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¿Tiene la proteína de unión al ARN de MS2 algún efecto de represión de la traducción?


Publicado desde Quora: http://www.quora.com/Does-the-MS2-RNA-binding-protein-have-any-translational-repression-effects

Estoy pensando en la proteína MS2 que se une a su diana de ARN en forma de horquilla. ¿La interacción de la proteína MS2 con la horquilla colocada corriente arriba de un ORF causaría alguna represión traduccional?


Supongo que está hablando de la técnica de visualización de mTAG para ARNm (1). Probablemente esté familiarizado con él, pero el OFR de interés está etiquetado con la secuencia MS2L aguas abajo y aguas arriba de 3'UTR. También hay una versión modificada, en la que puede visualizar tanto el ARNm de interés como la proteína que se traduce, consulte la figura siguiente (2). Haim y sus colegas encontraron que la levadura que expresa mCherry y ATP2 marcado con MS2L crecía en medios que contenían glicerol, lo que requeriría una traducción eficiente de ATP2.

Así que supongo que no hay represión de la traducción si etiqueta el ARNm aguas abajo del ORF. A menos que tenga una muy buena razón para etiquetar el ORF de interés con MS2 aguas arriba del codón de inicio, no lo haría, porque estas estructuras de tallo-bucle probablemente detendrían la traducción, ya que la estructura secundaria del ARNm se ha implicado en el inicio de la traducción. eficiencia.


Regulación traslacional dirigida utilizando el andamio de la familia de proteínas PUF

Los complejos reguladores formados en los ARNm controlan la traducción, la estabilidad y la localización. Estos complejos poseen dos actividades: una que se une al ARN y otra, el efector, que provoca una función biológica. La familia de proteínas de unión de ARN Pumilio y FBF (PUF) proporciona un andamio versátil para diseñar y seleccionar proteínas con nuevas especificidades. Aquí, el andamio PUF se usa para apuntar a la activación y represión de la traducción de ARNm específicos y para inducir la adición y eliminación de poli (A) específicas. Para ello, vinculamos proteínas de andamio PUF a un activador de traducción, GLD2, o un represor de traducción, CAF1. Las proteínas quiméricas activan o reprimen los ARNm diana en Xenopus ovocitos, y provocan la adición o eliminación de poli (A). La magnitud del control de la traducción se relaciona directamente con la afinidad del complejo ARN-proteína en un rango de 100 veces KD. Las proteínas quiméricas actúan tanto en los ARNm informadores como en los endógenos: un ARNm que normalmente se desadenila durante la maduración de los ovocitos, en cambio, recibe poli (A) en presencia de una quimera apropiada. La estrategia PUF-efector permite el diseño de proteínas que afectan la traducción y estabilidad de ARNm específicos in vivo.

El control del ARN mensajero es omnipresente. Los complejos reguladores que controlan la traducción, la estabilidad y la localización se forman en los elementos de la 3'UTR de los ARNm diana (1-8). Estos complejos reguladores poseen dos actividades: una que proporciona especificidad al ARN y otra, la efectora, que determina el resultado. Estas actividades pueden residir en la misma o en diferentes moléculas del complejo.

Los dominios efectores pueden analizarse uniendo la proteína a la 3'UTR de un ARNm informador. Este enfoque general, a veces denominado ensayo de “función atada”, se ha utilizado para identificar las actividades de reguladores conocidos, subdividirlos en regiones reguladoras más pequeñas y analizar sus mecanismos de acción (9-11). Una ventaja del enfoque es la separación de las actividades efectoras y de unión del ARN. Por lo general, el reclutamiento de la proteína que se va a analizar se logra mediante una interacción ARN-proteína bien caracterizada y de alta afinidad, como la de la proteína de la cubierta MS2 o la proteína N λ con su sitio de unión. Para muchos experimentos, las 3'UTR son una ubicación ideal para insertar los sitios de unión: su plasticidad tolera la inserción de secuencias extrañas y reclutan muchas proteínas reguladoras naturales.

En este artículo, exploramos el uso del andamio de proteínas Pumilio y FBF (PUF) como un dispositivo para atar dominios efectores de traducción en células vivas. Las proteínas PUF se unen a secuencias de ARN cortas y específicas (7). Las especificidades de la secuencia de ARN de varias proteínas PUF se han determinado experimentalmente, al igual que la estructura de varios complejos PUF-ARN. Todas las proteínas PUF examinadas hasta la fecha comprenden un andamio similar, en el que un triángulo en rampa de tres hélices α se repite ocho veces (Fig. 1) (12-14). Juntas, estas repeticiones forman un arco extendido. En una cara del arco hay ocho hélices α que se unen al ARN, llamadas hélices de reconocimiento de ARN.

Arquitectura de complejos PUF-ARN. Ocho hélices de reconocimiento de ARN (rojas en estructura y diagrama) aportan aminoácidos para contactar la base de ARN (azul en estructura y diagrama). Las bases verdes en la estructura FBF-2 corresponden a bases invertidas. Las líneas rectas indican uno o más contactos entre el ARN y la hélice indicada. (A) Complejo Pumilio1-ARN humano (12). (B) C. elegans Complejo FBF-2-RNA (24)

El andamio PUF proporciona un modo versátil de reconocer secuencias de ARN. En la condición más simple, ejemplificada por Pumilio humano, las ocho repeticiones reconocen ocho nucleótidos: cada hélice α de reconocimiento de ARN se une a una base (Fig.1A) (12). Las interacciones de unión involucran tres residuos de aminoácidos conservados en cada repetición: dos hacen contactos de borde con las bases y los otros se apilan entre las bases. Las proteínas PUF de origen natural obtienen sus distintas especificidades a través de perturbaciones del dominio PUF. En algunos casos, las perturbaciones de la estructura de PUF, que probablemente incluyan alteraciones en la curvatura, imponen un requisito de bases adicionales que pueden "voltearse" lejos de la proteína, como se ejemplifica por Caenorhabditis elegans FBF-2 (Figura 1B) (15-19). En otras proteínas PUF, hélices α adicionales en un extremo de la proteína forman bolsas para bases adicionales, extendiendo la longitud del sitio (20).

La arquitectura PUF proporciona un andamio versátil para crear proteínas con nuevas especificidades de ARN. Las mutaciones pueden diseñarse racionalmente para alterar la especificidad del ARN, basándose en las estructuras conocidas de los complejos PUF-ARN naturales (12, 16, 18, 21, 22, 23-24). Se pueden obtener nuevas especificidades transfiriendo un segmento de una proteína a otra, mediante mutagénesis dirigida o mediante selecciones genéticas de bibliotecas de proteínas (18, 23). Por lo tanto, el andamio PUF puede proporcionar una herramienta manejable para diseñar proteínas con nuevas especificidades, para una variedad de propósitos.

Las proteínas efectoras, GLD2 y CAF1, controlan la traducción y la longitud de la cola de poli (A). GLD2 es una polimerasa poli (A) citoplasmática. Activa la traducción de ARNm específicos durante el desarrollo temprano y en el sistema nervioso (25-30). CAF1 es una deadenilasa y acorta las colas de poli (A) (31, 32). Además, CAF1 posee una actividad de represión traduccional intrínseca que persiste incluso en ausencia de su actividad deadenilasa (33). Tanto GLD2 como CAF1 se reclutan para ARNm específicos a través de la acción de otras proteínas que se unen al ARN, ya que no se unen al ARN con alta afinidad por sí mismas.

Xenopus laevis Los ovocitos proporcionan un excelente sistema para probar la utilidad del andamio PUF como dispositivo de sujeción. La maquinaria de traducción endógena traduce los ARN microinyectados y la producción de proteínas se puede controlar fácilmente (34, 35). Los ARN inyectados suelen ser estables, incluso si carecen de poli (A), lo que simplifica el análisis de la actividad de traducción. Se han identificado una variedad de dominios de activación y represión en ovocitos (9, 10, 26, 28, 33, 36, 37), y los eventos de adición y eliminación de poli (A) citoplasmáticos están bien documentados (30, 38, 39, 40, 41, 42, 43–44).

Aquí, probamos si el andamio PUF se puede utilizar para dirigir dominios efectores a ARNm específicos in vivo. Utilizamos proteínas PUF naturales y mutantes para unir dominios efectores de traducción a ARNm tanto reporteros como endógenos. Nuestros hallazgos demuestran que la actividad traslacional se puede aumentar o disminuir por diseño. Discutimos este enfoque para la modulación dirigida de la actividad del ARNm en el citoplasma.


Abstracto

TransLas proteínas de unión al ARN que actúan (RBP) regulan la traducción del ARNm al interactuar con los elementos de la secuencia en las regiones no traducidas 5 'y 3'. Estas RBP pueden controlar el reclutamiento de los ARNm en el ribosoma y regular la velocidad de síntesis de proteínas o, alternativamente, reprimir la traducción del ARNm mediante la regulación de la inestabilidad / degradación del ARNm.


Resultados

PfAlba1 es esencial, pero puede sobreexpresarse a partir de un episoma con una etiqueta Ty1 C-terminal en P. falciparum etapas de sangre

Numerosos intentos de noquear al ALBA1 (PF3D7_0803200) locus o generar parásitos de eliminación de proteínas inducibles para PfAlba1 no tuvieron éxito (Figura S1 en el archivo adicional 1). Después de tres transfecciones independientes con dos construcciones de plásmidos diferentes (Figura S1a en el archivo adicional 1), no obtuvimos parásitos knockout gen, lo que indica que la interrupción de la ALBA1 locus era perjudicial para P. falciparum crecimiento intraeritrocítico. A partir de entonces, adoptamos un enfoque de eliminación de proteínas condicional, en el que modificamos el ALBA1 locus para expresar PfAlba1 etiquetado con el Escherichia coli Dominio de desestabilización de DHFR (eDHFR), que está estabilizado por la molécula pequeña de trimetroprina (TMP) [22] (Figura S1b en el archivo adicional 1). Cuando se cultivaron parásitos transgénicos ALBA1-eDHFR-HA en ausencia de TMP, no observamos una reducción significativa en los niveles de PfAlba1-eDHFR-HA, incluso después de 10 días (Figura S1c en el archivo adicional 1, día 7 y día 10 paneles), lo que indica que la proteína etiquetada es refractaria al fármaco estabilizador. Finalmente, generamos parásitos hipermórficos para ALBA1, mediante la transfección de 3D7 con un plásmido que codifica una versión etiquetada en el extremo C de PfAlba1, PfAlba1-Ty1, del promotor heterólogo de calmodulina (PAG leva) (Figura 1a). Usando Western Blot, detectamos PfAlba1-Ty1 con anticuerpos anti-Ty1 y anti-PfAlba1 (Fig.1b) y cuando analizamos la localización de la proteína etiquetada en etapas de trofozoíto y esquizontes usando ensayos de inmunofluorescencia, encontramos que PfAlba1-Ty1 era predominantemente citoplasmático (Fig. 1c) como se describió para el PfAlba1 nativo [20].

PfAlba1-Ty1 etiquetado C-terminalmente se expresó con éxito a partir de un episoma en P. falciparum etapas de sangre asexuales. a La transfección y mantenimiento del plásmido pPfAlba1-Ty1C se confirmó mediante PCR de ADN genómico. Pares de cebadores dirigidos a endógenos ALBA1 (p1 + p2 ver el archivo adicional 11 para las secuencias de cebadores), el ALBA1-TY1 locus en el episomap3 + p4 y p5 + p6), y los no relacionados ALBA4 locus genómicoA4F + R), en parásitos 3D7 no transfectados o parásitos que albergan el vector vacío o pPfAlba1-Ty1C. El esquema (panel superior) no está dibujado a escala UTR = región sin traducir. El carril más a la izquierda (panel inferior) representa el marcador de tamaño, GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (Fermentas, Life Technologies). B Se detectó PfAlba1-Ty1 en lisados ​​de proteínas preparados a partir de un vector vacío o parásitos PfAlba1-Ty1 mediante electroforesis en gel desnaturalizante y transferencia Western con anticuerpos anti-Ty1 de ratón o anticuerpos anti-PfAlba1. PfAldolase sirvió como control de carga. C Se utilizaron ensayos de inmunofluorescencia para determinar la localización de PfAlba1-Ty1 en trofozoíto (T) y esquizontes (S) etapas de los parásitos PfAlba1-Ty1. Los transfectantes de vector vacío sirvieron como control negativo. Los anticuerpos utilizados incluyeron anti-Ty1 de ratón (verde) o anti-PfAlba1 (rojo). Los núcleos se marcaron con DAPI (azul). La barra de escala representa 1 μM

Los niveles excesivos de PfAlba1 inhiben el crecimiento intraeritrocítico de P. falciparum

Antes de caracterizar funcionalmente PfAlba1-Ty1, exploramos si podíamos modular los niveles de expresión de la proteína etiquetada durante el P. falciparum IDC y, de ser así, si el parásito tenía un umbral de tolerancia para los niveles de PfAlba1-Ty1. Cuando tratamos los parásitos 3D7 + PfAlba1-Ty1 que estaban creciendo inicialmente con 2,5 μg / ml de blasticidina-S (BS) en el medio de crecimiento con cantidades crecientes de BS durante dos días, los niveles de proteína PfAlba1-Ty1 aumentaron gradualmente (Fig. 2a), alcanzando un máximo de cinco veces la regulación al alza a 20 μg / ml BS en relación con 2,5 μg / ml BS (Fig. 2b). También observamos que los niveles de PfAlba1 endógeno aumentaron de una manera dependiente de la dosis de BS (Fig.2a Figura S2a en el archivo adicional 1), pero no de una segunda proteína de la familia Alba PfAlba4 (Fig.2a) y otros dos ortólogos, PfAlba2 y PfAlba3 (datos no mostrados), lo que indica que la sobreexpresión de PfAlba1-Ty1 afectó directamente los niveles endógenos de PfAlba1. Nótese que, incluso a 2,5 µg / ml de BS, los transfectantes PfAlba1-Ty1 expresan niveles más altos de PfAlba1 total en comparación con el vector de control vacío (Figs. 1b y 2a).

La sobreexpresión de PfAlba1 reduce el crecimiento intraeritrocítico de P. falciparum. a Lisados ​​de proteínas preparados a partir de vectores vacíos o transfectantes PfAlba1-Ty1 cultivados en presencia de concentraciones crecientes de blasticidina-S (BS 2,5-20 μg / ml) se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante y se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos anti-Ty1 de ratón, anticuerpos anti-PfAlba1 o anticuerpos anti-PfAlba4. PfAldolase sirvió como control de carga. B Los niveles de PfAlba1-Ty1, detectados por los anticuerpos anti-Ty1 en (a), se midieron por densitometría. Para cada concentración de BS, después de normalizar la señal de PfAlba1-Ty1 a la señal de PfAldolasa, los datos se normalizaron a la muestra de 2,5 μg / ml. Los datos representan las medias de un mínimo de tres experimentos independientes ± error estándar (S.E. barras de error). C El crecimiento del vector vacío (panel izquierdo) o PfAlba1-Ty1 (panel derecho) los parásitos se midieron mediante citometría de flujo durante 5 días en presencia de las concentraciones indicadas de BS (en μg / ml). los eje y denota el porcentaje de parasitemia en cada momento. Los datos representan las medias de un mínimo de tres experimentos independientes ± S.E. (barras de error). D los

Se controló la IDC de 48 h de vector vacío o transfectantes PfAlba1-Ty1 mediante citometría de flujo. los eje y denota el porcentaje de etapas del anillo en cada punto de tiempo. los línea discontinua vertical representa un ciclo de replicación. Los datos representan las medias de tres experimentos independientes ± S.E. (barras de error)

Posteriormente, seguimos el crecimiento de parásitos sincronizados en fase de anillo 3D7 + PfAlba1-Ty1 tratados con diferentes concentraciones de BS mediante citometría de flujo y encontramos que, después de dos ciclos de replicación, hubo una reducción marcada en la parasitemia de los parásitos 3D7 + PfAlba1-Ty1 a 10 , 15 y 20 μg / ml BS en comparación con el vector vacío 3D7 + (Fig. 2c Figura S2b en el archivo adicional 1). Incluso a 5 μg / ml BS, los transfectantes PfAlba1-Ty1 mostraron una tasa de multiplicación ligeramente menor en comparación con los transfectantes de vector vacío (Fig. 2c), lo que indica que un modesto aumento de 1,5 veces en los niveles de PfAlba1-Ty1 fue suficiente para retrasar el crecimiento del parásito. Usamos esta concentración de BS para un análisis adicional y medimos el tiempo del ciclo celular de los parásitos 3D7 + PfAlba1-Ty1 mediante citometría de flujo. Sin embargo, no observamos una diferencia significativa en la progresión del anillo a las etapas tardías entre el vector vacío 3D7 + y los parásitos 3D7 + PfAlba1-Ty1 (Fig.2d), lo que implica que la reducción del crecimiento de los transfectantes PfAlba1-Ty1 no se debió a un cambio en tiempo del ciclo celular. En general, nuestros resultados muestran que las cantidades excesivas de PfAlba1 reducen P. falciparum crecimiento intraeritrocítico de una manera dependiente de la dosis, pero no alterando el inicio de la replicación del ADN y la esquizogonía.

El análisis de inmunoprecipitación identifica 1665 transcripciones que se asocian con complejos PfAlba1-Ty1 en etapas de trofozoíto

Para comenzar a delinear el papel de PfAlba1 en la regulación postranscripcional, primero identificamos su en vivo Interactoma de ARN por inmunoprecipitación y análisis de secuenciación profunda. Debido a que los intentos de inmunoprecipitar (IP) PfAlba1 endógeno con anticuerpos anti-PfAlba1 no tuvieron éxito (datos no mostrados), nos centramos en PfAlba1-Ty1. Recientemente se utilizó un enfoque similar en los gametocitos del parásito de la malaria del ratón. Plasmodium berghei para identificar los objetivos de ARN de DOZI o CITH etiquetados con proteína verde fluorescente, los componentes centrales de unión al ARN del complejo represor traduccional DOZI-CITH [23]. En consecuencia, preparamos lisados ​​celulares en condiciones no desnaturalizantes de los parásitos trofozoíto en etapa 3D7 + PfAlba1-Ty1 que crecen a 5 μg / ml BS, cuando PfAlba1 y PfAlba-Ty1 son predominantemente citoplasmáticos (Fig. 1c), e IPed la proteína etiquetada usando anti Anticuerpos -Ty1 (Fig. 3a). Como se muestra en la Fig. 3b, pudimos aislar al máximo

20% del total de PfAlba1-Ty1 expresado en 3D7 + PfAlba1-Ty1 y, para nuestra sorpresa, también detectó PfAlba1 endógeno en el complejo IPed (ver imagen contrastada). Dado que se ha informado que las proteínas de Alba forman homo y heterodímeros en las arqueas [24, 25], una explicación de esta observación puede ser la interacción directa de PfAlba1-Ty1 con PfAlba1.

