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¿Cómo es una RT-PCR representativa del contenido de ARN en una célula?

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Por ejemplo, primero recopilamos todo el contenido de ARN de una línea celular de mamífero. Digamos, por ejemplo, que recolectamos 80 uL de ARN con una concentración de 150 ng / uL. A continuación, para producir ADNc, tomamos 1000 ng de ARN. Sin embargo, estos 1.000 ng son una muestra completamente aleatoria del ARN total que teníamos. ¿Cómo es esa muestra aleatoria de ARN representativa del contenido de ARN originalmente en nuestras células?


No está muy claro exactamente qué pregunta el interlocutor, pero ...

… Una forma de pensar sobre esto es preguntarse qué tan probable es que un ARN de baja abundancia esté ausente de la muestra tomada de la preparación de ARN. Esto haría que la muestra no sea representativa a nivel cualitativo.

La pregunta establece que se aíslan 12.000 ng de ARN. Como no se especifica nada más, asumo que esto es ARN total. Una estimación aproximada del ARN total por célula eucariota es de 20 pg.

Esto significa que la preparación provino de 6 x 105 células. (Asumo un rendimiento del 100%, pero esto realmente no afectará la conclusión).

Ahora suponga que un ARNm de baja abundancia está presente en 10 copias por célula. Por tanto, la preparación de ARN total contiene 6 x 106 copias de ese ARNm de baja abundancia.

Tomamos una muestra de 1,000 ng del total de 12,000 ng. En otras palabras, tomamos 1/12 de la preparación de ARN. Si esa preparación de ARN contiene 106 copias del ARNm de baja abundancia, ¿qué probabilidad hay de que tomemos una muestra que no contiene copias de ese ARNm de baja abundancia? Aquí mis matemáticas me fallan, pero intuitivamente digo que la probabilidad es muy muy pequeño.

Ahora, si hay 1,000 ARNm diferentes de baja abundancia en la célula, la probabilidad de perder cada uno de ellos es muy muy pequeño, pero la probabilidad general de perder uno de ellos es 1000 x muy muy pequeño, así que tal vez muy pequeña.

Seguiré pensando en cómo calcular el valor de muy muy pequeño, pero si alguien quiere ayudar, ¡gracias de antemano!


¿Cuáles son las diferencias entre PCR, RT-PCR, qPCR y RT-qPCR?


La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular relativamente simple y ampliamente utilizada para amplificar y detectar secuencias de ADN y ARN. En comparación con los métodos tradicionales de clonación y amplificación de ADN, que a menudo pueden llevar días, la PCR requiere solo unas pocas horas. La PCR es muy sensible y requiere una plantilla mínima para la detección y amplificación de secuencias específicas. Los métodos básicos de PCR han avanzado aún más desde la simple detección de ADN y ARN. A continuación, proporcionamos una descripción general de los diferentes métodos de PCR y los reactivos que proporcionamos en Enzo Life Sciences para sus necesidades de investigación. Nuestro objetivo es ayudar a los científicos a acceder rápidamente a los reactivos de PCR para utilizarlos en su próximo proyecto de investigación.

Para la PCR estándar, todo lo que necesita es una ADN polimerasa, magnesio, nucleótidos, cebadores, la plantilla de ADN a amplificar y un termociclador. El mecanismo de la PCR es tan simple como su propósito: 1) el ADN bicatenario (dsDNA) se desnaturaliza por calor, 2) los cebadores se alinean con las cadenas simples de ADN y 3) los cebadores se extienden por la ADN polimerasa, lo que da como resultado dos copias del original. Cadena de ADN. El proceso de desnaturalización, recocido y alargamiento a lo largo de una serie de temperaturas y tiempos se conoce como un ciclo de amplificación. Cada paso del ciclo debe optimizarse para la plantilla y el conjunto de cebadores utilizados. Este ciclo se repite aproximadamente 20-40 veces y luego se puede analizar el producto amplificado. La PCR se usa ampliamente para amplificar el ADN para un uso experimental posterior. La PCR también tiene aplicaciones en pruebas genéticas o para la detección de ADN patógeno.

Dado que la PCR es un método muy sensible y se requieren volúmenes muy pequeños para reacciones individuales, se recomienda la preparación de una mezcla maestra para varias reacciones. La mezcla maestra debe estar bien mezclada y luego dividida por el número de reacciones, asegurándose de que cada reacción contenga la misma cantidad de enzima, dNTP y cebadores. Muchos proveedores, como Enzo Life Sciences, también ofrecen mezclas de PCR que ya contienen todo excepto los cebadores y la plantilla de ADN.

Las regiones ricas en guanina / citosina (ricas en GC) representan un desafío en las técnicas de PCR estándar. Las secuencias ricas en GC son más estables que las secuencias con menor contenido de GC. Además, las secuencias ricas en GC tienden a formar estructuras secundarias, como lazos en horquilla. Como resultado, las cadenas dobles ricas en GC son difíciles de separar completamente durante la fase de desnaturalización. En consecuencia, la ADN polimerasa no puede sintetizar la nueva hebra sin obstáculos. Una temperatura de desnaturalización más alta puede mejorar esto y los ajustes hacia una temperatura de hibridación más alta y un tiempo de hibridación más corto pueden prevenir la unión inespecífica de cebadores ricos en GC. Los reactivos adicionales pueden mejorar la amplificación de secuencias ricas en GC. El DMSO, el glicerol y la betaína ayudan a romper las estructuras secundarias que son causadas por las interacciones GC y, por lo tanto, facilitan la separación de las cadenas dobles.


RT-PCR y síntesis de ADNc amp

La síntesis de ADN a partir de una plantilla de ARN, mediante transcripción inversa, produce ADN complementario (ADNc). Las transcriptasas inversas (RT) utilizan una plantilla de ARN y un cebador complementario al extremo 3 & primo del ARN para dirigir la síntesis de la primera cadena de ADNc, que se puede usar directamente como plantilla para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta combinación de transcripción inversa y PCR (RT-PCR) permite la detección de ARN de baja abundancia en una muestra y la producción del ADNc correspondiente, facilitando así la clonación de genes de baja copia. Alternativamente, el ADNc de la primera hebra puede hacerse de doble hebra usando ADN polimerasa I y ADN ligasa. Estos productos de reacción se pueden utilizar para la clonación directa sin amplificación. En este caso, se requiere la actividad de la ARNasa H, ya sea de la RT o suministrada de forma exógena.

Muchos RT están disponibles en proveedores comerciales. La transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV) y la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV, MMLV) son RT que se utilizan comúnmente en los flujos de trabajo de biología molecular. La transcriptasa inversa ProtoScript & reg II es una transcriptasa inversa M-MuLV recombinante con actividad reducida de RNasa H y mayor termoestabilidad. Puede usarse para sintetizar el ADNc de la primera hebra a temperaturas más altas que el M-MuLV de tipo salvaje. La enzima es activa hasta 50 ° C, proporcionando mayor especificidad, mayor rendimiento de ADNc y más producto de ADNc de longitud completa, hasta 12 kb de longitud.

