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Cebado de VPg de la replicación de virus de ARN

Cebado de VPg de la replicación de virus de ARN


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Estoy haciendo una presentación sobre la replicación de SARS-CoV-2 para mi clase de química, y descubrí que para replicar su ARN, el virus usa ARN polimerasa dependiente de ARN, que está preparada por un cebador VPg. Dado que la presentación es para una clase de química, no una clase de biología molecular, me gustaría conocer la química detrás de la forma en que funcionan los cebadores.

Intenté buscar la información en Internet, pero no pude encontrar la información que necesito.


Aunque esta pregunta probablemente debería descartarse fuera de tema como tarea no investigada, me imagino que no todos los lectores estarán familiarizados con el cebador VPg para la replicación del ARN viral. Por lo tanto, sugeriré algunos de los aspectos químicos de este proceso que podrían incluirse en una presentación y comentaré sobre el proceso en sí.

Algunas características químicas de la replicación del ARN viral cebado con VPg

  1. La reacción química. Esto no es diferente de muchas otras reacciones que involucran una ARN polimerasa. Implica la reacción de un NTP con el 3'OH de la ribosa en una cadena de ARN en crecimiento, formando un enlace fosfodiéster, extendiendo así la cadena. La cadena de ARN en crecimiento se denomina cebador porque se requiere para iniciar la adición en muchos casos; sin embargo, en el caso de muchos virus de ARN monocatenarios, el inicio real de una nueva cadena utiliza un cebador compuesto por un péptido pequeño al que se U se han adherido residuos. Generalmente se presentan diagramas simples de este proceso para la ADN polimerasa dependiente de ADN y se pueden encontrar en textos estándar, p. Iceberg et al. Figura 5.22

  2. El mecanismo de reacción. Esta reacción es catalizada por una enzima que participa en la reacción. El mecanismo de catálisis se resume en la instalación de EBI (donde se pueden encontrar diagramas) como:

Las ARN polimerasas catalizan el ataque nucleofílico de un nucleósido 5'-trifosfato unido por el 3'-hidroxilo de un cebador de ARN, lo que da como resultado la incorporación de un nucleósido monofosfato en el ARN y la liberación de pirofosfato. Se cree que esto ocurre usando catálisis de dos metales. En la ARN polimerasa II, dos iones de magnesio están coordinados por cuatro aspartatos (3'OH del ARN también propuesto para coordinarse débilmente con Mg2+A). Mg2+Se propone una reducción de la pKa alrededor del hidroxilo atacante mientras que el Mg2+B está ahí para estabilizar las cargas negativas durante el estado de transición ...

  1. La termodinámica de la reacción.. La ruptura de un enlace fosfodiéster y la formación de otro significa que la reacción está más o menos en equilibrio (sin cambios en la energía libre de Gibbs). Una razón por la que se cree que no se invierte es porque el pirofosfato producido se hidroliza en la célula a ortofosfato, que es irreversible ya que el cambio de energía libre en esta reacción se pierde en forma de calor.

  2. Enlace de hidrógeno a la plantilla. La reacción implica copiar una hebra molde, y la base de esta especificidad es el enlace de hidrógeno de Watson-Crick entre la base molde y el NTP entrante. Sin embargo, específicamente para el cebador VPg, existe un enlace de hidrógeno de los dos residuos U al final de la hebra molde. (Los diagramas de enlaces de hidrógeno AU deberían ser fáciles de encontrar).

  3. El enlace químico del cebador VPgUU. Los residuos de ácido uridílico se añaden al péptido VPg en el grupo hidroxilo de un residuo de tirosina en una reacción que es catalizada por la ARN polimerasa viral. Vale la pena señalar que aunque muchos residuos de aminoácidos de proteínas son químicamente inertes, los hidroxiaminoácidos tienen potencial reactivo, más notablemente al estar fosforilados.

Un punto de reflexión más amplio

Una pregunta que esto plantea es por qué la necesidad de una proteína, VPg, como complemento de un cebador de ácido nucleico. Leer más sobre el tema revelará que esta proteína realmente interactúa con diferentes partes del ARN viral en el curso de la adquisición de los residuos de uridilato y la selección del AA donde debe unirse. Las interacciones químicas con el ARN y otras proteínas aquí son las interacciones débiles no covalentes (enlaces de hidrógeno, interacciones de van der Walls y algunas interacciones iónicas) que son típicas de las proteínas. En lugar de que su debilidad sea una razón para considerarlos sin importancia, tales interacciones son cruciales para la química de la vida porque su misma debilidad significa que pueden estar tanto roto como hecho. Las interacciones son reversibles, lo que lleva a la muy propiedad dinámica que tipifica la vida. Merecen la atención de un químico.


