9. Dado que esta robusta herramienta es capaz de corregir directamente las mutaciones que causan enfermedades, su capacidad para tratar trastornos genéticos ha atraído la enorme atención de los investigadores. Teniendo en cuenta los casos notificados de orientación inespecífica de las proteínas Cas9, muchos estudios se centraron en mejorar las características de Cas9. En este sentido, se han logrado avances significativos en la elección de ARN guía, nuevas enzimas y métodos para identificar objetivos fuera de lugar. Aquí, destacamos la historia y varios aspectos directos de CRISPR-Cas9, como la precisión en la focalización genómica, la transferencia del sistema y su control sobre los eventos de corrección con sus aplicaciones en futuros estudios biológicos y el tratamiento moderno de enfermedades.

Palabras clave: CRISPR-Cas9 edición del genoma de nuevos tratamientos dirigidos específicamente.


Los componentes de CRISPR-Cas trabajan juntos para mejorar la protección contra virus

Crédito: CC0 Public Domain

Investigadores de Skoltech y sus colegas de Rusia y EE. UU. Han demostrado que los dos componentes del sistema de inmunidad bacteriano CRISPR-Cas, uno que destruye elementos genéticos extraños como virus y otro que crea "recuerdos" de elementos genéticos extraños almacenando fragmentos de su ADN en una ubicación especial del genoma bacteriano, están físicamente ligados. Este enlace ayuda a las bacterias a actualizar de manera eficiente su memoria inmunológica cuando se infectan con virus mutantes que aprendieron a evadir la defensa CRISPR-Cas. El artículo fue publicado en la revista procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias.

CRISPR-Cas, un mecanismo de defensa que proporciona a las bacterias resistencia a sus virus (bacteriófagos), destruye el ADN de adversarios encontrados previamente "comparándolo" con espaciadores, pequeños fragmentos de información genética almacenados como una "biblioteca" en un "chip de memoria". ubicado en un sitio especial del genoma bacteriano. CRISPR-Cas "aprende" a reconocer nuevos enemigos mediante la incorporación de nuevos espaciadores derivados de virus en esta biblioteca durante la infección. Las dos etapas del funcionamiento de CRISPR, la adquisición de espaciadores y su uso para combatir las reinfecciones, se denominan adaptación e interferencia, en consecuencia.

"Para evitar CRISPR, los fagos adquieren mutaciones que introducen desajustes con los espaciadores. Por lo tanto, para mantener una defensa eficaz, el sistema CRISPR-Cas necesita actualizar el conjunto de espaciadores más rápido de lo que surgen los fagos mutantes con mutaciones de escape. Para cumplir con este requisito, CRISPR -Los sistemas cas han desarrollado un mecanismo especial de adaptación preparada. Durante la adaptación preparada, los espaciadores preexistentes que reconocen un objetivo, incluso de manera ineficiente, promueven la adquisición muy eficiente de espaciadores adicionales de la misma molécula de ADN en la que se encuentra el objetivo ", Olga Musharova, Skoltech científico investigador y primer autor del artículo, explica.

El mecanismo molecular exacto del cebado aún no está claro, pero requiere una estrecha coordinación entre la muerte y las partes memorizadoras del mecanismo CRISPR. En el nuevo artículo, el profesor Konstantin Severinov de Skoltech, Musharova y sus colegas pudieron confirmar la existencia de un complejo de cebado que incluye tanto las proteínas Cas1-Cas2 responsables de adquirir nuevos espaciadores como la proteína Cas3 que escinde el ADN enemigo.

"La parte que destruye el ADN extraño y la parte que adquiere nueva información para la función protectora futura del sistema CRISPR-Cas están vinculadas. Es como si el mazo en un juego Whac-A-Mole también pudiera tomar fotografías de los lunares para referencia futura ", Dijo Severinov.

En experimentos con E. coli, el equipo demostró que los fragmentos de ADN degradados por Cas3 se pasan directamente a Cas1-Cas2 como "preespaciadores" que eventualmente se convierten en espaciadores. "Este resultado es de importancia fundamental. Descubrimos el vínculo entre la interferencia y los procesos de adaptación", dice Musharova. "Nuestros hallazgos también muestran cómo la adaptación de CRISPR puede hacerse más eficiente, lo cual es importante para usar poblaciones bacterianas para el almacenamiento de información".

El equipo planea seguir investigando la adaptación cebada en las células bacterianas y encontrar la forma más eficiente de instalar los "recuerdos" deseados en el ADN bacteriano en forma de espaciadores.


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A DSB o no a DSB

Confiar en HDR para editar corre el riesgo de introducir indeles o translocaciones cromosómicas. Incluso con una nucleasa dirigida con precisión, con HDR, "estás a merced de la célula", observa Stoddard. Para editar sin la imprevisibilidad de HDR, agrega, observe los desarrollos en recombinasas específicas del sitio (SSR).

"Los SSR lo hacen todo", dice Marshall Stark, genetista molecular en el Universidad de Glasgow en Escocia. "Rompen y vuelven a unir el ADN sin necesidad de factores de acogida". Incluso en células con HDR bajo o nulo, los SSR pueden integrar ADN exógeno en un sitio objetivo. En condiciones óptimas, dice Stark, "los SSR pueden ser extremadamente eficientes, con una recombinación cercana al 100% en unos pocos minutos". Los SSR pueden realizar cambios similares a los de un interruptor, como invertir la orientación de un segmento de ADN. Esto los hace valiosos para crear rutas similares a circuitos electrónicos que controlan el comportamiento de las células con fines industriales o aplicaciones de biología sintética, como la fabricación de biocomputadoras. Sin embargo, los SSR tienen sitios objetivo complejos, raros, de 30 a 50 pares de bases.

Stark nombra dos enfoques para adaptar los SSR para una edición del genoma más generalizada: (1) usando la evolución dirigida que selecciona nuevas especificidades de destino y (2) haciendo proteínas de fusión. Por ejemplo, él y otros están uniendo dominios de recombinasa derivados de SSR a módulos de dedos de zinc que se unen a secuencias de ADN específicas. La tecnología está "todavía en el nivel de investigación", señala Stark. "Si tiene un objetivo en particular en mente, todavía es mucho trabajo hacer una recombinasa para él".

Para la edición del genoma sin DSB, los investigadores utilizan Cas9, que todavía está dirigido por gRNA, pero no corta el ADN o hace solo mellas de una sola hebra. Las variantes de Cas9 se fusionan con activadores o represores de la transcripción, o con enzimas que alteran la estructura de la cromatina modificando el ADN o las proteínas histonas de empaquetamiento del ADN para cambiar la expresión génica. Esta edición del epigenoma se asemeja a la regulación genética natural, dice Gersbach, "sin riesgo de cambios fuera del objetivo en las secuencias de ADN". El método es una herramienta de investigación básica para el estudio de la epigenética y tiene usos terapéuticos potenciales, como reactivar el gen silenciado que causa el síndrome del X frágil de discapacidad intelectual (4).

La edición de bases realiza cambios de un solo par de bases al tiempo que evita mutaciones no deseadas de la reparación de DSB. Funciona en células sin HDR. Las innovaciones en este método se publican con regularidad, pero los primeros editores de base desarrollados por el grupo de David Liu en Universidad Harvard tenía un Cas9 desactivado que apuntaba a una secuencia de ADN fusionada a una enzima que convierte la citosina en uracilo. La proteína de fusión cambia un par de citosina-guanina en timina-adenina. Otro editor de base, que el laboratorio de Liu generó a través de la ingeniería de proteínas y la evolución dirigida, cambia la adenina-timina en guanina-citosina. Solo estos dos sistemas de edición de bases pueden realizar un tercio de todos los posibles cambios de pares de bases, afirma Liu, y potencialmente corregir el 62% de las mutaciones puntuales patógenas humanas conocidas.

A partir del verano de 2019, más de 100 artículos de investigación describieron experimentos utilizando la edición de base, dice Liu, "incluidos varios que corrigieron modelos animales de enfermedades genéticas humanas mediante la reversión directa de mutaciones puntuales". Por ejemplo, un editor corrigió una mutación que causa fenilcetonuria (5). Liu y otros están diversificando la edición de bases, expandiendo las opciones de cambio de bases, aumentando la especificidad y mejorando la actividad en animales vivos y en sitios objetivo que requieren distinguir entre secuencias muy similares.


Ensayos clínicos CRISPR: una actualización de 2021

2020 fue un gran año para CRISPR y mdash, los descubrimientos de nuevas proteínas Cas, el uso de la tecnología CRISPR para estudiar y desarrollar pruebas de diagnóstico de COVID-19, un Premio Nobel y más. El año pasado también trajo resultados de ensayos clínicos que utilizan la tecnología CRISPR, sobre la que informamos por primera vez en 2019, y el inicio de nuevos ensayos clínicos.

En este nuevo artículo de revisión, repasaremos los conceptos básicos de los ensayos clínicos y luego trazaremos los ensayos actuales basados ​​en CRISPR desde los antecedentes de la enfermedad hasta lo que realmente esperamos aprender de estos ensayos.

CONCEPTOS BÁSICOS DEL ENSAYO CLÍNICO

En los Estados Unidos, la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) evalúa la seguridad y eficacia de los nuevos tratamientos para enfermedades a través de ensayos clínicos en pacientes voluntarios. Los primeros ensayos analizan la seguridad y los efectos secundarios. Los ensayos posteriores prueban la eficacia y comparan nuevas terapias con tratamientos estándar.

Los ensayos actuales que utilizan tratamientos basados ​​en CRISPR aún se encuentran en las primeras etapas. Eso significa que incluso si los tratamientos son seguros y efectivos, es probable que aún falten algunos años para la aprobación de la FDA y estén ampliamente disponibles para los pacientes.

La llegada de la tecnología CRISPR abre nuevas posibilidades en la medicina de precisión. Actualmente se están realizando ensayos en cinco áreas de tratamiento: trastornos sanguíneos, cánceres, enfermedades oculares, infecciones crónicas y trastornos del plegamiento de proteínas. Todos los ensayos clínicos actuales de CRISPR están destinados a editar células o tejidos específicos sin afectar a los espermatozoides ni a los óvulos, lo que significa que no se pueden transmitir cambios en el ADN a las generaciones futuras.

TRASTORNOS DE LA SANGRE

ANTECEDENTES DE ENFERMEDADES

Los glóbulos rojos utilizan la hemoglobina para transportar oxígeno desde los pulmones a todos los tejidos del cuerpo. La mutación en un gen que codifica parte de la molécula de hemoglobina causa dos trastornos genéticos diferentes: la enfermedad de células falciformes (ECF) y la beta talasemia.

En la anemia de células falciformes (ECF), los glóbulos rojos se deforman. Su forma de media luna o & ldquosickle & rdquo hace que bloqueen los vasos sanguíneos, lo que ralentiza o detiene el flujo sanguíneo. Esto causa un dolor intenso y repentino. Las complicaciones incluyen dolor crónico, daño orgánico, accidentes cerebrovasculares y anemia. En la beta talasemia, los pacientes no producen suficiente hemoglobina. Esto conduce a anemia y fatiga. En los casos más graves, los pacientes tienen daños en los órganos, especialmente en el hígado, los huesos y el corazón. Ambas enfermedades pueden ser fatales.

