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Comprensión de la metodología de secuenciación de ADN de ray wu

Comprensión de la metodología de secuenciación de ADN de ray wu


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Estoy tratando de entender el método que Ray Wu desarrolló para secuenciar los extremos cohesivos 5 'del ADN de un fago lamda. Estoy leyendo estos dos artículos escritos por él, pero me quedé en el punto en el que usa el 32P nucleótidos.

Estructura y secuencia de bases en los extremos cohesivos del ADN del bacteriófago lambda

Análisis de la secuencia de nucleótidos del ADN: II. Secuencia completa de nucleótidos de los extremos cohesivos del ADN del bacteriófago λ

No me queda claro, al leer los periódicos, el paso en el que lleva a cabo la polimerización del ADN. ¿Usó todos los 32P nucleótidos a la vez o de uno en uno. Según tengo entendido, hizo que el ADN pol para usar los nucleótidos tritiados para llenar los huecos de los extremos cohesivos 5 'y luego se escinde con una ADNasa en muchos oligonucleótidos que luego se fraccionan con electroforesis. Si agregó todos los nucleótidos tritiados a la vez, ¿cómo reconoció cuál está en un lugar específico?

¿Alguien puede describir el proceso con más detalle utilizando un enfoque paso a paso?

Gracias,


Secuencia ADN

Se realiza la determinación de la secuencia precisa y el orden de las bases del ADN: adenina, guanina, citosina y timina. El propósito es analizar y comparar la composición genética de los individuos. Además, tiene importancia en los estudios evolutivos y el origen de las especies. Sin duda, la técnica de secuenciación del ADN ha revolucionado el campo de la investigación biotecnológica.


Descripción

Los métodos de ADN recombinante son técnicas potentes y revolucionarias que permiten el aislamiento de genes individuales en grandes cantidades de un conjunto de miles o millones de genes y la modificación de estos genes aislados o sus regiones reguladoras para reintroducirlos en las células para su expresión a niveles de ARN o proteínas. . Estos atributos conducen a la solución de problemas biológicos complejos y a la producción de nuevos y mejores productos en las áreas de la medicina, la agricultura y la industria.
Metodología de ADN recombinante, un volumen de la serie Métodos seleccionados en enzimología producida en formato de sobremesa, contiene una selección de artículos clave de los volúmenes 68, 100, 101, 153, 154 y 155 de Métodos en enzimología. Los procedimientos esenciales y ampliamente utilizados proporcionados a un precio asequible serán una ayuda invaluable para el estudiante de posgrado y el investigador.


Ray Wu, de 79 años, un transformador genético de cultivos, ha muerto

Ray Wu, un bioquímico e ingeniero genético que ayudó a dirigir una investigación en la Universidad de Cornell sobre la modificación genética del arroz y otros cultivos para resistir mejor el estrés ambiental, murió el 10 de febrero en Ithaca, Nueva York. Tenía 79 años.

La causa fue una insuficiencia cardíaca, dijo su familia.

En la década de 1980, el Dr. Wu y otros científicos de Cornell comenzaron a buscar formas de hacer que el arroz fuera más resistente a los insectos, la sequía, el agua salada y las temperaturas extremas. Usando genes aislados de bacterias y otras fuentes, los investigadores indujeron a las células de arroz a producir ciertas proteínas que mejoran la fuerza y ​​resistencia de las plantas. Por ejemplo, se introdujo con éxito un gen aislado de las patatas, el inhibidor de proteinasa II, para producir una proteína que perturba el barrenador rosado del tallo, un insecto que puede dañar las plantas de arroz.

Las plantas modificadas, llamadas arroz transgénico, se han cultivado desde entonces en invernaderos en Cornell, en preparación para las pruebas de campo en los Estados Unidos y en los países en desarrollo donde el arroz es un cereal básico. Un colaborador del Dr. Wu, Ajay K. Garg, investigador asociado senior en biología molecular y genética en Cornell, dijo que el arroz transgénico eventualmente se cruzaría con cepas de arroz nativas de cada región, con la esperanza de crear variedades más saludables y de mayor rendimiento. plantas.

El Dr. Wu aplicó influencias genéticas similares al maíz para producir granos con un mayor contenido de azúcar.