La síntesis de ácidos nucleicos puede ocurrir de dos formas, con una plantilla o sin ella. En la mayoría de los sistemas biológicos, la síntesis de la plantilla es la que se produce, ya que es la única forma de replicar la información genómica. Para la síntesis de ácido nucleico basada en plantillas en sistemas biológicos (ya sea de ADN o ARN), las enzimas que realizan las reacciones pueden usar material monocatenario (en el caso del virus ssDNA o ssRNA virus), sin embargo, todavía necesitan una pequeña región de ácido nucleico bicatenario para se unen y comienzan a polimerizar; de lo contrario, la síntesis podría comenzar en cualquier lugar de la hebra molde que no sería particularmente útil, por lo tanto, los cebadores, las polimerasas se unen a la región bicatenaria y comienzan a polimerizar siempre agregando nuevos nucleótidos al extremo 3 'de la hebra del cebador que son complementarios al nucleótido en la hebra molde. Por lo general, en las células vivas, la síntesis de nuevas moléculas de ARN no se producirá con una plantilla de ARN (generalmente no hay ARN polimerasa dependiente de ARN, hay excepciones, pero generalmente son el resultado de infecciones virales previas), pero solo con una plantilla de ADN para procesar. ARN mensajero / de transferencia / ribosómico. En el caso de COVID y otros virus de ARN de cadena +, el virus tiene que codificar la ARN polimerasa y también producir un cebador que creará una región de doble cadena que permitirá que se produzca la síntesis de ARN.


Complejos de replicación de virus de ARN

Derechos de autor: © 2010 Tao, Ye. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de Atribución Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se acredite el autor y la fuente originales.

Fondos: Los autores no recibieron financiación específica para este manuscrito.

Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.

La mayoría de los virus que infectan a animales y plantas en la actualidad son virus de ARN [1]. Existen virus de ARN bicatenario (ds) con genomas de ARNdc, así como virus ARN (+) y (-) cuyos genomas son ARN monocatenario (ss) de polaridad positiva o negativa. Los virus de ARN tienen genomas pequeños que rara vez superan los 30 kb de tamaño, y una gran parte de sus genomas se usa para codificar proteínas involucradas en la replicación del ARN viral. La síntesis de ARN viral es catalizada por la ARN polimerasa dependiente de ARN codificada por virus (RdRp), que carece de actividad de corrección de pruebas. Aunque los detalles de la replicación del ARN varían mucho entre los virus, existen claramente principios comunes en la organización de la maquinaria de replicación de diferentes virus ARN.


Por qué se ha estudiado la replicación del poliovirus durante más de 50 años

El poliovirus es el agente etiológico de la poliomielitis, una parálisis flácida aguda que afecta al 1-2% de los pacientes infectados y, en raras ocasiones, provoca la muerte por paralización de los músculos que controlan la garganta o la respiración. Una característica sorprendente de la infección son las discapacidades de por vida que pueden afectar a los supervivientes de la enfermedad aguda. Transmitido por vía fecal-oral y oral-oral, este virus (tres serotipos) fue uno de los patógenos más temidos en los países industrializados durante el siglo XX, afectando a cientos de miles de niños cada año, a través de brotes durante los cálidos meses de verano. Si bien existen vacunas de gran eficacia para controlar la poliomielitis, sigue siendo endémica en unos pocos países, desde los cuales continúan propagándose y produciéndose brotes en todo el mundo. Desde su descubrimiento en 1908, el poliovirus se ha estudiado intensamente para comprender y controlar mejor este formidable patógeno. Sin embargo, la historia del poliovirus no se limita a la lucha contra la enfermedad. Los estudios de replicación de poliovirus también han desempeñado un papel importante en el desarrollo de la virología moderna, ya que los poliovirólogos y, de manera más general, los picornavirólogos han sido pioneros en muchos dominios de la virología molecular. El poliovirus fue, por ejemplo, el primer virus de ARN animal en el que se determinó la secuencia completa del genoma, el primer virus animal de ARN para el que se construyó un clon infeccioso y, junto con el rinovirus relacionado, el primer virus humano que tuvo su secuencia tridimensional. estructura resuelta por cristalografía de rayos X. De hecho, la historia de más de medio siglo de estudios de replicación de poliovirus está marcada por importantes descubrimientos, muchos de los cuales se resumen aquí y se ilustran en la Figura 1.

Abreviaturas y símbolos: 3D, proteínas receptoras tridimensionales (cilindros grises que abarcan la membrana plasmática) ARN, ácido ribonucleico VPg, proteína viral, ribosomas ligados al genoma (óvalo rojo) (formas ovaladas azules medianas unidas al ARN viral) + cadena de ARN, positivo -ARN genómico de sentido (línea azul horizontal u ondulada) - ARN de hebra, ARN antigenómico de sentido negativo (línea roja horizontal u ondulada) pol 3D, ARN polimerasa dependiente de ARN viral (formas rosadas) vesículas membranosas (formas ovaladas azul claro) Nups, nucleoporinas (naranjas, formas ovaladas oblongas).