El uso de RT modificados mejora la eficiencia de la formación de productos de longitud completa, asegurando que la copia del extremo 5 & prime de la transcripción de ARNm sea completa y permitiendo la propagación y caracterización de una copia fiel de ADN de una secuencia de ARN. El uso de RT más termoestables, donde las reacciones se realizan a temperaturas más altas, puede ser útil para la transcripción inversa del ARN que contiene una estructura secundaria.

Si necesita ayuda para comparar los reactivos de síntesis de ADNc y RT disponibles, consulte nuestra tabla de selección de síntesis de ADNc / RT.

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Descripción general de qPCR y RT-qPCR

La PCR cuantitativa, ya sea que implique un paso de transcripción inversa o no, se usa de forma rutinaria en los laboratorios de biología molecular y ha revolucionado la forma en que se lleva a cabo la investigación debido a su proceso relativamente simple (Figura 2). Sus ventajas sobre la PCR estándar incluyen la capacidad de visualizar qué reacciones han funcionado en tiempo real y sin la necesidad de un gel de agarosa. También permite un análisis verdaderamente cuantitativo. Uno de los usos más comunes de qPCR es determinar el número de copias de una secuencia de ADN de interés. Utilizando la cuantificación absoluta, el usuario puede determinar los números de copias de destino en referencia a una curva estándar de concentración definida de una manera mucho más precisa que nunca. RT-qPCR, por otro lado, permite la investigación de cambios en la expresión génica tras el tratamiento de sistemas modelo con inhibidores, estimulantes, pequeños ARN interferentes (ARNip) o modelos knockout, etc. Esta técnica también se utiliza de forma rutinaria para detectar cambios en la expresión tanto antes (como control de calidad) y después (confirmación del cambio) de los experimentos de RNA-Seq.

Flujo de trabajo de un experimento de qPCR y RT-qPCR estándar. Después del aislamiento de la muestra, se analiza la integridad antes de la generación de cDNA y el comienzo del ensayo de qPCR utilizando colorantes intercalados o sondas de hidrólisis. La fluorescencia se detecta a lo largo de los ciclos de PCR y se usa para generar una curva de amplificación que se usa para cuantificar la muestra objetivo durante el análisis de datos.

Preparación de la muestra

El paso más crucial en la tubería qPCR y RT-qPCR es posiblemente el aislamiento de la muestra. No importa qué tan bueno sea el diseño de su ensayo, si el material de partida está contaminado o degradado, no obtendrá resultados precisos. Una muestra de buena calidad es el punto de partida de los datos de buena calidad. Al aislar ADN para qPCR, es esencial que esté libre de contaminantes que puedan inhibir la reacción. La mayoría de las veces, la extracción se lleva a cabo utilizando kits disponibles comercialmente, que tienen la ventaja de ser fáciles de usar, simples y rápidos, especialmente cuando se integran con un sistema robótico. El tipo de extracción de ARN que se lleve a cabo depende del tipo de ARN requerido. El método de extracción más común utilizado es con kits de extracción de ARN total. Esto aísla el ARN mensajero (el ARNm, el precursor de la síntesis de proteínas), el ARN de transferencia (el ARNt decodifica el ARNm durante la traducción con el ribosoma) y el ARN ribosómico (el ARNr lee el orden de los aminoácidos durante la traducción y los une con el ribosoma), pero a menudo (no siempre) ) no logra aislar ARN más pequeños, como ARN no codificante (ARN ncRNA funcional transcrito a partir de ADN, pero no traducido a proteínas) y micro ARN (los miARN regulan la expresión génica inhibiendo la traducción del ARNm). Con la explosión de interés en los ARN potenciadores (eRNA pequeños RNA transcritos a partir de potenciadores) que pueden variar considerablemente en longitud, es esencial que los métodos de extracción se consideren cuidadosamente para asegurar el aislamiento del ARN de interés. Además de las consideraciones de extracción, es esencial que el ARN no esté contaminado con ADN, ya que este no se puede distinguir del ADNc en la reacción de qPCR. Para superar esto, la mayoría de los protocolos se basan en el uso de un tratamiento con DNasa I que digiere cualquier ADN.

Durante el aislamiento, la degradación de la muestra es siempre una posibilidad. En consecuencia, cualquier buen proceso implicará un paso de control de calidad para evaluar la integridad de la muestra. Esto se puede hacer rápidamente evaluando la relación A260 / 280 (comparando la absorbancia a 260 vs 280 nm, una medida de contaminación por proteínas) y la relación A260 / 230 (260 vs 230 nm, una indicación de la presencia de contaminantes orgánicos) de la muestra, sin embargo, esto no es muy exacto y está sujeto a la interferencia de varios factores. Una medida más precisa es el uso de un sistema de electroforesis en gel virtual como el Aligent Bioanalyser. Este sistema funciona mediante un chip que separa el ARN en función del tamaño y detecta el ARN mediante tintes fluorescentes. Esto luego se traduce a una computadora que, utilizando un algoritmo, produce un número de integridad de ARN (RIN) que representa la calidad de la muestra, siendo 10 el más alto.

El paso final en la preparación de la muestra para RT-qPCR es la generación de ADNc. El cDNA utiliza RT-PCR (Figura 1) para generar cDNA a partir de la plantilla de RNA utilizando una transcriptasa inversa. Esto se puede hacer empleando cebadores oligo (dT), que se hibridan con la cola poliA del ARN, o usando hexámeros aleatorios (cebadores de seis a nueve bases de largo, que hibridan en múltiples puntos a lo largo del transcrito de ARN). Generalmente, se cree que una mezcla de los dos cebadores es lo mejor, ya que permite la amplificación del ARN de cola poliA (principalmente ARNm) y ARN que no contiene poliA (ARNt, ARNr, etc.). Además de la consideración del cebador, la generación de ADNc puede ser parte del experimento de qPCR (denominado RT-qPCR de un paso) o se genera por separado de la qPCR (RT-qPCR de dos pasos), como se muestra en la Figura 3. La ventaja de RT-qPCR de un solo paso es que hay menos variación experimental y menos riesgos de contaminación, además de permitir un cribado de alto rendimiento, por lo que esta opción se suele utilizar para el cribado clínico. Sin embargo, sí significa que la muestra solo se puede usar un número limitado de veces, mientras que la RT-qPCR de dos pasos permite más reacciones por muestra y opciones de cebado flexibles y suele ser la opción preferida para el análisis de expresión génica a gran escala, pero no lo hace. requieren más optimización.