El trabajo sobre plantas modificadas genéticamente se basó en parte en los estudios anteriores del Dr. Wu sobre la secuenciación del ADN en la década de 1970. En 1976, el Dr. Wu y otros empalmaron material genético en bacterias, demostrando que es posible introducir un mensaje genético artificial en células vivas. En ese momento, predijo que el procedimiento algún día permitiría trasplantar una gran variedad de material genético, utilizando componentes celulares conocidos como plásmidos para transportar los mensajes.

El Dr. Wu compartió sus hallazgos y técnicas de laboratorio con muchos otros científicos a través de la enseñanza y la escritura, dejando un "legado en el desarrollo, la capacitación de muchos investigadores líderes en arroz en China, India, Corea y en todo el mundo en desarrollo", dijo Susan R. McCouch. , profesor de fitomejoramiento y genética en Cornell.

Ray Jui Wu nació en Pekín. Recibió su título universitario de la Universidad de Alabama, donde su padre, Hsien Wu, era bioquímico. Hsien Wu colaboró ​​en el desarrollo del método Folin-Wu para analizar los niveles de azúcar en sangre. Ray Wu obtuvo su doctorado en bioquímica de la Universidad de Pennsylvania en 1955.

De 1955 a 1966, el Dr. Wu realizó una investigación en el Instituto de Investigación de Salud Pública de la ciudad de Nueva York. Luego se unió a Cornell como profesor asociado de bioquímica y biología molecular, antes de ser nombrado profesor de bioquímica en 1972. Fue presidente de bioquímica, biología molecular y celular en Cornell de 1976 a 1978.

El Dr. Wu fue asesor de los gobiernos chino y taiwanés y apoyó una tradición de estudiantes chinos en ciencias en Cornell. Se convirtió en ciudadano estadounidense en 1961.


Comprensión de la metodología de secuenciación de ADN de Ray Wu - Biología

Búsqueda de métodos de secuenciación de ADN

En su innovadora presentación de 1957, Francis Crick propuso el concepto de flujo de información del ADN al ARN y a la proteína, que cambió para siempre la forma de razonar en biología. En este concepto lo que llamó el 'Dogma Central' explicó que el flujo de información era una calle de un solo sentido y consistía en una cadena de ácidos nucleicos en el ADN, copiados a una cadena de ácidos nucleicos en el ARN, que a su vez actúa como plantilla. para una secuencia de aminoácidos en una proteína.

Esta información y la estructura del ADN de Watson y Crick junto con Robert W. Holley, Har Gobind Khorana y Marshall W. Nirenberg que resolvieron el código genético a principios de la década de 1960 dejaron en claro la importancia de conocer la secuencia del ADN. Sin embargo, en este momento los científicos no tenían las herramientas adecuadas para leer el orden de los pares de bases en el ADN, por lo tanto, la secuencia de bases en cualquier ADN era desconocida en ese momento. Fueron necesarios unos diez años de intenso trabajo de investigación antes de que se secuenciara el primer ADN. Ray Wu determinó en 1971 los extremos cohesivos del ADN del bacteriófago λ (& ast), y Frederick Sanger completó el genoma de 48.502 pares de bases, diez años más tarde, utilizando el método de terminación de la cadena didesoxi en 1982 (& ast).

En las décadas de 1960 y 1970, los científicos se esforzaron mucho en intentar secuenciar el ADN. Desafortunadamente, los métodos de secuenciación de proteínas no funcionaron del todo para la secuenciación del ADN, porque las secuencias de aminoácidos constan de 20 bloques de construcción diferentes, mientras que el ADN consta solo de cuatro y son más similares entre sí, lo que dificulta su distinción. Además, la laboriosa técnica de escisión para secuenciar proteínas solo fue posible para secuencias relativamente cortas. Esta técnica se remonta a principios de la década de 1950 cuando Frederick Sanger desarrolló esta técnica ganadora del Premio Nobel y secuenció las dos cadenas de la molécula de insulina.