En las etapas de trofozoíto, un complejo de ribonucleoproteína PfAlba1-Ty1 interactúa con 1665 transcripciones. a Representación esquemática del protocolo de inmunoprecipitación de ARN. Los lisados ​​nativos preparados a partir de parásitos PfAlba1-Ty1 se incubaron con anticuerpos anti-Ty1 de conejo en presencia de inhibidores de proteasa y ARNasa para inmunoprecipitar (IP) un complejo de ribonucleoproteína que contiene PfAlba1-Ty1. Las moléculas de ARN con IPed se identificaron mediante ARN-seq. El ARN obtenido de parásitos de vectores vacíos sirvió como enlace de fondo. B Los lisados ​​(10% de la entrada utilizada para la inmunoprecipitación) o las proteínas IPed con anticuerpos anti-Ty1 de vector vacío o transfectantes PfAlba1-Ty1 se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante y se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos anti-Ty1 de ratón o anticuerpos anti-PfAlba1. PfAldolase sirvió como control de carga. La imagen contrastada muestra claramente la presencia de PfAlba1 en el complejo co-IPed anti-PfAlba1-Ty1. C Una estimación del núcleo de densidad gaussiana de la distribución de genes se clasifica de acuerdo con la abundancia de ARNm de las transcripciones de 1665 que co-IPed con el complejo PfAlba1-Ty1. los eje y representa la densidad relativa y el eje x representa los rangos de expresión génica, siendo 0 el menos expresado. D Distribución de fase de Fourier de los datos de secuencia de ARN normalizados de las transcripciones de 1665 co-IPed. Panel superior: P. falciparum Los datos transcriptómicos de IDC se obtuvieron de Bozdech et Alabama. [6], donde los autores proporcionan una métrica conveniente, la fase de Fourier, para definir las horas posteriores a la infección (HPI) en el que cada gen se transcribe con mayor abundancia. Panel inferior: una estimación del kernel de densidad gaussiana de la distribución de los valores de fase de Fourier de las transcripciones de 1665 que co-IPed con PfAlba1-Ty1 como muestra de Bozdech et Alabama. [6]

A partir de entonces, realizamos una secuenciación profunda de ARN (RNA-seq) de una manera específica de la hebra, mapeamos las lecturas de secuenciación al P. falciparum genoma, y ​​escaneado en busca de picos significativos de actividad de unión utilizando nuestra línea de análisis (descrita en detalle en “Materiales y métodos”). Se consideró que los picos que se enriquecieron dos veces o más en las inmunoprecipitaciones de PfAlba1-Ty1 en comparación con las inmunoprecipitaciones de vector vacío representaban eventos de unión específicos de PfAlba1-Ty1. Encontramos que en las etapas de trofozoíto, 1665 transcripciones co-IPed con el complejo PfAlba1-Ty1 (Tabla S1a en el archivo adicional 2). Los ARN co-IPed constituyen el 29% del transcriptoma del parásito fuerte de 5672 (transcripciones codificantes de 5365) e incluyen transcripciones codificantes de proteínas 1643. Para descartar posibles falsos positivos y / o falsos negativos en nuestro análisis, incluimos controles adicionales: IPed complejos de proteínas de vector vacío o lisados ​​de PfAlba1-Ty1 con anticuerpos IgG de conejo no específicos, purificamos cualquier ARN asociado y los analizamos por hebra. -seq. de ARN específico. Cuando comparamos las IP anti-Ty1 de los lisados ​​PfAlba1-Ty1 con las IP de IgG correspondientes utilizando nuestra línea de análisis, encontramos que 791 transcripciones se enriquecieron en las IP anti-Ty1 (Tabla S1b en el archivo adicional 2), 612 de las cuales (Tabla S1c en el archivo adicional 2) también estaban presentes en la lista de 1665 transcripciones identificadas anteriormente. Esto indicó que la utilización de dos controles diferentes da como resultado la identificación de un rango de posibles objetivos de PfAlba1: una lista permisiva de 1665 y una lista conservadora de 791, con 612 objetivos de alta confianza. Decidimos utilizar la lista permisiva para un análisis más detallado.

A continuación, preguntamos si las 1665 transcripciones enlazadas se encontraban entre las más transcritas en esta etapa del IDC mediante la realización de un análisis de correlación con el transcriptoma 3D7 de 28 a 30 h descrito por Bozdech y colegas [6] y encontramos que sus rangos de expresión iban desde bajos demasiado alto (Fig. 3c). Además, un análisis de la distribución de fase de Fourier de las transcripciones co-IPed demostró que el momento del pico de expresión de las transcripciones se distribuye uniformemente a través del espectro IDC sin un sesgo obvio a una sola hora posterior a la infección, y se asemeja mucho a la distribución subyacente descrita. por Bozdech et Alabama. [6] (Fig. 3d). Juntos, estos datos apoyan que la inmunoprecipitación anti-Ty1 no es selectiva para las transcripciones de trofozoítos más transcritas y detecta complejos específicos de ARNm de PfAlba1-Ty1 en vivo. Para los genes con intrones, observamos que los intrones se empalmaron en las lecturas de secuenciación mapeadas para la transcripción, lo que sugiere que el complejo PfAlba1-Ty1 no se une al pre-ARNm.

Por último, el análisis de Gene Ontology (GO) (Figura S3a en el archivo adicional 1 Archivo adicional 3) y una evaluación en profundidad de la lista de transcripciones co-IPed (archivo adicional 2) mostró que las maquinarias de limpieza, como el ribosoma y el espliceosoma, como así como los procesos celulares esenciales, como la glucólisis, la transcripción del ARN, la replicación del ADN y la traducción de proteínas, son el objetivo específico del complejo PfAlba1-Ty1 a nivel del ARNm. Esto proporciona una explicación de nuestra incapacidad para eliminar o eliminar genéticamente este gen / proteína. Las parcelas de cobertura de secuenciación normalizada para algunos de los candidatos de las clases de GO prominentes se muestran en la Figura S3b en el archivo adicional 1.

El PfAlba1 recombinante se une directamente a la mayoría de las transcripciones que co-IP con los complejos PfAlba1-Ty1

Para delinear las transcripciones que están directamente vinculadas por PfAlba1, a continuación adaptamos un in vitro Ensayo de extracción de ARN llamado ácidos nucleicos específicos asociados con proteínas (SNAAP) [26] con proteína recombinante glutatión-S-transferasa (GST) -PfAlba1 y ARN total preparado a partir de un trofozoito 3D7 y cultivo de esquizontes (Fig. 4a). Como se muestra en la Fig. 4b, el eluido de los pull-downs de GST-PfAlba1 estaba altamente enriquecido en ARN en comparación con el control negativo. Para establecer la identidad de los ARN unidos a GST-PfAlba1, realizamos una secuencia de ARN específica de la cadena, asignamos las lecturas de secuenciación al P. falciparum genoma, y ​​utilizando nuestra línea de análisis, descubrió que los ARN de 1927 se enriquecieron dos o más en los menús desplegables de GST-PfAlba1 en comparación con el control de GST (archivo adicional 4). Esto constituye el 34% del transcriptoma del parásito e incluye 1919 transcripciones que codifican proteínas. De estos, 592 y 465 transcripciones alcanzan picos de transcripción en las etapas de trofozoíto (24 a 38 h) y esquizonte (38 a 48 h), respectivamente. Además, las transcripciones enlazadas de 1927 no se encuentran exclusivamente entre las más transcritas en cualquiera de estas etapas (Fig. 4c) y muestran una amplia distribución de picos de transcripción de IDC según lo determinado por un análisis de su distribución de fase de Fourier (Fig. 4d). En conjunto, esto indica que la unión de PfAlba1-GST a las transcripciones de 1927 no depende de su abundancia relativa en estado estable y probablemente sea específica. Sorprendentemente, la superposición entre los en vivo y in vitro Las transcripciones enlazadas son 1193 o el 71% de las transcripciones co-IPed (Fig. 4e), lo que implica que una gran proporción de las transcripciones co-IPed son directamente reconocidas por PfAlba1-Ty1. Sin embargo, las 472 transcripciones co-IPed que no se unen in vitro plantean la posibilidad de que PfAlba1 pueda asociarse con algunos ARN a través de otras proteínas o complejos de proteínas.

Más del 71% de las transcripciones que co-IP con el complejo PfAlba1 se unen directamente a PfAlba1 recombinante in vitro. a los in vitro Protocolo de extracción de ARN. GST o GST-PfAlba1 se inmovilizaron en perlas magnéticas de glutatión-agarosa y se incubaron con total P. falciparum ARN preparado a partir de un cultivo mixto de trofozoítos y esquizontes de 3D7 en presencia de inhibidores de proteasa y ARNasa. Los ARN unidos se detectaron mediante la secuencia de ARN específica de la hebra, con GST como control negativo. B El ARN total o los ARN unidos a GST o GST-PfAlba1 se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante y se visualizaron mediante tinción con Sybr Gold. Marcador de tamaño = 0.1-2 kb RNA Ladder (Invitrogen, Life Technologies nt = nucleótidos). C Una estimación del núcleo de densidad gaussiana de la distribución de genes se clasifica de acuerdo con la abundancia de ARNm de las transcripciones de 1993 que se unen a GST-PfAlba1. Consulte la leyenda de la Fig. 3c para obtener más detalles. D Distribución de fase de Fourier de los datos de secuencia de ARN normalizados de las transcripciones unidas a GST-PfAlba1 de 1993. Consulte la leyenda de la Fig. 3d para obtener más detalles. mi Se utilizaron diagramas de Venn para representar la superposición de las transcripciones identificadas en el co-IPed (co-IP Archivo adicional 2) y en vitro-ligado (In vitro Archivo adicional 4) conjuntos de datos

Posteriormente, realizamos análisis de GO para identificar los componentes celulares, funciones moleculares y procesos biológicos enriquecidos en el in vitro-conjunto de datos de transcripción encuadernada (archivo adicional 5). Encontramos que, además de las clases encontradas en el conjunto de datos co-IPed, GST-PfAlba1 se unió directamente a las transcripciones que codifican componentes de la vacuola alimentaria, el proceso catabólico proteasómico dependiente de ubiquitina, la entrada en la célula huésped y el proceso biosintético de carbohidratos, por nombrar algunos (consulte la Figura S4a en el archivo adicional 1 para obtener más detalles). Gráficos de cobertura de secuenciación normalizados de transcripciones seleccionadas que co-IPed con el complejo PfAlba1-Ty1 y enlazado in vitro a GST-PfAlba1 se muestran en la Figura S4b en el archivo adicional 1. En general, llegamos a la conclusión de que, en las etapas de trofozoíto, PfAlba1 se une directamente a 1193 ARNm que codifican componentes involucrados en la traducción, transcripción y replicación del ADN, y puede apuntar a ellos para postranscripción regulación. Es de destacar que la traducción y la replicación del ADN son procesos metabólicos clave que se aceleran en la etapa del trofozoíto y deben regularse estrictamente, junto con la degradación de la hemoglobina [6, 27].

El exceso de PfAlba1 da como resultado la mala regulación de 926 transcripciones en la etapa de trofozoíto y la aparición temprana de un perfil transcriptómico similar a esquizontes

Está bien establecido que cambios significativos en los niveles de expresión de un RBP pueden afectar la estequiometría de los complejos RBP-ARN, lo que resulta en cambios a gran escala en las redes reguladoras postranscripcionales gobernadas por el RBP [28]. Por lo tanto, postulamos que medir el transcriptoma en estado estacionario de los parásitos que sobreexpresan PfAlba1 nos permitiría consolidar el grupo de ARN objetivo de PfAlba1 y predecir algunos de los resultados de la interacción PfAlba1-ARN. Con este fin, recolectamos ARN total de dos etapas del parásito IDC: anillos de 8 a 10 h, cuando PfAlba1 tiene una localización nuclear [20], y trofozoítos de 28 a 30 h, cuando PfAlba1 es predominantemente citoplasmático (Fig. 1c) [ 20], y realizó una secuencia de ARN específica de cadena de ARN enriquecido con poli (A) (Fig. 5a). Encontramos que, en comparación con los parásitos vectoriales vacíos 3D7 y 3D7 +, una pequeña proporción del transcriptoma en etapa de anillo de los transfectantes PfAlba1-Ty1 estaba regulado de manera doble o más diferencial (117 transcripciones = 2,1% del transcriptoma 52 regulado positivamente y 65 regulado negativamente) con la mayoría de estas transcripciones (62%) pertenecientes a familias de genes de virulencia multigénica como var, rifin, y Stevor (Tabla S5a en el archivo adicional 6). En contraste, 926 transcripciones fueron doble o más reguladas diferencialmente (635 reguladas positivamente y 291 reguladas negativamente) en trofozoítos 3D7 + PfAlba1-Ty1 (Tabla S5b en el archivo adicional 6), estos constituyen el 16% del transcriptoma total del parásito. Para validar los cambios transcripcionales, realizamos transcriptasa inversa cuantitativa-PCR (qRT-PCR) en una selección aleatoria de 14 genes (archivo adicional 5 genes resaltados en azul) y, como se muestra en la Fig. 5b, confirmamos los cambios determinados por ARN- seq. De manera más general, estos resultados indican que PfAlba1 participa en el mantenimiento de la homeostasis del ARNm de las etapas del trofozoíto.

La sobreexpresión de PfAlba1 perturba el transcriptoma de la etapa de trofozoíto, lo que da como resultado el inicio temprano de un perfil de transcripción similar a esquizontes. a Representación esquemática del experimento de elaboración de perfiles transcriptómicos. Los parásitos 3D7, 3D7 + vector vacío o 3D7 + PfAlba1-Ty1 se cultivaron en glóbulos blancos (WBC) -anillo libre de sangre (8-10 h después de la infección (h p.i.)) o etapas de trofozoíto (28-30 h p.i.), y el ARN recolectado y el ARNm enriquecido y analizado mediante ARN específico de cadena-seq. La expresión diferencial en 3D7 + PfAlba1-Ty1 en relación con 3D7 y transfectantes de vectores vacíos se cuantificó mediante edgeR [71]. B El análisis de qRT-PCR de los genes indicados se realizó usando ARN total aislado de vector vacío o transfectantes PfAlba1-Ty1. los izquierda, medio y paneles derechos incluyen genes que fueron regulados positivamente, sin cambios o regulados negativamente, respectivamente, de acuerdo con RNA-seq. los eje y denota -ΔΔCt, calculado como en “Materiales y métodos”. Los datos representan las medias de un mínimo de tres experimentos independientes ± error estándar (barras de error). C Horas posteriores a la infección (HPI) las estimaciones de los datos transcriptómicos se obtuvieron pasando los datos RNA-seq normalizados a través del algoritmo de máxima verosimilitud desarrollado por Lemieux et Alabama. [29]. los panel izquierdo muestra las estimaciones de HPI dentro de intervalos de confianza del 95%, mientras que panel derecho muestra las probabilidades reales determinadas para cada muestra durante el IDC de 48 h. D Frotis de sangre teñidos con Giemsa que muestran un anillo (R), trofozoíto (T) o esquizonte (S) etapas de vector vacío o transfectantes PfAlba1-Ty1. Los recuadros muestran vistas ampliadas de los glóbulos rojos infectados indicados

A continuación, utilizamos un método de análisis estadístico basado en la máxima verosimilitud [29] para estimar la edad de desarrollo de nuestros conjuntos de datos transcriptómicos PfAlba1-Ty1. Dada la periodicidad de la expresión génica en P. falciparum [6, 16], dicho análisis separa la expresión diferencial verdadera de los cambios temporales dependientes del ciclo celular en los patrones de expresión y es una medida importante de la calidad de nuestras réplicas de RNA-seq para la variabilidad técnica y biológica [29]. En particular, el transcriptoma del trofozoíto 3D7 + PfAlba1-Ty1 se asignó a un punto de tiempo posterior del ciclo de vida del parásito (38-40 ho 44-46 h para las dos réplicas), mientras que el tiempo del transcriptoma del anillo, a las 8-10 h, fue casi idéntico a los parásitos de tipo salvaje y que contienen vectores vacíos (Fig. 5c). Un gráfico de escala multidimensional también apoyó el cambio en la edad de desarrollo de los conjuntos de datos de trofozoítos 3D7 + PfAlba1-Ty1 (Figura S5a en el archivo adicional 1). En conjunto, estas observaciones sugieren que la sobreexpresión de PfAlba1 da como resultado el inicio temprano de un perfil transcriptómico de tipo esquizonte debido a la perturbación de la homeostasis del ARNm, y proporciona una explicación para la reducción del crecimiento de 3D7 + PfAlba1-Ty1. Sin embargo, esto no se manifiesta como un cambio en la replicación y morfología del ADN del parásito según lo evaluado por citometría de flujo (Fig. 2d) y tinción de Giemsa de las etapas relevantes (Fig. 5d), respectivamente.

Finalmente, identificamos términos GO enriquecidos en el conjunto de datos regulado diferencialmente y se asignaron a los siguientes grupos (Figura S5b en el archivo adicional 1 Archivo adicional 7): membrana plasmática de la célula huésped, parte del citoplasma de la célula huésped, micronema, cuello de rhoptry, complejo de membrana interna, unión a heparina, unión a la superficie de la célula huésped, unión a actina, adhesión célula-célula de un solo organismo, variación antigénica y entrada en la célula huésped. Un análisis más detallado agrupó estos términos en dos categorías principales: componentes necesarios para la interacción del huésped para lograr la citoadherencia y componentes esenciales para la invasión de eritrocitos. Curiosamente, solo un término GO significativo se superpuso con el co-IPed y / o in vitro-conjuntos de datos de ARN ligado: entrada en la célula huésped. De hecho, encontramos que las transcripciones que codifican los componentes de invasión de eritrocitos, incluido el complejo de la membrana interna, las micronemas y las proteínas rhoptry, estaban reguladas al alza en los trofozoítos 3D7 + PfAlba1-Ty1. Por ejemplo, 20 de

En esta etapa, 25 componentes de roptrías se triplicaron al alza (Tabla S5b en el archivo adicional 6, los nombres de los genes están en letras rojas). Debido a que estas transcripciones alcanzan picos de transcripción solo a las 38-42 h (Figura S6 en el archivo adicional 1), creemos que el cambio transcriptómico similar a esquizontes se debe en parte a la regulación positiva prematura de dichas transcripciones en los trofozoítos PfAlba1-Ty1, es decir,

8-14 h antes que en las células de tipo salvaje.

Cuando se sobreexpresa PfAlba1, 105 transcripciones unidas a PfAlba1, incluidos 13 componentes de invasión de eritrocitos, se regulan diferencialmente

Habiendo identificado PfAlba1's en vivo y in vitro El interactoma de ARN y los ARN que se regulan diferencialmente cuando los parásitos producen un exceso de PfAlba1, postulamos que los ARN detectados en todos estos conjuntos de datos probablemente serían el primer conjunto de transcripciones dirigidas por PfAlba1 para la regulación postranscripcional. En consecuencia, delineamos su intersección usando un diagrama de Venn y encontramos que una pequeña proporción, 8.8% (n = 105), de las 1193 transcripciones que enlazaban en vivo y in vitro fue doble o más regulado diferencialmente: 97 regulado al alza y 8 regulado a la baja (Fig. 6a). El análisis de grupo funcional de las 105 transcripciones reveló que el 43% codificaba proteínas conservadas de función desconocida, mientras que el resto codificaba 13 componentes de la maquinaria de invasión, como PfCDPK1, PfEBA175, PfRhopH2, PfRhopH3, PfRON2, PfRON3, PfRON4 y PfRh2a y 2b. 14 quinasas y moléculas de señalización relacionadas, tres proteínas relacionadas con la actina y la miosina y tres proteínas ApiAP2, por nombrar algunas (Fig. 6b Archivo adicional 8). Además, el transcriptoma regulado diferencialmente contenía 38 transcripciones que solo se unían en vivo y 119 transcripciones que solo enlazan in vitro (Fig. 6a Archivo adicional 8), expandiendo la lista principal de ARNm dirigidos por complejos PfAlba1 para la regulación durante el IDC a 262. Para visualizar la distribución celular y funcional de genes anotados en las intersecciones de Venn de la Fig. 6a, diseñamos un esquema de un P. falciparum célula en estadio sanguíneo asexual y mapeó cada gen y su categoría de intersección en el esquema utilizando MapMan [30] (Figura S7 en el archivo adicional 1). Se hizo evidente que los ARNm que codifican proteínas que contribuyen a la invasión de eritrocitos, incluidos los componentes de los orgánulos apicales y las proteínas motoras relacionadas con la actina y la miosina, constituyen una parte significativa de las dianas de PfAlba1.