Hay algunos tratamientos disponibles, pero a menudo, los pacientes aún sufren síntomas graves y complicaciones a causa de sus enfermedades. Los pacientes con MSC más graves y beta talasemia necesitan transfusiones de sangre frecuentes. El trasplante de médula ósea puede ser curativo, sin embargo, esto solo se puede hacer cuando se puede encontrar un donante compatible y sano. Esta no es una opción para la mayoría de los pacientes con SCD o beta talasemia.

ESTRATEGIAS DE TRATAMIENTO

El enfoque adoptado para tratar los trastornos sanguíneos con la tecnología CRISPR no corrige directamente las variantes genéticas que causan la enfermedad, pero utiliza una solución inteligente: en lugar de corregir directamente las mutaciones que causan la enfermedad, el objetivo es aumentar los niveles de hemoglobina fetal. Esta es una forma de hemoglobina que los fetos producen en el útero, pero los niños y los adultos no la producen. No se comprende del todo por qué los seres humanos cambian de una forma de hemoglobina a otra, pero la hemoglobina fetal puede reemplazar la hemoglobina adulta defectuosa en los glóbulos rojos. Este tratamiento se puede usar para tratar tanto la talasemia beta como la SCD.

En los pacientes con ECF, los síntomas comienzan a aparecer después de que disminuyen los niveles de hemoglobina fetal (HbF).

El primer paso del tratamiento es extraer una célula madre sanguínea del paciente de su sangre. A continuación, los científicos editan el genoma de estas células. Luego, la quimioterapia elimina las células madre sanguíneas defectuosas en el cuerpo del paciente y los pacientes y miles de millones de células madre editadas del genoma se devuelven al torrente sanguíneo. Las células madre sanguíneas editadas genéticamente se administran por vía intravenosa. Si este método funciona según lo previsto, estas células se asentarán y crearán una nueva población de células madre sanguíneas en la médula ósea, que producirá glóbulos rojos editados que producen hemoglobina fetal.

Este enfoque de tratamiento se considera edición del genoma ex vivo, porque la edición se produce fuera del cuerpo del paciente. La edición ex vivo garantiza que las herramientas de edición del genoma solo entren en contacto con las células diana correctas.

ENSAYOS CLÍNICOS ACTUALES DE CRISPR

En el primer uso de una terapia ex vivo basada en CRISPR para tratar una enfermedad genética, los investigadores trataron a un paciente con beta talasemia en Alemania en febrero de 2019.Desde entonces, 12 pacientes más han sido tratados, y siete de ellos han sido seguidos durante al menos tres. meses. Ninguno de los pacientes necesitó transfusiones de sangre en los meses posteriores al tratamiento. El primer paciente con SCD fue tratado con la misma terapia en Nashville, Tennessee en julio de 2019. Esta paciente, Victoria Gray, ha mostrado un progreso notable. Escuche a la propia Gray. Los primeros resultados en otros pacientes también son prometedores:

  • Todos los pacientes tratados por SCD o beta talasemia muestran niveles de hemoglobina de normales a casi normales, donde al menos el 30% (SCD) o el 40% (beta talasemia) de la hemoglobina es hemoglobina fetal.
  • En muestras de médula ósea tomadas de Gray, un paciente adicional con SCD y cinco pacientes con beta talasemia, los investigadores encontraron células con la edición genética esperada que les permite producir hemoglobina fetal. Esto indica que las células editadas se han instalado con éxito en la médula ósea.
  • Los únicos efectos secundarios inmediatos asociados con el tratamiento fueron el resultado de la administración de quimioterapia.
  • Lee mas:
      & mdash Frangoul et al., Revista de Medicina de Nueva Inglaterra & mdash Resumen de Frangoul et al. en la Sociedad Americana de Hematología
  • CRISPR Therapeutics y Vertex Pharmaceuticals están ejecutando conjuntamente los ensayos de hemoglobina fetal y reclutando pacientes en los EE. UU., Canadá y Europa.

    Un próximo ensayo de UCSF, UCLA y UC Berkeley, incluidos los investigadores de IGI, planea probar un enfoque alternativo que repararía directamente la mutación que causa la ECF.

    QUE OBSERVAR

    En este momento, hay una gran cantidad de investigaciones sobre el tratamiento de los trastornos sanguíneos. Las empresas farmacéuticas y de biotecnología, así como las instituciones de investigación académica, están trabajando tanto en terapias farmacéuticas como genéticas. Aún no sabemos qué enfoques serán los más seguros y efectivos, pero los pacientes seguramente se beneficiarán de la mayor actividad de investigación en estas áreas de enfermedades.

    Los resultados iniciales de Victoria Gray y otros pacientes voluntarios son extremadamente alentadores. Esperamos obtener resultados más detallados de otros participantes del ensayo, que con suerte mostrarán una reducción similar de los síntomas. El seguimiento a largo plazo de Gray y otros pacientes es crucial: se les hará un seguimiento durante años para ver si el tratamiento sigue siendo efectivo y para buscar posibles efectos secundarios, como efectos negativos para la salud o cáncer de origen no deseado o no deseado. ediciones, que no serán evidentes hasta más adelante en la línea.

    & ldquoLos ​​principales efectos secundarios hasta ahora han sido de la quimioterapia necesaria para eliminar las células de la médula ósea preexistentes para que las células editadas se injerten. La quimioterapia es un factor limitante enorme para estas terapias ”, explica Megan Hochstrasser, Ph.D., una experta en CRISPR que estudió con Jennifer Doudna y ahora se desempeña como Gerente del Programa Educativo IGI. & ldquoSi tienes que estar en el hospital durante semanas porque te extirpan la médula ósea con quimioterapia, que paraliza tu sistema inmunológico, es arriesgado, costoso y requiere mucho tiempo. Eso es una gran barrera para escalar esto y hacer que esté disponible ampliamente. Es un gran obstáculo que podría superarse si alguien encuentra la manera de administrar el tratamiento directamente, sin ablación de la médula ósea. & Rdquo

    La escalabilidad y mdash llevar el tratamiento a las muchas personas que lo necesitan será un gran desafío si el tratamiento avanza hasta la aprobación de la FDA, tanto por los desafíos técnicos de crear el producto individualizado y administrar el protocolo de tratamiento, como por el costo. La investigación de enfoques in vivo, que podrían eliminar la necesidad de quimioterapia y disminuir los riesgos y gastos asociados, se encuentra en las primeras etapas, pero será un enfoque de quienes trabajan para hacer que las terapias basadas en CRISPR sean más accesibles para los trastornos sanguíneos en los próximos años. .

    CÁNCERES

    ANTECEDENTES DE LA ENFERMEDAD

    El cáncer se refiere a un grupo de enfermedades causadas por el crecimiento celular descontrolado. En este momento, las terapias basadas en CRISPR están dirigidas principalmente a tratar cánceres de la sangre como la leucemia y el linfoma. También se completó recientemente un ensayo en China para un tipo de cáncer de pulmón.

    ESTRATEGIA DE TRATAMIENTO

    Las células T, un tipo de glóbulo blanco esencial para la respuesta del sistema inmunológico, están cubiertas de receptores que reconocen a otras células como seguras o amenazadoras. Patrullan el cuerpo, matan células extrañas o peligrosas o reclutan otras células para ayudar. En la inmunoterapia CAR-T, los investigadores diseñan genéticamente las células T de un paciente para que tengan un receptor que reconozca las células cancerosas del paciente y les indique que ataquen. El sistema inmunológico está altamente regulado para evitar atacar las células sanas. Algunos receptores de células T funcionan como "puntos de control" que determinan si se produce una respuesta inmunitaria. Cuando un receptor de células T PD-1 entra en contacto con una molécula llamada PD-L1 en otra célula, comunica que es una célula "quosafe" y la célula T la deja sola.

    Las células cancerosas a menudo están envueltas en estas señales de seguridad molecular, engañando a las células T que patrullan para que las ignoren. Los investigadores están utilizando CRISPR para editar el gen PD-1 en las células T para evitar que produzcan receptores PD-1 funcionales para que no puedan ser engañados por las células cancerosas. Este enfoque de inmunoterapia se conoce como inhibición del punto de control y, a menudo, se usa junto con la ingeniería CAR-T para brindar a las células T la mayor probabilidad posible de eliminar el cáncer.

    Para estos tratamientos, los investigadores recolectan células T de la sangre de un paciente y las diseñan en un laboratorio. Luego, los devuelven al torrente sanguíneo del paciente por vía intravenosa. Debido a que este tratamiento se basa en la edición ex vivo, es fácil entregar las herramientas de edición del genoma a las células objetivo. La terapia CAR-T fue aprobada para su uso en el tratamiento de cánceres de sangre en 2017.

    ENSAYOS CLÍNICOS CRISPR ACTUALES

    En 2016, un paciente con cáncer de pulmón se convirtió en la primera persona en el mundo en ser tratado con una terapia CRISPR: a este paciente se le inyectaron células T editadas con PD-1 en un ensayo clínico chino. Este y un ensayo clínico estadounidense que utiliza inmunoterapias para el cáncer basadas en CRISPR se han completado. Se encuentran en curso varios otros ensayos clínicos que utilizan inmunoterapias basadas en CRISPR, principalmente para tratar cánceres de la sangre.

    En el estudio chino, investigadores del West China Hospital de la Universidad de Sichuan trataron a 12 pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas con células T editadas en PD-1. Este enfoque no incluyó CAR-T, ya que actualmente no es una opción para los cánceres de pulmón. Los principales objetivos de este estudio fueron probar si el tratamiento era seguro, tenía efectos secundarios tolerables y si provocaba una respuesta inmunitaria peligrosa.

    En abril de 2020, los resultados de este ensayo se publicaron en Medicina de la naturaleza. Los hallazgos informados incluyen:

    • El tratamiento fue seguro de administrar y tuvo efectos secundarios aceptables como fiebre, sarpullido y fatiga.
    • La edición deseada se encontró en una mediana del 6% de células T / paciente antes de la infusión de regreso al paciente.
    • Se observaron efectos fuera del objetivo y cambios no deseados en varios lugares del genoma y mdash a baja frecuencia y se produjeron principalmente en partes del genoma que no codifican proteínas. Los efectos en el objetivo y los cambios no deseados de mdash en el sitio de destino y mdash fueron más comunes (mediana del 1,69%).
    • Se encontraron células T editadas en 11 de 12 pacientes dos meses después de la infusión, aunque en niveles bajos. Los pacientes con niveles más altos de células editadas tuvieron menos progresión de la enfermedad.
    • Lee mas:
        & mdash Yu y col., Medicina de la naturaleza & mdash Lacey & amp Fraietta, Tendencias en medicina molecular
    • El primer ensayo de terapia basada en CRISPR en los EE. UU. Combinó enfoques de inmunoterapia CAR-T y PD-1, utilizando CRISPR para editar un total de tres genes. Este estudio de fase 1, dirigido por la Universidad de Pensilvania en conjunto con el Instituto Parker, comenzó a reclutar en 2018 y se completó en febrero de 2020. Al igual que el ensayo chino, los objetivos eran determinar si el tratamiento era seguro y tenía efectos secundarios aceptables. , no para curar a los pacientes. Se trató a dos pacientes voluntarios con cáncer avanzado de glóbulos blancos (mieloma) y uno con cáncer óseo metastásico (sarcoma). Los hallazgos informados son:

      • El tratamiento fue seguro de administrar y tuvo efectos secundarios aceptables.
      • Las células T se establecieron en la médula ósea y se mantuvieron en niveles estables durante los nueve meses del estudio.
      • Las biopsias de tumores mostraron que las células T podían encontrar e infiltrar tumores.
      • Rara vez se observaron efectos fuera del objetivo. Pero, con frecuencia se observaron cambios no deseados en el sitio de destino, con el 70% de las células mostrando al menos una mutación en o cerca del sitio de destino durante la fabricación. Después de la infusión y con el tiempo en los pacientes, el porcentaje de células con mutaciones disminuyó.
      • Lee mas:
          & mdash Stadtmauer et al., Ciencias
      • Juntos, estos estudios indican que la terapia CAR-T diseñada por CRISPR puede ser una línea de tratamiento prometedora: es segura, los efectos secundarios son tolerables y el tratamiento no induce una fuerte reacción inmunitaria.