En ese momento, los ARN de transferencia eran los aminoácidos biológicamente activos más cortos conocidos, alrededor de 73 a 93 nucleótidos de longitud. Dado el tamaño reducido de los ARNt, fue posible utilizar un método de etiquetado y escisión análogo al método de Sanger de 1949. Robert W. Holley y colaboradores utilizaron una técnica similar para secuenciar el ARNt de alanina de Escherichia coli, la primera molécula de ácido nucleico secuenciada, publicada en 1965 (& ast).

El descubrimiento de las enzimas de restricción de tipo II en la década de 1970 (& ast) fue la clave para avanzar en las tecnologías de secuenciación. Escinden el ADN cerca de cadenas específicas de aproximadamente cuatro a ocho nucleótidos de largo, por lo tanto, podrían usarse para cortar el ADN en pequeños fragmentos que fueran posibles de separar mediante electroforesis. Estas enzimas escinden el ADN de doble hebra de modo que las hebras opuestas sobresalgan. Dado que se conocía la secuencia del sitio de escisión, este hecho fue una ventaja en algunos de los primeros esfuerzos de secuenciación, pero los métodos nunca avanzaron al nivel en el que era posible secuenciar secuencias de genes completas.

Un cambio decisivo comenzó cuando Frederic Sanger introdujo su "sistema de más y menos" en 1975 (& ast). Con este enfoque, fue posible determinar una secuencia de hasta aproximadamente 50 pares de bases en un solo análisis. Sin embargo, una de las deficiencias de este método era que era difícil medir la longitud correcta de los tramos de homopolímeros, como AAA o GGG, etc. Sin embargo, Sanger utilizó este método en 1977 para secuenciar el genoma del bacteriófago phi X174, 5.375 nucleótidos. de la longitud total estimada de 5.400 nucleótidos (& ast).

En el mismo año 1977, Maxam y Gilbert publicaron su método de secuenciación (& ast), que era en muchos aspectos similar al método de Sanger pero tenía la ventaja de resolver los estiramientos de homopolímeros.

A finales del año 1977, Sanger publicó un nuevo concepto de secuenciación (& ast), basado en la incorporación de los didesoxinucleótidos de terminación de cadena, ddNTPs. Este método podría producir inicialmente longitudes de lectura de aproximadamente 100 nucleótidos.

Walter Gilbert y Frederick Sanger compartieron el Premio Nobel de Química de 1980 (& ast) "por sus contribuciones relativas a la determinación de secuencias de bases en ácidos nucleicos". junto con Paul Berg "por sus estudios fundamentales de la bioquímica de los ácidos nucleicos, con especial atención al ADN recombinante".


Análisis de datos de secuencias de genes: descripción general

El análisis de la secuencia de ADN contiene diversas técnicas y métodos para identificar las diferentes características, funcionalidades, formas y estructuras de los elementos genómicos del ADN. Se utilizaron varios métodos como alineamientos de secuencia [1], búsquedas de datos biológicos y métodos analíticos [1] para generar el análisis de secuencia.

Proceso de diagnóstico médico para secuenciación

La historia antigua del proceso de diagnóstico médico comienza con las civilizaciones egipcia [2] y griega [3]. Son un recurso de información perfecto a pesar de la gran cantidad de información que ponen a disposición los investigadores médicos. Esto también incluye la secuenciación del ADN del elemento genético humano.

Se ha ejecutado un moderno proceso de diagnóstico médico para encontrar, analizar y controlar los trastornos de la salud humana. Este también se encarga de descubrir el proceso de tratamiento, las mejoras clínicas y el diagnóstico, etc. El proceso de diagnóstico médico puede clasificarse según sus propios fines y métodos. El más importante de estos métodos incluye el proceso de diagnóstico y detección de trastornos de la salud. Cada proceso de diagnóstico médico tiene sus propias indicaciones y contraindicaciones para las pruebas. Estos proporcionan las indicaciones para aceptar y rechazar el diagnóstico de prueba.

Desafíos en el proceso de diagnóstico médico

Existen varias técnicas y metodologías que se aplican en diferentes tipos de diagnóstico médico. Este procedimiento de diagnóstico se realiza logrando un diagnóstico diferencial o algoritmos médicos.

El proceso de diagnóstico médico es una práctica complicada. Esto necesita una habilidad clínica apropiada con el conocimiento de experiencia adecuado. Estos expertos deben ser capaces de analizar y evaluar las situaciones clínicas críticas. La presentación compleja en el proceso de diagnóstico médico necesita la interferencia de manera probabilística.