Los eosinófilos humanos y de ratón tienen actividad antiviral contra el virus de la parainfluenza

Los virus respiratorios provocan exacerbaciones del asma. Debido a que los eosinófilos son los leucocitos prominentes en las vías respiratorias de 60 a 70% de los pacientes con asma, evaluamos los efectos de los eosinófilos en un virus respiratorio común, la parainfluenza 1, en el pulmón. Los eosinófilos reclutados en las vías respiratorias de los ratones de tipo salvaje después de la sensibilización a la ovoalbúmina y el desafío disminuyeron significativamente el ARN del virus de la parainfluenza en los pulmones 4 días después de la infección en comparación con los animales no sensibilizados. Este efecto antiviral también se observó en ratones transgénicos de IL-5 con abundancia de eosinófilos en las vías respiratorias (NJ.1726), pero se perdió en ratones transgénicos deficientes en eosinófilos (PHIL) y en ratones transgénicos de IL-5 cruzados con ratones deficientes en eosinófilos (NJ .1726-PHIL). La pérdida de la proteína del gránulo de eosinófilos peroxidasa de eosinófilos, utilizando ratones transgénicos deficientes en peroxidasa de eosinófilos, no redujo el efecto antivírico de los eosinófilos. También se exploraron los mecanismos antivirales de los eosinófilos. in vitro. Los eosinófilos humanos aislados redujeron significativamente los títulos del virus de la parainfluenza. Este efecto no implicó la degradación del ARN viral por las ARNasas de gránulos de eosinófilos. Sin embargo, los eosinófilos tratados con un inhibidor de la sintasa de óxido nítrico perdieron su actividad antiviral, lo que sugiere que los eosinófilos atenúan la infectividad viral a través de la producción de óxido nítrico. En consecuencia, se midió la producción de óxido nítrico de eosinófilos con una sonda fluorescente intracelular. Los eosinófilos produjeron óxido nítrico en respuesta al virus ya un agonista sintético del receptor inmune innato que detecta el virus, el receptor tipo Toll (TLR) 7. El IFNγ aumentó la expresión del eosinófilo TLR7 y potenció la producción de óxido nítrico inducida por TLR7. Estos resultados sugieren que los eosinófilos promueven el aclaramiento viral en el pulmón y contribuyen a las respuestas inmunes innatas contra las infecciones por virus respiratorios en humanos.

Los eosinófilos humanos y de ratón son antivirales contra el virus de la parainfluenza a través de la producción de óxido nítrico y actúan como hospedadores sin salida para la infección por virus, pero no a través de la producción de ARNasas de gránulos de eosinófilos o peroxidasa de eosinófilos. Los eosinófilos pueden tener un papel antivírico subestimado en las infecciones del tracto respiratorio en humanos.

Los eosinófilos se encuentran infiltrando las vías respiratorias de aproximadamente dos tercios de los pacientes con asma (1) y se han relacionado experimentalmente con la hiperreactividad de las vías respiratorias (2) y la remodelación de las vías respiratorias (3). Es comprensible que esto haya llevado a la suposición de que los eosinófilos son únicamente desadaptativos en el asma y, por lo tanto, muchos tratamientos del asma están diseñados para reducir la inflamación eosinofílica (4-7). Esta estrategia ha producido resultados variables. Muchos pacientes con asma permanecen mal controlados a pesar de la terapia máxima (8). Las exacerbaciones de los síntomas del asma continúan causando una morbilidad significativa, gastos de atención médica y muerte (9, 10). Además, la prevención y el tratamiento de la causa más común de exacerbaciones del asma, las infecciones por virus respiratorios, son prácticamente inexistentes (11). Estas deficiencias resaltan nuestra comprensión limitada de la biología de los eosinófilos y han impulsado estudios que intentan definir el papel de los eosinófilos durante las infecciones por virus respiratorios en el asma. Por ejemplo, los ratones transgénicos con IL-5 con eosinófilos sistémicos elevados tenían títulos más bajos de virus sincitial respiratorio (VSR) en comparación con los ratones de tipo salvaje (12), mientras que los ratones transgénicos con IL-5 con eosinofilia en las vías respiratorias tenían títulos más bajos de virus de la neumonía en los ratones en comparación con los ratones. con controles (13). De manera similar, encontramos que los eosinófilos reclutados en las vías respiratorias después de la sensibilización a la ovoalbúmina se asociaron con menos virus parainfluenza 1 en los pulmones de los conejillos de indias, aunque esos experimentos no fueron diseñados para establecer un papel causal para los eosinófilos (14). En conjunto, estos estudios sugieren que los eosinófilos contribuyen a la inmunidad antiviral en los pulmones.

Los eosinófilos detectan virus invasores a través de varios mecanismos, incluidas las interacciones ligando-receptor tipo Toll (TLR) (15). TLR7 se une al ARN monocatenario que es un motivo genómico común para muchos virus respiratorios (16). La ligadura de TLR7 desencadena la señalización dependiente de la proteína adaptadora de la respuesta primaria de diferenciación mieloide 88 (MyD88) que promueve una respuesta antiviral de eosinófilos (12). Sin embargo, se están debatiendo los mediadores responsables de la actividad antiviral de los eosinófilos. Los eosinófilos liberan una variedad de proteínas granulares después de la activación que pueden ser antivirales. La proteína catiónica de eosinófilos y la neurotoxina derivada de eosinófilos son miembros de la superfamilia de la ARNasa A y se propone que tengan un efecto virucida al degradar los genomas del ARN viral (13, 17, 18). La peroxidasa de eosinófilos también se libera de los gránulos de eosinófilos y contribuye a la generación de especies de oxígeno reactivas a los antimicrobianos (19). Si los eosinófilos se dirigen a todos los virus con estas proteínas o mediante mecanismos únicos, se requiere más estudio.

El virus de la parainfluenza es uno de varios virus conocidos por causar exacerbaciones del asma (20). La parainfluenza se detecta en las vías respiratorias de hasta el 18% de los adultos durante las exacerbaciones agudas del asma (21). Su prevalencia es similar a la de la influenza y el coronavirus, y significativamente mayor que la del VSR en adultos. Dado que se estima que cada año se realizan 16 millones de visitas de atención aguda por exacerbaciones del asma (22), las exacerbaciones inducidas por la parainfluenza representan una carga considerable de enfermedad, sin embargo, la interacción entre el virus de la parainfluenza y los eosinófilos no está claramente definida.

En este estudio, investigamos la hipótesis de que los eosinófilos inhiben la infección por el virus de la parainfluenza en los pulmones. Los experimentos descritos en este documento evaluaron el efecto de los eosinófilos en la eliminación del virus de la parainfluenza. en vivo y evaluó el papel de los posibles mediadores antivirales. También examinamos los efectos del IFNγ en las respuestas antivirales de los eosinófilos como un mecanismo potencial para aumentar la actividad antiviral mediada por eosinófilos.

Los ratones que expresan IL-5 en el epitelio de las vías respiratorias (NJ.1726) (23), los ratones deficientes en eosinófilos (PHIL) (24) y los ratones deficientes en peroxidasa de eosinófilos (25) se mantuvieron mediante retrocruzamiento sobre un fondo C57BL / 6. Los animales se manipularon de acuerdo con la Ley de Bienestar Animal de EE. UU. Los protocolos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Uso y Cuidado Animal de la Universidad de Salud y Ciencias de Oregon (Portland, OR) y la Clínica Mayo (Scottsdale, AZ).