        Ninguno de los tratamientos proporcionó una cura, pero el objetivo de estos estudios fue solo ver si el tratamiento era seguro y si debía desarrollarse más para el tratamiento, no para curar la enfermedad. Como primeros intentos, ambos ensayos cumplieron sus objetivos de demostrar seguridad y tolerabilidad.

        "Algo realmente interesante es que el estudio estadounidense mostró un porcentaje de los grandes reordenamientos genómicos que la gente teme", dice Hochstrasser. & ldquoPero el porcentaje de celdas con estos cambios en realidad disminuyó con el tiempo. Parecía que las células que tenían ese tipo de mutaciones estaban muriendo o eran superadas por las otras células. Por lo tanto, parecía que las células que no querrías tener en el cuerpo en realidad no se estaban quedando en el cuerpo, lo cual fue una sorpresa para mí y muy alentador. & Rdquo

        QUE OBSERVAR

        La FDA ya ha aprobado terapias CAR-T e inhibidores de la vía PD-1 que no utilizan la edición del genoma. Ésta es una razón para el optimismo: el trabajo de prueba de principio para estas terapias ya se ha realizado con éxito.

        Según Hochstrasser, & ldquoThe eficiencia de la edición & mdash significa, el porcentaje de celdas que realmente consiguieron ediciones & mdash no fue muy bueno en ninguna de las pruebas. Pero estos ensayos se aprobaron hace años y se realizaron con tecnología de 2016. Desde entonces, ha habido muchos avances en la tecnología. Por lo tanto, es una importante prueba de concepto en torno a la seguridad y la tolerabilidad inmediatas del tratamiento, y debemos ver si pueden aumentar la eficiencia de edición.

        Usando técnicas ahora disponibles, más potentes, ¿será mayor la eficiencia de edición? Y con una mayor eficiencia de edición, ¿funcionará la inhibición de puntos de control genético tan bien o mejor que los medicamentos bloqueadores de puntos de control? ¿La edición de PD-1 será tan o más efectiva que los tratamientos con anticuerpos que inhabilitan PD-1? Las investigaciones futuras deberán responder a estas preguntas.

        Para ver la revisión completa de los ensayos clínicos de CRISPR que se están llevando a cabo en 2021, que cubren enfermedades oculares, infecciones crónicas, una enfermedad rara de plegamiento de proteínas y qué buscar a continuación de las terapias basadas en CRISPR, consulte el artículo completo del Innovative Genomics Institute.

        Por Hope Henderson, Instituto de Genómica Innovadora, marzo de 2021


        Resultados

        CRISPR como una memoria probabilística de fagos.

        Consideramos un modelo de infección donde las bacterias encuentran j = 1,…, K tipos de fagos, cada uno con probabilidad f j. Por simplicidad, se considera que todos los tipos de fagos son igualmente infecciosos y tienen tasas de crecimiento similares, condiciones que se relajan fácilmente. En el mecanismo CRISPR para la inmunidad adaptativa, las bacterias incorporan fragmentos de ADN del fago (espaciadores) en un casete CRISPR. Tras una infección posterior, las bacterias reclutan complejos CRISPR-Cas con espaciadores que coinciden con el fago invasor para escindir el ADN viral (Fig. 1).

        Inmunidad CRISPR en bacterias. Una bacteria (rectángulo bordeado) con maquinaria CRISPR encuentra un conjunto diverso de fagos (colores). El locus CRISPR-Cas se transcribe y luego se procesa para unir proteínas Cas (óvalos grises) con distintos espaciadores (colores), produciendo así complejos CRISPR-Cas. El complejo con un espaciador que es específico del ADN del fago inyectado (del mismo color) puede degradar el material viral y proteger a la bacteria de la infección.

        Suponga que los casetes CRISPR contienen L espaciadores en total y que una bacteria individual mantiene una población de complejos de proteínas N p Cas que pueden reclutarse para escindir invasores. La configuración del espaciador se puede caracterizar en términos de un vector s = con entradas que cuentan el número de espaciadores específicos para cada tipo de fago. El tamaño total del casete es la suma de s j, es decir, ∑ j s j = L, y cuantifica la cantidad de memoria inmune almacenada por una bacteria individual. Describimos la configuración del fago en un evento de infección dado como un vector v de longitud K con entradas que indican la presencia (1) o ausencia (0) de cada tipo viral. Finalmente, definimos la configuración de los complejos d = como un vector con entradas que cuentan el número de complejos específicos de cada fago durante la respuesta CRISPR. El número total de complejos es la suma de d j, es decir, ∑ j d j = N p. En términos de estas variables, la probabilidad de sobrevivir a una infección por fagos utilizando el mecanismo de defensa CRISPR-Cas es P supervivencia = 1 - ∑ vp V (v) ∑ s 1 + s 2 + ⋯ = L p S (s ∣ L) × ∑ re 1 + re 2 + ⋯ = N p 1 - α (v, re) q (re s). [1] Aquí p V (v) es la probabilidad de encontrar la configuración de fagos v, p S (s ∣ L) es la probabilidad de tener una configuración de casete s de longitud L, α (v, d) es la probabilidad de detectar todos los tipos virales presentes en v dada la configuración d de complejos, yq (d ∣ s) es la probabilidad de producir la configuración d CRISPR-Cas dado el conjunto de espaciadores sy N p Cas complejos proteicos.

        Incluso si el número de tipos de fagos excede el número de complejos (K ≫ N p), las bacterias pueden sobrevivir porque asumimos que una infección típica solo involucra unos pocos tipos virales (o incluso solo uno). En este escenario, un fago infectante atacará a una parte de una gran población bacteriana. Con cassettes que muestrean espaciadores al azar, es probable que al menos algunos individuos atacados contengan espaciadores específicos del fago y, por lo tanto, sobrevivan. Los mecanismos innatos también conducirán a la supervivencia de algunas bacterias sin espaciadores específicos, aunque no modelamos explícitamente esta contribución a la inmunidad. Las bacterias supervivientes y los individuos que no fueron atacados se replicarán y mantendrán la población. En este contexto, cuando llegue la siguiente infección, los casetes de la población bacteriana se extraerán de nuevo de forma eficaz al azar en relación con la nueva infección. Es decir, aunque los casetes se enriquecerán para reflejar la infección previa, la mayoría de los espaciadores aún se distribuirán al azar de modo que los casetes de diferentes bacterias individuales no estarán correlacionados en gran medida. En encuentros repetidos, los ciclos de enriquecimiento conducirán a casetes que reflejan la distribución de fagos. Este escenario sería desafiado si los fagos son muy diversos (K & gt & gt N p), las nuevas infecciones ocurren rápidamente (más rápido que los tiempos de replicación bacteriana de 1/2 a 1 h) y las infecciones llevan grandes cargas virales (en relación con el tamaño de la colonia). . En este caso, la población bacteriana no tendrá tiempo para equilibrarse entre los ataques y puede necesitar otros mecanismos de defensa además de CRISPR para sobrevivir.

        La forma de la función de probabilidad de detección α (v, d) depende del mecanismo específico utilizado por la maquinaria CRISPR para unirse y degradar un fago. Sin embargo, se requiere un número crítico de complejos específicos, dc, para que la maquinaria CRISPR logre la focalización a las velocidades medidas en los experimentos (32). Este número crítico depende implícitamente del tamaño celular, las constantes de difusión, las escalas de tiempo de la infección por fagos y el reconocimiento de la diana, y las constantes de disociación / asociación entre las secuencias espaciadoras y protoespaciadoras. Por debajo de este valor crítico, la detección es menos probable y por encima del valor crítico aumenta la probabilidad de detección.Consideramos dos formas funcionales para la probabilidad de que un tipo de fago particular pueda detectarse con d complejos específicos: 1) una restricción estricta α (d) = θ (d - dc), donde θ (x) es una función escalonada y es 0 si x & lt 0 y 1 si x & gt 0, y 2) una restricción suave α (d) = dhdh + dch. En ambos casos, d c es un parámetro de eficacia que depende de las tasas bioquímicas y determina el umbral en d por debajo del cual la detección es rara y por encima del cual la detección es común. La primera forma funcional (función escalonada) describe un comportamiento similar al de un interruptor en el que los complejos se unen al ADN del fago si superan una determinada concentración d & gt d c. La segunda forma imita una respuesta similar a la de Hill, donde la posibilidad de unión aumenta gradualmente con el número de complejos. Aquí permitimos que la unión de los complejos Cas con la unión del ADN del fago sea cooperativa. A medida que aumenta la cooperatividad h, el comportamiento de unión se vuelve cada vez más similar a un interruptor.

        En nuestro marco, asumimos que la incorporación del espaciador ocurre cuando el fago infectante es defectuoso o si entra en juego algún otro mecanismo de inmunidad. Luego, estamos considerando la probabilidad posterior de sobrevivir a los fagos debido a la maquinaria CRISPR-Cas cuando el espaciador ya está presente. La probabilidad de supervivencia aumentará cuando se incluyan también otras formas de inmunidad (por ejemplo, inmunidad innata y efectos de detección de quórum). Es importante destacar que CRISPR no es la primera línea de defensa, y otros mecanismos antifágicos pueden preceder o complementar el sistema CRISPR (33). El efecto neto de estos mecanismos adicionales puede modelarse incluyendo una línea de base distinta de cero en la función de probabilidad de detección α. Por lo tanto, nuestro modelo describe la ventaja de supervivencia adicional conferida por tener CRISPR como una memoria a largo plazo del paisaje de fagos. Debido a esto, una población bacteriana no necesita estar en peligro de extinción incluso si la contribución de CRISPR a la supervivencia es relativamente pequeña.

        Hay una cantidad óptima de memoria.

        En entornos realistas, podemos hacer suposiciones simplificadoras sobre el modelo general en la ecuación. 1. Por ejemplo, podemos suponer que las infecciones exitosas de una bacteria por diferentes fagos ocurren con baja probabilidad y son independientes. Por supuesto, una bacteria determinada puede ser infectada por múltiples fagos a lo largo de su vida. Dado que la probabilidad de que una bacteria se encuentre simultáneamente con múltiples fagos es pequeña, asumimos que los encuentros son secuenciales (es decir, el vector de configuración viral v tiene una única entrada distinta de cero).