El once por ciento de las transcripciones desreguladas en los trofozoítos de PfAlba1-Ty1 se unen directamente a PfAlba1, y la unión da como resultado la represión traslacional de componentes seleccionados de la maquinaria de invasión de eritrocitos. a Se utilizaron diagramas de Venn para representar la superposición de las transcripciones identificadas en el co-IPed (co-IP Archivo adicional 2), in vitro-ligado (In vitro Archivo adicional 4), y regulado diferencialmente (Exp. Archivo adicional 6) conjuntos de datos. B Gráfico circular que muestra las categorías funcionalmente sobrerrepresentadas en las 105 transcripciones desreguladas y vinculadas a PfAlba1. C La agrupación jerárquica de Bootstrap se utilizó para dividir 14 transcripciones reguladas al alza en trofozoítos PfAlba1-Ty1 en función de su enlace (log2(cambio de pliegue) sombreado azul) a PfAlba1-Ty1 (co-IP) y GST-PfAlba1 (In vitro). Los números en las casillas son las puntuaciones de bootstrap. Los grupos resultantes estaban unidos a PfAlba1 (grupo superior) y PfAlba1 sin consolidar (grupo inferior). D Panel superior: Se realizó un análisis de qRT-PCR de los genes indicados utilizando ARNm aislado de vector vacío o trofozoítos PfAlba1-Ty1. los eje y denota -ΔΔCt, calculado como en “Materiales y métodos”. Los datos representan las medias de un mínimo de tres experimentos independientes ± error estándar (barras de error). Panel inferior: Los lisados ​​de proteínas preparados a partir de un vector vacío o trofozoítos PfAlba1-Ty1 se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante y se analizaron mediante transferencia Western con los anticuerpos indicados. Lisados ​​preparados a partir de anillos 3D7 (R ctrl) o esquizontes (S ctrl) sirvió como control para la detección de proteínas, excepto para PfFIKK7.1. ** = Excepciones a la correlación observada entre la unión de PfAlba1-RNA y la represión traduccional

El interactoma de ARN de PfAlba1 contiene transcripciones que se describen bajo control de traducción.

Con el fin de asignar una función postranscripcional a PfAlba1, a continuación comparamos el interactoma de ARN PfAlba1 con conjuntos de genes regulados postranscripcionalmente identificados en estudios previos de etapas sanguíneas asexuales [16, 19].El primer conjunto de datos que evaluamos fue generado por Bozdech y colegas [16] utilizando análisis correlativo transcriptómico y proteómico, y contiene 127 ARNm en etapa asexual que están sujetos a regulación de traducción (Tabla S8a en el archivo adicional 9). Encontramos que 104 (o el 82%) de los 127 ARNm están unidos por PfAlba1 en vivo y / o in vitro (Tabla S8a en el archivo adicional 9), lo que sugiere que PfAlba1 puede modular la traducción del ARNm durante el desarrollo asexual. Trece de estos ARN unidos están mal regulados en trofozoítos PfAlba1-Ty1 e incluyen transcripciones de invasión como Rap1, Rap3, RhopH2, RhopH3 y RON4. El segundo conjunto de datos que analizamos fue generado por DeRisi y sus colegas [19] mediante el perfil ribosómico y contiene 297 ARNm en etapa asexual que están regulados en el nivel de eficiencia de traducción (Tabla S8b en el archivo adicional 9). De estos, 187 (o el 63%) están vinculados por PfAlba1 en vivo y / o in vitro (Tabla S8b en el archivo adicional 9), lo que nuevamente indica un papel para PfAlba1 en la regulación de la traducción del ARNm. De las transcripciones unidas, 48 ​​tienen niveles de estado estacionario alterados en trofozoítos PfAlba1-Ty1 e incluyen 20 transcripciones de invasión de eritrocitos y etapa de anillo temprano como Rap1, Rap3, RhopH2, RhopH3, Clag9, RON2-5, EBA181, MSP3, MSP6 y MSP11 (Tabla S8b en el archivo adicional 9). En conjunto, este análisis predijo un papel de PfAlba1 en la regulación de la traducción durante las etapas de sangre asexual.

La unión de PfAlba1 está relacionada con la represión de la traducción de componentes selectos de invasión de eritrocitos

A continuación, para definir la función reguladora traslacional de PfAlba1 durante el IDC, nos centramos en componentes seleccionados de la maquinaria de invasión y roptría que se regularon positivamente en los trofozoitos PfAlba1-Ty1 y mostraron unión diferencial de PfAlba1 en la co-inmunoprecipitación y in vitro experimentos desplegables. Es decir, nos centramos en RhopH3, CDPK1, Rap1 y Clag9, que se unían a PfAlba1 en vivo y / o in vitroy Rap2, AMA1 y TRAMP, que no se unieron en ninguna de las dos condiciones (Fig. 6c). Es de destacar que estos ARNm alcanzan picos de transcripción a las 38-42 h [6, 16] en los parásitos 3D7 (archivo adicional 8 Figura S6 en el archivo adicional 1) y picos de expresión de proteínas a las 38-48 h [16, 17]. Otros candidatos de no invasión que analizamos y que fueron transcripcionalmente regulados positivamente en los parásitos 3D7 + PfAlba1-Ty1 incluyeron miembros de la familia de quinasas FIKK de serina / treonina, FIKK7.1 y FIKK9.6: los ARNm no se unieron a PfAlba1 (Fig.6c ) y se sintetizan al máximo en las etapas de esquizonte medio y tardío, respectivamente (Figura S6 en el archivo adicional 1).

Recolectamos 28-30 h de trofozoítos en estadio 3D7 + vector vacío o parásitos 3D7 + PfAlba1-Ty1 y analizamos los niveles de ARNm y proteínas de los genes seleccionados. Usando análisis de qRT-PCR (Fig. 6d, panel superior), encontramos que los niveles de los nueve ARNm estaban elevados en los trofozoítos PfAlba1-Ty1 en comparación con los transfectantes de vector vacío. Sin embargo, utilizando Western Blot, observamos que los ARNm que se unen a PfAlba1 en vivo y / o in vitro, es decir., RhopH3, CDPK1 y Rap1, no se tradujeron en esta etapa, mientras que PfRap2 y PfTRAMP, cuyos ARNm no están unidos por PfAlba1, se tradujeron (Fig. 6d, panel inferior). Las excepciones fueron Clag9 y AMA1, que mostraron la tendencia opuesta (Fig.6d, marcada con asteriscos dobles): el ARNm de Clag9 se unió a PfAlba1, pero la proteína se tradujo en trofozoítos, mientras que el ARNm de AMA1 no se unió a PfAlba1, pero fue reprimido traduccionalmente . Por último, las proteínas FIKK, cuyas transcripciones no se unen a PfAlba1, se tradujeron tanto en PfAlba1-Ty1 como en trofozoítos de vector vacío (Fig. 6d, panel inferior). En general, nuestros resultados muestran una fuerte correlación entre la asociación PfAlba1 y la represión traslacional en las etapas del trofozoíto.

La liberación de la represión traslacional entre las etapas de desarrollo acompaña a la disociación del ARNm de un complejo PfAlba1

Finalmente, para investigar la base molecular del ajuste fino de la traducción de las transcripciones de invasión de eritrocitos, evaluamos la asociación de ARNm de RhopH3, CDPK1, Clag9, Rap1, Rap2, AMA1 y TRAMP con PfAlba1-Ty1 durante la expresión típica de proteínas, es decir., la etapa de esquizontes (42 a 45 h), y aproximadamente 14 a 17 h antes de la expresión de proteína detectable, es decir., trofozoítos (28-30 h) (Fig. 7a). Planteamos la hipótesis de que las transcripciones de invasión que están unidas y reprimidas traduccionalmente por PfAlba1 en trofozoítos se liberarían de PfAlba1 en esquizontes para permitir la traducción. Primero hicimos IP PfAlba1-Ty1 con anticuerpos anti-Ty1 en condiciones no desnaturalizantes (Fig. 7b), y realizamos un análisis de qRT-PCR con cebadores específicos para las transcripciones de invasión seleccionadas. Incluimos FIKK7.1 y FIKK9.6 como controles regulados al alza, pero no unidos, y analizamos tres ARNm sin cambios y no unidos como controles para la inmunoprecipitación: aldolasa, actina I y seril ARNt sintetasa. Para cada gen, también determinamos el cambio de veces en los niveles de transcripción de trofozoítos a las etapas de esquizontes en relación con el ARNm de actina I (Figura S8 en el archivo adicional 1) y usamos este valor para calcular el cambio de veces en la asociación de trofozoítos a esquizontes.

Las transcripciones reprimidas traslacionalmente se asocian con un complejo PfAlba1 en trofozoítos y posteriormente se liberan en esquizontes para una traducción eficiente. a Representación esquemática de la configuración experimental. Los lisados ​​nativos preparados a partir de los parásitos PfAlba1-Ty1 en la etapa de trofozoíto (28 a 32 h) o esquizonte (42 a 45 h) se incubaron con anticuerpos de conejo anti-Ty1 en presencia de inhibidores de proteasa y ARNasa contra IP de un PfAlba1-Ty1 que contiene complejo de ribonucleoproteína. Los ARN de IPed se extrajeron y analizaron mediante qRT-PCR. Finalmente, se comparó la asociación de ARN con la presencia de la proteína correspondiente en lisados ​​de células enteras. goi = gen de interés. B Lisados ​​(20% de la entrada utilizada para inmunoprecipitación) o proteínas IPed con anticuerpos anti-Ty1 del trofozoito PfAlba1-Ty1 (T) o esquizonte (S) se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante y se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos anti-Ty1 de ratón o anticuerpos anti-PfAlba1. PfAldolase sirvió como control. C Panel izquierdo: Se analizó el ARN IPed de lisados ​​de trofozoíto o esquizontes de PfAlba1-Ty1 mediante qRT-PCR con cebadores específicos para los genes indicados. los eje y del gráfico de barras indica el porcentaje de enriquecimiento, calculado como en “Materiales y métodos”. Los datos representan las medias de un mínimo de tres experimentos independientes ± error estándar (barras de error). ** = La transcripción de AMA1 se une a PfAlba1 en etapas de trofozoíto. Doblar el cambio de la asociación PfAlba1 de trofozoítos a esquizontes, es decir., T / S, se calculó como en “Materiales y métodos”. * = La asociación de ARNm de PfAlba1 y Clag9 no disminuye de trofozoítos a esquizontes. Panel derecho: lisados ​​de proteínas preparados a partir de vector vacío o trofozoítos PfAlba1-Ty1 (T) y esquizontes (S) se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante y se analizaron mediante western blot con los anticuerpos indicados

Como se ilustra en la Fig. 7c (panel izquierdo), los ARNm de RhopH3, CDPK1 y Rap1 se asociaron significativamente con PfAlba1-Ty1 en las etapas de trofozoíto, mientras que la asociación se perdió en las etapas de esquizontes. En consecuencia, detectamos sus productos proteicos, PfRhopH3, PfCDPK1 y PfRap1, solo en la etapa de esquizontes (Fig. 7c, panel derecho). AMA1, que no se detectó en nuestro co-IPed /in vitro - conjunto de datos de transcripción enlazada (archivos adicionales 2 y 4), significativamente asociado con el complejo PfAlba1 en etapas de trofozoíto solo (Fig. 7c, marcado con asteriscos dobles), aunque en menor medida que RhopH3, CDPK1 y Rap1, y fue reprimido por traducción . Por el contrario, los ARNm de Rap2 y TRAMP no se unieron a PfAlba1-Ty1 ni en trofozoítos ni en esquizontes (Fig. 7c, panel izquierdo), y la proteína correspondiente fue detectable en ambas etapas (Fig. 7c, panel derecho). La excepción fue Clag9: a pesar de una aparente disminución en la asociación de PfAlba1-Ty1 con el ARNm de Clag9 de trofozoítos a esquizontes (Fig. 7c, panel izquierdo), el cambio de asociación fue & lt1 (Fig. 7c, marcado con un asterisco), y PfClag9 se trasladó en ambas etapas (Fig. 7c, panel derecho). Suponemos que la unión de PfAlba1 puede afectar otras propiedades como la estabilidad y / o localización del ARNm de Clag9. Todos los ARNm de control no se asociaron significativamente con PfAlba1-Ty1 en ninguna de las etapas del IDC, y las proteínas PfFIKK7.1 y PfFIKK9.6 se detectaron solo en trofozoítos de PfAlba1-Ty1 y transfectantes de vector vacío. Tomados en conjunto, mostramos para una serie de ARNm de invasión de eritrocitos que la unión y liberación de un complejo de ribonucleoproteína (RNP) PfAlba1 está asociada con la traducción oportuna. Esto puede ser especialmente importante para eventos que deben programarse con alta precisión, como el ensamblaje de orgánulos secretores apicales y complejos de invasión de eritrocitos en las horas finales del IDC. De hecho, especulamos que la regulación ascendente temprana de las transcripciones Rap1, RhopH3, AMA1 y CDPK1 observadas en los trofozoítos PfAlba1-Ty1 se rescata por la unión de PfAlba1 a estos ARNm y previene su traducción hasta la etapa tardía de esquizontes, cuando la funcionalidad de PfRap1, PfRhopH3 , PfAMA1 y PfCDPK1 es crucial.


Resultados

Perfil traslacional global durante la respuesta inflamatoria mediada por macrófagos

Usamos la respuesta de BMDM primarias de ratón a LPS como modelo para estudiar las regulaciones traslacionales en la inflamación, porque esta es una de las respuestas inflamatorias mejor caracterizadas (revisado en Medzhitov y Janeway, 2000). Específicamente, las BMDM primarias de ratón se trataron con 100 ng / ml de LPS y se recogieron a las 0, 1, 2, 4 y 6 horas después de la estimulación con LPS. Las células recolectadas en cada momento se dividieron en dos fracciones, que se sometieron a perfiles de RNA-seq o ribosoma (Ribo-seq) (Figura 1A). En la secuencia de ARN, los ARN totales empobrecidos en ARN ribosómico se fragmentaron aleatoriamente, seguido de la clonación direccional para la secuenciación. En Ribo-seq, los fragmentos de ARNm protegidos con ribosoma (RPF) se aislaron mediante gradientes de densidad de sacarosa y luego se sometieron a clonación direccional y secuenciación. Las lecturas resultantes se alinearon luego con un transcriptoma de ratón bien anotado, con más de 300 millones de lecturas mapeadas en total. Por lo tanto, perfilamos la expresión de ARNm y la asociación ribosoma-ARNm en paralelo durante la respuesta inflamatoria mediada por BMDM.

Perfil de traducción global de la respuesta inflamatoria mediada por BMDM primaria de ratón.

(A) Flujo de trabajo del perfil paralelo de ribosomas y ARN durante la respuesta inflamatoria mediada por BMDM. (B) Las gráficas de metageno muestran el aumento y la disminución de la densidad de huellas de ribosomas (RFP) de 28 nt (lecturas por millón de lecturas mapeadas de forma única, RPM) cerca de los inicios y paradas de los CDS anotados, respectivamente. Los desplazamientos de 12 nt y 15 nt (indicados por las flechas rojas) desde los inicios y las paradas reflejan las distancias desde los terminales 5 'de RFP hasta los codones del sitio P y A del ribosoma en el inicio y la terminación de la traducción, respectivamente. (C) Resolución de subcodon de huellas de ribosomas. Tenga en cuenta que la periodicidad del codón de 3 nt con respecto a los CDS conocidos se observa para las RFP de 28 nt pero no para las lecturas de secuencia de ARN. (D) Las huellas de ribosomas son muy específicas de las regiones codificantes. Los diagramas de caja muestran la densidad de las lecturas de Ribo-seq y RNA-seq en 5'UTR, 3'UTR e intrones en relación con la de los CDS asociados. (mi) Análisis de agrupamiento de la eficiencia de traducción (TE) de los 724 genes traducidos diferencialmente (empírico p & lt0.05) en la respuesta inflamatoria. El mapa de calor muestra los valores medios de TE log2 centrados en filas a las 0, 1, 2, 4, 6 horas después del tratamiento con LPS. (F) Motivos de proteínas de unión a ARN enriquecidos dentro de las 3'UTR de los 724 genes regulados por traducción. Los 10 motivos más enriquecidos de las RBP expresadas por macrófagos se muestran junto con las estadísticas de enriquecimiento.

Nuestros conjuntos de datos Ribo-seq fueron altamente reproducibles, como se indica al comparar los resultados de dos conjuntos de réplicas biológicas de BMDM (Figura 1, suplemento de figura 1A). Además, las siguientes características fundamentales de la traducción se pueden capturar con una resolución de un solo nucleótido a partir de estos datos. Primero, los RPF delinean con precisión secuencias codificantes conocidas (CDS) y sus exones, con desplazamientos de 12 nt y 15 nt corriente arriba de los codones de inicio de traducción y codones de terminación, lo que refleja distancias conocidas desde el extremo 5 'de RFP hasta el extremo P y A - codones de sitio, respectivamente (Figura 1B). En segundo lugar, los RPF tienen periodicidad de codones de 3 nt, una característica clave de la translocación de ribosomas, pero las lecturas de RNA-seq no (Figura 1C). En tercer lugar, los RPF son muy específicos de las regiones CDS en comparación con las lecturas de RNA-seq (Figura 1D). En conjunto, estas observaciones indican una buena calidad de datos para el análisis global de la regulación traslacional en la respuesta inflamatoria.

Para identificar los ARNm traducidos diferencialmente en la respuesta inflamatoria, calculamos la eficacia de traducción aparente (TE) para cada ARNm expresado por encima de un umbral (FPKM ≥ 10) en cada punto de tiempo. Aquí, definimos el TE aparente como el enriquecimiento de RPF sobre lecturas de RNA-seq en las regiones CDS. Encontramos 724 ARNm con cambios de TE significativos (empíricos p & lt0.05) en los cinco puntos de tiempo durante el tratamiento con LPS (figura 1E) (archivo complementario 1). El análisis de la ontología genética reveló que estos ARNm están implicados en diversas vías (Figura 1 — figura del suplemento 1B), incluidas las vías de señalización de TNF y NF-kB que son críticas en las respuestas inflamatorias. En efecto, TNF El ARNm, que codifica la citocina inflamatoria esencial TNF, está regulado por traducción. Este ARNm se induce transcripcionalmente de 0 a 1 hora tras la estimulación con LPS y luego disminuye de 1 a 2 horas, y el nivel de ARNm permanece relativamente estable hasta 6 horas después de la estimulación. Los RPF de TNF El ARNm, sin embargo, disminuye significativamente de 1 a 6 horas, con pocas TNF RPF a las 6 h (Figura 1 — Figura suplemento 2), lo que indica TNF El ARNm se reprime traduccionalmente en las últimas etapas de la inflamación. De hecho, el aparente TE de TNF El ARNm en las BMDM tuvo una disminución significativa de 1 hora a 6 horas después de la estimulación con LPS (Figura 1, suplemento de figura 3A). Para confirmar aún más este resultado, realizamos un análisis de polisomas seguido de qRT-PCR para monitorear la distribución TNF ARNm a través del gradiente de sacarosa (Figura 1 — suplemento de figura 3B). Comparado con TNF ARNm en el punto de tiempo de 1 hora, el TNF El ARNm tuvo un cambio significativo desde la región de polirribosoma a la región de ARNm en el gradiente de sacarosa a las 6 horas después del tratamiento con LPS (Figura 1 - figura suplementaria 3B y C), lo que indica que esta transcripción fue reprimida traduccionalmente. Es importante destacar que la distribución de un ARNm de control, Gapdh ARNm, no cambió entre los puntos de tiempo de 1 hora y 6 horas (Figura 1 — figura suplementaria 3C), lo que indica la especificidad de la represión traslacional en el TNF ARNm. En conjunto, estas observaciones indicaron que una gran cantidad de ARNm están regulados a nivel de traducción durante la respuesta inflamatoria.