El virus de la parainfluenza (virus Sendai ATCC, Manassas, VA) se cultivó en monocapas de células de riñón de mono rhesus (RMK), se purificó mediante centrifugación en densidad de sacarosa y se tituló en células RMK (26) (ver los M ateriales y métodos en línea). Los títulos se expresaron como múltiplos de la dosis infecciosa del cultivo de tejidos al 50% (TCID50 cantidad de virus necesaria para infectar el 50% de las monocapas de RMK).

Se sensibilizaron ratones hembra de 6 a 8 semanas mediante inyección intraperitoneal con 0,04 μg y 0,2 μg de ovoalbúmina (Sigma, St. Louis, MO) con alumbre los días 1 y 14, respectivamente. Los días 24, 26 y 28, los ratones se anestesiaron con ketamina (45 mg / kg) y xilacina (8 mg / kg) y se desafiaron con ovoalbúmina intratraqueal al 2%. Los ratones se infectaron con parainfluenza (2,8 × 10 4 TCID50 Unidades) por vía intranasal el día 27. El día 31, los pulmones se lavaron y homogeneizaron (ver los M ateriales y métodos en línea).

El ARN de la proteína de matriz de parainfluenza en homogeneizados de pulmón se amplificó mediante RT-PCR en tiempo real y se normalizó a 18S. La expresión de ARN relativo se convirtió en réplicas de ARN absoluto utilizando una curva estándar de ARN de parainfluenza (ver los M ateriales y métodos en línea).

Los eosinófilos se aislaron con una pureza superior al 99% y una viabilidad superior al 99% de la sangre de voluntarios humanos sanos mediante centrifugación por densidad utilizando Ficoll-Paque Plus (Sigma) y selección negativa (ver los M ateriales y métodos en línea). El protocolo fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional. Los sujetos proporcionaron su consentimiento informado por escrito.

Los eosinófilos humanos se incubaron durante la noche con o sin IFNγ (300 U / ml). Se retiró el medio y se eliminó la parainfluenza (1 × 10 5 TCID50) se añadió durante 2 horas. Algunos cultivos se pretrataron con inhibidor de la óxido nítrico sintasa, clorhidrato de éster metílico de Nω-nitro-L-arginina ([l -NOMBRE] Sigma 100 μM) 30 minutos antes de la inoculación. La infectividad viral se cuantificó en células RMK mediante un ensayo de hemadsorción. Los títulos infecciosos se expresan como TCID50 U / ml de sobrenadante de cultivo.

Se cargaron eosinófilos humanos con una sonda fluorescente de detección de óxido nítrico (Strem, Newburyport, MA) y se expusieron a parainfluenza o agonista sintético de TLR7. ver los M ateriales y métodos en línea. Se midió la fluorescencia 60 minutos después mediante un lector de placas.

Se inocularon eosinófilos humanos con parainfluenza (1 × 10 5 TCID50) durante 2 horas, se lavó para eliminar el virus no unido y se mantuvo en medio fresco durante 72 horas. El ARN viral en los sobrenadantes de cultivo se cuantificó cada 24 horas mediante RT-PCR en tiempo real (ver los M ateriales y métodos en línea).

La expresión de TLR7 de eosinófilos se evaluó mediante RT-PCR en tiempo real e inmunofluorescencia (ver los M ateriales y métodos en línea).

Los datos se compararon utilizando ANOVA unidireccional con Bonferroni post hoc prueba. Los datos se presentan como media (± SEM). A PAG se consideró significativo un valor inferior a 0,05.

Los ratones C57BL / 6, sensibilizados y desafiados con ovoalbúmina, habían reducido significativamente (en ~ 90%) el ARN del virus de la parainfluenza en los pulmones 4 días después de la infección en comparación con los animales no sensibilizados (Figura 1A). La sensibilización y el desafío de la ovoalbúmina causaron un aumento sustancial de eosinófilos en el líquido de lavado broncoalveolar, así como macrófagos y neutrófilos (Figura 1B).

Figura 1. La sensibilización y la exposición a la ovoalbúmina aumentan la eliminación de la infección por el virus de la parainfluenza en los pulmones en vivo. (A) Se sensibilizaron ratones C57BL / 6 (intraperitoneal, días 1 y 14) y se desafiaron (intratraqueal, días 24, 26 y 28) con ovoalbúmina y se infectaron con el virus de la parainfluenza (intranasal, día 27). El ARN del virus de la parainfluenza se cuantificó mediante RT-PCR en tiempo real 4 días después de la infección. Los ratones sensibilizados y desafiados habían reducido significativamente el ARN de parainfluenza en el pulmón en comparación con los ratones de control infectados con parainfluenza no sensibilizados. (B) La sensibilización y la exposición a la ovoalbúmina aumentaron las células inflamatorias totales, los macrófagos (MΦ), los eosinófilos (Eos) y los neutrófilos (Neut) en el líquido de lavado broncoalveolar en comparación con los controles no sensibilizados. No hubo diferencias en los linfocitos (Linfa) entre los grupos (norte = 5). *PAG & lt 0,05 en comparación con ratones de control infectados con parainfluenza no sensibilizados. Los datos se presentan como medias (± SEM).

Los ratones NJ.1726 (↑ Eos ↑ IL-5) expresan constitutivamente IL-5 en el epitelio pulmonar y tienen un número elevado de eosinófilos en los pulmones (23). A los 4 días después de la infección, el ARN de parainfluenza disminuyó significativamente en los pulmones de los ratones NJ.1726 en comparación con los controles de los compañeros de camada de tipo salvaje (Figura 2A). Se cruzaron ratones transgénicos NJ.1726 IL-5 con ratones PHIL (ØEos), que están desprovistos congénitamente de eosinófilos, para diferenciar el efecto de los eosinófilos de IL-5. El contenido de ARN de parainfluenza en los pulmones de ratones NJ.1726-PHIL con deficiencia de eosinófilos que expresan IL-5 (ØEos ↑ IL-5) fue similar al de los ratones infectados de tipo salvaje, lo que indica que los eosinófilos, no IL-5, median el efecto antiviral. De manera similar, los ratones PHIL deficientes en eosinófilos solos tenían niveles de ARN de parainfluenza comparables a los de los ratones de tipo salvaje infectados (Figura 2A). El lavado broncoalveolar confirmó un aumento significativo de eosinófilos en las vías respiratorias de los ratones NJ.1726 en comparación con los controles de compañero de camada de tipo salvaje, y una ausencia de eosinófilos en los ratones PHIL y NJ.1726-PHIL (Figura 2B). No hubo diferencias significativas en los leucocitos totales u otros subconjuntos de células inflamatorias en el lavado broncoalveolar entre los grupos (Figura 2C).