        En segundo lugar, asumimos que el linaje de una bacteria se encuentra con muchos y diversos tipos de fagos durante varias generaciones, es decir, K ≫ 1. Debido a que los fagos mutan fácilmente, hay sutileza sobre lo que define a un tipo. Usamos una definición funcional: un tipo de fago se define por su reconocimiento específico por un espaciador dado. A veces, después de que una bacteria se vuelve inmune a un fago, las mutaciones puntuales en el virus pueden producir escapes que evaden el reconocimiento. Según nuestra definición, estos fugitivos son efectivamente un nuevo tipo de virus que la población bacteriana debe tratar secuencialmente en futuras infecciones (34 ⇓ ⇓ –37).

        En tercer lugar, suponemos que los espaciadores se muestrean uniformemente a partir de la distribución de fagos a lo largo del tiempo. En otras palabras, asumimos que los procariotas recogen espaciadores de los fagos a medida que se encuentran. Entonces, si encuentran diversos virus, tendrán diversas matrices y la distribución de fagos se reflejará naturalmente en la distribución de espaciadores. La incorporación de tal distribución es sencilla, asumiendo que la probabilidad p i de que se incorpore un espaciador es una función del tipo i viral. Sin embargo, esta distribución no se conoce experimentalmente. Por lo tanto, hacemos una suposición mínima de que todos los tipos de fagos son igualmente probables y ocurren con probabilidad 1 / K. Esta es una suposición conservadora porque la memoria inmune bacteriana confiere la menor ventaja cuando se enfrenta a un entorno de fagos insesgado (es decir, mínimamente informativo). En efecto, nos centramos en las características estadísticas a largo plazo de la inmunidad y no en la carrera armamentista coevolutiva a corto plazo entre la bacteria y el fago.

        Finalmente, asumimos que los encuentros de fagos a partir de los cuales se adquieren espaciadores ocurren aleatoriamente. Por tanto, cada espaciador del casete CRISPR tiene una probabilidad de 1 / K de ser específico para un fago dado. Dado que el tamaño del casete es mucho más pequeño que el número de tipos virales (L ≪ K), también se deduce que el casete normalmente tendrá uno o ningún espaciador que pueda apuntar a un tipo de fago en particular; en otras palabras, si = 0,1 ( pero vea a continuación un análisis que permite múltiples espaciadores de cada fago).

        En general, es probable que la distribución de espaciadores sea más uniforme que la distribución de fagos. Mecánicamente, una vez que un procariota tiene un espaciador que funciona bien para un fago dado al apuntar a una región conservada evolutivamente en su genoma, habrá menos ocasiones a largo plazo para adquirir muchos espaciadores adicionales del mismo virus ya que las defensas existentes funcionan, aunque a corto plazo, el direccionamiento CRISPR puede producir fagos defectuosos que fomentan la incorporación de espaciadores adicionales. (Ver Apéndice SI para discutir el cebado y los efectos de múltiples espaciadores específicos.) En escalas de tiempo más largas, es probable que se incorporen espaciadores de virus nuevos, lo que lleva a una distribución de espaciadores que es más uniforme que la distribución de virus. Desde un punto de vista estratégico, una vez que existe una defensa suficientemente efectiva contra las amenazas comunes, es estadísticamente más efectivo dedicar los recursos restantes preferentemente a amenazas raras. De hecho, aunque fenómenos como el cebado pueden llevar a la adquisición de múltiples espaciadores contra un virus dado (23 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –30), varios estudios han demostrado que tener solo unos pocos espaciadores de un tipo de fago dado es en gran medida suficiente para neutralizar las reinfecciones. (6, 8, 16 ⇓ ⇓ –19). Esto significa que la distribución de los espaciadores debe ser más uniforme que la distribución de los patógenos, es decir, se debe dar más peso a las infecciones raras de lo que justifica su frecuencia, sugiriendo nuevamente que una distribución uniforme de los espaciadores será una aproximación razonable. Se hicieron observaciones similares sobre el sistema inmunológico adaptativo de los vertebrados en las refs. 38 y 39. El cribado de RNA-seq en condiciones de laboratorio ha mostrado una expresión variable de espaciadores en casetes CRISPR, típicamente acompañada de un declive gradual desde el extremo líder, aunque puede haber promotores internos que conduzcan a una mayor expresión de espaciadores distales (12 ⇓ –14 ). Aproximaremos estos patrones de expresión esporádicos como un promedio constante a través de espaciadores cuya expresión es lo suficientemente alta como para montar una defensa contra los fagos.

        Derivamos una expresión para la probabilidad de sobrevivir a una infección por fagos, dado el tamaño del casete L, el número de complejos Cas N p y la diversidad de la población de fagos K (Materiales y métodos y Eq. 3). A través de una amplia gama de parámetros y para varias opciones de funciones de probabilidad de detección α (v, d), encontramos que hay una cantidad óptima de memoria, que consta de unas pocas decenas de espaciadores en el casete CRISPR, para maximizar la probabilidad de supervivencia (Fig. .2 y Fig. S1). El óptimo se produce porque existe una compensación entre la cantidad de memoria almacenada en los casetes CRISPR y la eficacia con la que una bacteria puede utilizar sus recursos limitados (es decir, proteínas Cas) para convertir la memoria en una respuesta funcional. Si el casete CRISPR es demasiado pequeño, las bacterias no recuerdan los encuentros pasados ​​con fagos lo suficientemente bien como para defenderse de futuras infecciones. Por otro lado, si el casete es demasiado grande, los complejos Cas se unen con poca frecuencia al espaciador correcto para proporcionar una inmunidad eficaz contra un virus invasor particular. La cantidad óptima de memoria inmune (tamaño del casete) debe estar entre estos dos extremos, con detalles que dependen de la diversidad de fagos, el número de complejos de Cas y la función de probabilidad de detección α (v, d) (Fig.2 y Materiales y métodos).

        Existe una cantidad óptima de memoria inmunológica. El mapa de calor muestra la probabilidad de sobrevivir a una infección por fagos, P supervivencia, en función del tamaño del casete y la diversidad de fagos con N p = 700 complejos Cas. La supervivencia de P se puede interpretar como el tamaño fraccional de la población que persistirá después de los ataques secuenciales de fagos si CRISPR es el único mecanismo de defensa. La función de probabilidad de detección es una función escalonada α (d) = θ (d - d c) con umbral d c = 8, lo que implica que la detección de un fago requiere al menos d c complejos unidos a los espaciadores correspondientes. Para cualquier número de tipos de fagos, existe un tamaño de casete óptimo. Consulte la Fig. S1 para ver las diferentes opciones de N p, d c y formas funcionales para α.

        La memoria óptima depende de la diversidad de fagos.

        ¿Cómo depende la cantidad óptima de memoria CRISPR de la diversidad de amenazas virales? Si hay relativamente pocos tipos de fagos, una estrategia óptima para una bacteria sería mantener una memoria eficaz para la mayoría de las amenazas y hacer coincidir las variantes virales con un casete cuyo tamaño crece con la diversidad viral. Esta estrategia de emparejamiento fracasará finalmente a medida que aumenta la diversidad de la población de fagos si el número de proteínas Cas (N p) es limitado. Examinamos esta compensación midiendo el tamaño de casete óptimo a medida que variamos la diversidad viral (K) mientras manteníamos fija la maquinaria CRISPR (N p y la probabilidad de detección α (v, d)).

        Para caracterizar la diversidad viral, definimos un parámetro κ = K / N p como la relación entre el número de tipos de fagos (K) y el número de complejos Cas (N p). Cuando la diversidad de fagos es baja (κ ≤ 1), la cantidad óptima de memoria (número de espaciadores en una célula) aumenta sublinealmente con la heterogeneidad viral (Fig. 3), aproximadamente como una ley de potencia. Cuando la probabilidad de detección α (v, d) es casi similar a un interruptor, el tamaño óptimo del casete se escala aproximadamente como L ∼ K (Fig.3 A y B derivación analítica para d c = 1 en Apéndice SI). Esto implica que cuando la diversidad viral es baja, la cantidad de memoria debería aumentar con la diversidad, pero en realidad es beneficioso no retener un recuerdo de todos los encuentros previos con fagos. Olvidar algunos encuentros permitirá a la bacteria montar una respuesta más fuerte contra amenazas futuras al involucrar un mayor número de complejos Cas para las amenazas que se recuerdan. Esta sublinealidad en la cantidad óptima de memoria se vuelve más fuerte a medida que aumenta el número de complejos CRISPR-Cas específicos de fago necesarios para una respuesta eficaz, dc.

        La cantidad óptima de memoria inmunológica depende de la diversidad viral. Los paneles muestran el tamaño de casete óptimo (L) en relación con el número de complejos Cas (N p) parametrizados como λ = L / N p, en función de la diversidad viral (K) en relación con el número de complejos parametrizados como κ = K / N p. Examinamos maquinarias CRISPR con diferentes funciones de probabilidad de detección: (A) probabilidad de detección similar a un interruptor con una función escalonada α (d) = θ (d - d c) y un modelo más suave α (d) = d h / (d h + d c h) con (B) h = 10 que conduce a una probabilidad de detección casi similar a un interruptor y (C) h = 2 que conduce a una transición más suave entre la probabilidad de detección baja y alta. Aquí dc es un umbral efectivo sobre el número de complejos (d) requeridos para detectar fagos con alta probabilidad.

        Cuando la diversidad de fagos es alta (κ & gt 1), la cantidad óptima de memoria depende del mecanismo CRISPR a través del umbral de respuesta d c, pero es independiente de la heterogeneidad viral siempre que d c ≥ 2 (Fig.3 ver Apéndice SI para discutir el caso especial d c = 1). En la naturaleza, se espera que los fagos sean muy diversos (K ≫ N p). Por lo tanto, nuestro modelo predice que el tamaño del casete de una bacteria está determinado por el nivel de expresión de los complejos Cas N p y el umbral de detección dc del mecanismo CRISPR particular que utiliza la especie.

        La memoria aumenta con la eficacia de la detección.

        La eficacia de la detección depende de dos parámetros clave: 1) el umbral de detección d cy 2) el número de proteínas Cas disponibles N p. En la Fig.4, mostramos que el tamaño de casete óptimo para defenderse contra una población de fagos diversa (κ = K / N p ≫ 1) decae como una ley de potencia del umbral de detección ∼ (dc / N p) - β con un exponente β ≃ 1 (Materiales y métodos). Esta desintegración se produce porque los espaciadores transcritos compiten para formar complejos con las proteínas Cas, por lo tanto, tener espaciadores más distintos efectivamente disminuye el número promedio de complejos que serían específicos para cada infección. Por tanto, cuanto menor sea el tamaño del casete, más probable será que se produzcan los complejos específicos de dc necesarios para una respuesta CRISPR eficaz. El tamaño de casete óptimo es un compromiso entre este impulso por tener menos memoria y el impulso por tener una defensa que abarque el panorama patógeno.

        La cantidad óptima de memoria inmunológica depende del umbral de detección. La figura muestra el tamaño de casete óptimo en relación con el número de proteínas Cas, λ = L / N p, en función del umbral para detectar un fago, también en relación con el número de proteínas Cas, d c / N p. Consideramos diferentes formas funcionales de la probabilidad de detección: (A) función de paso con un umbral de detección agudo α (d) = θ (d - d c) y (B y C) Funciones de colina, α (d) = d h / (d h + d c h), con h = 10 en B y h = 3 en C. Se considera que los tipos de fagos son 1.000 veces más numerosos que el número de complejos (κ = K / N p = 1.000). (Recuadros) El tamaño de casete óptimo se escala como L = C (d c / N p) - β sobre un rango realista de valores para el número de complejos y umbrales de detección de fagos en una sola célula bacteriana. Los mejores ajustes se muestran en cada caso con (A) β = 0,9 y C ∼ 1, (B) β = 1 y C ≃ 0,7, y (C) β = 1 y C ≃ 0.8.