Introducción

El norovirus humano (HuNV) es actualmente una de las principales causas de gastroenteritis aguda en adultos y se prevé que se convierta en la causa predominante de diarrea en todos los grupos de edad en todo el mundo (Patel et al., 2008 Bok y Green, 2012). La HuNV puede establecer una infección crónica y pone en peligro la vida de los pacientes inmunodeprimidos (Bok y Green, 2012). Sin embargo, todavía no se dispone de ninguna vacuna o antiviral eficaz contra el virus HuNV, principalmente debido a la falta de una vacuna eficaz. in vitro y en vivo sistema de infección de HuNV. Los desarrollos recientes de líneas de células B inmortalizadas, el sistema organoide derivado de células madre y ratones deficientes en BALB / c Rag - & # x03B3c para la infección por HuNV proporcionan nuevos modelos para estudiar HuNV (Taube et al., 2013 Jones et al. , 2014 Ettayebi et al., 2016). Desde su aislamiento de ratones inmunodeprimidos (Wobus et al., 2004), el NoV murino (MNV) ha servido como un modelo sustituto eficaz (Karst et al., 2003 Wobus et al., 2006) para dilucidar el mecanismo molecular de la replicación del NoV. y patogenia.

El norovirus (NoV) es un virus de ARN (+ ARN) monocatenario de sentido positivo que pertenece al Caliciviridae familia. El genoma de ARN & # x223C7.6 kb + de NoV contiene tres marcos de lectura abiertos (ORF) (Hardy, 2005), con un ORF4 adicional para MNV (McFadden et al., 2011). ORF1 codifica una poliproteína que se escinde en proteínas no estructurales, incluida la proteína de virión ligada al genoma (VPg) y la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) (Sosnovtsev et al., 2006). RdRp amplifica el genoma viral utilizando trifosfatos de ribonucleótidos (rNTP) como sustratos en baja fidelidad debido a la falta de un mecanismo de corrección de pruebas eficaz. El inicio de la síntesis de ARN por RdRp en una plantilla de ARN puede ser dependiente o independiente del cebador en Caliciviridae, Picornaviridae, y Potyviridae (Green, 2007 Goodfellow, 2011 Jiang y Laliberte, 2011). En el primer caso, VPg sirve como cebador para estos virus, proporcionando grupos hidroxilo libres de un residuo de tirosina o serina. El VPg unido covalentemente al extremo 5 & # x2032 de los ARN virales juega un papel crucial en la traducción de proteínas virales y la replicación del genoma (Burroughs y Brown, 1978 Herbert et al., 1997 Goodfellow, 2011 Jiang y Laliberte, 2011).

VPg es una proteína similar a un glóbulo fundido intrínsecamente desordenada con múltiples funciones. Es muy diverso en secuencia y tamaño, oscilando entre 2 y 90 kDa, de los cuales el mayor pertenece a Birnaviridae que posee ARNds bisegmentados con su RdRp enlazado como VPg (Calvert et al., 1991). El ARN genómico del calicivirus felino, miembro de Caliciviridae, no es infeccioso después de la escisión proteolítica de la VPg (Herbert et al., 1997). Se demostró que VPg se une a su RdRp afín en enterovirus71 (EV71), virus de la fiebre aftosa (FMDV) y coxsackievirus (CV) (Ferrer-Orta et al., 2006 Gruez et al., 2008 Chen et al., 2013 ), con el que la VPg de los calivirus no comparte homología de secuencia. Aún no se dispone de una estructura del complejo caliciviral RdRp-VPg y se desconoce el papel de la interacción RdRp & # x2013VPg en la replicación de NoV.

En este estudio, caracterizamos algunas propiedades bioquímicas y biofísicas del complejo MNV RdRp-VPg (1-73). El MNV VPg indujo la formación de multímeros de orden superior o fibrillas tubulares de RdRp y aumentó la actividad de RdRp. La replicación de mutantes de MNV con RdRps defectuosos de unión a VPg se bloqueó completamente en un sistema de cultivo celular. Además, la estructura cristalina del complejo proporcionó la evidencia de que la interacción entre VPg y RdRp juega un papel crucial en la replicación de NoV a través de la formación de multímeros de orden superior de las moléculas de RdRp.