Figura 2. Los eosinófilos promueven la eliminación del virus de la parainfluenza en el pulmón murino en vivo. Ratones de control de tipo salvaje (WT) (C57BL / 6), ratones transgénicos con eosinófilos pulmonares altos debido a la sobreexpresión de IL-5 por un promotor específico de pulmón (NJ.1726 ↑ Eos ↑ IL-5), ratones transgénicos con pulmón alto IL-5 pero desprovisto de eosinófilos (NJ.1726-PHIL ØEos ↑ IL-5) y ratones deficientes en eosinófilos (ratones transgénicos PHIL ØEos) se infectaron con el virus de la parainfluenza (intranasal). (A) El contenido de ARN de parainfluenza en el pulmón se cuantificó mediante RT-PCR en tiempo real 4 días después de la infección. Los ratones NJ.1726 (↑ Eos ↑ IL-5) tenían un ARN de parainfluenza significativamente reducido en comparación con los ratones de control (WT). Los ratones NJ.1726-PHIL (ØEos ↑ IL-5) y los ratones PHIL (ØEos) tenían niveles de ARN de parainfluenza comparables a los de WT. (B) El lavado broncoalveolar de ratones NJ.1726 infectados con parainfluenza (↑ Eos ↑ IL-5) contenía significativamente más eosinófilos en comparación con todos los demás grupos. No se detectaron eosinófilos en el lavado broncoalveolar en ratones PHIL (ØEos) o NJ.1726-PHIL (ØEos ↑ IL-5). (C) No hubo diferencias en otros tipos de células inflamatorias entre los grupos (norte = 7–10). *PAG & lt 0,05. Los datos se presentan como medias (± SEM).

La peroxidasa de eosinófilos es una proteína granulada liberada por los eosinófilos. Se sensibilizaron y desafiaron ratones de tipo salvaje y transgénico con deficiencia de peroxidasa de eosinófilos con ovoalbúmina e infectados con el virus de la parainfluenza. El ARN del virus de la parainfluenza se cuantificó a partir de pulmón homogeneizado mediante RT-PCR en tiempo real 4 días después de la infección. La sensibilización y la exposición a la ovoalbúmina se asoció con una reducción significativa del ARN de parainfluenza en ratones de tipo salvaje y con deficiencia de peroxidasa de eosinófilos en comparación con los controles no sensibilizados (Figura 3A), lo que indica que el efecto antivírico mediado por eosinófilos no dependía de la liberación de peroxidasa de eosinófilos. Los ratones de tipo salvaje y deficientes en peroxidasa de eosinófilos sensibilizados y desafiados tenían eosinófilos de las vías respiratorias significativamente elevados en relación con los ratones de tipo salvaje no sensibilizados y deficientes en peroxidasa de eosinófilos (Figuras 3B y 3C).

Figura 3. La peroxidasa de eosinófilos no es necesaria para el efecto antivírico de los eosinófilos. en vivo. (A) Se sensibilizaron y desafiaron (S / C) ratones WT y ratones knockout para peroxidasa de eosinófilos (EPX - / -) con ovoalbúmina y se infectaron con el virus de la parainfluenza. El ARN viral se cuantificó mediante RT-PCR en tiempo real 4 días después de la infección. Los ratones WT (WT S / C) y EPX - / - (EPX - / - S / C) sensibilizados y desafiados tenían un ARN de parainfluenza significativamente reducido en el pulmón en comparación con los ratones de control no sensibilizados e infectados con parainfluenza. (B) La sensibilización a la ovoalbúmina y la provocación aumentaron los eosinófilos en el líquido de lavado broncoalveolar en ratones WT y EPX - / - en comparación con controles no sensibilizados. (C) No hubo diferencias en otros tipos de células inflamatorias entre los grupos (norte = 4–5). *PAG & lt 0,05. Los datos se presentan como medias (± SEM).

Se inocularon eosinófilos humanos aislados con parainfluenza durante 2 horas, luego se lavaron para eliminar el virus no unido y se cultivaron en medio fresco durante 72 horas para evaluar si la parainfluenza infecta directamente a los eosinófilos y, de ser así, si los eosinófilos apoyan la producción de progenie viral. El ARN de parainfluenza, cuantificado mediante RT-PCR en tiempo real a partir de sobrenadantes de cultivo, aumentó progresivamente durante 72 horas (Figura 4, eje izquierdo), lo que indica que el virus es capaz de infectar eosinófilos y producir transcripciones virales. Sin embargo, a pesar de la replicación, los títulos del virus de la parainfluenza, según lo determinado por el ensayo de hemadsorción, permanecieron indetectables en estos puntos de tiempo (Figura 4, eje derecho), lo que indica que los eosinófilos no favorecen la producción de virus infecciosos.

Figura 4. Los eosinófilos infectados con parainfluenza producen una progenie viral que no es infecciosa. Se aislaron eosinófilos humanos de la sangre periférica y se infectaron con el virus de la parainfluenza durante 2 horas, se lavaron para eliminar el virus no unido y se mantuvieron en cultivo durante 72 horas. El ARN de parainfluenza de sobrenadantes de eosinófilos se cuantificó mediante RT-PCR en tiempo real cada 24 horas (cuadrado sólido, eje izquierdo). Al mismo tiempo, los títulos del virus de la parainfluenza infeccioso se evaluaron mediante un ensayo de hemadsorción utilizando células de riñón de mono rhesus y se expresaron como dosis infecciosa de cultivo de tejidos al 50% (TCID50) U / ml (circulo abierto, eje derecho) (norte = 4). Los datos se presentan como medias (± SEM).

Se compararon los niveles de ARN que codifica tres proteínas estructurales del virus de la parainfluenza (es decir, proteína de matriz, proteína de fusión y nucleoproteína) 2 horas después de la inoculación entre cultivos de eosinófilos infectados por virus y cultivos con medios inoculados con virus para determinar si el efecto antiviral mediado por eosinófilos resultó de la liberación de ARNasas de gránulos de eosinófilos. Al mismo tiempo, los títulos del virus de la parainfluenza se evaluaron en este momento en las células RMK mediante un ensayo de hemadsorción. Los eosinófilos disminuyeron significativamente los títulos del virus de la parainfluenza en comparación con los cultivos inoculados con virus sin eosinófilos, lo que demuestra que los eosinófilos reducen la infectividad del virus de la parainfluenza (Figura 5A). Se observó una reducción adicional en los títulos de virus cuando se pretrataron eosinófilos con IFNγ. Sin embargo, las cantidades de ARN para las tres proteínas estructurales del virus de la parainfluenza fueron similares entre cultivos que contenían eosinófilos infectados por virus y cultivos inoculados con virus sin eosinófilos (Figura 5B), lo que demuestra que la infecciosidad reducida no se debe a la degradación del genoma del ARN viral. por las ARNasas de gránulos de eosinófilos.

Figura 5. La actividad antiviral de los eosinófilos contra la parainfluenza no implica las ARNasas granuladas. Se aislaron eosinófilos humanos de sangre periférica y se infectaron con el virus de la parainfluenza. (A) La infectividad viral se evaluó 2 horas después de la inoculación mediante un ensayo de hemadsorción y se expresó como TCID viral.50 U / ml. La infectividad de la parainfluenza fue casi indetectable en los sobrenadantes de eosinófilos cultivados (Eos) y eosinófilos pretratados con IFNγ (Eos + IFNγ) en comparación con el virus de parainfluenza cultivado en medios sin eosinófilos (Media + IFNγ). (B) El ARN que codifica las proteínas estructurales del virus de la parainfluenza, la matriz, la fusión y la nucleoproteína (NP) se cuantificó en los sobrenadantes de eosinófilos mediante RT-PCR en tiempo real 2 horas después de la inoculación. No se detectaron diferencias entre ninguno de los tres genes, lo que sugiere que la reducción de la infectividad de la parainfluenza no se debió a la degradación del ARN viral por las ARNasas granulares de eosinófilos (norte = 4–7). *PAG & lt 0,05. Los datos se presentan como medias (± SEM).