        Si la probabilidad de detección depende en gran medida del número de complejos ligados con un umbral d c (Fig.4A), en una primera aproximación, menos de dc complejos unidos a un espaciador específico son inútiles, ya que la detección sigue siendo poco probable, y más grande que este número es un desperdicio, ya que no mejoraría la detección. En este caso, si la expresión de la proteína Cas fuera un proceso determinista, sería óptimo tener un casete con espaciadores N p / dc, cada uno de los cuales podría expresarse y unirse a complejos dc exactamente, prediciendo que L = (dc / N p) - 1. Sin embargo, dado que la expresión génica es intrínsecamente estocástica, a veces habría más de dc complejos unidos para un espaciador dado y, a veces, menos. Esta propagación estocástica, que surge en parte debido a efectos de tamaño finito, debilita la dependencia del tamaño óptimo del casete en el umbral dc, lo que hace que el exponente β y el coeficiente C sean ligeramente & lt1 en la escala de tamaño de casete óptimo L ∼ C (dc / N p ) - β (Figura 4, Recuadros) ver Materiales y métodos para una derivación más detallada. Si el umbral de detección es suave, la eficacia del mecanismo CRISPR depende menos de tener al menos complejos dc, específicos de un fago. Además, tener un número de complejos ligeramente mayor que el umbral de detección puede aumentar la probabilidad de detección. Estos efectos se combinan para producir una escala entre el tamaño de casete óptimo y la eficacia de detección, L ∼ (d c / N p) - 1 (Fig.4 B y C).

        En resumen, nuestro modelo predice que un mecanismo CRISPR más eficaz (es decir, tener un umbral de detección más bajo dc o un mayor número de complejos N p) debería estar asociado con una mayor cantidad de memoria inmunológica.

        Nuestro modelo también proporciona una estimación del número típico de espaciadores por célula en poblaciones bacterianas que contrarrestan un conjunto diverso de patógenos (régimen de K ≫ N p). Suponga que el número típico de complejos Cas es N p ∼ 1,000, comparable al número de copias de otras proteínas en una célula bacteriana (40, 41), y que la detección rápida de un fago infectante requiere un número modesto de complejos CRISPR-Cas activados , con un umbral de detección en el rango de cc ∼ 10 a 100 (32). Nuestro modelo predice entonces que el repertorio inmune óptimo debería estar en el rango de L ∼ 10 a 100, consistente con las observaciones empíricas (2, 7 ⇓ ⇓ ⇓ –11).

        Memoria óptima con múltiples espaciadores específicos.

        Los casetes CRISPR pueden contener más de un espaciador específico para un virus determinado. Esto puede suceder, por ejemplo, debido al cebado, donde la presencia de algunos espaciadores que coinciden al menos parcialmente con un fago invasor puede llevar a la adquisición de espaciadores adicionales (23 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –30), aumentando la efectividad del CRISPR -Cas sistema contra virus recurrentes o de alta abundancia. Por otro lado, tener solo unos pocos espaciadores de un tipo de fago dado parece en gran medida suficiente para neutralizar las reinfecciones (6, 8, 16 ⇓ ⇓ -19), incluso de virus coevolutivos. Además, experimentalmente, se sabe que los casetes CRISPR de tipo salvaje se dirigen a diversos fagos en lugar de tener principalmente espaciadores que apuntan a unas pocas amenazas.

        Por lo tanto, generalizamos nuestro modelo para permitir que los espaciadores máximos de 1 & lt s & lt s se adquieran de cada tipo de fago (detalles en Apéndice SI). Siguiendo las refs. 6, 8 y 16 ⇓ ⇓ –19, se espera que el parámetro s max sea un número pequeño del orden de unos pocos. En este caso, el número óptimo de espaciadores sigue siendo similar al resultado descrito anteriormente cuando había como máximo un espaciador para cada fago (Apéndice SI, Figs. S3 y S4). Para completar, también probamos los efectos de permitir que s max sea ilimitado. En este caso, cuando la diversidad de especies de fagos es alta como se esperaba (15), los resultados nuevamente no cambian. Esto se debe a que tener muchos espaciadores de un tipo de fago tiene el costo de no detectar algún otro tipo de fago cuando el número de complejos está limitado por N p. Si la diversidad de fagos es suficientemente baja, tener muchos espaciadores para cada virus no excluye que ningún tipo de fago único esté bien representado, por lo tanto, el tamaño del repertorio inmune en este escenario no está limitado.


        Una nueva herramienta CRISPR enciende y apaga los genes como un interruptor de luz

        La versión clásica del niño prodigio de la edición de genes literalmente corta un gen en pedazos solo para apagarlo. Es efectivo, sí. Pero es como pasar un cable eléctrico por una trituradora de papel para apagar una bombilla que no funciona bien. Una vez que se cortan los cables, no hay vuelta atrás.

        ¿Por qué no agregar un interruptor de luz en su lugar?

        Este mes, un equipo de la Universidad de California, San Francisco (UCSF) reinventó CRISPR para hacer precisamente eso. En lugar de actuar directamente sobre los genes, cortando o intercambiando letras genéticas irrevocablemente, la nueva variante CRISPR se dirige a la maquinaria biológica que activa o desactiva los genes de forma natural.

        ¿Traducción? CRISPR ahora puede "activar un interruptor de luz" para controlar los genes, sin siquiera tocarlos directamente. Se pone mejor. La nueva herramienta, CRISPRoff, puede hacer que un gen permanezca en silencio durante cientos de generaciones, incluso cuando sus células huésped se transforman de células madre en células más maduras, como las neuronas.Una vez que los genes de la "bella durmiente" están listos para despertar, una herramienta complementaria, CRISPRon, vuelve a encender el interruptor de la luz.

        Esta nueva tecnología "cambia el juego, así que ahora básicamente estás escribiendo un cambio [en genes] que se transmite", dijo el autor Dr. Luke Gilbert. "De alguna manera, podemos aprender a crear una versión 2.0 de CRISPR-Cas9 que sea más segura e igual de efectiva".

        Estás bromeando. ¿Cómo?

        El quid es algo llamado epigenética. Es un sistema completo de sustancias químicas y proteínas que controla si un gen está activado o desactivado.

        Si eso suena confuso, comencemos con el aspecto real de los genes dentro de una célula y cómo se activan. Al "encender", me refiero a que los genes se convierten en proteínas, lo que construye nuestra forma física, controla nuestro metabolismo y nos hace funcionar como seres humanos vivos y que respiran.

        Los genes están incrustados dentro de cadenas de ADN que se envuelven muy firmemente alrededor de una proteína central, algo así como espárragos envueltos en tocino. Para que los genes se activen, el primer paso es que necesitan un montón de proteínas para arrancar suavemente la cadena de ADN de los "espárragos", de modo que los genes ahora floten libremente dentro de su cápsula espacial celular, llamada núcleo.

        Una vez que ese trozo de ADN de tocino está libre, más proteínas se apresuran a agarrarse al gen. Luego, bajarán los nucleótidos del gen (A, T, C y G) como una cortadora de césped. Sin embargo, en lugar de mantillo, esta “máquina” biológica arroja un mensajero que le dice a la célula que comience a producir proteínas: ARNm. (Sí, lo mismo que fabrica algunas de nuestras vacunas Covid-19). El ARNm dirige la fábrica de proteínas de nuestras células para que comience la producción, y voilà, ¡ese gen ahora está encendido!

        Cualquier cosa que interrumpa este proceso debilita la capacidad del gen para convertirse en proteínas, esencialmente apagándolo. Es enormemente poderoso, porque una sola máquina epigenética puede controlar cientos o miles de genes. Es un interruptor de luz maestro para el genoma.

        El escritor de memoria genética

        El equipo comenzó con un sistema CRISPR que tiene un Cas9 castrado. Esto significa que la proteína que normalmente participa en el corte de un gen, Cas9, ya no puede cortar el ADN, incluso cuando está atada al lugar correcto por el otro componente, el ARN guía "sabueso". Luego agregaron una proteína que está involucrada en la desactivación de genes para esta versión de CRISPR.

        Aquí está la parte inteligente: la proteína está diseñada para secuestrar un proceso epigenético natural para desactivar genes. Los genes a menudo se desactivan mediante un proceso natural llamado "metilación". Normalmente, el proceso es transitorio y reversible en un gen. CRISPRoff controla este proceso y, a su vez, apaga cualquier gen objetivo, pero durante un período de tiempo mucho más largo, sin destruir físicamente el gen.

        Gracias al poder de "mejora" de la epigenética, CRISPRoff permite a los investigadores ir en grande. En un experimento dirigido a más de 20.000 genes dentro de células renales humanas inmortalizadas con CRISPRoff, el equipo pudo apagar esos genes de manera confiable.

        No satisfecho con una calle de un solo sentido, el equipo diseñó a continuación una variante CRISPR similar, con una proteína diferente relacionada con la epigenética, denominada CRISPRon. En las células dentro de las placas de Petri, CRISPRon pudo anular CRISPRoff y, a su vez, reactivar los genes.

        "Ahora tenemos una herramienta simple que puede silenciar la gran mayoría de genes", dijo el autor del estudio, el Dr. Jonathan Weissman. & # 8220 Podemos hacer esto para múltiples genes al mismo tiempo sin ningún daño en el ADN ... y de una manera que se puede revertir ”.

        Ir a la distancia

        Aún más loco, el interruptor de apagado duró generaciones. Cuando el equipo desactivó un gen relacionado con el sistema inmunológico, persistió durante 15 meses, después de unas 450 generaciones celulares.

        Las ediciones también duraron una transformación fundamental, es decir, el viaje de una célula de una célula madre pluripotente inducida (iPSC) a una neurona. Las iPSC a menudo comienzan como células de la piel y se rejuvenecen en células madre a través de un baño químico, cuando luego realizan un segundo viaje para convertirse en neuronas. Este proceso a menudo borra los cambios epigenéticos. Pero para sorpresa de los autores, la influencia de CRISPRoff se mantuvo durante las transformaciones. En un experimento, el equipo descubrió que apagar un gen relacionado con el Alzheimer en las iPSC también reducía la cantidad de proteínas tóxicas codificadas posteriormente en las neuronas resultantes.

        “Lo que mostramos es que esta es una estrategia viable para silenciar a Tau y evitar que esa proteína se exprese”, dijo Weissman, destacando solo una forma en que CRISPRoff, y el control del epigenoma en general, puede alterar la medicina.

        CRISPR 2.0

        Esta no es la primera vez que alguien intenta apuntar al epigenoma con CRISPR. El mismo equipo experimentó anteriormente con otro conjunto de variantes de CRISPR que intentaron lo mismo. La diferencia entre los dos es el tiempo y la estabilidad. Con la configuración anterior, los científicos lucharon por mantener el "interruptor de luz" apagado durante una sola generación. El nuevo no tiene problemas para mantener los cambios a través de múltiples divisiones y transformaciones en el genoma.