Resultados

Caracterización de construcciones derivadas de ORF de TaV

El TaV ORF1 de longitud completa (140 kDa) fusionado a una cola N-terminal que contiene una etiqueta de hexa-histidina (TaV rORF1 Fig 1A) se expresó en células de insecto Hi5 infectadas con un baculovirus recombinante, rBV-TaV ORF1. Después de la expresión, la proteína recombinante se escindió rápidamente liberando un fragmento de proteína de 75 kDa (Fig. 1B) [13]. La espectrometría de masas (MALDI-TOF / TOF) mostró que este polipéptido alberga los primeros 674 residuos de la proteína recombinante, incluido el dominio RdRP completo (TaVpol de aquí en la Fig. 1A). El paso de purificación final, cromatografía de exclusión por tamaño, mostró que TaVpol es un dímero en solución (Fig. 1C). Esta construcción se utilizó tanto para análisis cristalográficos como para caracterización funcional de la actividad RdRP. Además, otras construcciones de proteínas, que albergan mutaciones en los motivos del sitio activo C TaVpol(D351A / D352A) y B TaVpol(T443A / T444A) y en los dos sitios de nucleotidilación putativos, TaVpol(S4A) y TaVpol(T157A), o deleciones en el extremo N- y / o C-terminal de la proteína, TaV rORF1 (Δ27), TaVpol(Δ27-Δ657) y TaVpol(Δ611-617), también se expresaron y purificaron (Fig. 1A). Es importante señalar que el gen mutante TaV rORF1 (Δ27) dio como resultado una variante de proteína que no sufre una degradación proteolítica significativa en células de insectos, lo que permite la purificación del polipéptido completo (Fig. 1B). Sorprendentemente, esta proteína parece ser un monómero en solución según se determina mediante cromatografía analítica de exclusión por tamaño (Fig. 1C). La versión truncada TaVpol(Δ27-Δ657) también es un monómero (Fig. 1C). Se obtuvo una pequeña cantidad de TaV rORF1 de longitud completa purificada y se usó en ensayos de actividad posteriores.

(A) La caricatura representa esquemáticamente las construcciones de proteínas utilizadas en este informe. La línea roja indica el fragmento cristalizado que contiene el dominio RdRP (TaVpol). La etiqueta de polihistidina, ubicada en el extremo N de cada proteína recombinante, se indica en la parte superior. Las posiciones de los aminoácidos sustituidos en las versiones de proteínas mutantes se indican como "*". (B) SDS-PAGE teñido con azul de Comassie correspondiente a TaV purificadopol y construcciones TaV rORF1 (Δ27). El carril M corresponde a marcadores de masa molecular (kDa). (C) Cromatografía analítica en una columna Superdex 200 5/150 calibrada de TaV purificadopol (azul), TaV rORF1 (Δ27) (rojo) y TaVpol(Δ27-Δ657) (verde).

In vitro actividad polimerasa de TaV rORF1 y TaVpol

los in vitro Actividades de síntesis de ARN del TaV rORF1 de longitud completa y su dominio RdRP TaVpol se analizaron por primera vez utilizando una plantilla de ssRNA derivada de la región 3 'no traducida (UTR) del genoma de TaV [4], lo que demuestra que ambas construcciones son capaces de sintetizar dsRNA a partir de una plantilla de ssRNA en ausencia de un cebador, en una reacción dependiente de Mg 2+ como ion catalítico (Fig 2). La actividad RdRP de TaVpol también se probó en presencia de un cebador de ARN corto (8 nts) complementario a una secuencia interna de TaV 3'-UTR, que muestra niveles equivalentes de síntesis de ARN (Fig 2A). Además, el uso de plantillas de ssRNA de secuencias totalmente heterólogas (como la 3'-UTR de un genoma de nodavirus Fig 2A) indica que, al menos in vitro, la enzima TaV no requiere secuencias de molde específicas o estructuras secundarias para la polimerización. También se observó actividad de polimerización de ARN en moldes de ARN cortos (de 6 a 25 nucleótidos) que albergan secuencias derivadas de TaV 3'-UTR o no relacionadas (Fig 2B). Estos datos ilustran que, aunque TaVpol es capaz de llevar a cabo de novo La síntesis de ARN en pequeñas plantillas no específicas, la presencia de una guanina en el extremo 3 'de la plantilla parece ser necesaria para iniciar la reacción.

Autorradiogramas representativos de in vitro Ensayos de actividad TaV RdRP analizados en geles TBE de acrilamida al 7%. (A) Panel izquierdo, primer carril, plantilla de ssRNA etiquetada con α-32 P GTP segunda y tercera líneas, actividades RdRP de TaV rORF1 y TaVpol, respectivamente, utilizando la plantilla de ssRNA de 311 nts de longitud previamente no etiquetada correspondiente a la TaV 3'-UTR. Panel derecho, actividad de polimerización de TaVpol realizado en: i) ausencia de molde (primer carril), ii) presencia del molde TaV 3'-UTR (segundo carril), iii) presencia de TaV 3'-UTR hibridado con un cebador oligonucleotídico corto complementario a un molde interno secuencia (tercer carril) y, iv) presencia de un molde viral no relacionado (el 3'-UTR del cuarto carril del nodavirus SJNNV). (B) Actividad de polimerización de TaVpol en plantillas cortas de ssRNA. Los oligonucleótidos de 6, 12 y 16 nts de longitud (izquierda) se derivan de TaV 3'-UTR y los de 13 y 25 nts de longitud (derecha) contienen secuencias no relacionadas con TaV. El control negativo (-) se realizó en ausencia de ARN. (C) Se emplearon diferentes iones (Mg 2+, Mn 2+, Zn 2+, Co 2+, Ca 2+) y concentraciones que iban de 1 a 25 mM en experimentos de polimerización realizados en condiciones óptimas (ver Métodos y S1 Fig. ). Se realizó un control negativo (-) utilizando una mezcla de reacción que carecía de iones metálicos.