En el diagnóstico médico, un diagnóstico diferencial puede definirse como un proceso para distinguir los diversos trastornos y las condiciones de sus síntomas. Los expertos médicos utilizan este proceso de diagnóstico diferencial para identificar una enfermedad específica en un paciente. De otras formas, necesitan identificar y eliminar todas las condiciones que amenazan la vida de manera inminente. El diagnóstico diferencial tiene sus propias abreviaturas.

Métodos tempranos de secuenciación de ADN

La primera secuencia de ADN fue descubierta en los primeros años de 1970. Esto fue realizado por varios investigadores a través de sus contribuciones críticas de investigación que incluyen cromatografía bidimensional [4], secuenciación basada en fluorescencia con secuenciador de genes de ADN, etc.

En 1970, Ray Wu en la Universidad de Cornell descubrió la identificación y determinación tempranas del método de secuenciación de genes de ADN basado en un procedimiento específico de ubicación y extensión de cebadores. Las presentes estructuras de secuenciación se clasificaron utilizando la catálisis de la ADN polimerasa clásica y el proceso de etiquetado de nucleótidos. Estos procesos se aplicaron para categorizar el fago de cordero del ADN entre los años 1970 a 1973.

Frederick Sanger es un científico popular que ha sido galardonado con un premio noble dos veces por sus hallazgos sobre la secuenciación de proteínas y la secuenciación del ADN. Ha publicado y descubierto una técnica para secuenciar secuencias de genes de ADN a través de "inhibidores de terminación de cadena" en el año 1977. Las diversas innovaciones en la secuenciación de elementos genéticos de ADN fueron sucedidas por avances simultáneos en la tecnología recombinante en el ADN [5]. El avance anterior mejora y se aplica en las muestras de genomas humanos que pueden diferenciarse o separarse fácilmente de los elementos de origen genético humano del ADN que los elementos del virus.

Secuenciación genómica completa

La primera y más importante secuenciación del genoma completo del ADN se realizó con el bacteriófago φX17. Este proceso de secuenciación se inició en el año 1977. En 1984, los científicos del consejo de la junta de investigación médica (Reino Unido) interpretaron la secuenciación genómica completa del virus "Epstein-Barr". Este virus rodea 1,72,282 nucleótidos en su secuencia genética. Esto se considera un gran salto y un hito en la secuenciación del ADN.
En la década de 1980, se inició una técnica no radiactiva para reubicar los elementos genéticos de la codificación de la secuencia del gen del ADN. En el año 1976 se inventó la primera máquina semiautomatizada para secuenciación de genes. En 1987 y principios de 2000, se inventó la máquina completamente automatizada Genesis de DuPont.

HTS: métodos de secuenciación de alto rendimiento

En el escenario actual, diferentes técnicas avanzadas de investigación genómica y técnicas relacionadas con la secuenciación de genes que fueron inventadas a mediados de la década de los noventa. A principios de 2000 había algunos secuenciadores de ADN semiautomatizados y totalmente automatizados con fines de lucro. Estos métodos también se denominan NGS. Algunos de los métodos de NGS comparados son "secuenciación de una sola molécula", secuenciación de genes piro, secuenciación de genes por síntesis, semiconductor de iones, síntesis de anclaje de sonda combinatoria, secuenciación de nanoporos, secuenciación de genes por ligación y terminación de cadena.

El método de alto rendimiento o métodos NGS son los métodos de secuenciación que se utilizan en el proceso de secuenciación del genoma, la creación de perfiles de secuencia de ARN, la secuenciación de chips y la caracterización de Epi-genoma. La nueva secuenciación es un proceso importante porque el material genético de un tipo de personalidad en particular puede no mostrar todas las discrepancias genómicas con nuevas personas.