        Una herramienta CRISPR confiable para la epigenética es increíblemente poderosa. Aunque tenemos medicamentos que funcionan de manera similar, son mucho menos precisos y tienen una dosis de efectos secundarios. Sin embargo, por ahora, CRISPRoff y CRISPRon solo funcionan en células en placas de Petri, y el siguiente paso hacia la supremacía genómica sería garantizar que funcionen en los seres vivos.

        Si ese es el caso, podría cambiar la edición genética para siempre. Desde la reprogramación de circuitos biológicos en biología sintética hasta el secuestro o reversión de circuitos para prevenir enfermedades, la reprogramación epigenética ofrece una manera de hacerlo todo sin tocar un gen, evitando la amenaza de mutaciones, al tiempo que produce efectos duraderos a través de generaciones.

        “Creo que nuestra herramienta realmente nos permite comenzar a estudiar el mecanismo de heredabilidad, especialmente la heredabilidad epigenética, que es una gran pregunta en las ciencias biomédicas”, dijo el autor del estudio, el Dr. James Nuñez.


        Variabilidad en la durabilidad de la inmunidad CRISPR-Cas

        La durabilidad de la resistencia del huésped se ve desafiada por la capacidad de los patógenos para escapar de la defensa de sus huéspedes. Comprender la variabilidad en la durabilidad de la resistencia del huésped es de suma importancia para diseñar estrategias de control más efectivas contra las enfermedades infecciosas. Aquí, estudiamos la durabilidad de varias repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas -Cas (CRISPR-Cas) alelos de la bacteria Streptococcus thermophilus contra los fagos líticos. Encontramos una variabilidad sustancial en la durabilidad entre diferentes bacterias resistentes. Dado que el escape del fago es impulsado por una mutación en la secuencia del fago dirigida por CRISPR-Cas, exploramos los costos de aptitud asociados con estas mutaciones de escape. Descubrimos que, en promedio, las mutaciones de escape disminuyen la aptitud del fago. Sin embargo, la magnitud de este costo de aptitud no predice la durabilidad de la inmunidad CRISPR-Cas. Sostenemos que esta variabilidad en la durabilidad de la resistencia puede deberse a variaciones en la tasa de mutación del fago o en la proporción de mutaciones letales en el genoma del fago. Estos resultados tienen implicaciones importantes sobre la dinámica coevolutiva entre bacterias y fagos y para el despliegue óptimo de estrategias de resistencia contra patógenos y plagas. Comprender la durabilidad de la inmunidad CRISPR-Cas también puede ayudar a desarrollar estrategias de impulso genético más efectivas basadas en la tecnología CRISPR-Cas9.

        Este artículo es parte de un tema de una reunión de debate "La ecología y evolución de los sistemas inmunitarios adaptativos CRISPR-Cas procarióticos".

        1. Introducción

        La salud pública y la agricultura se ven constantemente amenazadas por la propagación de enfermedades infecciosas. Se ha desarrollado un arsenal de diversas estrategias profilácticas y terapéuticas para limitar la circulación de patógenos (por ejemplo, introgresión de genes de resistencia en variedades de plantas, uso de fármacos antimicrobianos). Sin embargo, la eficacia de esas intervenciones puede verse erosionada rápidamente por la evolución de las poblaciones de patógenos [1–4]. Es importante señalar que las distintas estrategias de defensa pueden conducir a resultados evolutivos muy diferentes. Por ejemplo, se sabe que la inmunidad imperfecta selecciona más agresividad y virulencia en los patógenos [5,6]. Además, las distintas estrategias de defensa pueden diferir en su nivel de durabilidad. ¿Por qué algunas estrategias de defensa del huésped se superan muy rápidamente mientras que otras siguen siendo efectivas durante un largo período de tiempo [4,7,8]? Una mejor comprensión de la durabilidad de las defensas del huésped (definida como la inversa de la velocidad de adaptación del patógeno a esas defensas) es clave para el desarrollo de estrategias de gestión sostenible de patógenos y plagas [7,9].

        Los estudios empíricos y experimentales en patosistemas vegetales han desempeñado un papel clave en la identificación de los principales factores que actúan sobre la durabilidad de la resistencia del huésped [4,7,9-11]. Por ejemplo, se sabe que el tipo de resistencia de la planta tiene un impacto significativo en la velocidad de adaptación de patógenos. Cualitativo resistencia, una respuesta de todo o nada, a menudo se considera menos duradera que cuantitativo resistencia, que reduce la progresión de la enfermedad en la planta. Este efecto generalmente se atribuye al determinismo genético más simple de la adaptación del patógeno a la resistencia cualitativa que involucra unos pocos (o incluso uno solo) genes de virulencia importantes [12]. Por el contrario, la adaptación al determinismo poligénico de la resistencia cuantitativa requiere múltiples mutaciones de patógenos [13, 14]. Sin embargo, la resistencia cualitativa presenta mucha variación en la durabilidad [4]. Una explicación clásica de esta variación en la durabilidad implica restricciones selectivas que actúan sobre la población de patógenos. Más específicamente, es probable que la defensa del huésped sea más duradera si las mutaciones (alelos de virulencia) que permiten al patógeno escapar de la resistencia cualitativa están asociadas con costos de aptitud [4,12]. La comprensión de las limitaciones selectivas que actúan en los sitios objetivo de los diferentes mecanismos de resistencia puede ayudar a predecir la durabilidad de la resistencia y limitar la velocidad de adaptación del patógeno [4, 15]. Probar esta hipótesis, sin embargo, es a menudo difícil en patosistemas vegetales donde la medición de la durabilidad de los mecanismos de resistencia específicos en experimentos controlados plantea dificultades prácticas [16, 17].

        Aquí, usamos la interacción entre las bacterias y sus bacteriófagos (o fagos) líticos para estudiar los factores que modulan la durabilidad de la resistencia del huésped. Las bacterias tienen acceso a una amplia gama de sistemas de defensa para defenderse de los fagos [18-21]. Entre estos distintos sistemas de defensa, las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas — genes asociados con CRISPR CRISPR-Cas tiene la capacidad única de generar cientos de alelos diferentes de resistencia dirigidos a diferentes sitios en el genoma del fago [22]. Aquí, aprovechamos esta propiedad única para explorar la variabilidad en la durabilidad entre distintos alelos de resistencia CRISPR-Cas dirigidos al mismo fago. CRISPR-Cas es una defensa inmune procariota adaptativa que integra en el locus CRISPR (integración de un espaciador) una pequeña secuencia de ADN de fago (el protoespaciador, aquí de 30 pb de largo) de un genoma invasor y utiliza esta memoria para apuntar y degradar la invasión posterior coincidencia de ADN (interferencia) [23]. Para seleccionar e integrar un protoespaciador específico de un ácido nucleico extraño en su matriz CRISPR, muchos sistemas CRISPR-Cas se basan en una secuencia de 2-5 pb, el motivo adyacente del protoespaciador (PAM) [24], que flanquea un lado de la secuencia del protoespaciador y obligatorio para la integración e interferencia del espaciador. Dado su tamaño, el PAM está presente en numerosas ocasiones en el genoma del fago, lo que conduce potencialmente a cientos de diferentes resistencias dirigidas a varios protoespaciadores [22].

        Para estudiar la variabilidad en la durabilidad de la resistencia CRISPR, monitoreamos la evolución del fago virulento 2972 ​​contra la matriz CRISPR1 de Streptococcus thermophilus DGCC7710. Streptococcus thermophilus es una bacteria Gram-positiva, ampliamente utilizada en la industria láctea para la elaboración de yogures y quesos. La inmunidad de esta bacteria contra los fagos se basa principalmente en dos sistemas activos CRISPR-Cas de tipo II-A, siendo CRISPR1 el más activo [24]. Cuando se adquiere un espaciador que se dirige al fago 2972, la inmunidad CRISPR bloquea el ciclo lítico del fago al que se dirige [23, 25] y, por lo tanto, puede verse como una forma muy específica de cualitativo resistencia. En este sistema, los fagos solo pueden escapar de CRISPR-Cas mutando su PAM o secuencia de semillas (es decir, la parte proximal del protoespaciador) [26]. A continuación, primero cuantificamos la capacidad del fago 2972 ​​para escapar de un conjunto de bacterias resistentes, cada una de las cuales tiene en su matriz CRISPR1 un nuevo espaciador distinto que se dirige a un único sitio protoespaciador único en el genoma del fago. En segundo lugar, aislamos mutantes de fago de escape en cada una de las bacterias resistentes (por ejemplo, cada escape de fago se muta en una región protoespaciadora específica y diferente) y caracterizamos su aptitud relativa durante la infección de una población de bacterias sensibles a los fagos. Este protocolo experimental nos permitió discutir el vínculo potencial entre los efectos de aptitud de las mutaciones de escape en el fago y la durabilidad de diferentes alelos de resistencia en las bacterias.

        2. Material y métodos

        (a) Cepas bacterianas y fagos

        La bacteria S. thermophilus DGCC 7710 (WT) y su fago virulento 2972 ​​se obtuvieron del Centro de referencia de virus bacterianos Félix d’Hérelle (www.phage.ulaval.ca) [27]. Las bacterias se cultivaron en caldo LM17 (M17 Oxoid (37 g l -1) con 5 g l -1 de lactosa) y se incubaron a 40 ° C.Para la amplificación de fagos 10 mM de CaCl estéril2 se agregaron al caldo. Usando un protocolo estandarizado descrito en [28], una cultura de S. thermophilus DGCC 7710 se desafió con el fago virulento 2972, y las colonias / células supervivientes (mutantes insensibles a bacteriófagos (BIM)) se examinaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la expansión de su matriz CRISPR, seguida de una electroforesis en agarosa al 2%. Las secuencias de cebadores y el protocolo de PCR se pueden encontrar en el material complementario electrónico, S1. Para confirmar que cada BIM posee un espaciador diferente, secuenciamos los espaciadores recién adquiridos (secuenciación de Sanger por Eurofins Genomics MWG). Un total de 17 BIM diferentes, cada uno con un espaciador único y distinto adquirido en el locus CRISPR1 activo (verificamos que no se adquirió ningún otro espaciador en la otra matriz CRISPR activa), se conservaron y utilizaron en este estudio. Las secuencias espaciadoras se proporcionan en el material complementario electrónico, S2. Finalmente, los protoespaciadores se colocaron en el genoma del fago 2972 ​​que se publica en [27].

        (b) Detección y titulación de fagos

        Se produjeron céspedes bacterianos sembrando 6 ml de agar blando (LM17 + CaCl2 con agar al 0,8% y 400 μl de bacterias en fase media exponencial) sobre placas previamente vertidas con 30 ml de agar duro (LM17 + CaCl2 con agar al 1,5%). Para la titulación de fagos, se añadieron 50 µl de fagos diluidos a agar blando. Para la detección de fagos, se colocaron directamente sobre el agar blando solidificado 5 µl de solución de fagos. Cuando fue necesario, los fagos se diluyeron en tampón de fagos (Tris-HCl 50 mM pH 7,5 + NaCl 100 mM + MgSO 8 mM4). Las placas se incubaron durante la noche a 40ºC y las placas se contaron (titulación) o se registraron (detección).