Como el resto de polimerasas conocidas, la actividad RdRP de TaVpol depende estrictamente de iones metálicos como Mg 2+ y Mn 2+ (Fig. 1C). Como se describió antes [14-16], el cofactor Mn +2 mejora fuertemente la síntesis de ARN. En contraste con lo que se observó para el RdRP de IBDV no canónico [17], solo se observó actividad residual en presencia de Co 2+ 1 mM (Fig. 1C). Además, la sustitución de Mg 2+ o Mn 2+ por otros cationes divalentes, es decir,Ca 2+ o Zn 2+, ejerce un claro efecto inhibidor sobre la síntesis de ARN (Fig. 1C). El análisis de la cinética de polimerización realizado en condiciones óptimas para esta enzima (RdRP 1,3 mM en MES 50 mM pH 6, NaCl 150 mM y MgCl 5 mM2 a 35 ° C S1 Fig) muestra un perfil sigmoide con un paso inicial de síntesis de ARN baja y un estado final de saturación (S2 Fig).

La estructura de TaVpol

La estructura de TaVpol se resolvió mediante métodos SAD a partir de cocristales derivados de Lu 3+ a una resolución de 3,0 Å (Tabla 1) [13]. A continuación, se utilizaron datos nativos para completar y refinar el modelo a una resolución final de 2,15 Å (Tabla 1). La unidad asimétrica de cristal comprende un dímero de polimerasa muy compacto que contiene 1.326 residuos: de P10 a K672 de la molécula A y de P10 a E674 de la molécula B. Los monómeros A y B son casi idénticos, con una desviación rms de 0,27 Å para la superposición de todos residuos. Cada monómero consta de un núcleo de RdRP globular (residuos 41 a 648) y dos brazos terminales (residuos 10 a 40 y 649 a 674) que se extienden fuera del núcleo y participan en una serie de interacciones intermoleculares que estabilizan la estructura dimérica (Fig. 3). El núcleo RdRP adopta la arquitectura clásica cerrada de "mano derecha" que consta de dedos (hélices α3-α13 y α15-α16 aminoácidos 41-303 y 375-443), palma (α14, β6-β8 304-374 y α17-α18 , β9-β10 444-519) y subdominios del pulgar (α19-α24 520-649), rodeando los siete motivos conservados (A a G) que se requieren para el reconocimiento del sustrato y la catálisis (Fig. 4A). Como se esperaba de las predicciones bioinformáticas anteriores [3, 4], las comparaciones estructurales utilizando Dali [18] muestran similitudes importantes entre TaVpol y polimerasas de birnavirus. Los aciertos más altos se obtuvieron con los RdRP de IPNV (PDB id 2YIB) e IBDV (PDB id 2QJ1) que mostraron puntuaciones Z de 25,4 y 21,9 y desviaciones r.m.s de 3,1 y 2,9 Å para la superposición de 523 y 524 residuos, respectivamente. Además, también se observaron semejanzas inesperadas y sorprendentes cuando el TaV generalpol La arquitectura se comparó con las de diferentes miembros de la Flaviviridae familia, con puntuaciones Z de 16,1 (identificación de PDB del virus de la encefalitis japonesa 4K6M), 13,8 (identificación de PDB DV 4V0R) y 13,8 (identificación de PDB del VHC 2XIZ) con desviaciones rms de 3,3, 3,3 y 3,4 Å para la superposición de 448, 444 y 330 residuos, respectivamente. Se obtuvieron resultados similares cuando se superpusieron los subdominios individuales (Fig. S3).

(A) Las dos moléculas de la unidad asimétrica cristalina se muestran como cintas en azul y trigo, respectivamente. Los aminoácidos en los extremos N- y C-terminales mantienen la estructura dimérica de la enzima. El recuadro inferior muestra in vitro ensayos de polimerización que evidencian que la deleción de los primeros 27 residuos de aminoácidos N-terminales potencia la actividad enzimática. (B) Primer plano de las interacciones establecidas entre el extremo N-terminal de la molécula B (azul) con la cavidad central de la molécula A (trigo). Los primeros nueve residuos de proteínas están desordenados y no son visibles en la densidad de electrones. El primer residuo visible, P10, se encuentra a 18 Å del sitio activo. (C) Primer plano de las interacciones establecidas entre el extremo C-terminal de la molécula B con el dominio de los dedos de la molécula A. En los paneles B y C, las cadenas laterales de los residuos implicados en las interacciones intermoleculares se representan como barras y se etiquetan explícitamente. Debido a la presencia de la simetría no cristalográfica (ncs), las interacciones de la díada entre los extremos N y C de la molécula A con la molécula B y las de los extremos N y C de la molécula B con la molécula A son idénticas.