Identificación de reguladores traslacionales potenciales en los BMDM activados

La traducción de ARNm se puede modular mediante elementos cis en UTR y factores que actúan en trans, como RBP y microARN. Para identificar los posibles reguladores traslacionales en la respuesta inflamatoria, realizamos el siguiente análisis computacional. En primer lugar, buscamos en las 3'UTR de los 724 ARNm traducidos diferencialmente en busca de motivos significativamente enriquecidos (p & lt10 −100 ajustado, prueba exacta de Fisher) que coincidan con los sitios de unión conocidos de

200 RBP identificadas mediante estudios de unión in vitro (Ray et al., 2013), que generaron una lista de RBP que pueden unirse a estos ARNm. A continuación, de esta lista de RBP, elegimos las que se expresan (FPKM ≥10) en BMDM, lo que resultó en un grupo de RBP (Figura 1F) que pueden ser reguladores de traducción potenciales en la respuesta inflamatoria. Entre estos RBP se encuentran varios reguladores de traducción conocidos, como Pcbp1, Pcbp2 y Cpeb4 (Hu et al., 2014 Makeyev y Liebhaber, 2002), que respaldan la validez de este enfoque.

Aquí, nos centramos en Zfp36 (TTP), una proteína de unión a ARE (elemento rico en AU), por varias razones. Primero, los estudios genéticos en ratones indicaron que se requiere Zfp36 para resolver la inflamación (Taylor et al., 1996). En segundo lugar, Zfp36 se expresa abundantemente en BMDM activadas (FPKM & gt200). En tercer lugar, aunque Zfp36 se caracterizó por promover la degradación del ARNm diana (revisado en Brooks y Blackshear, 2013), su papel en el control de la traducción del ARNm no se comprende bien en las BMDM primarias.

Para probar si Zfp36 puede regular la traducción de ARNm, realizamos los experimentos de anclaje, que nos permiten determinar la función de una RBP diana sin conocer sus ARNm de sustrato (Coller y Wickens, 2007). Específicamente, utilizando la interacción sólida y específica entre el polipéptido del bacteriófago λN y el motivo de ARN BoxB, unimos una proteína de fusión λN-Zfp36 a la 3'UTR de un ARNm de luciferasa de luciérnaga (FLuc) (Figura 1 - Figura 4). Actividad de luciferasa y la FLuc A continuación, se analizó el nivel de ARNm en células T 293. Tethering Zfp36 redujo tanto la actividad luciferasa como la Fluc Nivel de ARNm (Figura 1 - Figura 4). Es importante destacar que la traducibilidad del Fluc ARNm, definido como la actividad luciferasa normalizada al Fluc El nivel de ARNm se redujo significativamente de una manera dependiente de Zfp36 (Figura 1, suplemento de figura 4), lo que indicó que Zfp36 puede reprimir la traducción de ARNm. Este resultado es consistente con observaciones previas en los BMDM knockout Zfp36 que el TNF El ARNm, un objetivo de Zfp36, aumenta

dos veces en comparación con la de las BMDM de tipo salvaje, pero la proteína TNF aumentó

cinco veces (revisado en Taylor et al., 1996), lo que indica que Zfp36 también reprime la traducción del ARNm diana en BMDM primarias.

A continuación, nuestro objetivo fue determinar cómo Zpf36 reprime la traducción de ARNm en BMDM primarias e identificar las dianas de ARNm de Zfp36 endógena.

Un ratón knock-in con etiqueta de epítopo V5 para estudiar la Zfp36 endógena

Estudios anteriores que utilizaron inmunoprecipitación (IP) de Zfp36 sobreexpresado o el sistema de dos híbridos de levadura han identificado muchas proteínas con las que Zpf36 puede interactuar (revisado en Brooks y Blackshear, 2013). Aunque se pueden obtener conocimientos mecanicistas útiles, hay tres advertencias al interpretar estos resultados previos: (1) las líneas celulares pueden no representar las células primarias correspondientes (2) las proteínas que se unen a la Zfp36 sobreexpresada pueden no interactuar con la Zfp36 endógena y (3) para muchas interacciones identificadas, su efecto sobre la expresión génica aún se desconoce.También se aplican limitaciones similares a las dianas de ARNm identificadas en líneas celulares de tipo macrófago y no macrófago que sobreexpresan Zpf36 (Mukherjee et al., 2014 Tiedje et al., 2016). Sin embargo, un desafío técnico significativo del estudio de la Zpf36 endógena es la falta de disponibilidad de anticuerpos de grado IP para el aislamiento de Zfp36 específico y eficiente.

Para caracterizar la regulación endógena de la expresión génica mediada por Zfp36 en un entorno biológicamente relevante y para superar los obstáculos técnicos, creamos un ratón knock-in de etiqueta de epítopo V5 utilizando la edición del genoma mediada por CRISPR / Cas9 (Figura 2A). Específicamente, un sgRNA dirigido a un sitio genómico cerca de la región del codón de terminación del locus Zfp36 se coinyectó en cigotos de ratón con la enzima Cas9 y un oligonucleótido que contiene una etiqueta de epitotpo V5 de 51 nt con un

Brazo homólogo de 60 nt a cada lado de la secuencia V5. La ruptura del ADN de doble hebra generada por el Cas9 facilitó el knock-in en marco de la etiqueta del epítopo V5 mediante recombinación homóloga. Los cigotos genéticamente modificados se transfirieron a madres de ratón adoptivo, y el alelo knock-in Zfp36-V5 en los ratones resultantes se controló mediante PCR (Figura 2B). Purificamos genéticamente este alelo knock-in Zfp36-V5 mediante retrocruces. Los ratones homocigotos Zfp36-V5 nacieron en la proporción mendeliana predicha a partir de apareamientos heterocigotos (Figura 2 — suplemento de figura 1A). Además, a diferencia de las BMDM deficientes en Zfp36 (Taylor et al., 1996), las BMDM de los ratones Zfp36-V5 tienen la misma respuesta a LPS que las de los ratones de tipo salvaje en términos de inducción de citocinas inflamatorias y expresión de Zfp36 (Figura 2 - figura suplemento 1B), lo que indica que Zfp36-V5 en los ratones knock-in se expresa al mismo nivel endógeno que Zfp36 en ratones de tipo salvaje. Además, los ratones Zfp36-V5 son fenotípicamente indistinguibles de los ratones de tipo salvaje. Estas observaciones son consistentes con la noción de que la secuencia knock-in de la etiqueta V5 de 51 nt no altera el promotor Zfp36 ni cambia los elementos reguladores en el 3'UTR.

Generación de un ratón knock-in con etiqueta de epítopo V5 de Zfp36 para estudios mecanicistas sobre el Zfp36 endógeno.

(A) Flujo de trabajo para generar un ratón knock-in Zfp36-V5 mediante la edición del genoma mediada por CRISPR / Cas9. (B) Genotipado de los ratones knock-in Zfp36-V5 utilizando los dos cebadores que se muestran en (A). (C) Detección específica e inequívoca de Zfp36 utilizando el epítopo V5 en BMDM de los ratones Zfp36-V5. Se trataron BMDM de ratones de tipo salvaje y Zfp36-V5 con LPS 100 ng / ml durante 4 h, seguido de transferencia Western usando un anticuerpo anti-V5. Las bandas de doblete de Zfp36 se deben a sus modificaciones postraduccionales. (D) Aislamiento eficaz de Zfp36 endógeno utilizando el epítopo V5 en BMDM de los ratones Zfp36-V5. Las BMDM de los ratones Zfp36-V5 se estimularon con 100 ng / ml de LPS durante 4 horas, seguido de reticulación con UV254. Se utilizaron un anticuerpo anti-V5 y dos IgG diferentes para eliminar la Zfp36 endógena de los lisados ​​celulares, respectivamente. La entrada, las muestras de IP y los sobrenadantes se sometieron a SDS-PAGE y análisis de transferencia Western usando un anticuerpo anti-V5. El siguiente suplemento de figura está disponible para la Figura 2.

La etiqueta V5 permite la detección precisa y el aislamiento eficiente de Zfp36 endógeno. Utilizando un anticuerpo V5, pudimos detectar de forma inequívoca el Zfp36 endógeno en los BMDM de los ratones Zfp36-V5 (Figura 2C, Figura 2, suplemento de figura 1C). Es importante destacar que, a diferencia de un anticuerpo Zfp36, el anticuerpo V5 no dio como resultado bandas inespecíficas (Figura 2 — suplemento de figura 1C), lo que indica la alta especificidad de la detección de Zfp36. Además, utilizando el anticuerpo V5, también podríamos aislar de manera eficiente Zfp36 endógena de BMDM tratadas con LPS reticulado con UV (ver más abajo), como lo indica la distribución de Zfp36 en las muestras de entrada, IP y sobrenadante (Figura 2D). Finalmente, los ratones Zfp36-V5 proporcionan una fuente casi ilimitada de células primarias (es decir, BMDM). En conjunto, estas ventajas hacen que el ratón Zfp36-V5 sea una herramienta valiosa para la caracterización mecanicista de Zfp36 endógena en entornos biológicamente relevantes.

Zfp36 interactúa directamente con la proteína de unión a poli (A) citoplasmática en BMDM activadas

Para determinar cómo Zfp36 regula la expresión génica en BMDM primarias, primero identificamos las proteínas con las que interactúa la Zfp36 endógena mediante el uso de IP seguido de proteómica cuantitativa. Específicamente, las BMDM de los ratones Zfp36-V5 se recolectaron después de 4 h de estimulación con LPS, cuando Zfp36-V5 se expresa abundantemente (Figura 2 - suplemento de figura 1C). La Zfp36 y sus proteínas asociadas se sometieron a IP usando el anticuerpo V5 o IgG como control. Debido a la capacidad de unión de ARN de Zfp36, la IP se realizó con RNasaA, que interrumpe las interacciones mediadas por ARN, de modo que solo se pueden aislar interacciones proteína-proteína. Las proteínas IPed se sometieron a análisis proteómico cuantitativo basado en tándem mass-tag (TMT) (Thompson et al., 2003) para identificar las proteínas específicamente asociadas con Zfp36 (Figura 3A). En este método, las proteínas aisladas por el anticuerpo V5 o IgG fueron digeridas por tripsina. Los péptidos resultantes de cada muestra se marcaron con una etiqueta de masa isobárica diferente, seguido de la combinación para la espectrometría de masas (etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta, iTRAQ), identificación y cuantificación. La etiqueta de masa única de cada muestra permite comparar la abundancia de las proteínas identificadas en la V5 IP frente a las muestras de control de IgG. Con este enfoque, identificamos varias proteínas que están significativamente enriquecidas (& gt2 veces en las tres réplicas biológicas) en las muestras de IP V5 (archivo complementario 2). Como control positivo, la propia Zfp36 tenía un enriquecimiento superior a 20 veces, lo que indica la validez de este método. La siguiente proteína más enriquecida (& gt4 veces) y detectada abundantemente fue Pabpc1, seguida de 14-3-3θ (Figura 3B). De ahora en adelante, nos enfocamos en Pabpc1, la proteína de unión a poli (A) citoplásmica 1, debido a su papel en el control de la traducción y estabilidad del ARNm (Mangus et al., 2003).

Zfp36 endógeno interactúa con Pabpc1 en BMDM estimulada por LPS.

(A) Flujo de trabajo para la proteómica cuantitativa de etiqueta de masa en tándem (TMT) para identificar las proteínas asociadas con Zfp36 endógena en BMDM estimuladas con LPS. (B) Proteínas asociadas a Zfp36 identificadas por la proteómica cuantitativa de TMT. (C) Zfp36 interactúa con Pabpc1 endógena en BMDM estimuladas con LPS. Las BMDM de los ratones Zfp36-V5 o los ratones de tipo salvaje (WT) se trataron con 100 ng / ml de LPS durante 4 horas, seguido de IP con (+) o sin (-) RNasaA (200 ng / ml) usando un anti- Anticuerpo V5. Los productos de entrada (5%) y de IP se sometieron a SDS-PAGE y análisis de transferencia Western usando los anticuerpos indicados. (D) La interacción Zfp36-Pabpc1 es independiente del ARN. El plásmido que expresaba Zfp36 de tipo salvaje marcado con FLAG o un mutante, Zfp36 (F118N), se cotransfectó con un plásmido que expresaba Pabpc1 marcado con HA en células T 293, respectivamente. La IP se realizó con (+) o sin (-) RNasaA (200 ng / ul) usando un anticuerpo anti-FLAG o una IgG. Se utilizaron SDS-PAGE y Western blot para analizar las proteínas indicadas en las muestras de entrada e IP. (mi) Presentación esquemática de truncamientos de Zfp36 para mapear la región que interactúa con Pabpc1. (F) Identificación de la región en Zfp36 que se une a Pabpc1. Los plásmidos que expresan truncamientos de Zfp36 marcados con FLAG que se muestran en (mi) se cotransfectaron con un plásmido que expresa Pabpc1 marcado con HA en células T 293, respectivamente. La IP se realizó con RNasaA (200 ng / ml) utilizando un anticuerpo anti-FLAG o una IgG. Se utilizaron SDS-PAGE y Western blot para analizar las proteínas indicadas en las muestras de entrada e IP. El siguiente suplemento de figura está disponible para la Figura 3.

Para verificar la interacción independiente del ARN entre Zfp36 y Pabpc1, realizamos dos experimentos adicionales. Primero, realizamos IP en BMDM estimuladas de ratones Zfp36-V5 y ratones de tipo salvaje con o sin RNasaA usando el anticuerpo V5. La Pabpc1 endógena se detectó mediante transferencia Western en las muestras de IP de las BMDM de Zfp36-V5 de una manera insensible a la RNasaA pero no en la de las BMDM de tipo salvaje (Figura 3C). Es importante destacar que Gapdh, una proteína citoplasmática abundante, no se detectó en las muestras de IP, lo que indica la especificidad de los IP (Figura 3C). Este resultado mostró que la interacción endógena Zfp36-Pabpc1 no está mediada por ARN. Para confirmar aún más que la interacción entre estas dos RBP es independiente del ARN y para descartar la posibilidad de que esta interacción esté mediada por la etiqueta V5, realizamos IP en células 293 T que expresan una Pabpc1 etiquetada con HA con una Zfp36 etiquetada con FLAG o un mutante Zfp36 deficiente en unión a ARN marcado con FLAG (Zfp36 [F118N]) (Lai et al., 2002). Encontramos que el Pabpc1 etiquetado con HA se co-IPed específicamente con el Zfp36 de tipo salvaje y el mutante en presencia de RNaseA (Figura 3D). Para descartar aún más la posibilidad de que la interacción Zfp36-Pacbpc1 esté mediada por secuencias de poli (A) que la ARNasaA no puede degradar, realizamos el experimento de IP con ARNasa1, que degrada el ARN de una manera no específica de secuencia. Descubrimos que Zfp36 todavía interactuaba con Pabpc1 en esta condición (Figura 3 - Figura 1). En conjunto, estos experimentos revelaron que la interacción Zfp36-Pabpc1 es verdaderamente independiente del ARN. Dado que Pabp1c es la proteína asociada a Zfp36 más abundante identificada por la proteómica cuantitativa, se argumenta que la interacción endógena Zfp36-Pabpc1 es una interacción directa en las BMDM activadas.

Para definir una región mínima en Zfp36 que pueda interactuar específicamente con Pabpc1, realizamos mapeos estructura-función. En detalle, se coexpresaron una serie de truncamientos de Zfp36 etiquetados con FLAG (Figura 3E) en células T 293 con una Pabpc1 etiquetada con HA para co-IP, respectivamente. Tomamos dos pasos para asegurarnos de que la interacción identificada sea independiente del ARN. Primero, todos los truncamientos de Zfp36 tenían la mutación F118N (Zfp36-m), que anula la capacidad de unión al ARN (Lai et al., 2002). En segundo lugar, los IP se realizaron con RNaseA. Este análisis dio como resultado una región mínima de los aminoácidos 39 a 196 en Zfp36 (Zfp36-mF) que puede expresarse de manera estable e interactúa específicamente con Pabpc1 (Figura 3F).

La represión traduccional mediada por Zfp36 depende de Pabpc1

Para probar si la interacción Zfp36-Pabpc1 es necesaria para la represión traduccional mediada por Zfp36, realizamos dos experimentos. En primer lugar, utilizando el polipéptido λN y el sistema de anclaje de motivo de ARN BoxB, unimos truncamientos de Zfp36 y 2 de Zfp36 que no pueden interactuar con Pabpc1 (Figura 4, suplemento de figura 1), por separado, a la 3'UTR de un FLuc ARNm, y luego midió la actividad luciferasa, la Fluc Nivel de ARNm y traducibilidad (Figura 4A). Descubrimos que, a diferencia de Zfp36, los dos truncamientos no reprimían específicamente la traducción del Fluc ARNm (Figura 4B). Este resultado es consistente con la noción de que la interacción Zfp36-Pabpc1 es funcional.

La interacción Zfp36-Pabpc1 es necesaria para la represión traduccional mediada por Zfp36.

(A) Indicadores de luciferasa y Zfp36 y sus truncamientos utilizados en el experimento de anclaje. El cuadro azul representa el polipéptido λN. (B) Actividad de luciferasa, ARNm de FLuc y traducibilidad determinadas en el experimento de anclaje. El plásmido indicador FLuc-5BoxB o el plásmido de control se cotransfectó con el plásmido λN-GFP o con plásmidos que expresan λN-Zfp36 y sus truncamientos que se muestran en (A) en células 293 T, respectivamente. El ensayo de luciferasa y la medición de ARNm se realizaron entre 24 y 30 horas después de la transfección. La traducibilidad se calculó como la actividad luciferasa normalizada por el nivel de ARNm de FLuc. La actividad luciferasa, ARNm de FLuc y la traducibilidad de las células que expresan λN-GFP se establecieron como 1 para la cuantificación relativa, respectivamente. (C) El ARNm informador FLuc-5BoxB-MALAT1 es una transcripción poli (A). El ARN total de las células 293 T transfectadas con el plásmido indicador FLuc-5BoxB-MALAT1 se fraccionó mediante oligod (T)25 perlas magnéticas. Los ARN se cuantificaron mediante qRT-PCR en las fracciones poli (A) + y poli (A). El nivel de ARN en la fracción poli (A) se estableció como 1 para el cálculo del nivel relativo de ARN. (D) IP de HA-Pabpc1 en células T 293. Un plásmido que expresa HA-Pabpc1 se cotransfectó en células T 293 con el indicador FLuc-5BoxB-SV40pA o el indicador FLuc-5BoxB-MALAT1. Se realizó IP usando un anticuerpo anti-HA, y se usó Western blot para examinar las proteínas indicadas en las muestras de entrada y de IP. (mi) Pabpc1 no se une al ARNm informador FLuc-5BoxB-MALAT1. La qRT-PCR se realizó en los ARNm indicados del ARN total aislado de las muestras de entrada y de IP de (D). (F) Zfp36 no puede reprimir la traducción del ARNm de FLuc-5BoxB-MALAT1. La luciferasa, el nivel de ARNm y la traducibilidad del ARNm de FLuc-5BoxB-MALAT1 se determinaron en el experimento de anclaje como se describe en (B). Todos los resultados representan las medias (± DE) de tres experimentos independientes. * p & lt0.05, n.s. no significativo (p & gt0.05) según la prueba t de Student. El siguiente suplemento de figura está disponible para la Figura 4.