REFERENCIAS
1. Ken Nguyen, Xuan Guo, Yi Pan (julio de 2016). Alineación de secuencias biológicas múltiples: funciones de puntuación, algoritmos y evaluación, ISBN: 978-1-118-22904-0
2. Medicina del Antiguo Egipto: https://en.wikipedia.org/wiki/Ancient_Egyptian_medicine
3. Medicina griega antigua https://en.wikipedia.org/wiki/Ancient_Greek_medicine
4 Levitt M (mayo de 2001). "El nacimiento de la biología estructural computacional". Naturaleza Estructural y Biología Molecular. 8 (5): 392–3. Doi: 10.1038 / 87545. PMID 11323711.
5. Alipanahi, B Delong, A Weirauch, Mt Frey, Bj (agosto de 2015). "Predecir las especificidades de la secuencia de proteínas de unión a ADN y ARN mediante aprendizaje profundo". Nat Biotecnología. 33 (8): 831–8. Doi: 10.1038 / Nbt.3300. PMID 26213851.

El Dr. Vijay Arputharaj es profesor I de Ciencias de la Información y la Computación en la Universidad Skyline de Nigeria. Tiene un doctorado. en Ciencias de la Computación, de la Universidad de Bharathiar, Coimbatore, India.

Puede unirse a la conversación en Facebook @SkylineUniversityNG y en Twitter @SkylineUNigeria


Hay un universo completamente nuevo, esperando ser explorado - Bienvenido al universo del ADN

El 20 de julio de 1969, nuestro mundo cambió cuando los humanos caminaron sobre la superficie de la luna por primera vez. Este logro pionero de Neil A. Armstrong, Buzz Aldrin, Michael Collins y todos los ingenieros y equipos de la misión Apolo 11 amplió nuestra realidad. .

En 1977, Frederick Sanger y sus colegas Nicklen y Coulson introdujeron el método del terminador de cadena o secuenciación didesoxi o simplemente secuenciación de Sanger como la conocemos. Similar al alunizaje, la secuenciación de Sanger cambió el mundo de la biología y dominará el mundo de la secuenciación durante los próximos 30 años. Al igual que Armstrong, Aldrin y Collins se apoyaron en gigantes como Hans Lippershey y Galileo Galilei, que inventaron el telescopio en 1608/1609, o el cosmonauta ruso Yuri Gagarin, que fue el primer humano en el espacio (12 de abril de 1961), Sanger y sus colegas también se pararon sobre los hombros de gigantes:

  • Francis Crick, James Watson y Rosalind Franklin, quienes presentaron al mundo la estructura de doble hélice del ADN en 1953.
  • Marshal Nirenberg, quien demostró que diferentes combinaciones de bases de ADN codifican aminoácidos específicos en 1961.
  • Robert Holley y sus colegas, quienes fueron los primeros en secuenciar el ARN de transferencia de levadura (ARNt) usando ARNas con especificidad de base en 1965.
  • Ray Wu, quien fue el primero en descifrar una secuencia corta de ADN utilizando una técnica llamada extensión de cebadores en 1970.
  • Walter Fiers, quien leyó la primera secuencia de ADN de un gen completo, que codifica una proteína de recubrimiento del virus MS2, en 1972.

Imagen: Principio de secuenciación de Sanger

Desde 1977, el mundo de la genómica experimentó muchos cambios profundos, más notables con la introducción de la secuenciación de próxima generación basada en el método de secuenciación por síntesis. Hoy en día, los enfoques genómicos se utilizan para responder preguntas científicas en investigación, farmacia y diagnóstico, agricultura y alimentos, biotecnología y ciencia médica.

Con el espíritu del primer alunizaje tripulado hace 50 años, Eurofins Genomics lanza "El universo del ADN". Representa las infinitas aplicaciones de la genómica. Para cada pregunta de investigación en el campo de la genómica, Eurofins Genomics tiene una solución. Ya sea que necesite secuenciación de Sanger, cebadores y sondas, secuenciación de próxima generación, genes sintéticos, CRISPR o autenticación y prueba de línea celular para Micoplasma contaminaciones ... El Universo del ADN siempre proporciona las herramientas genómicas para que los científicos sean exploradores. Alcanza las estrellas: ¡estamos encantados de ayudarte!

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Comprensión de la metodología de secuenciación de ADN de Ray Wu - Biología

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¿Cuáles son las técnicas clásicas de secuenciación del ADN?

A continuación, presentamos un breve vistazo a los diferentes métodos de secuenciación del ADN que han definido las fronteras de la genómica y la metagenómica en las últimas cuatro décadas.