(A) Diagrama de cinta de la enzima TaV que muestra la típica arquitectura cerrada de la mano derecha que rodea los siete motivos de secuencia conservados (A, rojo B, verde C, naranja D, violeta E, amarillo F, cian G, rosa). Los elementos estructurales secundarios así como los extremos N- y C-terminales de la enzima están marcados. El bucle largo λ6 que ocluye parcialmente la cavidad central de la enzima se resalta en azul oscuro. Los dos residuos de ácido aspártico del motivo C (D351 y D352) y el motivo A (D369 y D374) se muestran como barras. El esquema (panel inferior) muestra la organización permutada del dominio de la palma TaV. (B) Primer plano del bucle λ6 con las dos cadenas laterales aromáticas, Y611 y F613, mostradas como palos y etiquetadas. Las estructuras de los bucles equivalentes en dos miembros distintos del Flaviridae familia, HCV (verde) y DV (naranja) se superponen. El residuo de unión del cebador del VHC Y448, responsable de la interacción con el primer nucleótido añadido a la cadena de ARN recién sintetizada [19], se encuentra cerca de F613 en TaV y de H798 en DV. (C) Autorradiografías de in vitro La actividad de TaV RdRP, analizada en geles de TBE de acrilamida al 7%, muestra que las mutaciones en los residuos del motivo C D351 y D352 anulan la síntesis de ARN (arriba) y que la eliminación de la punta de λ6 (residuos 611-617) mejora la polimerización del ARN (abajo).

La señal de VPg putativa (residuos 153-165) se encuentra en el dedo índice (nomenclatura PV [20]), cubriendo la conexión α5-α6 y el extremo N-terminal α6 (Fig. 4A). La estructura de este motivo parece estar estrechamente relacionada con su homólogo birnavirus (Fig. 5A) [9-11]. Aguas arriba de este motivo, tres hélices (α3-α5) también contribuyen a que el dedo índice cruce el subdominio de la palma para interactuar con el pulgar y cerrar la estructura de la mano derecha (Fig. S4). Finalmente, α3 está unido por un bucle largo a las hélices N-terminales α2 y α1 que se extienden fuera del núcleo de la polimerasa. Se observan grandes diferencias estructurales en esta región N-terminal cuando se comparan birnavirus y permutatetravirus (Fig. 5A). Se analizó la actividad de autonucleotidilación de la enzima TaV. in vitro usando ambos TaVpol y construcciones de rORF1 de TaV en presencia de la plantilla de ssRNA derivada de TaV descrita anteriormente. Autonucleotidilación de TaVpol no se ha detectado (Fig. 5B). Además, TaVpol(T157A) y TaVpol(S4A), donde los residuos de nucleotidilación pronosticados [4, 11] fueron reemplazados por alanina, mantienen niveles de síntesis de ARN similares a los detectados con la enzima de tipo salvaje en in vitro ensayos de polimerización (Fig. S5). Solo el TaV rORF1 de longitud completa retiene la señal radiactiva α-32 P GTP (Fig. 5B). Aunque se requieren más experimentos para mapear con precisión el sitio de guanilación, esta observación indica que el extremo C-terminal de ORF1 de TaV es esencial para la autonucleotidilación.

(A) Superposición estructural del extremo N-terminal de la polimerasa TaV (oro) con los residuos equivalentes en el RdRP de IBDV (verde). Los residuos estrictamente conservados dentro de la firma VPg se muestran como barras y etiquetados. (B) Autorradiografía de in vitro actividades de autoguanilación de TaVpol y TaV rORF1 analizó SDS-PAGE al 11% (arriba). Los geles también se tiñeron con azul de Coomassie para evaluar la carga de proteínas (abajo). La posición de los marcadores de masa molecular (M) se indica (kDa) en la parte inferior del gel.

La permutación C-A-B del TaVpol palm, con el motivo GDD (residuos 350-352), ubicado en la horquilla β6-β7, y los residuos del motivo A D369 y D374, que se encuentran al final de la cadena β8, son espacialmente compatibles con una organización canónica del sitio activo (Fig. 4A). Se encontraron arquitecturas de palma similares en las estructuras RdRP de los birnavirus [9-11].