A continuación, especulamos que si la interacción Zfp36-Pabpc1 es importante, entonces Zpf36 no podría reprimir la traducción de las transcripciones que carecen de Pabpc1, como los ARNm sin colas de poli (A). Para probar esta hipótesis, creamos un ARNm poli (A) menos (poli (A) -) reemplazando la señal de poliadenilación de SV40 en el indicador FLuc (FLuc-5BoxB-SV40pA) con una secuencia del extremo 3 'de MALAT1, que puede resultar en transcripciones citoplasmáticas sin colas poli (A) (Figura 4C) (Wilusz et al., 2012). De hecho, cuando el resultado FLuc-5Box-MALAT1 El ARNm se fraccionó mediante perlas magnéticas oligod (T), la mayoría (& gt95%) permaneció en la fracción poli (A), que es similar a las transcripciones poli (A), como histona ARNm (H2ab) y ARNr 18S pero diferente del Gapdh transcripción, un ARNm de poli (A) + (Figura 4C). Para determinar aún más que el poli (A) - FLuc-5Box-MALAT1 El ARNm no está asociado con Pabpc1, realizamos IP de ARN en las células T 293 que expresan un HA-Pabpc1 con el FLuc-5BoxB-SV40pA ARNm o el FLuc-5BoxB-MALAT1 ARNm. Descubrimos que HA-Pabpc1 puede extraer cantidades significativas de las transcripciones poli (A) +, como la FLuc-5BoxB-SV40pA ARNm y Gapdh ARNm, pero no las transcripciones poli (A), como las FLuc-5BoxB-MALAT1 ARNm y histona ARNm (H2ab) (Figura 4D y E). Estos resultados indicaron que Pabpc1 no se une al poli (A) - FLuc-5BoxB-MALAT1 ARNm. Cuando Zfp36 estaba atado al FLuc-5BoxB-MALAT1 ARNm, encontramos que no hay cambios en la actividad de luciferasa, FLuc Nivel de ARNm, o traducibilidad en comparación con los de atar una proteína de control (GFP) (Figura 4F), lo que indica que Zfp36 no puede reprimir la traducción del poli (A) - ARNm que no está asociado con Pabpc1. Juntos, estos resultados defienden la importancia funcional de la interacción Zfp36-Pabpc1 en la represión traduccional mediada por Zfp36.

Identificación de objetivos globales de ARNm de Zfp36 en los BMDM activados por CLIP-seq

Para determinar la relevancia funcional de la interacción Zfp36-Pabpc1 en la expresión de los ARNm diana de Zfp36, primero identificamos los ARNm que la Zfp36 endógena se une en las BMDM activadas. Específicamente, realizamos CLIP-seq (Darnell, 2010) en BMDM Zfp36-V5. En este método, las BMDM activadas se reticularon primero por UV (254 nm), que solo introduce enlaces covalentes entre el ARN y las proteínas que están en contacto directo entre sí (Darnell, 2010). Las regiones libres de proteínas de los ARN fueron digeridas por RNasa1 en el lisado celular. Luego, el anticuerpo V5 protegió la Zfp36 y sus fragmentos de ARN asociados. El enlace covalente entre Zfp36 y sus fragmentos de ARN asociados permite lavados rigurosos durante el paso de IP, lo que disminuye sustancialmente las interacciones inespecíficas. A continuación, los fragmentos de ARN se aislaron y clonaron para una secuenciación de alto rendimiento. Un total de

Se obtuvieron 5 millones de lecturas mapeadas de forma única a partir de dos experimentos CLIP-seq independientes (Figura 5A). Es importante destacar que los resultados de CLIP de estas dos réplicas biológicas fueron similares entre sí pero diferentes de RNA-seq en el RNA total, lo que indica una alta reproducibilidad de los datos (Figura 5B).

Identificación de todo el transcriptoma de ARNm diana de Zfp36 utilizando CLIP-seq.

(A) Una tabla que resume el número de lecturas mapeadas unívocamente en el genoma del ratón para los duplicados CLIP-seq y RNA-seq. (B) Gráficos logarítmicos del número de lecturas mapeadas unívocamente por gen de los duplicados de CLIP-seq y el mRNA-seq. Cada punto representa un gen. Se indican los coeficientes de correlación de Pearson (Cor). (C) CLIP-seq lee la distribución dentro de los genes que codifican proteínas. Para las lecturas CLIP-seq mapeadas de forma única a los ARNm, se muestran sus porcentajes en las regiones 3'UTR, 5'UTR, CDS e intrón. (D) Motivos de unión a Zfp36 sobrerrepresentados identificados por CLIP-seq. El motivo se identificó mediante análisis MEME en los grupos de unión de Zfp36 dentro de los ARNm. El valor E es 1.6e-22. (mi) Análisis de ontología genética de los ARNm diana de Zfp36 en BMDM activadas.

Identificamos 280 ARNm con picos claros de unión a Zfp36 presentes en los dos experimentos CLIP-seq independientes (archivo complementario 3). Estos ARNm incluyen dianas Zfp36 bien caracterizadas, como TNF, IL-6, y Zfp36 sí mismo. La mayoría de los picos de unión se encuentran dentro de las 3'UTR de los ARNm diana (Figura 5C). Críticamente, el análisis de motivos reveló que el motivo de secuencia enriquecido más significativamente dentro de los picos de unión a Zfp36 es UAUUUAUU (Figura 5D). Aunque la reticulación inducida por UV-C (como UV254nm) ocurre preferentemente en las uridinas (Sugimoto et al., 2012), el motivo rico en U que identificamos (Figura 5D) es consistente con los motivos de unión a Zfp36 determinados a partir de la unión de ARN in vitro estudios sobre Zfp36 (revisados ​​en Brooks y Blackshear, 2013), argumentando firmemente que la secuencia UAUUUAUU es también el motivo de unión in vivo de Zfp36 en las BMDM activadas. El análisis de ontología genética reveló que los ARNm diana de Zfp36 están involucrados en varias vías importantes en las respuestas inflamatorias, como las vías de señalización de citocinas y quimiocinas (Figura 5E). En conjunto, estos resultados indicaron la validez de los datos de CLIP-seq e identificaron dianas de ARNm que la Zfp36 endógena se une en las BMDM activadas.

La interacción Zfp36-Pabpc1 es necesaria para la represión traduccional mediada por Zfp36 en BMDM activadas

Para determinar si la interacción Zfp36-Pabpc1 es funcionalmente relevante en el control de la expresión de ARNm diana de Zfp36 en BMDM activadas, primero atenuamos esta interacción endógena. Específicamente, expresamos la región Zfp36 mínima (Zfp36-mF) que puede interactuar con Pabpc1 (Figura 3E, F) en BMDM Zfp36-V5 usando un vector retroviral (Figura 6A). Es importante destacar que Zfp36-mF contiene una mutación puntual (F118N) que anula la actividad de unión al ARN (Lai et al., 2002), lo que elimina las complicaciones de la unión competitiva para los ARNm diana de Zfp36. IP con RNaseA indicó que la interacción endógena Zfp36-Pabpc1 se redujo a la mitad en las BMDM que expresan Zfp36-mF en comparación con las BMDM de control (Figura 6B, C).

La interacción Zfp36-Pabpc1 es importante para la represión traduccional mediada por Zfp36 en BMDM estimulada por LPS.

(A) Expresión del fragmento Zfp36-mF en BMDM estimuladas con LPS. Las BMDM de los ratones Zfp36-V5 se transdujeron con un vector retroviral vacío o un vector retroviral que expresa el fragmento Zfp36-mF (Figura 3E). Las BMDM transducidas se trataron con LPS durante 4 horas y el nivel de expresión de Zfp36-mF se controló mediante transferencia Western usando los anticuerpos indicados. (B) Zfp36-mF atenúa la interacción endógena Zfp36-Pabpc1 en BMDM activadas. El Zfp36 se administró por IP con RNaseA (200 ng / ml) de los lisados ​​celulares de las BMDM transducidas estimuladas con LPS en (A) utilizando un anticuerpo anti-V5. Se utilizaron SDS-PAGE y Western blot para analizar las proteínas indicadas en las muestras de entrada e IP. (C) Cuantificación de la interacción Zfp36-Pabpc1. La Pabpc1 endógena IPed se cuantificó mediante ImageJ, y la intensidad de Pabpc1 de las BMDM que expresan el vector vacío se estableció como 1 para la cuantificación relativa. (D) Análisis de polisomas de Zfp36-mF que expresan BMDM primarias. (mi) Los ARNm diana de Zfp36 se regulan positivamente en la traducción en las BMDM que expresan Zfp36-mF. La distribución de ARNm en las fracciones de mRNP, 80S y polirribosoma (mostradas en D) se cuantificó mediante qRT-PCR en las BMDM activadas que expresaban Zfp36-mF (+) o un vector retroviral vacío (-), respectivamente. (F) Los niveles de ARNm diana de Zfp36 no cambiaron drásticamente en las BMDM que expresan Zfp36-mF. Los ARNm de TNF e IL-6 se cuantificaron mediante qRT-PCR en las BMDM activadas que expresaban Zfp36-mF o un vector vacío, respectivamente. Se usó ARNr 18S para la normalización. (GRAMO) Las proteínas de los ARNm diana de Zfp36 aumentan al atenuar la interacción Zfp36-Pabpc1. Las proteínas TNF e IL-6 se cuantificaron mediante ELISA en el lisado celular y el sobrenadante de las BMDM que expresan Zfp36-mF y las BMDM de control, respectivamente. Los resultados representan las medias (± DE) de tres experimentos independientes. * p & lt0.05 y n.s. no significativo según la prueba t de Student.

A continuación, monitoreamos la asociación de ribosomas de los ARNm diana de Zfp36 mediante el perfil de polisoma mediado por gradiente de densidad de sacarosa. La expresión del fragmento Zfp36-mF no cambió el perfil polisoma global en las BMDM activadas (Figura 6D), de acuerdo con la noción de que este fragmento no se une al ARN. Luego examinamos la distribución de siete ARNm diana de Zfp36 a través del gradiente. Estos ARNm se expresan abundantemente y tienen fuertes picos de unión a Zfp36 dentro de sus 3'UTR. Al debilitar la interacción Zfp36-Pabpc1, los siete ARNm diana de Zfp36 tenían cambios significativos desde la región mRNP, que carece de ribosoma translocado, a la región polirribosoma, donde se produce la traducción activa, en el gradiente de sacarosa (Figura 6E). Críticamente, la distribución de Gapdh El ARNm, que no es un objetivo de Zfp36, no cambió con la expresión de Zfp36-mF (Figura 6E). Estas observaciones indicaron que la atenuación de la interacción Zfp36-Pabpc1 dio como resultado un aumento específico de la asociación de ribosomas en los ARNm diana de Zpf36.

Para verificar aún más la importancia funcional de la interacción Zfp36-Pabpc1, medimos los niveles de ARNm y proteína de dos objetivos de Zfp36: TNF y IL-6. Estas dos citocinas son actores críticos en la respuesta inflamatoria. La RT-PCR cuantitativa reveló que IL-6 El ARNm no se alteró significativamente y TNF El ARNm se redujo ligeramente (a

70% del control) cuando se expresó Zfp36-mF (Figura 6F). Curiosamente, sin embargo, a nivel de proteína, tanto el TNF como la IL-6 aumentaron significativamente en los lisados ​​celulares de las BMDM que expresan Zfp36-mF (Figura 6G). Se observaron aumentos similares en el sobrenadante de las células que expresan Zfp36-mF (Figura 6G), aunque el aumento de IL-6 no fue estadísticamente significativo. Por tanto, los resultados combinados del nivel de ARNm y el nivel de proteína indicaron que la eficiencia de traducción de estos dos ARNm diana de Zfp36 aumentó cuando se atenuó la interacción endógena Zfp36-Pabpc1.

En conjunto, estos resultados revelaron que la interacción Zfp36-Pabpc1 es necesaria para la represión traduccional de los ARNm diana de Zfp36 en BMDM activadas.

Zfp36 reprime la traducción en pasos similares a los que Pabpc1 regula la traducción

Para determinar con qué paso (s) de traducción interfiere Zfp36, utilizamos indicadores bicistrónicos que contienen elementos IRES (sitio de entrada de ribosoma interno). Los elementos IRES son ARN estructurados presentes en muchos virus que pueden posicionar y activar el inicio de la traducción eucariota (Fraser y Doudna, 2007). Es importante destacar que, en comparación con la traducción canónica, diferentes elementos IRES virales requieren diferentes subconjuntos de factores de iniciación de la traducción. Por lo tanto, al examinar la sensibilidad de varias traducciones mediadas por IRES a Zfp36, nuestro objetivo fue analizar qué paso (s) de traducción son reprimidos por Zfp36. Aquí, usamos dos elementos IRES: el virus de la hepatitis C (VHC) IRES, que requiere todos los factores de iniciación excepto eIF4G y eIF4E para el inicio de la traducción, y el virus de la parálisis del grillo (CrPV) IRES, que solo necesita la subunidad del ribosoma 40S para la traducción. iniciación. Estos dos elementos IRES se insertaron entre un CDS de FLuc y un CDS de luciferasa de renilla (RLuc) en el indicador bicistrónico, respectivamente (Figura 7A). Por tanto, la traducción de FLuc está controlada por la traducción dependiente del casquete canónico, mientras que RLuc se traduce por la traducción mediada por IRES. Además, los motivos de ARN BoxB en el 3'UTR del indicador permiten la unión específica de Zfp36 o una proteína de control (GFP) en los ARNm del indicador bicistrónico utilizando el polipéptido λN. Cuando se ataba Zfp36, los niveles de ARNm informador no cambiaban en comparación con los de la atadura de GFP (Figura 7B). Curiosamente, sin embargo, las actividades de luciferasa FLuc y RLuc disminuyeron significativamente en el informador HCV-IRES o en el informador CrPV-IRES (Figura 7C). Dado que la subunidad del ribosoma 40S es el único factor que necesita el elemento IRES de CrPV para iniciar la traducción (Fraser y Doudna, 2007), estos resultados argumentan firmemente que Zfp36 interfiere con el reclutamiento de la subunidad del ribosoma 40S durante el inicio de la traducción o inhibe los eventos en o después del inicio de la traducción. Paso de unión de la subunidad 60S durante la traducción del ARNm. Curiosamente, Pabpc1 también regula estos pasos para facilitar la traducción del ARNm (Mangus et al., 2003). Por tanto, estas observaciones indican que Zfp36 reprime la traducción en pasos similares a los que Pabpc1 regula la traducción.

Zfp36 reprime la traducción en pasos similares a los que Pabpc1 regula la traducción.

(A) Presentación esquemática del sistema informador de luciferasa bicistrónico para diseccionar cómo Zfp36 reprime la traducción. (B) El anclaje de Zfp36 no cambia los niveles de ARNm de los indicadores bicistrónicos. El plásmido informador bicistrónico (ya sea el informador de HCV o el informador de CrPV) se cotransfectó con el plásmido λN-GFP o el plásmido λN-Zfp36 en células T 293, respectivamente. Los niveles de ARNm informador de las células T 293 transfectadas se cuantificaron mediante qRT-PCR, y se usó ARNr 18S para la normalización. (C) Zfp36 inhibe tanto la traducción canónica como la traducción mediada por IRES. El plásmido indicador bicistrónico se cotransfectó con el plásmido λN-GFP o el plásmido λN-Zfp36 en células 293 T, respectivamente. Las actividades de luciferasa de luciérnaga (FLuc) y renilla (RLuc) se midieron a las 24-30 horas después de la transfección. La traducibilidad se calcula como la actividad luciferasa normalizada por el nivel de ARNm informador. (D) Un modelo para la regulación de la expresión génica mediada por Zfp36 en BMDM activadas. Todos los resultados de la cuantificación representan las medias (± DE) de tres experimentos independientes. * p & lt0.05 y n.s. no significativamente diferente según la prueba t de Student.


DISCUSIÓN

Varias de las observaciones anteriores sugieren que la proteína del dominio KH, GLD-1, funciona como un represor directo de glp-1 traducción. Primero, el GLD-1 endógeno puede asociarse específicamente con glp-1 ARN que contiene el elemento de represión GRE. En segundo lugar, el GLD-1 recombinante se une específica y directamente a un fragmento de 34 nucleótidos del glp-1 SCR in vitro. En tercer lugar, la unión de GLD-1 a glp-1 El ARN se interrumpe específicamente por mutaciones en el GRE que también interrumpen la represión de la traducción en células germinales meióticas y embriones tempranos. Finalmente, el agotamiento de GLD-1 endógeno causa una expresión inapropiada de GLP-1 endógeno en momentos y lugares de desarrollo similares donde el glp-1 Funciones GRE. Estos resultados sugieren fuertemente que GLD-1 es un represor de glp-1 traducción en dos etapas de desarrollo, profase temprana de la meiosis de células germinales y temprana en la embriogénesis.

GLD-1 es un miembro conservado de la familia de proteínas STAR / Quaking / GSG que se ha relacionado con varios eventos de transducción de señales y desarrollo. En C. elegans, Se ha demostrado que GLD-1 controla la determinación del sexo y la ovogénesis en la línea germinal mediante la regulación de varios ARNm de la línea germinal (Francis et al., 1995a Jan et al., 1999 Lee y Schedl, 2001 Xu et al., 2001). Nuestros estudios sugieren una nueva función para GLD-1 en el control de la asimetría embrionaria temprana. Esta función contribuye a la localización de un receptor Notch en las células anteriores del embrión. En otros organismos, los miembros de la familia STAR se han conectado a varias cascadas de señalización de proteína quinasa (Vernet y Artzt, 1997). En C. elegans, GLD-1 regula la traducción de trα-2, que codifica un receptor de membrana clave para la determinación del sexo (Jan et al., 1999 Kuwabara et al., 1992). GLD-1 también se asocia con ARNm que codifica una proteína quinasa Raf en la línea germinal (Lee y Schedl, 2001). Nuestros resultados vinculan la función GLD-1 con el control de otro sistema de señalización, la vía Notch. Por lo tanto, esta familia de proteínas de unión a ARN puede ser generalmente importante para la regulación de una variedad de diferentes eventos de señalización que controlan importantes decisiones de desarrollo en los metazoos.

Estos resultados sugieren que GLD-1 contribuye a la organización espacial de la señalización Notch tanto en el embrión como en la línea germinal. En el embrión, la localización de los ligandos GLP-1 / Notch y el receptor es probablemente importante para el patrón espacial de los destinos de las células anteriores (Mello et al., 1994 Priess y Thomson, 1987). Sugerimos que GLD-1 participa en este proceso mediante la represión de glp-1 traducción en células posteriores del embrión. En la línea germinal, la represión GLD-1 de glp-1 podría ser parte de un sistema de retroalimentación negativa de la regulación del ARN que controla la organización espacial de la señalización Notch y el desarrollo de las células germinales. El GLP-1 se expresa en células germinales mitóticas de la punta distal, donde mantiene la población de células madre mitóticas (Austin y Kimble, 1987 Crittenden et al., 1994). Curiosamente, la expresión de GLD-1 se inhibe en la región de la punta distal mitótica por un proceso que depende de las proteínas de unión a RNα FBF-1 y FBF-2, que pueden unirse directamente al gld-1 3 'UTR (Crittenden et al., 2002 Jones et al., 1996). Esto puede ser importante para permitir la expresión completa del receptor de GLP-1 en estas células. A medida que las células germinales se alejan de la punta distal y de la fuente del ligando para la señalización de GLP-1, entran en meiosis y comienzan a expresar GLD-1 y probablemente otros factores (ver más abajo), que luego reprimen la traducción de glp-1 ARNm. GLD-1 es esencial para promover la salida de la mitosis y la diferenciación de gametos femeninos (Francis et al., 1995a Francis et al., 1995b). Sin embargo, los estudios genéticos sugieren que la regulación negativa de GLP-1 por GLD-1 solo contribuye débilmente a la inhibición de la mitosis de células germinales (Francis et al., 1995b). Podría ser que la represión GLD-1 de glp-1 ARNm y otros ARNm, junto con la localización del ligando GLP-1 / Notch en la célula somática de la punta distal (Henderson et al., 1994), proporcionan sistemas redundantes para restringir espacialmente la señalización de GLP-1 y organizar la proliferación mitótica de células madre de la línea germinal en la gónada.