        (c) Durabilidad de la resistencia

        La durabilidad de la resistencia del huésped se define como el tiempo durante el cual permanece eficaz [7]. En ausencia de un parásito de escape preexistente, la durabilidad de una resistencia depende de dos factores: (i) la velocidad a la que se generan los mutantes de escape y (ii) su propagación a la población huésped. En el caso de una población hospedante resistente homogénea, cualquier mutante de escape se propagará rápidamente a la población. En este caso simple, la durabilidad de una resistencia depende principalmente de la velocidad a la que aparecen por mutación los mutantes de escape viables.

        Usamos un protocolo de Luria-Delbrück de tres pasos para medir la tasa de mutación de fagos para cada secuencia objetivo por los 17 BIM diferentes (ver el material complementario electrónico, S3 para una descripción gráfica del protocolo). Estas medidas se replicaron tres veces con tres lisados ​​clonales independientes del fago 2972. Para evaluar la influencia potencial de la variación genética permanente en la tasa de escape, medimos la frecuencia inicial de mutantes de escape contra cada BIM. Se encontró que la frecuencia de mutantes preexistentes para cada uno de los 17 BIM diferentes estaba por debajo de 2,9 × 10 −5. Debido a que inoculamos una pequeña cantidad de fago 2972 ​​(ver más abajo), se asumió que el impacto de la variación genética permanente sobre la adaptación del fago era insignificante.

        En el primer paso de este protocolo, para cada BIM, los fagos de tipo salvaje (WT) se amplificaron en 96 réplicas independientes en las bacterias sensibles al fago WT (es decir, en ausencia de selección). En cada réplica, 20 μl de LM17 + CaCl2 se inocularon con 0,2 μl de bacterias WT en fase exponencial media, fagos a una concentración de 300 unidades formadoras de placa (UFP) / 20 μl y se incubaron a 40 ° C durante 24 h. Confirmamos titulando cuatro repeticiones antes de la incubación que norteI ≈ 300 PFU / 20 μl y medimos norteF titulando 10 lisados ​​elegidos al azar. Nosotros encontramos norteF ≈ 1,72 × 10 6 PFU / 20 μl.

        En el segundo paso del protocolo, las bacterias de cada réplica se sedimentaron con una centrifugación de 5 min (6189 g) (ver el material complementario electrónico, S4) y se inoculó el 25% (5 μl) del sobrenadante en un recipiente de 200 μl. cultivo del BIM focal y se incubó durante 24 ha 40 ° C. Este segundo paso aseguró que incluso en réplicas donde la frecuencia de mutantes de escape era pequeña al final del primer paso, la frecuencia de mutantes de escape sería lo suficientemente alta como para ser detectable en el tercer paso del protocolo.

        En el último y tercer paso del protocolo, se evaluó la presencia de fagos de escape en cada réplica individual mediante ensayos de detección de fagos. PAGmi, la probabilidad de escape, se calculó como la fracción de réplicas en las que era detectable el escape de fagos. Es posible [29] estimar la tasa de mutaciones de escape contra cada BIM usando:

        (d) Aptitud relativa de mutantes de escape de fagos

        Para cada uno de los 17 BIM diferentes, seleccionamos al azar cinco cepas de fagos que escaparon a la resistencia bacteriana. Una sola placa de cada uno de estos cinco aislados se amplificó en líquido y se volvió a aislar dos veces en placas, en el BIM en el que se aislaron. Después de la amplificación, los fagos y las bacterias restantes se separaron por filtración (0,2 µm) y los fagos se almacenaron en glicerol al 20% a -80 ° C. La secuenciación del genoma (ver el material complementario electrónico, S5 para la lista de cebadores y S6 para su secuencia protoespaciadora) confirmó que todos los fagos de escape contenían mutaciones en su PAM o su secuencia semilla. Este protocolo generó una colección de mutantes de escape para todos los BIM.

        La aptitud relativa de todos los mutantes de escape se determinó mediante experimentos de competición por triplicado contra un fago de referencia que contiene una deleción de 37 pb en su orf24 (ver el material complementario electrónico, S7).Esta deleción nos permitió distinguir fácilmente la cepa de referencia de todos los demás mutantes de escape (ver el material complementario electrónico, S7). Aproximadamente 3000 fagos (50% de mutante de escape y 50% de fago de referencia) se inocularon en 10 ml de LM17 + CaCl.2 suplementado con 100 μl de bacterias WT en la fase estacionaria temprana. Después de una incubación de 24 horas a 40 ° C, las bacterias restantes se eliminaron por filtración y los fagos se almacenaron a -80 ° C. Antes y después de la amplificación, la proporción del fago analizado se midió mediante PCR cuantitativa (qPCR) (ver el material complementario electrónico, S7). La aptitud relativa del mutante de escape metro fue determinado usando

        (e) Análisis estadísticos

        Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software R (v. 3.3.2, [30]), a través de RS tudio (v. 1.0.136).

        Realizamos un análisis de varianza (ANOVA) para determinar si la posición del protoespaciador en el genoma del fago afecta la durabilidad de las resistencias.

        Se utilizaron modelos lineales para el análisis de datos de aptitud relativa. En el primer modelo, probamos el efecto del genotipo del fago sobre la aptitud relativa. Para controlar la tasa de falsos descubrimientos, como todas las mutaciones de escape se compararon con el fago de referencia de forma independiente, se aplicó el procedimiento de Benjamini-Hochberg al derivado pag-valores. En el segundo modelo, probamos el impacto del tipo de mutación (sinónimo versus no sinónimo) en la aptitud relativa de los fagos que escapan de los BIM que se dirigen a un orf (36 mutantes de escape de fagos). En el tercer modelo, evaluamos el efecto de la aptitud relativa de los mutantes de escape de fagos sobre la durabilidad de la resistencia de sus respectivos BIM.

        3. Resultados

        Para estudiar la durabilidad de varios alelos CRISPR, generamos 17 cepas resistentes diferentes (BIM) caracterizadas por un espaciador nuevo y único dentro de la matriz CRISPR1. Cada espaciador se dirige a un protoespaciador diferente, es decir, una parte diferente del genoma del fago (material complementario electrónico, S2). En total, 13 de los 44 genes del fago (así como algunas regiones no codificantes) fueron dirigidos por al menos un espaciador, lo que llevó a una buena cobertura del genoma del fago por estos 17 BIM (figura 1).

        Figura 1. Variabilidad en la durabilidad de la inmunidad CRISPR-Cas. La tasa de mutación de 17 protoespaciadores, cuyas posiciones están etiquetadas en el X-eje, se midieron mediante pruebas de fluctuación. PAGmi Los valores, es decir, el número de réplicas en las que evolucionó un mutante de escape de fagos, se informan y muestran heterogeneidad entre las secuencias diana, lo que implica que existe heterogeneidad en la durabilidad de las resistencias CRISPR-Cas.

        Nuestras medidas de durabilidad de BIM mediante pruebas de fluctuación revelaron una variación considerable en la capacidad del fago para escapar de diferentes BIM (figura 1, material complementario electrónico, S8, ANOVA, F16 = 10.89, pag = & lt 0,001). También usamos la probabilidad de escape para estimar las tasas de mutación para cada secuencia objetivo (secuencias semilla y PAM) (ver el material complementario electrónico, S9). La tasa de mutación promedio se estimó en 3.4 × 10 −7 mutación / secuencia diana / replicación y la tasa de escape en el BIM menos duradero fue 123 veces mayor que en uno de los BIM más duraderos.

        Una posible explicación de la variación observada en la durabilidad de las resistencias podría resultar de las diferencias en los costos de aptitud asociados con sus respectivos mutantes de escape. En principio, el uso de la proporción de réplicas sin mutantes de escape en el protocolo de Luria-Delbrück produce una estimación de la tasa de mutación que no se ve afectada por la selección de mutantes viables [31]. Para explorar la validez de esta hipótesis, aislamos 40 fagos mutantes que escapaban de las 17 resistencias CRISPR individuales distintas. Un total de 35 fagos de escape llevan una sola mutación de pb en la secuencia objetivo, cuatro de los fagos restantes portan mutaciones de doble pb en la secuencia objetivo, un fago de escape tiene una deleción de un solo pb (ver el material complementario electrónico, S6). Entre las sustituciones, 27 son transversiones, 12 son transiciones de purina y cuatro transiciones de pirimidina. Diez mutantes de escape se caracterizaron por mutaciones sinónimas (ver el material complementario electrónico, S10).

        Para medir la aptitud, competimos con cada uno de los mutantes del fago de escape contra un fago de referencia y medimos su abundancia relativa antes y después del experimento. A partir de estos datos, dedujimos la aptitud relativa. Encontramos que la aptitud relativa era muy variable, oscilando entre −6,21 y 0,68 con un promedio de −2,22 y una desviación estándar de 1,71 (figura 2, véase el material complementario electrónico, S11). Aunque la mayoría de los mutantes de escape del fago tenían una aptitud más baja que el fago WT (32 de 40), algunos mutantes de escape eran neutrales (8 de 40) (figura 2 material complementario electrónico, S11). La presencia de mutaciones no sinónimas no fue un buen predictor de la aptitud mutante de escape (t = −0.509, PAG(R & gt t) = 0,612) y todas las mutaciones sinónimos probadas, excepto una aptitud de fago inferior (ver el material complementario electrónico, S12). Descubrimos que la aptitud mutante de escape no era un buen predictor de la durabilidad de cada BIM (figura 3, t = −0.423, PAG(R & gt t) = 0,673). Por lo tanto, la heterogeneidad en la durabilidad de las resistencias CRISPR no se debe a la heterogeneidad de los costos de aptitud asociados con estas mutaciones de escape (figura 3).

        Figura 2. Distribución de los efectos de aptitud de las mutaciones de escape en el fago. La aptitud relativa se midió a través de experimentos de competición con una colección de 40 fagos de escape, mutados en su semilla o secuencias PAM. Los fagos que portan mutaciones neutrales y deletéreas se representan en gris medio y oscuro, respectivamente. Los puntos negros muestran la aptitud relativa de cada fago de escape. El segmento punteado representa la aptitud del fago WT 2972. El valor de aptitud de cada fago de escape también se proporciona en el material complementario electrónico, S11.

        Figura 3. Aptitud relativa de los mutantes de escape de fagos frente a la durabilidad (probabilidad de escape PAGmi) de sus respectivos BIM. Cada color corresponde a un solo BIM y cada punto a un solo fago de escape. Las barras de error corresponden a intervalos de confianza del 95%. Los datos brutos se proporcionan en el material complementario electrónico, S9 y S11.

        4. Discusión

        Estudiamos la variación en la capacidad del fago virulento 2972 ​​para escapar de distintos alelos de resistencia en el sistema inmunológico CRISPR-Cas de su huésped. S. thermophilus DGCC7710. Encontramos (i) una variación considerable en la durabilidad entre estas diferentes cepas resistentes (y por lo tanto en la tasa de mutación aparente de los protoespaciadores de fagos), y (ii) una variación sustancial en la aptitud entre los fagos que portan mutaciones de escape. Sin embargo, el costo de esas mutaciones de escape no se asoció con la durabilidad de sus respectivas cepas de resistencia. Si el costo de aptitud de las mutaciones de escape no es un buen predictor de la durabilidad de la resistencia, ¿qué impulsa la variación en la durabilidad? Creemos que dos procesos no mutuamente excluyentes podrían explicar los patrones observados: (i) variación en la tasa de mutación a lo largo del genoma del fago, y (ii) variación en la probabilidad de generar mutaciones letales entre diferentes secuencias objetivo del sistema CRISPR-Cas .