El pulgar helicoidal de TaVpol es más grande que los dominios del pulgar de otros ssRNA RdRPs que se sabe que inician la replicación de una manera dependiente del cebador como picorna y calicivirus polimerasas [2,21]. Además, el TaVpol el pulgar posee un asa larga (residuos λ6 591-625), que sobresale hacia la cavidad central y que es estructuralmente equivalente a las asas de cebado de los flavivirus y el bacteriófago ϕ6 [21-24] (figura 4B). Las comparaciones estructurales muestran que el bucle λ6, que conecta las hélices α20 y α22, se origina en la misma parte del subdominio del pulgar que para los flavirus DV y West Nile Virus (WNV), pero es más grande y contiene dos elementos estructurales secundarios en su N-terminal: el corta α21- y una vuelta 310 η8-hélices (Fig. 4A y 4B). La posición de este elemento se estabiliza mediante interacciones establecidas entre diferentes residuos α21 que entran en contacto con la hélice α1 en el extremo N de la polimerasa y entre la punta del bucle (residuos 613-616) con los residuos 301-304 y 317-320 dentro de la hélice. α12 y el bucle α12-α13, respectivamente.

Para investigar más a fondo el papel del bucle λ6 en la actividad de TaV RdRP, generamos un mutante de deleción, TaVpol(Δ611-617), se espera que muestre un sitio activo abierto, sin la plataforma de cebado putativo que soporta el cebador rNTP durante de novo iniciación pero que, a su vez, puede favorecer la acomodación del dsRNA recién sintetizado durante el alargamiento. La actividad de elongación del ARN se probó luego usando la plantilla de ARN derivada de TaV 3'-UTR. El análisis de los productos de reacción en geles desnaturalizantes de poliacrilamida mostró un aumento de la actividad del TaVpol(Δ611-617) mutante en esta plantilla en comparación con la enzima original (Fig. 4C). También se observaron actividades aumentadas comparables después de deleciones similares dentro de los bucles de cebado equivalentes de RdRP de HCV y DV [25, 26]. Como la plantilla larga de ssRNA utilizada en estos ensayos es capaz de formar una bifurcación por complementariedad de bases que puede colocarse en la cavidad central de RdRP, los productos de elongación observados de este mutante se generarían mediante síntesis de RNA cebado por retroceso. Apoyando esta interpretación, el de novo La síntesis de ARN en moldes de oligonucleótidos cortos se suprime en el TaVpol(Δ611-617) mutante (Fig. S6).

Organización dimérica de TaVpol

Ambas moléculas de polimerasa en la unidad asimétrica se asocian en un eje molecular pseudoduplicado. La superficie de contacto entre estas dos moléculas, calculada mediante el programa PISA [27], muestra un área total de 6.038 Å 2 (

11% de su superficie total) y predice una energía estabilizadora de dímeros de ΔGdisgusto = 46,3 kcal / mol. La interfaz de la interacción involucra: (i) el extremo N-terminal de una molécula en contacto con la cavidad del sitio activo de la segunda polimerasa y (ii) el extremo C-terminal de una molécula en contacto con los dedos superiores de la segunda (Fig 3) .

Las interacciones mediadas por el extremo N de la polimerasa involucran la parte visible del extremo N-terminal (residuos 10-14) y la hélice α1 (residuos 15-29) que se extiende hacia la cavidad central de la molécula vecina (relacionada con la díada), contactando la hélice del dedo α8 (residuos 205-207) y el bucle α8-α9 (208-225). Las interacciones intermoleculares son principalmente enlaces de hidrógeno de la cadena principal, pero también incluyen un puente salino entre R37 y D101 (β3). El primer residuo visible en la densidad electrónica (P10) ocupa la base del canal de plantilla, aproximadamente en la posición esperada del primer nucleótido de plantilla, en estrecho contacto con los residuos 209-211 (Fig. 3B). Estos contactos involucran un total de 38 residuos, cubriendo una superficie de 2725 Å 2 con una energía ΔGdisgusto = 16,5 kcal / mol. Se han obtenido cristales equivalentes después de la escisión enzimática de la etiqueta de hexa-histidina N-terminal. Desafortunadamente, la estructura resultante no reveló información adicional sobre el posicionamiento de los primeros nueve residuos de proteínas.

Con el fin de explorar el papel funcional del N-terminal de la polimerasa en estrecho contacto con el canal molde de la enzima vecina, diseñamos un mutante TaV rORF1, TaV rORF1 (Δ27), que carece de los primeros 27 residuos N-terminales (Fig 1) . Sorprendentemente, TaV rORF1 (Δ27) no sufre la escisión en el polipéptido de 75 kDa observado en la proteína de longitud completa y, además, se organiza como un monómero en solución (Fig. 1C). Ensayos de polimerización realizados con este mutante así como con el TaVpolLa construcción (Δ27-Δ657) muestra que la eliminación de los primeros 27 residuos que previene la formación de dímeros también provoca un aumento significativo en la síntesis de ARN (Figs. 3A, recuadro inferior y S7).