Nuestros estudios y observaciones previas sugieren que la localización precisa de glp-1 la traducción en el embrión requiere la regulación de GLD-1 por otros factores. En el embrión temprano, la traducción localizada requiere no solo el GRE sino también el GDE que promueve la traducción. Debido a que la GDE solo es necesaria para regular la GRE, sugerimos que funcione como un sitio de unión para un factor de desrepresión que inhibe la unión de GLD-1 a la GRE o su actividad (Fig. 6). La localización de la traducción podría lograrse de forma más sencilla mediante la localización del desrepresor en las células anteriores. Sin embargo, GLD-1 está muy enriquecido en células posteriores (Jones et al., 1996). Podría ser necesario un desrepresor para inhibir los niveles residuales bajos de GLD-1 que persisten en las células anteriores. Quizás, la localización tanto de GLD-1 como de factores desrepresores asegura una localización precisa de GLP-1 y otros reguladores del destino celular. Alternativamente, otro represor no localizado también puede contribuir a glp-1 Represión de ARNm a través del GRE.


Resultados

PAB puede estimular la traducción en ovocitos de Xenopus

Para determinar si PAB puede estimular la traducción en Xenopus laevis ovocitos, unimos PAB a la 3'-UTR de un ARNm informador adaptando un ensayo de "función atada" previamente utilizado para estudiar la estabilidad del ARNm en levaduras (Coller et al., 1998 Figura 1A). Este enfoque libera los estudios del papel de PAB en la traducción de sus otras funciones y permite modular la presencia de PAB en un mRNA específico sin las complicaciones del agotamiento de PAB. en vivo. In vitro Los ARNm transcritos que codifican MS2 o MS2 fusionados a PAB (MS2-PAB Figura 1A) se inyectaron en la etapa VI Xenopus ovocitos. Los ovocitos se incubaron durante 6 h para permitir la producción de proteínas. A continuación, se inyectaron los ARNm informadores y los ovocitos se incubaron durante la noche antes de la recolección. Se utilizaron dos ARNm y se inyectaron como una mezcla (Figura 1B). El ARNm de Luc-MS2 codifica la luciferasa y contiene sitios de unión a MS2 a la inversa, un ARNm de β-Gal de control codifica la β-galactosidasa pero no contiene sitios de MS2 (Figura 1B). A lo largo de este trabajo, la actividad de traducción se cuantificó como la actividad de luciferasa normalizada a las variaciones de la actividad de β-galactosidasa en los niveles de β-galactosidasa fueron típicamente & lt10%, mostrando que el ARNm de control no respondía a la presencia de las proteínas de fusión (ver leyenda de la Figura 3).

La expresión de MS2-PAB estimuló la actividad luciferasa del ARNm de Luc-MS2 en comparación con la proteína MS2 sola (Figura 1C). La estimulación media observada fue de 7 veces, siendo rara vez & lt4,5 o & gt10 veces. La reducción de la cantidad de ARNm informador en un orden de magnitud no aumentó la estimulación por PAB unido, lo que sugiere que la proporción de ARNm informador a proteína PAB en condiciones estándar fue óptima (datos no mostrados). Los ARNm de Luc-MS2 marcados con 32 P fueron igualmente estables en los ovocitos que expresan MS2 o MS2-PAB durante el transcurso del experimento (Figura 1D). Esto sugiere fuertemente que el aumento de la actividad luciferasa se debió a diferencias en la traducción y no a la estabilidad del ARNm informador.

Para determinar si la estimulación por MS2 – PAB ocurrió solo en cis, analizamos los efectos de MS2-PAB en el ARNm de Luc-ΔMS2. Este ARNm solo se diferencia del ARNm de Luc-MS2 en que carece de sitios de unión a MS2 (Figura 1B). La traducción de Luc-ΔMS2 no fue estimulada por MS2-PAB (Figura 2A, compare las barras 1 y 2 con 3 y 4). Los ensayos de cambio de movilidad en gel demostraron que MS2-PAB interactuó solo con el ARNm de Luc-MS2: el ARNm de Luc-MS2 sin marcar, pero no el ARNm de Luc-ΔMS2, compite por la unión de MS2-PAB a un ARN radiomarcado corto que lleva sitios MS2 (Figura 2B). los cis La dependencia de la estimulación del PAB unido se corroboró por la falta de efecto de MS2-PAB en el ARNm de β-galactosidasa de control (datos no mostrados).

Para determinar si la estimulación requería la porción PAB de la proteína de fusión, se fusionaron otros dos polipéptidos a la proteína de cubierta MS2 (Figura 2C). MS2 – CAT es una fusión de MS2 con cloranfenicol acetiltransferasa bacteriana (CAT), una proteína sin función conocida en el metabolismo del ARN. MS2-U1A es una fusión de MS2 con U1A, una proteína de unión a ARN espliceosomal de la familia de motivos de reconocimiento de ARN (RRM) (Jovine et al., 1996 y referencias en el mismo). La inyección de ARNm de Luc-MS2 en ovocitos que expresan estas proteínas de fusión reveló que solo MS2-PAB estimulaba la traducción de luciferasa (Figura 2C). Todas las proteínas de fusión se expresaron en ovocitos (Figura 2D). [La proteína MS2 no se pudo visualizar fácilmente debido al bajo número de metioninas en esta pequeña proteína (datos no mostrados).] Esto sugiere que el PAB unido estimula la traducción de una manera específica que no se logra con otras proteínas de fusión, incluidas otras RRM- que contiene proteínas. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que PAB estimula la traducción de un modo específico, cis-dependiente en Xenopus ovocitos.

Múltiples dominios de PAB pueden estimular la traducción

PAB se compone de cuatro motivos de unión a ARN no equivalentes de la familia RRM y un dominio C-terminal (Sachs et al., 1986 Burd et al., 1991 Figura 3A). RRM 2 proporciona la mayor parte de la capacidad de PAB para unir poli (A), mientras que RRM 4 proporciona la mayor parte de su actividad de unión de ARN "no específica" (Nietfeld et al., 1990 Burd et al., 1991 Kühn y Pieler, 1996 Deardorff y Sachs, 1997). El extremo C-terminal de PAB es el menos conservado y no parece unirse al ARN (Kühn y Pieler, 1996): puede promover interacciones intermoleculares entre moléculas de PAB (Kühn y Pieler, 1996) y puede contribuir a la estabilización del ARNm en levaduras ( Coller et al., 1998 ).

Examinar las contribuciones de dominios PAB separados a la traducción en vivo, atamos regiones de PAB y analizamos la traducción (Figura 3A).Un experimento representativo se muestra en la Figura 3B y el promedio de varios experimentos en la Figura 3C. Una proteína de fusión que contiene RRM 1–4 (MS2 1–4) tenía una actividad estimulante completa, lo que sugiere que no se requiere el extremo C-terminal. Es poco probable que la estimulación por los RRM 1–4 esté mediada por el reclutamiento de PAB endógeno de longitud completa a través de la dimerización (datos no mostrados por Kühn y Pieler, 1996). Los RRM 1 y 2 (MS2 1–2) fueron suficientes para estimular la traducción y parecían ser más activos que el PAB completo; la importancia de esta diferencia reproducible no está clara. Sorprendentemente, una proteína de fusión que contiene sólo RRM 3 y 4 (MS2 3-4) también estimuló la traducción de Luc-MS2 en un grado similar a MS2-PAB de longitud completa. Una fusión que contiene sólo la parte C-terminal de PAB (MS2-Ct) mostró una capacidad más pequeña pero reproducible y específica para estimular la traducción (Figura 3B y C). MS2-U1A, incluido como control adicional para cualquier actividad estimulante no específica, no estimuló la traducción de manera significativa. Todas las proteínas de fusión se expresaron en ovocitos (Figura 3D) y las diferencias en los niveles de expresión no explican las diferencias en su actividad. De manera similar, el aumento de la proporción de proteína a ARNm inyectando 10 veces menos ARNm informador no tuvo ningún efecto sobre la magnitud de la estimulación (datos no mostrados), lo que sugiere que estaban presentes niveles suficientes de proteínas de fusión para la estimulación máxima.

Llegamos a la conclusión de que varias regiones de PAB (RRM 1-2 y RRM 3-4) estimulan la traducción de manera eficiente. Curiosamente, las actividades de los RRM 1 y 2 y de los RRM 3 y 4 parecen ser redundantes: la actividad de los RRM 1 a 4 no es mayor que la de los RRM 1 y 2 o de los RRM 3 y 4. El extremo C-terminal tiene un valor más bajo, pero actividad estimulante significativa.

Factores que interactúan con Xenopus PAB

En otras especies (Saccharomyces cerevisiae, humano y trigo), PAB interactúa in vitro con eIF-4G, que forma parte de un complejo cap-binding con eIF-4E (Tarun y Sachs, 1996 Le et al., 1997 Imataka et al., 1998). En humanos, Paip-1, que tiene una homología significativa con eIF-4G, también interactúa con PAB (Craig et al., 1998). Para comprender mejor cómo Xenopus PAB estimula la traducción en ovocitos, determinamos si las regiones de Xenopus Los PAB que provocan la activación traslacional interactúan con eIF-4G o Paip-1. Realizamos pruebas de dos híbridos utilizando Xenopus Derivados de PAB y el N-terminal de eIF-4G (eIF-4GNt) o Paip-1 de longitud completa de humanos el Xenopus las proteínas aún no están clonadas. Partes de PAB se presentaron como fusiones LexA y eIF-4G y Paip-1 como GAL4 fusiones de dominio de activación. PAB 1-2 (que contiene RRM 1 y 2) interactuó con eIF-4G y Paip-1, pero no con otra proteína de unión a ARN (IRP1 Figura 4A). La interacción de PAB con Paip-1 pareció más fuerte que con eIF-4G, esto no se debe a niveles más altos de Paip-1 (datos no mostrados). El C-terminal de PAB (PAB-Ct), que estimula débilmente la traducción en el ensayo de función atada, interactuó solo con Paip-1 (Figura 4A). PAB 3-4, que estimula de manera eficiente la traducción, interactuó con ninguno de los factores (Figura 4A).

Todas las proteínas de fusión LexA se expresaron a niveles similares en levadura, según se determinó mediante transferencia Western usando un anticuerpo monoclonal anti-LexA (Figura 4B). Por tanto, la falta de interacción entre factores específicos no se debe a la falta de proteínas en la levadura. Además, PAB 3-4 es capaz de interactuar con otras proteínas en el sistema de dos híbridos, lo que sugiere que es nuclear y activo (datos no mostrados). Concluimos que múltiples interacciones, que involucran eIF-4G, Paip-1 y otros, factores aún no identificados, pueden mediar la estimulación traslacional por Xenopus PAB.

La interacción con eIF-4G pero no con Paip-1 se correlaciona con la estimulación traslacional in vivo

Los RRM 1 y 2 de PAB estimulan la traducción en ovocitos e interactúan con eIF-4G y Paip-1. Ambos factores están presentes en los ovocitos: eIF-4G se ha detectado previamente (Keiper y Rhoads, 1999), y un anticuerpo anti-Paip-1 detecta una proteína del peso molecular predicho en extractos de ovocitos (Figura 5A). Por tanto, las interacciones con eIF-4G o Paip-1 podrían ser la base del efecto estimulante de los RRM 1 y 2 en los ovocitos.

Para distinguir qué interacción fue importante en vivo, intentamos identificar una forma mutante de PAB que interactuaba con solo una de las proteínas. Construimos una deleción C-terminal de RRM 1 y 2, en la que se eliminaron los últimos 38 aminoácidos de RRM2 (PAB 1–2Nt) esta región de levadura PAB es necesaria para la unión a eIF-4G (Otero et al., 1999). El análisis de dos híbridos con PAB 1–2Nt reveló que no se unía a eIF-4G, pero sí a Paip-1 (Figura 5B). Una variante que contenía RRM 1 y 2 en su totalidad interactuó con eIF-4G, como se esperaba (Figura 5B).

Para determinar si la forma eliminada de la traducción estimulada por PAB, se expresó en ovocitos una fusión de MS2 que contiene esta región (MS2 1–2Nt Figura 5C). MS2 1-2Nt no estimuló la traducción de Luc-MS2 (Figura 5D), aunque la proteína se expresó de manera eficiente (Figura 5E). Por tanto, la deleción de la región de los RRM 1 y 2 que se requiere para la unión a eIF-4G anula la estimulación traslacional. Estos datos proporcionan evidencia de que la interacción con eIF-4G es necesaria para la estimulación traslacional y que la interacción con Paip-1 es insuficiente.

La activación traslacional no requiere poli (A) ni actividad de unión completa al ARN

En sistemas libres de células de levadura, se ha sugerido que un complejo de cola PAB-poli (A) es esencial para la capacidad de PAB de interactuar con eIF-4G y estimular la traducción (Tarun y Sachs, 1996 Tarun et al., 1997). Nuestros datos sugieren que este no es el caso en Xenopus ovocitos: los ARNm informadores en las Figuras 1, 2, 3, 4, 5 carecen de poli (A) pero fueron estimulados por PAB unido. De manera similar, la traducción fue estimulada de manera eficiente por los RRM 3 y 4 (Figura 3), a pesar de la capacidad significativamente reducida para unir poli (A) (Burd et al., 1991 Kühn y Pieler, 1996 Deardorff y Sachs, 1997), y por los RRM 1 y 2, aunque Xenopus PAB que carece de RRM4 y el extremo C-terminal no interactúa de manera estable con poli (A) en los ovocitos (Wormington et al., 1996 ).

Para probar de manera más decisiva si la estimulación por PAB anclado requería unión de poli (A), introdujimos mutaciones puntuales en las secuencias RNP1 de PAB en MS2 1-2 (Figura 6A) que previamente se demostró que disminuía la unión de poli (A) 100 veces. in vitro (Deardorff y Sachs, 1997 y referencias en el mismo). La estimulación por esta forma mutante de PAB (MS2-Rd) es comparable a la de MS2-PAB de longitud completa, aunque se reduce ligeramente en relación con MS2 1-2 (Figura 6B y C). Este resultado argumenta que el PAB anclado no entra en contacto con el poli (A) en trans en ARNm distintos del informador, y esa unión de poli (A) se puede dispensar para la estimulación.

El análisis de dos híbridos reveló que la forma defectuosa de unión al ARN de los RRM 1 y 2 todavía interactuaba con eIF-4G y Paip-1, aunque con una afinidad ligeramente reducida (Figura 6D). Este resultado argumenta que la interacción entre PAB y estos factores en el sistema de dos híbridos es a través de interacciones proteína-proteína y no a través de un puente de ARN. Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren fuertemente que la estimulación traslacional es una propiedad intrínseca de la Xenopus Proteína PAB, y que el papel de poli (A) en la estimulación mediada por PAB en ovocitos es simplemente reclutar PAB.

Estimulación traslacional por levadura PAB en ovocitos

Dado que la estimulación traslacional por Xenopus El PAB en los ovocitos no presentó el mismo requisito para el poli (A) que el PAB de la levadura. in vitro, comparamos directamente los efectos de la levadura atada y Xenopus PAB en ovocitos, utilizando un ARNm informador que carece de poli (A). Sorprendentemente, el PAB de levadura anclado (MS2-yPAB) estimuló la traducción del ARNm no adenilado incluso más eficientemente que el anclado Xenopus PAB (Figura 7). Esto sugiere que las diferencias entre levadura y Xenopus PAB per se no tienen en cuenta las diferencias en la dependencia poli (A) entre Xenopus ovocitos y levadura in vitro extractos. La mayor actividad de la proteína de levadura puede reflejar la regulación de Xenopus Actividad de PAB en ovocitos (ver Discusión).

Estimulación traslacional por PAB en levadura

Para examinar el papel de PAB en la levadura, se ideó un ensayo fenotípico para medir la actividad de PAB en células de levadura intactas. Usamos un ARNm informador adenilado relativamente estable para eliminar las complicaciones debidas al recambio (Coller et al., 1998). Los sitios MS2 se insertaron en el 3'-UTR de un informador que codifica la proteína metalotioneína de cobre de levadura (CUP1) marco de lectura abierto (Figura 8A). La capacidad de la levadura para sobrevivir en presencia de cobre es proporcional a los niveles de proteína Cup1p (Stutz y Rosbash, 1994). los CUP1 / MS2 gen, que lleva los sitios MS2, era funcional en el sentido de que complementaba una alteración cromosómica de la CUP1 gen (datos no mostrados).

La expresión de MS2 – yPAB aumentó significativamente la supervivencia en niveles altos de cobre, lo que permitió el crecimiento en concentraciones de hasta 2,4 mM (Figura 8B, panel superior). Estos efectos fueron específicos, ya que ni MS2 solo, yPAB solo ni una fusión MS2-Sex-lethal (MS2-Sxl) (Crowder et al., 1999) mejoró el crecimiento celular a altas concentraciones de cobre (Figura 8B, panel superior). El nivel de ARNm en estado estacionario del CUP1 / MS2 El reportero no se vio afectado significativamente por ninguna de las proteínas de fusión (Figura 8B, panel inferior), lo que sugiere que la mayor resistencia al cobre por MS2-yPAB es atribuible a la traducción y no a las alteraciones de los niveles de ARNm. Los efectos sobre el transporte de ARNm no se pueden eliminar formalmente, pero se utilizaron ARNm informadores poliadenilados para prevenir la retención nuclear.

Para cuantificar los efectos de traslación de MS2 – yPAB, reemplazamos CUP1 con LacZ (Figura 8A). La actividad de la β-galactosidasa se incrementó 2,7 veces por MS2-yPAB en relación con las células que expresan MS2 sola (Figura 8C). La magnitud de la estimulación es consistente con el nivel modesto de aumento en la resistencia al cobre (Stutz y Rosbash, 1994), pero considerablemente menor que la observada con MS2-yPAB en ovocitos (Figura 7). Esto puede deberse a la presencia de poli (A) en los ARNm informadores en las células de levadura, las colas podrían unirse al PAB endógeno y minimizar los efectos de MS2-yPAB. En apoyo de esta idea, los ARNm informadores poliadenilados en los ovocitos fueron estimulados solo 2,4 veces por MS2-yPAB (datos no mostrados).

Para examinar el papel de la unión de poli (A) en la levadura, construimos una forma mutante de MS2-yPAB (MS2-yRd), que contiene mutaciones puntuales en cada uno de sus RRM que deprimen colectivamente la unión de poli (A) 300 veces (Deardorff y Sachs, 1997). Es importante destacar que MS2-yRd estimuló CUP1 / MS2 expresión así como MS2-yPAB (Figura 8D, panel superior), sin afectar los niveles de ARNm en estado estacionario (Figura 8D, panel inferior).

Para identificar regiones específicas de MS2-yPAB que se requieren para la estimulación de la traducción en levadura, analizamos una serie de deleciones de PAB fusionadas con la proteína de la cubierta de MS2 (Figura 9A). La eliminación de los últimos 90 aminoácidos de levadura PAB (MS2 y1–4CΔ90) impidió la capacidad de PAB para estabilizar ARNm informadores de otro modo inestables (datos no mostrados) pero no su capacidad para promover la traducción (Figura 9B). Una deleción más grande reveló que los RRM 1-3 son suficientes para soportar el crecimiento en altas concentraciones de cobre (MS2 y1-3 Figura 9B). Curiosamente, en contraste con Xenopus PAB, RRM 3 y 4 y el extremo C de la levadura PAB no promueven la traducción (Figura 9B). Esta proteína de fusión es activa, ya que puede estabilizar los ARNm (Coller et al., 1998). Estos resultados sugieren que los RRM 1-3 son suficientes para la estimulación traslacional en la levadura y son consistentes con la observación de que RRM2 es fundamental para la in vitro asociación de Pab1p con eIF-4G (Kessler y Sachs, 1998).