El virus de la parainfluenza se incubó en presencia de eosinófilos humanos aislados durante 2 horas y luego se cuantificó la infectividad viral mediante titulación en células RMK (mediante ensayo de hemadsorción). Como se muestra en la Figura 6A, los eosinófilos disminuyeron significativamente los títulos del virus de la parainfluenza en comparación con la parainfluenza incubada en un medio sin eosinófilos. Los eosinófilos se cultivaron con el inhibidor de la sintasa de óxido nítrico, l -NOMBRE, para determinar si el efecto antiviral mediado por eosinófilos se debió a la producción de óxido nítrico. Eosinófilos tratados con l -NAME lost their ability to reduce virus titers, indicating that, upon exposure to virus, eosinophils attenuate viral infectivity through the production of nitric oxide ( Figure 6A ). The quantity of nitric oxide produced by eosinophils was evaluated with a copper-conjugated intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe 1 hour after addition of virus. Eosinophils exposed to parainfluenza virus had significantly increased fluorescence, indicating that eosinophils produce nitric oxide in response to parainfluenza infection. This increased fluorescence was blocked by l -NAME, confirming that nitric oxide was the mediator responsible ( Figures 6B and 6C ).

Figura 6. Eosinophil-derived nitric oxide reduces parainfluenza virus infectivity. Human eosinophils isolated from peripheral blood were cultured overnight with IFNγ. (A) Eosinophils were treated with the nitric oxide synthase inhibitor Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride ( l -NAME 100 μM) or vehicle for 30 minutes, then infected with parainfluenza virus. Virus infectivity was quantified 2 hours after infection by hemadsorption assay and expressed as viral TCID50 U/ml. Parainfluenza virus infectivity was significantly decreased in the presence of eosinophils. Eosinophils treated with l -NAME lost their antiviral activity (norte = 4). (B) Nitric oxide production was assessed using an intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe. Eosinophils loaded with the probe were treated with l -NAME or vehicle and infected with parainfluenza for 1 hour. Eosinophil fluorescence increased significantly in response to parainfluenza infection, indicating an increase in nitric oxide production by eosinophils. l -NAME treatment prevented parainfluenza-induced nitric oxide production by eosinophils (norte = 4). (C) Representative images of eosinophils loaded with nitric oxide–detecting fluorophore. Magnification, ×100. *PAG < 0.05. Data are presented as means (±SEM).

Eosinophils were cultured with or without IFNγ overnight. IFNγ increased eosinophil TLR7 expression relative to unstimulated eosinophils, both quantitatively by real-time RT-PCR ( Figure 7A ) and qualitatively by immunostaining ( Figure 7B ). Eosinophils’ response to TLR7 agonist was also evaluated with a nitric oxide–detecting fluorescent probe. Eosinophils treated for 1 hour with the synthetic TLR7 agonist, R837, had significantly increased fluorescence compared with vehicle-treated controls, indicating that TLR7 agonist induces nitric oxide production ( Figures 7C and 7D ). R837-mediated nitric oxide production was potentiated in eosinophils exposed to IFNγ. l -NAME and the oligonucleotide TLR7 antagonist, IRS661, but not a control oligonucleotide, blocked R837-induced nitric oxide production.

Figura 7. IFNγ up-regulates Toll-like receptor 7 (TLR7) expression and potentiates TLR7-induced nitric oxide production in eosinophils. Human eosinophils were isolated from peripheral blood and grown in culture. (A) TLR7 expression was quantified by real-time RT-PCR from eosinophils treated with or without IFNγ. TLR7 RNA was significantly increased in eosinophils treated with IFNγ compared with untreated eosinophils (norte = 5). (B) Eosinophils were immunostained with antibodies against TLR7 (green), and nuclei were labeled with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (blue). TLR7 was expressed in unstimulated (−IFNγ) and IFNγ stimulated (+IFNγ) eosinophils. Images obtained with an LSM780 confocal microscope (numerical aperture 1.4 Zeiss, Thornwood, NY). (C) Eosinophils were loaded with an intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe and stimulated with synthetic TLR7 agonist R837. Eosinophil fluorescence increased in response to R837. IFNγ pretreatment potentiated the R837-induced increase in fluorescence. R837-induced fluorescence was blocked by l -NAME and by the oligonucleotide TLR7 antagonist IRS661, but not by a control oligonucleotide (IRS control) (norte = 6). (D) Representative images of eosinophils loaded with nitric oxide–detecting fluorophore. Magnification, ×100. *PAG < 0.05 compared with no IFNγ control. # PAG < 0.05 compared with all other groups, except between IFNγ-treated R837 and R837 + IRS control. Data are presented as means (±SEM).

Our results demonstrate a significant antiviral effect of eosinophils on parainfluenza virus infection in mouse airways en vivo and in isolated human eosinophils in vitro. Eosinophils appear to mediate their antiviral effects via both passive and proactive mechanisms. Specifically, our data show that eosinophils are a “dead-end” cellular host for parainfluenza, failing to propagate infectious viral progeny after infection. Thus, elevated eosinophil numbers in the lung may passively disrupt airway infection by acting as a cellular decoy and/or “sink,” interfering with the progressive expansion of viral numbers during infection. Our data also show that eosinophils proactively mediated antiviral activities through the production of nitric oxide and up-regulation of TLR7. In contrast, we did not find evidence that eosinophils directly attenuate parainfluenza through the release of eosinophil peroxidase or by degrading the viral RNA genome through the release of granule RNases.

These findings expand on prior eosinophil studies (12–14, 17, 18, 27) by establishing an antiviral role for eosinophils against parainfluenza virus, while suggesting that key differences exist in the eosinophils’ antiviral mechanisms against different viruses. Previous studies proposed that eosinophils inhibit RSV and pneumonia virus in mice, in part via the degradation of viral RNA genomes by eosinophils’ granule RNases, eosinophil cationic protein, and eosinophil-derived neurotoxin (13, 17, 18). However, we found that eosinophils did not alter the quantity of viral RNA transcripts for three key parainfluenza virus structural proteins (i.e., matrix, fusion, and nucleoprotein), despite causing a substantial reduction in parainfluenza infectivity, titered in RMK cells by hemadsorption assay. This suggests that eosinophils do not inhibit parainfluenza through RNase activity on the viral genome. Importantly, our methods differed from prior studies by quantifying both viral RNA and infectivity compared with only assessing viral infectivity after treating infected eosinophils with RNase inhibitors. Concurrent measurement of viral RNA levels and infectivity led to the additional finding that, although human eosinophils infected with parainfluenza produce viral RNA, these viral progeny are not infectious. This phenomenon, termed an “abortive” infection, has been described for many viruses, including RSV (28) and coronavirus (29) in macrophages, and influenza A in neutrophils (30), as well as for parainfluenza virus in Madin-Darby bovine kidney cells (31) and chick embryo fibroblasts (32). Evidence suggests that specific virus and host cell characteristics impact productive versus abortive outcomes during virus infections (33), but those characteristics require further investigation.