Los métodos clásicos de secuenciación

1. Secuenciación de Maxam-Gilbert

1977 fue un año decisivo para los estudios de genómica. A Allan Maxam y Walter Gilbert se les atribuye la publicación del primer método de secuenciación de ADN estandarizado que aprovechó la modificación química del ADN. La modificación química de las bases resultó en la escisión en sitios específicos (nucleótidos). Utiliza marcaje radiactivo en el extremo 5 & # 8242 de la molécula de ADN. Al variar la concentración del agente modificador, los equipos pueden controlar los sitios de escisión, lo que genera una familia de fragmentos de ADN de diferentes tamaños. La visualización es fácil: el gel se coloca en una película de rayos X que produce bandas oscuras correspondientes al ADN radiomarcado. El análisis es relativamente simple, siempre que los fragmentos sean pequeños y no repetitivos.

2. Secuenciación de Sanger

El método de terminación de cadena también fue introducido en 1977 por Frederick Sanger et. Alabama. Había sido la técnica de secuenciación de ADN más popular hasta la estandarización de otros métodos avanzados. La secuenciación de Sanger utiliza ADN monocatenario como plantilla, cebador de ADN, desoxinucleósido trifosfato (dNTP), ADN polimerasa y di-desoxinucleósido trifosfato (ddNTP) como terminadores de cadena. La falta de radiactividad hizo que el método Sanger fuera más favorable que el método Maxam-Gilbert. Después de la extensión controlada del ADN, hay una ronda de desnaturalización por calor y separación de las hebras mediante electroforesis en gel.

El método Sanger de secuenciación y análisis de ADN es sencillo y rápido para secuencias de ADN cortas. Los laboratorios combinan la secuenciación del terminador de tinción de ADN estándar con analizadores de secuencia de ADN automatizados de alto rendimiento para la determinación rápida de la secuencia de ADN.

¿Cuáles son los desafíos de las técnicas clásicas de secuenciación y análisis de ADN?

  • El período de retraso inicial para la unión del cebador en el método de Sanger corresponde a la mala calidad de la secuenciación del ADN en las primeras 15 a 40 bases.
  • La eficiencia del proceso disminuye después de 700 a 900 bases.
  • El poder de resolución es insuficiente para secuencias de ADN más grandes.

¿Qué es la secuenciación de próxima generación?

La secuenciación de próxima generación o NGS no se refiere a un único método de secuenciación del ADN. Hay varios métodos estandarizados de secuenciación y análisis de ADN que se incluyen en la categoría NGS. Casi todos comparten algunas características. Son

  1. Rápido
  2. Bajo costo
  3. Capaz de secuenciar fragmentos de ADN medianos a grandes
  4. Alta fiabilidad
  5. Capaz de ejecutar reacciones de secuenciación masivamente paralelas simultáneamente

Todos los métodos NGS son técnicas de alto rendimiento.


Comprensión de la metodología de secuenciación de ADN de Ray Wu - Biología

Secuenciación de primera generación

En una ronda de 1953, Watson y Crick desarrollaron el primer modelo del ADN, dando al mundo información inherente del activo más valioso de sus identidades únicas. Tomaron datos cristalográficos de Rosalind Franklin y Maurice Wilkins que, además de proporcionarles un marco para el ADN, les dieron información sobre el proceso de replicación y cómo se codifican las proteínas. Sin embargo, debido a la longitud infinita del ADN & rsquos y al pequeño número de pares de nucleótidos, resultó difícil configurar las secuencias correctamente.