Referencias

Nilsen TW, Graveley BR: Expansión del proteoma eucariota por empalme alternativo. Naturaleza. 2010, 463 (7280): 457-463. 10.1038 / nature08909

Barbosa-Morais NL, Irimia M, Pan Q, Xiong HY, Gueroussov S, Lee LJ, Slobodeniuc V, Kutter C, Watt S, Colak R: El panorama evolutivo del empalme alternativo en especies de vertebrados. Ciencias. 2012, 338 (6114): 1587-1593. 10.1126 / science.1230612

Merkin J, Russell C, Chen P, Burge CB: Dinámica evolutiva de la regulación de genes e isoformas en tejidos de mamíferos. Ciencias. 2012, 338 (6114): 1593-1599. 10.1126 / science.1228186

Witten JT, Ule J: Comprensión de la regulación del empalme mediante mapas de empalme de ARN. Trends Genet. 2011, 27 (3): 89-97. 10.1016 / j.tig.2010.12.001

Miller JW, Urbinati CR, Teng-Umnuay P, Stenberg MG, Byrne BJ, Thornton CA, Swanson MS: Reclutamiento de proteínas ciegas musculares humanas para (CUG) (n) expansiones asociadas con distrofia miotónica. EMBO J. 2000, 19 (17): 4439-4448. 10.1093 / emboj / 19.17.4439

Kalsotra A, Xiao XS, Ward AJ, Castle JC, Johnson JM, Burge CB, Cooper TA: Un cambio postnatal de proteínas CELF y MBNL reprograma el empalme alternativo en el corazón en desarrollo. Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América. 2008, 105 (51): 20333-20338. 10.1073 / pnas.0809045105

Terenzi F, Ladd AN: El empalme alternativo de desarrollo conservado de transcripciones de tipo muscleblind-like (MBNL) regula la localización y la actividad de MBNL. RNA Biol. 2009, 7 (1): 43-55.

Botta A, Caldarola S, Vallo L, Bonifazi E, Fruci D, Gullotta F, Massa R, Novelli G, Loreni F: Efecto de la expansión repetida de [CCTG] n sobre la expresión de ZNF9 en la distrofia miotónica tipo II (DM2). Biochim Biophys Acta. 2006, 1762 (3): 329-334. 10.1016 / j.bbadis.2005.11.004

Osborne RJ, Lin X, Welle S, Sobczak K, O’Rourke JR, Swanson MS, Thornton CA: Impacto transcripcional y postranscripcional del ARN tóxico en la distrofia miotónica. Genética molecular humana. 2009, 18 (8): 1471-1481. 10.1093 / hmg / ddp058

Du H, Cline MS, Osborne RJ, Tuttle DL, Clark TA, Donohue JP, Hall MP, Shiue L, Swanson MS, Thornton CA: Empalme alternativo aberrante y expresión génica de matriz extracelular en modelos de ratón de distrofia miotónica. Nat Struct Mol Biol. 2010, 17 (2): 187-193. 10.1038 / nsmb.1720

Kino Y, Washizu C, Oma Y, Onishi H, Nezu Y, Sasagawa N, Nukina N, Ishiura S: las proteínas MBNL y CELF regulan el empalme alternativo del canal de cloruro del músculo esquelético CLCN1. Ácidos nucleicos Res. 2009, 37 (19): 6477-6490. 10.1093 / nar / gkp681

He F, Dang W, Abe C, Tsuda K, Inoue M, Watanabe S, Kobayashi N, Kigawa T, Matsuda T, Yabuki T: Estructura de la solución del dominio de unión del ARN en la proteína 2. Protein Sci. 2009, 18 (1): 80-91.

Teplova M, Patel DJ: Conocimientos estructurales sobre el reconocimiento de ARN mediante el regulador de empalme alternativo, similar a un ciego muscular, MBNL1. Nat Struct Mol Biol. 2008, 15 (12): 1343-1351. 10.1038 / nsmb.1519

Goers ES, Purcell J, Voelker RB, Gates DP, Berglund JA: MBNL1 une motivos GC incrustados en pirimidinas para regular el empalme alternativo. Ácidos nucleicos Res. 2010, 38 (7): 2467-2484. 10.1093 / nar / gkp1209

Cass D, Hotchko R, Barber P, Jones K, Gates DP, Berglund JA: Los cuatro dedos de Zn de MBNL1 proporcionan una plataforma flexible para el reconocimiento de sus elementos de unión de ARN. BMC Mol Biol. 2011, 12: 20- 10.1186 / 1471-2199-12-20

Tran H, Gourrier N, Lemercier-Neuillet C, Dhaenens CM, Vautrin A, Fernandez-Gomez FJ, Arandel L, Carpentier C, Obriot H, Eddarkaoui S: análisis de regiones exónicas involucradas en la localización nuclear, actividad de empalme y dimerización de Muscleblind -como-1 Isoformas. Revista de Química Biológica. 2011, 286 (18): 16435-16446. 10.1074 / jbc.M110.194928

Grammatikakis I, Goo YH, Echeverria GV, Cooper TA: Identificación de los dominios MBNL1 y MBNL3 necesarios para la activación y represión del empalme. Ácidos nucleicos Res. 2011, 39 (7): 2769-2780. 10.1093 / nar / gkq1155

Purcell J, Oddo JC, Wang ET, Berglund JA: La mutagénesis combinatoria de dedos de zinc MBNL1 aclara clases distintas de eventos reguladores de empalme. Mol Cell Biol. 2012, 32 (20): 4155-4167. 10.1128 / MCB.00274-12

Graveley BR, Maniatis T: Los dominios ricos en arginina / serina de las proteínas SR pueden funcionar como activadores del corte y empalme de pre-mRNA. Mol Cell. 1998, 1 (5): 765-771. 10.1016 / S1097-2765 (00) 80076-3

Del Gatto-Konczak F, Olive M, Gesnel MC, Breathnach R: hnRNP A1 reclutado en un exón in vivo puede funcionar como un silenciador de empalme de exón. Mol Cell Biol. 1999, 19 (1): 251-260.

Robinson F, Smith CW: Un dominio represor de empalme en la proteína de unión al tracto de polipirimidina. J Biol Chem. 2006, 281 (2): 800-806.

Gooding C, Edge C, Lorenz M, Coelho MB, Winters M, Kaminski CF, Cherny D, Eperon IC, Smith CW: MBNL1 y PTB cooperan para reprimir el corte y empalme del exón 3 de Tpm1. Ácidos nucleicos Res. 2013, 41 (9): 4765-4782. 10.1093 / nar / gkt168

Sun S, Zhang Z, Fregoso O, Krainer AR: Mecanismos de activación y represión por los factores de corte y empalme alternativos RBFOX1 / 2. Rna. 2011, 18 (2): 274-283.

Shankarling G, Lynch KW: Los dominios funcionales mínimos de los parálogos hnRNP L y hnRNP LL exhiben diferencias mecanicistas en la represión de empalme exónico. Biochem J. 2013, 453 (2): 271-279. 10.1042 / BJ20130432

Hudson BP, Martinez-Yamout MA, Dyson HJ, Wright PE: Reconocimiento del elemento rico en ARNm AU por el dominio de dedos de zinc de TIS11d. Nat Struct Mol Biol. 2004, 11 (3): 257-264. 10.1038 / nsmb738

Fu Y, Ramisetty SR, Hussain N, Baranger AM: Reconocimiento de ARN de MBNL1: contribuciones de la secuencia de MBNL1 y la conformación del ARN. Chembiochem. 2012, 13 (1): 112-119. 10.1002 / cbic.201100487

Gooding C, Clark F, Wollerton MC, Grellscheid SN, Groom H, Smith CW: una clase de exones humanos con puntos de ramificación distantes predichos revelados por el análisis de zonas de exclusión de dinucleótidos AG. Genome Biol. 2006, 7 (1): R1- 10.1186 / gb-2006-7-1-r1

Yuan Y, Compton SA, Sobczak K, Stenberg MG, Thornton CA, Griffith JD, Swanson MS: Muscleblind-like 1 interactúa con horquillas de ARN en el empalme de ARN diana y patógenos. Ácidos nucleicos Res. 2007, 35 (16): 5474-5486. 10.1093 / nar / gkm601

Wollerton MC, Gooding C, Robinson F, Brown EC, Jackson RJ, Smith CW: actividad de empalme alternativo diferencial de isoformas de proteína de unión al tracto de polipirimidina (PTB). Rna. 2001, 7 (6): 819-832. 10.1017 / S1355838201010214

Joshi A, Coelho MB, Kotik-Kogan O, Simpson PJ, Matthews SJ, Smith CW, Curry S: Análisis cristalográfico de las interacciones de proteína de unión al tracto de polipirimidina-Raver1 implicadas en la regulación del empalme alternativo. Estructura. 2011, 19 (12): 1816-1825. 10.1016 / j.str.2011.09.020

Gromak N, Smith CW: Un silenciador de empalme que regula el empalme alternativo específico del músculo liso está activo en múltiples tipos de células. Ácidos nucleicos Res. 2002, 30 (16): 3548-3557. 10.1093 / nar / gkf480

Sharma S, Maris C, Allain FH, Black DL: snRNA U1 interactúa directamente con la proteína de unión al tracto de polipirimidina durante la represión del empalme. Mol Cell. 2011, 41 (5): 579-588. 10.1016 / j.molcel.2011.02.012

Wang ET, Cody NA, Jog S, Biancolella M, Wang TT, Treacy DJ, Luo S, Schroth GP, Housman DE, Reddy S: regulación de todo el transcriptoma del empalme de pre-mRNA y localización de mRNA por proteínas muscleblind. Celda. 2012, 150 (4): 710-724. 10.1016 / j.cell.2012.06.041

Charizanis K, Lee KY, Batra R, Goodwin M, Zhang C, Yuan Y, Shiue L, Cline M, Scotti MM, Xia G: Empalme alternativo mediado por 2 Muscleblind-like en el cerebro en desarrollo y desregulación en la distrofia miotónica. Neurona. 2012, 75 (3): 437-450. 10.1016 / j.neuron.2012.05.029

Warf MB, Berglund JA: MBNL se une a estructuras de ARN similares en las repeticiones CUG de la distrofia miotónica y su sustrato pre-ARNm, la troponina cardiaca T. Rna. 2007, 13 (12): 2238-2251. 10.1261 / rna.610607

Warf MB, Diegel JV, von Hippel PH, Berglund JA: Los factores proteicos MBNL1 y U2AF65 se unen a estructuras de ARN alternativas para regular el empalme. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009, 106 (23): 9203-9208. 10.1073 / pnas.0900342106

Nasim FU, Hutchison S, Cordeau M, Chabot B: los sitios de unión de hnRNP A1 de alta afinidad y las repeticiones invertidas que forman dúplex tienen efectos similares en la selección del sitio de empalme de 5 'en apoyo de un mecanismo común de salida y represión. Rna. 2002, 8 (8): 1078-1089. 10.1017 / S1355838202024056

Fisette JF, Toutant J, Dugre-Brisson S, Desgroseillers L, Chabot B: hnRNP A1 y hnRNP H pueden colaborar para modular la selección del sitio de empalme de 5 '. Rna. 2010, 16 (1): 228-238. 10.1261 / rna.1890310

Cherny D, Gooding C, Eperon GE, Coelho MB, Bagshaw CR, Smith CW, Eperon IC: estequiometría de un complejo de empalme regulador revelado por análisis de una sola molécula. EMBO J. 2010, 29 (13): 2161-2172. 10.1038 / emboj.2010.103

Llorian M, Schwartz S, Clark TA, Hollander D, Tan LY, Spellman R, Gordon A, Schweitzer AC, de la Grange P, Ast G: actividad de empalme alternativo dependiente de la posición revelada por el perfil global de eventos de empalme alternativo regulados por PTB. Nat Struct Mol Biol. 2010, 17 (9): 1114-1123.

Gromak N, Rideau A, Southby J, Scadden AD, Gooding C, Huttelmaier S, Singer RH, Smith CW: La proteína de interacción PTB raver1 regula el empalme alternativo de alfa-tropomiosina. EMBO J. 2003, 22 (23): 6356-6364. 10.1093 / emboj / cdg609

Ho TH, Charlet BN, Poulos MG, Singh G, Swanson MS, Cooper TA: Las proteínas Muscleblind regulan el empalme alternativo. EMBO J. 2004, 23 (15): 3103-3112. 10.1038 / sj.emboj.7600300


Material suplementario

AGO, proteína argonauta ALP, vía lisosomal de autofagia ELA, esclerosis lateral amiotrófica AMPK, proteína quinasa activada por AMP ARE-RBP, proteínas de unión a ARN que reconocen elementos ricos en AU ARE, elemento rico en AU ATM, ataxia-telangiectasia mutada CARM1, coactivador -arginina metiltransferasa 1 CBP asociada, proteína de unión al elemento de respuesta a AMPc (CREB) -proteína de unión CD62E, E-selectina Chk2, punto de control quinasa 2 Clk1, quinasa similar a Cdc 1 COX-2, ciclooxigenasa 2 CSE, cistationina y # x03B3-liasa CTSS, catepsina S CUREs, elementos ricos en CU DDR, respuesta al daño del ADN DGCR8, región crítica 8 del síndrome de DiGeorge DICE, elemento de control de diferenciación ECRG2, gen relacionado con el cáncer de esófago 2 eNOS, óxido nítrico sintasa endotelial ERK, quinasa regulada por señales extracelulares EV71, enterovirus 71 FASTK, serina / treonina quinasa activada por Fas FBXW2, proteína 2 que contiene repetición F-box / WD FTLD, FUS degeneración lobar fronto-temporal, fusionada en sarcoma FXR2P, proteína relacionada con X frágil 2 GM-CSF, granulocito-macroph factor estimulante de colonias GSK3 & # x03B2, glucógeno sintasa quinasa 3 & # x03B2 G3BP1, proteína de unión al dominio Ras-GAP SH3 1 HDM2 / MDM2, doble minuto humano / ratón 2 hnRNP A1 / A2 / K, ribonucleoproteína nuclear heterogénea A1 A2 y K HNS, secuencia de transporte nucleocitoplasmático de HuR Hsp27, proteína de choque térmico 27 ​​HuR, antígeno humano R IDR, región intrínsecamente desordenada IKK & # x03B1, I & # x03BA B cinasa & # x03B1 IRES, sitio de entrada del ribosoma interno JAK3, Janus cinasa 3 KH , K homología KI, región interactiva K KLF2, Kr & # x00F factor similar a pulso 2 KNS, dominio de transferencia nuclear K KSRP, proteína reguladora de empalme de tipo KH LCR, región de baja complejidad LLPS, separación de fases líquidas y # x2013 líquidas MAPK, proteína activada por mitógenos cinasa MAPKAPK-2/3, proteína cinasa 2 y 3 mFas activada por MAPK, Fas miRISC unido a membrana, complejo silenciador inducido por miARN miARN, microARN MK2 / 3, proteína quinasa 2 y 3 MLO activada por MAPK, sin membrana orgánulo MMP2 / 7, metaloproteinasa de matriz 2 y 7 mRNP, ribonucleoproteína mensajera par tículo NCL, nucleolina NEDD8, célula precursora neural expresada 8 NLS regulada negativamente en el desarrollo, señal de localización nuclear O-GlcNAc, O-glicosilo -norte-acetilación PABP, poli (A) -proteína de unión PAD4, peptidil arginina deiminasa 4 PAR, poli (ADP-ribosa) PARP-1, PAR polimerasa 1 Pc2, proteína polycomb 2 Pin1, proteína que interactúa con NIMA (nunca en la mitosis A) - 1 PKA, proteína cinasa A PKC & # x03B1 / & # x03B4 / & # x03B6, proteína cinasa C & # x03B1 & # x03B4 y & # x03B6 PLD, pre-miARN de dominio priónico, precursor de miARN pri-miARN, miARN primario PRMT1, proteína arginina N-metiltransferasa 1 PTH, hormona paratiroidea PTM, modificación postraduccional r15-LOX, eritroide-15-lipoxigenasa RBD, dominio de unión a ARN RBP, proteína de unión a ARN RGG / RG, RRM rico en arginina / glicina, Motivo de reconocimiento de ARN sFas, Fas SGs soluble, gránulos de estrés SIRT1, Sirtuin 1 SMN, supervivencia de la neurona motora snRNP U1, partícula de ribonucleoproteína nuclear pequeña U1 SR, SRPK1 / 2 rica en serina / arginina, proteína cinasa SR 1 y 2 SRSF1 / 3, Factor de empalme SR 1 y 3 StUbL, ubiquitina ligasa SUMO dirigida a SUMO, pequeño modificador similar a ubiquitina TDP-43, proteína de unión al ADN TAR de 43 kDa TIA-1, células T intra antígeno celular 1 TIAR, TIAR relacionado con TIA-1, proteína relacionada con TIA-1 TRAF6, factor 6 asociado con el receptor de TNF TRN, transportina TTP, Tristetraprolina Ub, ubiquitina UBXD8, proteína que contiene el dominio X regulador de ubiquitina 8 UCP2, proteína de desacoplamiento 2 UPS, sistema de ubiquitina-proteasoma UTR, región no traducida XIAP, inhibidor de la proteína de apoptosis ligado al cromosoma X & # x03B2-TrCP 1, & # x03B2-proteína que contiene repetición de transducina 1.


† Dirección actual: Rijk Zwaan, De Lier 2678 ZG, Países Bajos.

El material complementario electrónico está disponible en línea en https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.5113668.

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Referencias

Glisovic T, Bachorik JL, Yong J, Dreyfuss G

. 2008 Proteínas de unión a ARN y regulación génica postranscripcional. FEBS Lett. 582, 1977-1986. (doi: 10.1016 / j.febslet.2008.03.004) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2011 Expresión de genes plástidos: elaboraciones específicas de orgánulos en un andamio procariota. Plant Physiol. 155, 1520-1532. (doi: 10.1104 / pp.110.171231) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Hammani K, Bonnard G, Bouchoucha A, Gobert A, Pinker F, Salinas T, Giegé P

. 2014 Las proteínas modulares de repeticiones helicoidales son actores importantes para la expresión de genes de orgánulos. Biochimie 100, 141-150. (doi: 10.1016 / j.biochi.2013.08.031) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2015 Los proteomas de unión a ARN de la levadura al hombre albergan enigmRBP conservados. Nat. Comun. 6, 10127. (doi: 10.1038 / ncomms10127) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2012 Información sobre la biología del ARN a partir de un atlas de proteínas de unión a ARNm de mamíferos. Celda 149, 1393-1406. (doi: 10.1016 / j.cell.2012.04.031) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Marondedze C, Thomas L, Serrano NL, Lilley KS, Gehring C

. 2016 El repertorio de proteínas de unión a ARN de Arabidopsis thaliana . Sci. Reps. 6, 29766. (doi: 10.1038 / srep29766) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Bach-Pages M, Homma F, Kourelis J, Kaschani F, Mohammed S, Kaiser M, Van Der Hoorn RAL, Castello A, Preston GM

. 2020 Descubriendo el proteoma de unión al ARN de las hojas de las plantas con un método mejorado de captura del interactoma del ARN. Biomoléculas 10, 661. (doi: 10.3390 / biom10040661) Crossref, ISI, Google Académico

Marondedze C, Thomas L, Gehring C, Lilley KS

. 2019 Cambios en el Arabidopsis El proteoma de unión al ARN revela nuevos mecanismos de respuesta al estrés. BMC Plant Biol. 19, 139. (doi: 10.1186 / s12870-019-1750-x) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2016 Determinación in planta del proteoma de unión a ARNm de Arabidopsis plántulas etioladas. Célula vegetal. 28, 2435-2452. (doi: 10.1105 / tpc.16.00562) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Zhang Z, Boonen K, Ferrari P, Schoofs L et al.