Eosinophils also inhibit parainfluenza through the production of nitric oxide. Previously, systemic suppression of nitric oxide production using an inhibitor of nitric oxide synthase delayed clearance of RSV in wild-type mice and in IL-5 transgenic animals with systemic eosinophilia en vivo (12, 34). Given the widespread expression of nitric oxide synthases, however, these studies were unable to distinguish the specific role of eosinophil-derived nitric oxide, which our study has elucidated. The ability of eosinophils to produce nitric oxide has been suspected for some time, given the presence of both constitutive and inducible nitric oxide synthase isoforms in eosinophils (35), but detecting nitric oxide has historically been challenging due to its short half-life and rapid diffusion across biologic membranes (36). These issues were overcome by using a copper-conjugated intracellularly retained fluorescent probe. We found that eosinophils generate nitric oxide in response to virus infection, and in response to stimulation with synthetic TLR7 agonist. IFNγ potentiated TLR7-mediated nitric oxide production in eosinophils, likely in part through the up-regulation of TLR7 expression. Thus, our results show that antiviral cytokine signaling augments eosinophils’ viral detection and their antiviral nitric oxide response.

Nitric oxide mediates antiviral effects via the production of a variety of reactive nitrogen products that inhibit viral proteases (37), and alter host cell function through nitrosylation of tyrosine and thiol groups (38). The consequences of these nitrogen species are diverse, ranging from inhibition of virus protein and RNA synthesis to potentiation of inflammation and injury to the respiratory tract (39). Nitric oxide also regulates many other physiologic processes, including eosinophil migration (40) and survival (41, 42), airway epithelial cell ciliary motility (43), and airway caliber through airway smooth muscle relaxation (44). Eosinophil-derived nitric oxide may affect multiple functions in the airway beyond what our experiments were designed to assess.

Eosinophils’ attenuation of parainfluenza virus infection was not dependent on the release of eosinophil peroxidase. Eosinophil peroxidase is a granule protein that, together with the respiratory burst from activated eosinophils, generates potent reactive oxygen species that have been suggested to contribute to host immune defense (45). For example, eosinophil peroxidase has been shown to have virucidal effects against human immunodeficiency virus in vitro (46). However, the role of eosinophil peroxidase en vivo as a host defense mechanism remains unclear. Eosinophil peroxidase deficiency had no effect in an experimental model of helminthic parasite infections in mice (47), and its deficiency has also been detected in humans without manifesting an apparent phenotype (48). Our data further suggest that eosinophil peroxidase has no role in eosinophils’ antiviral activity against parainfluenza.

Importantly, our experiments differentiate the effects of eosinophils’ versus IL-5. Although NJ.1726 IL-5 transgenic mice (↑Eos ↑IL-5) with an abundance of airway eosinophils had reduced parainfluenza virus in the lung, NJ.1726-PHIL mice (ØEos ↑IL-5) with elevated IL-5 in the absence of eosinophils did not. This is pertinent given the presence of IL-5 receptors on leukocytes other than eosinophils, including macrophages and neutrophils (49), which could have contributed to the antiviral effect en vivo. Furthermore, our data demonstrate that, although an induced airway eosinophilia promoted viral clearance, clearance of virus was similar for eosinophil-deficient mice relative to wild-type control animals. This suggests that the presence of a specific airway eosinophilia mediates one or more unique antiviral mechanisms not occurring at homeostatic baseline, and underlines the need for better characterization of asthma phenotypes when evaluating respiratory virus infections in humans.

Human studies have historically been confounded by the heterogeneity of asthma phenotypes (50), the need for invasive bronchoscopic testing, the immune effects of corticosteroid treatment, differences in virus detection methods (i.e., PCR, ELISA, culture) and the variety of respiratory viruses that cause asthma exacerbations (20). Recent trials that studied exacerbation rates in well characterized steroid-resistant eosinophilic subjects with asthma treated with mepolizumab, a monoclonal antibody against IL-5, found no difference in the incidence of respiratory tract infections (4, 5). However, airway infections were rare events, and were diagnosed clinically without objective evidence of the presence of an infecting virus. Furthermore, these trials did not quantify airway and lung parenchymal eosinophils, nor did they characterize the eosinophils’ activation state after treatment. Nonetheless, future studies that define the interaction between eosinophils and viruses may lead to novel treatment targets for eosinophilic asthma and for respiratory virus infections in humans.

The results of our study paradoxically suggest that eosinophils have beneficial antiviral effects during respiratory virus infections despite considerable evidence linking viruses to asthma exacerbations (20, 21). However, we cannot conclude that eosinophils’ antiviral effects result in fewer exacerbations. On the contrary, it is possible, and perhaps likely, that eosinophils’ ability to detect and respond to viruses promotes an exuberant, and ultimately detrimental, airway inflammatory response in subjects with asthma. Although our study did not specifically address airway physiology, Adamko and colleagues (14) found that eosinophils mediate virus-induced airway hyperreactivity in sensitized guinea pigs, and were associated with lower viral titers, yet lower viral titers did not improve airway hyperreactivity. Thus, the negative effects of activated eosinophils’ in the airway may mask any positive impact from fewer viral transcripts. Consequently, as therapies become progressively more targeted against pulmonary eosinophils, there will be an even greater need for understanding the complexity of eosinophil biology in the lungs.


Advantages & Limitations of scRNA-Seq Assays

scRNA-Seq is a very powerful method that allows transcriptomic analysis of heterogeneous tissue, or dynamic processes in one single experiment. Without microdissection or FACS-sorting, samples can be directly prepared for the scRNA-Seq protocol. Depending on the number of cells and the sequencing depth, scRNA-Seq can be very sensitive and detect a population representing less than 1% of the total population.

Because of the quantity of information generated by scRNA-Seq, some of the protocol steps have to be handled with care. The preparation of the single-cell solution can be challenging especially for tissues or cells surrounded by an extracellular matrix. The protocols used to isolate these cells can by themselves modify the transcriptome and the sequencing data could be the result of these manipulations instead of an endogenous cellular process. In contrast, for bulk RNA-Seq, tissues can be directly lysed in trizol, freezing the transcriptome at the very first step of the extraction. scRNA-Seq identifies fewer transcripts than bulk RNA-Seq and this imperfect coverage can lead to a biased quantification. However, this flaw can be corrected by bioinformatic analysis. Finally, most scRNA-Seq protocols only focus on poly-A RNAs, which excludes all non-coding RNAs.

scRNA-Seq is more expensive and more time-consuming than bulk RNA-Seq but in one experiment, you obtain the transcriptome profile of several populations.