Dado que el ADN era una pieza bastante grande para usar como mecanismo para encontrar el orden de las bases, los científicos optaron por ARN ribosómico o ARN de transferencia en microbios o usaron ARN de bacteriófagos que eran mucho más cortos que una célula eucariota típica y no tenían la hebra complementaria como el ADN. Sin embargo, las cosas empezaron a ralentizarse cuando, en lugar de averiguar el orden real de los pares de bases, los científicos solo pudieron averiguar la composición que marcó la entrada de Robert Holley en 1965. Holley y sus colegas utilizaron ARNt de alanina de Saccharomyces cerevisiae para desarrollar una secuencia de ácido nucleico. Junto a Holley, Fred Sanger, un bioquímico británico utilizó el fraccionamiento de ADN para agregar al ARN ribosómico existente y transferirlo. El fraccionamiento se produce mediante el uso de una electroforesis de campo pulsado con campos eléctricos alternos para separar los fragmentos de ADN según características como su masa. Alrededor de este tiempo, los científicos ampliaron el alcance de su investigación y comenzaron a trabajar con bacteriófagos purificados, lo que fue posible gracias a la investigación emergente en el campo de la genómica. Dado que estos organismos tienen cinco extremos cohesivos colgantes, Ray Wu y Dale Kaiser utilizaron polimerasa para crear nucleótidos radiactivos al final con el fin de deducir la secuencia de ADN. A pesar de estos intentos, las bases que encontraron los científicos resultaron ser más cortas de lo habitual, lo que exigió más alteraciones.

Para alcanzar mejores resultados, se tuvieron que realizar nuevos desarrollos utilizando el fraccionamiento de ADN. Dado que este proceso involucró tanto electroforesis en gel como cromatografía, se adoptó una técnica bidireccional que utiliza los protocolos de los sistemas más y menos de Alan Coulson y Sanger & rsquos, y las técnicas de escisión de Allan Maxam y Walter Gilbert & rsquos. Se utiliza un cebador para sintetizar ADN con nucleótidos radiomarcados que finaliza con una reacción positiva, o polimerización para crear extensiones que terminan con un solo tipo de nucleótido. La prueba menos es donde los otros tres nucleótidos entran en juego y se secuencian hasta que hay un espacio en la secuencia donde el cuarto nucleótido de la reacción positiva está ausente. Posteriormente, se usa electroforesis en gel para analizar dónde se encuentran cada uno de los nucleótidos. Con este método, Sanger y sus colegas pudieron encontrar el genoma de un bacteriófago. A pesar de sus similitudes significativas, el enfoque de Gilbert y Maxam difería en cómo se escindieron los fragmentos de ADN. En lugar de utilizar la polimerización, se utilizó una sustancia química para romper los nucleótidos en pedazos más pequeños. Este método fue más prominente que el método de Sanger & rsquos y se sabe que es la primera aplicación verdadera de secuenciación de ADN.

En 1977, Sanger hizo otro avance en el campo de la tecnología del ADN que alteró drásticamente la forma en que se realizaba la secuenciación antes del descubrimiento. Llamada técnica didesoxi, este método aprovechó la ausencia de un grupo hidroxilo de 3 y rsquo que son necesarios para la extensión de las cadenas de ADN que se conectan a los grupos de fosfato de 5 y rsquo. El uso de nucleótidos radiomarcados en concentraciones desiguales con la concentración de ADN, ralentiza el proceso de síntesis de ADN. Este proceso se realiza utilizando ADN polimerasa donde se realiza la síntesis de ADN. Al hacerlo, se agregan piezas modificadas de nucleótidos (didesoxinucleótidos) de las bases A, C, G y T y, dado que carecen de un grupo hidroxilo, se detiene el proceso de síntesis a mitad de camino. Dado que hay cuatro bases, cada reacción que implique la producción de una cadena de ADN debe recibir los cuatro nucleótidos por separado. Este proceso da como resultado varias longitudes diferentes de fragmentos de ADN, cada uno único. El siguiente paso es desnaturalizar el fragmento de ADN y pasarlo por electroforesis en gel. La simplicidad y facilidad con la que se podía realizar este proceso lo convirtió en el método universal de secuenciación de ADN que llegó a conocerse como terminación de cadena o simplemente secuenciación de Sanger.


Los siguientes años siguieron con técnicas mejoradas en este campo, que podía incorporar más de una base en una sola reacción, así como producir nuevas máquinas que podían identificar secuencias de especies complejas en todo el mundo. Se comenzaron a desarrollar más métodos que se utilizan fácilmente en la actualidad y dieron como resultado lo que hoy conocemos como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las tecnologías de ADN recombinante.

La imagen de la derecha muestra el proceso de una técnica de PCR: reacción en cadena de la polimerasa.


Ver el vídeo: Secuenciación de ADN de Sanger (Julio 2022).


Comentarios:

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