        Primero, una variación en la tasa de mutación a lo largo del genoma del fago puede resultar de una heterogeneidad de la maquinaria de replicación. Esta variación en las tasas de mutación se ha descrito previamente en levaduras [32], virus de ARN [33] y bacterias [34], pero hasta donde sabemos, aún no en bacteriófagos. Se desconoce el mecanismo preciso utilizado por el fago 2972 ​​para replicar y reparar su genoma, lo que limita nuestra capacidad para probar esta hipótesis. Sin embargo, dado que el fago 2972 ​​codifica y expresa su propia maquinaria de replicación y no posee ningún mecanismo de reparación [27,35], es tentador plantear la hipótesis de que no hay mecanismos de reparación involucrados y que la replicación completa se realiza mediante su maquinaria de replicación. Esta maquinaria podría producir una variación sustancial entre diferentes partes del genoma del fago. Sin embargo, tenga en cuenta que la mayoría de los mutantes de escape que aislamos se debieron a transversiones en lugar de transiciones (ver el material complementario electrónico, S10), mientras que la mayoría de las maquinarias de replicación muestran un patrón sesgado de transición [32,36]. Si una tasa de fidelidad heterogénea estuviera en el origen de la heterogeneidad observada en la durabilidad de las resistencias, la maquinaria 2972 ​​tendría un sesgo de mutación no convencional.

        En segundo lugar, la variación en la frecuencia de mutaciones letales a lo largo del genoma del fago también podría contribuir a la variación observada en la durabilidad de BIM. Las mutaciones letales son muy frecuentes y pueden alcanzar hasta el 40% de las mutaciones totales de los virus [37-39], pero, hasta donde sabemos, no se ha estudiado la heterogeneidad de la probabilidad de mutación letal a lo largo del genoma. Debido a que se sabe que algunos genes son esenciales mientras que otros son accesorios (p. Ej. orf39 y orf41 no se expresan durante una infección por el fago 2972 ​​[35]), podemos esperar que las mutaciones en diferentes genes den como resultado diferentes fracciones de mutaciones letales y, en consecuencia, variaciones en la durabilidad entre los BIM dirigidos a estos diferentes genes.

        Se requieren experimentos adicionales para evaluar la importancia relativa de las variaciones en (i) la tasa de mutación y (ii) la proporción de letales a lo largo del genoma del fago sobre la durabilidad de la resistencia a CRISPR. La heterogeneidad en la tasa de mutación podría evaluarse midiendo la durabilidad de varios espaciadores que se dirigen a diferentes regiones codificantes no funcionales del genoma del fago. El fago 2972 ​​lleva dicha secuencia en forma de un módulo de lisogenia incompleto que no se expresa [27, 35]. Si pudiéramos crear diferentes BIM dirigidos a este módulo, cualquier heterogeneidad en la durabilidad entre esos BIM solo resultaría de una heterogeneidad en las tasas de mutación entre las diferentes secuencias de destino. Para evaluar la hipótesis alternativa de que la variación en la durabilidad resulta de la variación en la fracción de mutantes letales, se podría medir directamente esta fracción de mutantes letales mediante la introducción sistemática de mutaciones puntuales en la secuencia objetivo de BIM con niveles contrastados de durabilidad [37– 39]. Gracias a los avances recientes en biología molecular, se puede producir una serie de mutantes cambiando sistemáticamente cada uno de los nucleótidos de la secuencia diana [40,41]. La comparación del número de mutaciones letales para una resistencia duradera y no duradera permitiría evaluar directamente el impacto de este factor en la variación de la durabilidad.

        Se sabe que la inmunidad CRISPR-Cas genera y mantiene una alta diversidad de alelos de resistencia contra el mismo fago [22, 42] y se sabe que esta diversidad en la resistencia limita el crecimiento de la población de fagos [29, 42]. Los modelos teóricos y las pruebas experimentales indican que tal diversidad limita la aparición evolutiva de los patógenos [29]. Sin embargo, esos estudios ignoran la heterogeneidad en la durabilidad de la resistencia entre diferentes alelos. Nuestros resultados indican que otro beneficio potencial de generar esta diversidad es explorar un rango de durabilidad de resistencia. Los alelos más duraderos superarán a los otros BIM y esto puede proporcionar una forma muy sólida de obstaculizar la evolución del fago. Además de esta diversidad entre huéspedes, una sola célula puede adquirir más de un espaciador contra el mismo parásito. La adquisición de múltiples espaciadores dirigidos a diferentes partes del genoma del fago implica que el fago necesita múltiples mutaciones antes de que pueda infectar esta bacteria de resistencia múltiple [25]. Como la mayoría de las mutaciones de escape son costosas (figura 2), es probable que portar múltiples mutaciones de escape reduzca drásticamente la aptitud del fago. Por el contrario, la adquisición de múltiples espaciadores no altera la aptitud de las bacterias [43]. Esta asimetría puede ayudar a explicar la extinción final de las poblaciones de fagos que coevolucionan con la inmunidad CRISPR-Cas [22,44]. También es importante señalar que algunos fagos han desarrollado la capacidad de vencer la inmunidad CRISPR utilizando proteínas anti-CRISPR que inhiben la defensa conferida por CRISPR-Cas [45,46] (tenga en cuenta que, hasta donde sabemos, el fago 2972 ​​no lleva ningún anti-CRISPR -CRISPR contra S. thermophilus Sistemas CRISPR). Aunque anti-CRISPR puede ser parcialmente eficaz contra CRISPR-Cas, la cooperación entre fagos asegura que, por encima de una concentración mínima, los fagos puedan invadir una población de huéspedes resistente sin adquirir mutaciones de escape en las secuencias dirigidas por CRISPR-Cas [47,48] .

        Streptococcus thermophilus es ampliamente utilizado por la industria láctea para la fabricación de varios productos lácteos fermentados (yogur, queso) y la identificación de BIM con una resistencia particularmente duradera podría tener implicaciones muy prácticas. Es probable que el uso y / o la combinación de estos BIM protejan los cultivos iniciadores contra la infección por fagos. Además, sería particularmente útil identificar espaciadores duraderos que se dirijan a fagos relacionados. Estos espaciadores generalistas se han observado antes [23]. El uso de un espaciador generalista duradero podría mejorar enormemente la resistencia de S. thermophilus son. Nuestro modelo biológico también brinda una oportunidad única para evaluar experimentalmente la efectividad de diferentes estrategias de intervención sobre la eficacia a largo plazo de la resistencia a patógenos. Por lo tanto, puede proporcionar información importante para la implementación de la gestión sostenible de patógenos y plagas [4,9,29].

        Además de estas aplicaciones en la industria láctea y en la agricultura, la tecnología CRISPR-Cas9 se puede utilizar como endonucleasa impulsora, es decir. una herramienta genética que hace que un alelo modificado se propague a poblaciones naturales por herencia no mendaliana [49]. De hecho, en un heterocigoto que lleva un CRISPR-Cas9 y su guía, la endonucleasa apuntará y escindirá el alelo homólogo. Como los mecanismos de reparación generalmente involucran secuencias de ADN homólogas, generalmente agregarán una copia del CRISPR-Cas9 y su guía en el lugar del alelo anterior, lo que conducirá a la rápida propagación de la guía CRISPR-Cas9 / en la población [49,50 ]. Sin embargo, si la presencia de CRISPR-Cas9 es costosa para su anfitrión, es probable que surja una mutación de escape y se interrumpa la propagación del impulso genético [50,51]. Nuestros resultados indican que es probable que la durabilidad de las estrategias de impulso genético dirigidas a distintas regiones del genoma sea muy variable. Comprender la fuente última de la variación de la durabilidad es particularmente importante para la efectividad del impulso genético basado en CRISPR-Cas9.


        Proteínas Cas9 de diseñador

        Cas9-sgRNA "off-the-peg" cataliza las reacciones de interferencia del bucle R que desencadenan un DDSB en el sitio del bucle R. Esto también ha facilitado el desarrollo de tecnologías de edición de genes basadas en la modificación de la arquitectura de la proteína de Cas9 de tipo salvaje, Cas9 inactivada por nucleasa (dCas9) y Cas9 'nickasa' de corte monocatenario (nCas9), incluida la regulación transcripcional y la formación de imágenes, revisada recientemente en [61 ]. También se han generado fusiones de proteína Cas9 para mejorar la HR en células humanas, al sesgar la elección de la vía de reparación del ADN en el sitio de la DDSB. Dos ejemplos han fusionado CtIP y RAD52 con Cas9 [82,83].

        La proteína de fusión CtIP se exploró utilizando dos métodos diferentes. Una fusión activa Cas9-CtIP pudo estimular un aumento en la edición en comparación con la HR estándar, y una segunda fusión Cas9 mejoró aún más la HR fusionando un fragmento N-terminal de CtIP, considerado el dominio potenciador de HR (HE), es decir crucial para su inicio de la HR [82]. La proteína de fusión RAD52 se diseñó con el mismo fundamento de forzar una proteína crucial para completar la HR cerca del sitio de un DDSB Cas9 y se encontró que mejora la eficiencia de la inserción del casete indicador [83].

        Las fusiones de dCas9 o nCas9 a enzimas modificadoras de bases de ADN han facilitado la edición de bases individuales. Una fusión de citidina desaminasa (CDA) -dCas9 ha generado una transición de C a T en residuos de citosina dirigidos al bucle R mediante la generación de uracilo, que se reemplaza con timina durante la reparación posterior del ADN (Figura 3) [84]. La ventana generada por el lazo R del ssDNA permite que la desaminasa convierta C en U. Al fusionar el inhibidor de la uracilglucosilasa (UGI) al extremo C-terminal de CDA, se evitó la reparación de la escisión de la base dCas9, lo que permitió que la reparación del desajuste (MMR) completara el proceso. Cambio de C a T [84]. El sistema se mejoró mediante la fusión de un segundo UGI, para favorecer aún más la MMR, y la proteína Gam derivada del bacteriófago, que une los extremos libres de DDSB, minimizando la generación de In / Del. Una adenina desaminasa fusionada con dCas9 ha sido eficaz en la conversión dirigida de adenina en inosina, que a su vez se convierte en guanina [85]. También se ha informado de un sistema similar, edición de ARN para reemplazo programable de A a I (REPAIR), para la edición de una sola base de adenosina a guanina a través de un intermedio de inosina en las transcripciones de ARN en células de mamíferos que utilizan Cas13 catalíticamente inactivo, un CRISPR de clase 2 Enzima de edición de ARN Cas [86]. Finalmente, la dependencia de la edición del genoma CRISPR-Cas9 basada en HR en las enzimas HR de la célula huésped podría hacer que sea atractivo desarrollar una fusión Cas9 con proteínas que son activas como recombinasas específicas de sitio o tienen una actividad de integración de ADN similar (Figura 3). En este escenario, la formación de bucle R mediada por Cas9 se dirigiría al ADN para la integración de una carga útil de ADN dúplex transportada por la enzima de fusión.


        Ver el vídeo: Optimización dos sistemas CRISPR-Cas e as súas aplicacións in vivo. Dr. Miguel Moreno Mateos (Agosto 2022).