Pulmonary Adenocarcinoma—Pathology and Molecular Testing

Prodipto Pal MD, PhD , . Ming-Sound Tsao MD, FRCPC , in Pulmonary Adenocarcinoma: Approaches to Treatment , 2019

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) is feasible in clinical laboratories, however, with its own set of challenges. As noted earlier, ALK rearrangement has many different candidate fusion partners, even for the ALK-EML4, the most common fusion in NSCLC, there are many fusion variants, largely due to different breakpoint regions on EML4, thus would require a multiplexed approach. However, with RT-PCR-based methods, a priori knowledge of the candidate fusion genes is needed to identify fusion variants which can later be confirmed by subsequent sequencing 101 and has been used in studies with high level of sensitivity albeit with varying level of specificity (85%–100%) compared with FISH. 102,103 A negative result by RT-PCR requires appropriate caution due to the potential of false-negative results due to the missing unknown fusion variants. In addition, RT-PCR assays are dependent on procuring high-quality RNA from FFPE tissue. Newer RNA-based assays are under active development (assays such as NanoString system) that can simultaneously detect various fusion partners as well as offer the added advantage of detecting other driver fusion-type alterations in a multiplexed setup (such as ROS1, RET, etc.). 104–106


Conclusiones

In summary, we described an alternative method using Real-Time RT-PCR to determine the rate of mRNA degradation by accurately measuring the number of mRNA molecules relative to total RNA. Using this approach, we obtained a values for the β-actin mRNA half-life in Nalm-6 cells that are comparable to those estimated from Northern blot studies using normal human leukocytes [13]. Therefore, Real-Time RT-PCR is a reliable method for measuring mRNA half-life. Because of its sensitivity, half-life of mRNAs expressed at very low level can be determined in cases in which Northern blots may not be sensitive enough. The length of the amplified fragment is important to determine the mRNA half-life because incomplete or degraded mRNA can interfere with the measurement of the actual mRNA half-life. Ideally, full-length cDNA molecules should be amplified to ensure integrity and identity of the mRNA species. The use of the fluorogenic SYBR Green I dye limits the length of the amplified product (cDNA recommended to be less than 200 bp). However, the use of TaqMan ® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), molecular beacons (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA), or fluorescence resonance energy transfer (FRET) probes (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) could overcome this limitation and allow amplification of longer PCR products. In addition, since multiplex Real-Time RT-PCR can be achieved in the same reaction tube using different fluorogenic dyes, this method could be modified to simultaneously estimate mRNA half-life of several genes. Thus, our approach represents a rapid and sensitive assay to determine mRNA half-life.


Sars-CoV-2 RNA on surfaces poor indicator of quantity, timing of previous contamination

Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Transmission electron micrograph of SARS-CoV-2 virus particles, isolated from a patient. Image captured and color-enhanced at the NIAID Integrated Research Facility (IRF) in Fort Detrick, Maryland. Credit: National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH

A team of UK investigators has shown that RNA copies recovered from surfaces are a poor indicator for determining the numbers of viable SARS-CoV-2 virus particles.

The research, published in Applied and Environmental Microbiology, a publication of the American Society for Microbiology, found that a common UK isolate of SARS-CoV-2 that may have initially contaminated surfaces in the general environment became undetectable within 48 hours. The isolate of SARS-CoV-2 remained viable for more than twice as long on hydrophobic surfaces as on hydrophilic surfaces.

The materials tested in the study were representative of those in personal protective equipment, as well as high hand-touch sites such as stainless steel.

An impediment to determining how long SARS-CoV-2 remains viable on different surfaces has been that in most cases, viable virus that has landed on surfaces is rarely detected, according to corresponding author Thomas Pottage, BSc, Senior Project Leader—Biosafety and Bioresponse, Public Health England, Porton Down, UK. However, many studies have used reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) successfully to detect viral RNA and use this as an indicator of how much of the virus was previously found on the surface.

Therefore, the investigators first sought to determine the relationship between initial quantities of viable virus, and subsequent RNA copy number on a contaminated surface, hoping that the latter could serve as a surrogate for the former. To test this, they contaminated surfaces of interest with artificially high concentrations of the virus in the laboratory. But there was no clear relationship between the numbers of RNA copies recovered over time to the number of viable virus particles in the initial inoculum. The investigators did observe that the numbers of virus particles decreased quite rapidly.

The relationship in levels of RNA and viable SARS-CoV-2 shows that in previous surface sampling studies where SARS-CoV-2 RNA was recovered, there were likely low concentrations of viable virus on those surfaces at the time of contamination, according to Pottage.

"This study estimates that the SARS-CoV-2 would survive less than two days on surfaces under normal environmental concentrations," said Pottage.

Conversely, artificially high concentrations of SARS-CoV-2 that were deliberately deposited on surgical mask material and stainless steel in a laboratory setting resulted in relatively lengthy persistence, with 99.9% reductions in viable virus taking place over 122 and 114 hours, respectively. Viability dropped the fastest on a polyester shirt, with a 99.9% reduction occurring over 2.5 hours.

"Our results show that the porous but hydrophobic surfaces of the surgical mask and Tyvek coverall produce similar decay rates when compared to the non-porous hydrophobic surfaces of stainless steel," with a reduction in numbers of virus particles of 99.999% over seven days, said the authors. Viable SARS-CoV-2 was recovered from these surface materials over longer periods of time compared to the porous, hydrophilic surfaces tested, cotton and woven polyester.


Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods

Small noncoding RNAs perform multiple regulatory functions in cells, and their exogenous mimics are widely used in research and experimental therapies to interfere with target gene expression. MicroRNAs (miRNAs) are the most thoroughly investigated representatives of the small RNA family, which includes short interfering RNAs (siRNAs), PIWI-associated RNA (piRNAs), and others. Numerous methods have been adopted for the detection and characterization of small RNAs, which is challenging due to their short length and low level of expression. These include molecular biology methods such as real-time RT-PCR, northern blotting, hybridization to microarrays, cloning and sequencing, as well as single cell miRNA detection by microscopy with in situ hybridization (ISH). In this review, we focus on the ISH method, including its fluorescent version (FISH), and we present recent methodological advances that facilitated its successful adaptation for small RNA detection. We discuss relevant technical aspects as well as the advantages and limitations of ISH. We also refer to numerous applications of small RNA ISH in basic research and molecular diagnostics.

Palabras clave: LNA probe PLA Piwi-interacting RNA TIRCA enzyme-labeled fluorescence signal amplification padlock probes rolling circle amplification short interfering RNA tyramide signal amplification.

Cifras

Types of nucleotide modifications used…

Types of nucleotide modifications used in small RNA ISH probes. ( A )…

Sequence amplification and detection methods…

Sequence amplification and detection methods for small RNA ISH include ( A )…

Sequence amplification and detection methods…

Sequence amplification and detection methods for small RNA ISH include ( A )…


Ver el vídeo: RT-PCR Test Procedure Explained. RT-PCR Machine Working. How Virus attacks. RNA vs DNA. Malayalam (Mayo 2022).