. 2016 Proteínas de unión a ARNm reticuladas con UV capturadas de protoplastos del mesófilo de las hojas. Métodos de planta 12, 42. (doi: 10.1186 / s13007-016-0142-6) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2019 Los efectos de la temperatura ambiente sobre el desarrollo de Brachypodium distachyon y las proteínas de unión al ARNm en plantas con flores. . Lovaina, Bélgica: KU Leuven. Google Académico

Marondedze C, Thomas L, Gehring C, Lilley KS

. 2020 El estrés por sequía provoca cambios específicos en los componentes del espliceosoma y los gránulos de estrés. Parte delantera. Mol. Biosci. 6, 163. (doi: 10.3389 / fmolb.2019.00163) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2014 Impacto dependiente e independiente del ácido salicílico de una proteína de unión a ARN en la inmunidad de las plantas. Entorno de células vegetales. 37, 696-706. (doi: 10.1111 / pce.12188) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Heintzen C, Nater M, Apel K, Staiger D

. 1997 AtGRP7, una proteína de unión a ARN nuclear como componente de un ciclo de retroalimentación negativa regulada por el circadiano en Arabidopsis thaliana . Proc. Natl Acad. Sci. Estados Unidos 94, 8515-8520. (doi: 10.1073 / pnas.94.16.8515) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2009 La proteína 3 del dominio de choque frío regula la tolerancia a la congelación en Arabidopsis thaliana . J. Biol. Chem. 284, 23 454-23 460. (doi: 10.1074 / jbc.M109.025791) Crossref, ISI, Google Scholar

. 2004 Un nuevo gen de Arabidopsis, FLK, codifica una proteína de unión a ARN con motivos de homología K y regula el tiempo de floración a través de FLOWERING LOCUS C. Célula vegetal. 16, 731-740. (doi: 10.1105 / tpc.019331) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2002 Análisis del genoma: motivo de reconocimiento de ARN (RRM) y dominio de homología K (KH) proteínas de unión al ARN de la planta con flores Arabidopsis thaliana . Ácidos nucleicos Res. 30, 623-635. (doi: 10.1093 / nar / 30.3.623) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Schmal C, Reimann P, Staiger D

. 2013 Un interruptor de palanca regulado por reloj circadiano explica las oscilaciones de AtGRP7 y AtGRP8 en Arabidopsis thaliana . PLoS Comput. Biol. 9, e1002986. (doi: 10.1371 / journal.pcbi.1002986) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Cruz TM, Carvalho RF, Richardson DN, Duque P

. 2014 Regulación del ácido abscísico (ABA) de Arabidopsis Expresión del gen de la proteína SR. En t. J. Mol. Sci. 15, 17 541-17 564. (doi: 10.3390 / ijms151017541) Crossref, ISI, Google Académico

Thatcher LF, Kamphuis LG, Hane JK, Onate-Sanchez L, Singh KB

. 2015 El Arabidopsis La proteína de unión al ARN del dominio KH ESR1 funciona en los componentes de la señalización del jasmonato, desvinculando la restricción del crecimiento y la resistencia al estrés. Más uno 10, e0126978. (doi: 10.1371 / journal.pone.0126978) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2013 La proteína de unión a ARN FPA regula las respuestas de defensa activadas por flg22 y la actividad del factor de transcripción mediante poliadenilación alternativa. Sci. Reps. 3, 2866. (doi: 10.1038 / srep02866) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2010 Una supuesta proteína de unión a ARN regula positivamente la inmunidad mediada por ácido salicílico en Arabidopsis . Mol. Plant Microbe Interact. 23, 1573-1583. (doi: 10.1094 / MPMI-05-10-0106) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Daszkowska-Golec A, Wojnar W, Rosikiewicz M, Szarejko I, Maluszynski M, Szweykowska-Kulinska Z, Jarmolowski A

. 2013 Arabidopsis mutante supresor de abh1 muestra una nueva cara de los jugadores ya conocidos: ABH1 (CBP80) y ABI4-en respuesta a ABA y estrés abiótico durante la germinación de semillas. Plant Mol. Biol. 81, 189-209. (doi: 10.1007 / s11103-012-9991-1) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2014 APUM5, que codifica una proteína de unión a ARN de Pumilio, regula negativamente la expresión génica sensible al estrés abiótico. BMC Plant Biol. 14, 75. (doi: 10.1186 / 1471-2229-14-75) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Kim JS, Jung HJ, Lee HJ, Kim KA, Goh C-H, Woo Y, Oh SH, Han YS, Kang H

. 2008 La proteína de unión al ARN 7 rica en glicina afecta las respuestas al estrés abiótico regulando la apertura y el cierre de los estomas Arabidopsis thaliana . Planta J. 55, 455-466. (doi: 10.1111 / j.1365-313X.2008.03518.x) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Park HY, Kang IS, Han JS, Lee CH, An G, Moon Y-H

. 2009 OsDEG10 que codifica una pequeña proteína de unión a ARN está involucrado en la señalización del estrés abiótico. Biochem. Biophys. Res. Comun. 380, 597-602. (doi: 10.1016 / j.bbrc.2009.01.131) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Park SJ, Kwak KJ, Oh TR, Kim YO, Kang H

. 2009 Las proteínas del dominio del choque frío afectan la germinación de las semillas y el crecimiento de Arabidopsis thaliana en condiciones de estrés abiótico. Plant Cell Physiol. 50, 869-878. (doi: 10.1093 / pcp / pcp037) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Schomburg FM, Patton DA, Meinke DW, Amasino RM

. 2001 FPA, un gen involucrado en la inducción floral en Arabidopsis, codifica una proteína que contiene motivos de reconocimiento de ARN. Célula vegetal. 13, 1427-1436. (doi: 10.1105 / tpc.13.6.1427) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2001 Proteínas de unión al ARN y ritmos circadianos en Arabidopsis thaliana . Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 356, 1755-1759. (doi: 10.1098 / rstb.2001.0964) Enlace, ISI, Google Académico

Riehs-Kearnan N, Gloggnitzer J, Dekrout B, Jonak C, Riha K

. 2012 Crecimiento aberrante y letalidad de Arabidopsis La deficiencia de factores de desintegración del ARN mediada por tonterías es causada por una respuesta de tipo autoinmune. Ácidos nucleicos Res. 40, 5615-5624. (doi: 10.1093 / nar / gks195) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Schmidt F, Marnef A, Cheung MK, Wilson I, Hancock J, Staiger D, Ladomery M

. 2010 Un análisis proteómico de mRNP unido a oligo (dT) que contiene estrés oxidativo inducido Arabidopsis thaliana Proteínas de unión a ARN ATGRP7 y ATGRP8. Mol. Biol. Reps. 37, 839-845. (doi: 10.1007 / s11033-009-9636-x) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2015 Análisis global de la interacción ARN-proteína y los paisajes de la estructura secundaria del ARN del Arabidopsis núcleo. Mol. Celda. 57, 376-388. (doi: 10.1016 / j.molcel.2014.12.004) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Krauss P, Markstadter C, Riederer M

. 1997 Atenuación de la radiación ultravioleta por cutículas vegetales de especies leñosas. Entorno de células vegetales. 20, 1079-1085. (doi: 10.1111 / j.1365-3040.1997.tb00684.x) Crossref, ISI, Google Académico

Silverman IM, Li F, Gregory BD

. 2013 Los análisis de la era genómica de la estructura secundaria del ARN y las proteínas de unión al ARN revelan su importancia para la regulación postranscripcional en las plantas. Ciencia de las plantas . 205–206, 55-62. (doi: 10.1016 / j.plantsci.2013.01.009) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2012 Poli (A) polimerasa mitocondrial y poliadenilación. Biochim. Biophys. Acta 1819, 992-997. (doi: 10.1016 / j.bbagrm.2011.10.012) Crossref, PubMed, Google Académico

Köster T, Marondedze C, Meyer K, Staiger D

. Las proteínas de unión a ARN de 2017 revisadas: las Arabidopsis interactoma de ARNm. Tendencias Plant Sci. 22, 512-526. (doi: 10.1016 / j.tplants.2017.03.009) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Kedersha N, Stoecklin G, Ayodele M, Yacono P et al.

. 2005 Los gránulos de estrés y los cuerpos de procesamiento son sitios vinculados dinámicamente de remodelación de mRNP. J. Cell Biol. 169, 871-884. (doi: 10.1083 / jcb.200502088) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2006 gránulos de ARN. J. Cell Biol. 172, 803-808. (doi: 10.1083 / jcb.200512082) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2006 Gránulos de estrés: Cuerpos citoplasmáticos que contienen RNP que surgen bajo estrés. La estructura y mecanismo de organización. Mol Biol. 40, 937-944. (doi: 10.1134 / s0026893306060021) Crossref, ISI, Google Académico

. 2008 Los gránulos de estrés de las plantas y los cuerpos de procesamiento de ARNm son distintos de los gránulos de estrés por calor. Plant J. Cell Mol. Biol. 56, 517-530. (doi: 10.1111 / j.1365-313X.2008.03623.x) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Téllez SR, Kanhonou R, Alepuz P, Ros R

. 2020 Proteínas de unión a ARN como dianas para mejorar la tolerancia al estrés salino en los cultivos. Agronomía 10, 250. (doi: 10.3390 / agronomy10020250) Crossref, Google Académico

Sánchez de Groot N, Armaos A, Grana-Montes R, Alriquet M, Calloni G, Vabulas RM, Tartaglia GG

. La estructura del ARN 2019 impulsa la interacción con las proteínas. Nat. Comun. 10, 3246. (doi: 10.1038 / s41467-019-10923-5) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2009 ¿Qué tan comunes son las funciones extraribosomales de las proteínas ribosomales? Mol. Celda. 34, 3-11. (doi: 10.1016 / j.molcel.2009.03.006) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2008 La red de plantas de dedos de zinc. Celda. Mol. Life Sci. 65, 1150-1160. (doi: 10.1007 / s00018-007-7473-4) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

CD de Nguyen, Mansfield RE, Leung W, Vaz PM, Loughlin FE, Grant RP, Mackay JP

. 2011 Caracterización de una familia de dedos de zinc tipo RanBP2 que pueden reconocer ARN monocatenario. J. Mol. Biol. 407, 273-283. (doi: 10.1016 / j.jmb.2010.12.041) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Frei dit Frey N, Muller P, Jammes F, Kizis D, Leung J, Perrot-Rechenmann C, Bianchi MW

. 2010 La proteína de unión al ARN Tudor-SN es esencial para la tolerancia al estrés y estabiliza los niveles de ARNm sensibles al estrés que codifican proteínas secretadas en Arabidopsis . Célula vegetal. 22, 1575-1591.(doi: 10.1105 / tpc.109.070680) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2005 Caracterización de transgénicos Arabidopsis plantas que sobreexpresan GR-RBP4 bajo alta salinidad, deshidratación o estrés por frío. J. Exp. Bot. 56, 3007-3016. (doi: 10.1093 / jxb / eri298) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Maurel C, Boursiac Y, Luu DT, Santoni V, Shahzad Z, Verdoucq L

. 2015 Acuaporinas en plantas. Physiol. Rvdo. 95, 1321-1358. (doi: 10.1152 / physrev.00008.2015) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Pena EJ, Ferriol I, Sambade A, Buschmann H, Niehl A, Elena SF, Rubio L, Heinlein M

. 2014 La evolución experimental del virus revela un papel de la dinámica de los microtúbulos de las plantas y TORTIFOLIA1 / SPIRAL2 en el tráfico de ARN. Más uno 9, e105364. (doi: 10.1371 / journal.pone.0105364) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 1998 La presencia de deshidroascorbato y deshidroascorbato reductasa en tejidos vegetales. FEBS Lett. 425, 528-529. (doi: 10.1016 / s0014-5793 (98) 00281-6) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 1979 Destrucción de H2O2 por sistemas dependientes de ascorbato de cloroplastos. Biochim. Biophys. Acta 546, 426-435. (doi: 10.1016 / 0005-2728 (79) 90078-1) Crossref, PubMed, Google Académico

Hakimi H, Suganuma K, Usui M, Masuda-Suganuma H, Angeles JMM, Asada M, Kawai S, Inoue N, Kawazu S

. 2014 Plasmodium knowlesi la tiorredoxina peroxidasa 1 se une a los ácidos nucleicos y tiene actividad de chaperona de ARN. Parasitol. Res. 113, 3957-3962. (doi: 10.1007 / s00436-014-4060-0) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Carmona P, Rodríguez-Casado A, Molina M

. 1999 Estructura conformacional y modo de unión de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa a ARNt estudiado por espectroscopía Raman y CD. Biochim. Biophys. Acta 1432, 222-233. (doi: 10.1016 / s0167-4838 (99) 00113-2) Crossref, PubMed, Google Académico

. 2019 Identificación completa de interacciones ARN-proteína en cualquier organismo mediante separación de fases orgánicas ortogonal (OOPS). Nat. Biotechnol. 37, 169-178. (doi: 10.1038 / s41587-018-0001-2) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 1993 Unión específica de secuencia de ARN de transferencia por gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. Ciencias 259365-368. (doi: 10.1126 / science.8420004) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2019 GAPDH como una proteína de unión de ARN rica en AU no canónica modelo. Semin. Cell Dev. Biol. 86, 162-173. (doi: 10.1016 / j.semcdb.2018.03.013) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2016 El lado dulce de la regulación del ARN: gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa como proteína de unión al ARN no canónica. Wiley Interdiscip. Rev. ARN. 7, 53-70. (doi: 10.1002 / wrna.1315) Crossref, PubMed, Google Académico

Michaud M, Ubrig E, Filleur S, Erhardt M, Ephritikhine G, Marechal-Drouard L, Duchene A-M

. 2014 El direccionamiento diferencial de las isoformas de ARNm de VDAC3 influye en la morfología de las mitocondrias. Proc. Natl Acad. Sci. Estados Unidos 111, 8991-8996. (doi: 10.1073 / pnas.1402588111) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Saint-Georges Y, García M, Delaveau T, Jourdren L, Le Crom S, Lemoine S, Tanty V, Devaux F, Jacq C

. 2008 Biogénesis mitocondrial de levaduras: un papel de la proteína de unión al ARN PUF Puf3p en la localización del ARNm. Más uno 3, e2293. (doi: 10.1371 / journal.pone.0002293) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2017 Un análisis a escala del genoma de los ARNm que se dirigen a las mitocondrias de las plantas: los AUG ascendentes en las regiones 5 'no traducidas reducen la asociación mitocondrial. Plant J. Cell Mol. Biol. 92, 1132-1142. (doi: 10.1111 / tpj.13749) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Vals F, Corre N, Hashem Y, Giege P

. 2020 Especificidades del aparato de traducción mitocondrial vegetal. Mitocondria 53, 30-37. (doi: 10.1016 / j.mito.2020.04.008) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2007 La localización subcelular específica de ARNm representa un paso crucial para el ajuste fino de la expresión génica en células de mamíferos. Biochim. Biophys. Acta 1773, 473-475. (doi: 10.1016 / j.bbamcr.2006.06.008) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Corral-Debrinski M, Blugeon C, Jacq C

. 2000 En la levadura, se requiere la región 3 'sin traducir o la presecuencia de ATM1 para la localización exclusiva de su ARNm en la vecindad de las mitocondrias. Mol. Celda. Biol. 20, 7881-7892. (doi: 10.1128 / mcb.20.21.7881-7892.2000) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Marc P, Margeot A, Devaux F, Blugeon C, Jacq C

. 2002 Análisis de todo el genoma de ARNm dirigidos a mitocondrias de levadura. Rep. EMBO 3, 159-164. (doi: 10.1093 / embo-reports / kvf025) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Michaud M, Marechal-Drouard L, Duchene AM

. 2010 Tráfico de ARN en células vegetales: dirección de ARNm citosólicos a la superficie mitocondrial. Plant Mol. Biol. 73, 697-704. (doi: 10.1007 / s11103-010-9650-3) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Lesnik C, Golani-Armon A, Arava Y

. 2015 Traducción localizada cerca de la membrana externa mitocondrial: una actualización. RNA Biol. 12, 801-809. (doi: 10.1080 / 15476286.2015.1058686) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Tian L, Chou HL, Fukuda M, Kumamaru T, Okita TW

. 2020 Localización de ARNm en células vegetales. Plant Physiol. 182, 97-109. (doi: 10.1104 / pp.19.00972) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2011 DREME: descubrimiento de motivos en los datos del factor de transcripción ChIP-seq. Bioinformática 27, 1653-1659. (doi: 10.1093 / bioinformatics / btr261) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Zarrinpar A, Bhattacharyya RP, Lim WA

. 2003 La estructura y función de los dominios de reconocimiento de prolina. Sci. STKE. 2003, RE8. (doi: 10.1126 / stke.2003.179.re8) PubMed, Google Académico

. 2015 Funciones emergentes de secuencias desordenadas en proteínas de unión a ARN. Trends Biochem. Sci. 40, 662-672. (doi: 10.1016 / j.tibs.2015.08.012) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2012 Formación libre de células de gránulos de ARN: los ARN unidos identifican características y componentes de conjuntos celulares. Celda 149, 768-779. (doi: 10.1016 / j.cell.2012.04.016) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2016 Identificación completa de dominios de unión a ARN en células humanas. Mol. Celda. 63, 696-710. (doi: 10.1016 / j.molcel.2016.06.029) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2020 Los análisis de todo el sistema del interactoma de poli (A) (+) ARN de levadura de fisión revelan conocimientos sobre la organización y función de los complejos ARN-proteína. Genome Res. 30, 1012-1026. (doi: 10.1101 / gr.257006.119) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Konig J, Zarnack K, Rot G, Curk T, Kayikci M, Zupan B, Turner DJ, Luscombe NM, Ule J

. El iCLIP de 2010 revela la función de las partículas de hnRNP en el empalme a la resolución de nucleótidos individuales. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 909-915. (doi: 10.1038 / nsmb.1838) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2008 HITS-CLIP proporciona conocimientos de todo el genoma sobre el procesamiento de ARN alternativo del cerebro. Naturaleza 456, 464-469. (doi: 10.1038 / nature07488) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2010 Una nueva técnica de purificación por afinidad de ARNm para la identificación de proteínas y transcripciones que interactúan en complejos de ribonucleoproteínas. ARN 16, 2277-2290. (doi: 10.1261 / rna.2091710) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

. 2018 Detección de interacción ARN-proteína en células vivas. Nat. Métodos. 15207-212. (doi: 10.1038 / nmeth.4601) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Fazal FM, Han S, Parker KR, Kaewsapsak P, Xu J, Boettiger AN, Chang HY, Ting AY

. Atlas de localización de ARN subcelular de 2019 revelado por APEX-Seq. Celda 178, 473-490. (doi: 10.1016 / j.cell.2019.05.027) Crossref, PubMed, ISI, Google Académico

Coppin L, Leclerc J, Vincent A, Porchet N, Pigny P

. 2018 Ciclo de vida del ARN mensajero en células cancerosas: ¿papel emergente de las proteínas de unión a ARN convencionales y no convencionales? En t. J. Mol. Sci. 19, 650. (doi: 10.3390 / ijms19030650) Crossref, ISI, Google Académico


Ver el vídeo: Traducción del ARN: Síntesis de proteínas (Enero 2022).