El TaVpol El extremo C está formado por un brazo largo (residuos 649–674) que se extiende a lo largo de las hélices α8, α9 y α14 de los dedos en la superficie externa de la proteína (Fig. 3C). Las interacciones mediadas por el C-terminal incluyen 43 residuos, que forman una superficie de contacto de 3313 Å2, con un ΔGdisgusto = 17,2 kcal / mol.

TaVpol Los dímeros también se observaron mediante microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa (Fig. S8), lo que indica que la estructura del dímero, observada por primera vez en los cristales, es estable en solución y se mantiene incluso a concentraciones de proteína muy bajas.

Estructura de TaVpol en complejo con una plantilla de ssRNA y rNTP entrantes

TaVpolSe obtuvieron cocristales del complejo -ssRNA-rNTP después de la incubación de TaVpol con la plantilla de oligonucleótidos 5’-CCCAUUCGACUCCUG, ATP, CTP y MnCl2. Este complejo cristalizó en el grupo espacial I222 con un TaV.pol dímero en la unidad asimétrica. La estructura se resolvió mediante reemplazo molecular y se refinó a una resolución de 3,5 Å (Tabla 1). Las comparaciones estructurales entre enzimas no unidas y ssRNA-rNTP unidas revelaron dos cambios conformacionales significativos: (i) una rotación ∼7˚ de un monómero con respecto al otro en el dímero y (ii) un reordenamiento conformacional del extremo N de la polimerasa, resultando en una sutil apertura de la cavidad central que facilita la entrada de la plantilla (S9 Fig).

El análisis estructural de este complejo reveló la presencia de una densidad extra en el sitio activo de la polimerasa en una de las dos moléculas de la unidad asimétrica cristalina (Molécula B). Esta densidad se interpretó como la presencia de una molécula de ATP unida, con la base de ATP apilada estrechamente en los residuos Y611 y F613 del bucle λ6 y la fracción trifosfato ocupando el túnel de entrada de nucleótidos, en contacto con los residuos básicos R280, K278 del motivo F y K488. del motivo D (Fig. 6A y 6B).

(A) Ubicación de los dos sitios de unión para las moléculas de rNTP entrantes que se encuentran en las diferentes estructuras cristalinas. El motivo C está resaltado en naranja con los residuos catalíticos D351 y D352 mostrados como barras. (B) Primer plano de la molécula de ATP unida al TaVpol sitio activo con la base de adenina apilada firmemente sobre los residuos Y611 y F613 en el bucle de cebado λ6 (azul). El resto de ribosa interactúa con el residuo catalítico D351 del motivo C (naranja), y el trifosfato está involucrado en puentes salinos con K278 y R280 en el motivo de dedos F (cian) y K448 del motivo D. El mapa de densidad de electrones 2Fo-Fc alrededor la molécula de ATP se muestra en un contorno de 1σ (malla verde). (C) Sitio de unión inesperado para un nucleótido CTP en el dominio del pulgar de TaVpol. El mapa de densidad de electrones 2Fo-Fc (1σ) se muestra como una malla verde. Un pico fuerte adicional de densidad de electrones, que se encuentra cerca del sitio de unión de NTP, se interpretó por la presencia de un ion sulfato de la solución de cristalización. Este sulfato parece estrechamente unido a las cadenas laterales de tres residuos R.

Desafortunadamente, la densidad de electrones correspondiente a la plantilla de ssRNA era demasiado débil y discontinua para permitir la construcción de un modelo preciso. Sin embargo, se detectaron picos fuertes a lo largo del canal de plantilla de la polimerasa que correspondería a las fracciones de fosfato del oligonucleótido unido en una orientación similar a la de las plantillas derivadas de la superposición de complejos RdRP-ssRNA disponibles en la enzima TaV (Fig. S10). .

Además, también se observó un pico adicional de densidad de electrones en estrecho contacto con los residuos del motivo B T443 y T444, lejos de la trayectoria de la cadena de fosfodiéster de plantilla putativa (Fig. S10). El análisis de rayos X de un segundo TaVpolEl complejo -ssRNA indicó que esta densidad correspondería a la base de la plantilla en la posición 3 'que sobrepasa su sitio de unión predicho en frente del rNTP entrante, apareciendo apretado a estos residuos del motivo B. Desafortunadamente, sólo se pudo recopilar un conjunto de datos parcial de estos cristales (53,8% de completitud a 3,1 Å de resolución S10 Fig). El motivo B contiene una serie de residuos S / T estrictamente conservados en RdRP que están implicados en la unión de la plantilla y la translocación del dsRNA recién sintetizado [28-29]. El TaVpol-RNA complejo sugiere que estos restos del motivo B también podrían servir como un sitio de unión para la base terminal de la plantilla en una etapa de preiniciación. Para evaluar el papel de estos residuos conservados en la síntesis de ARN, T443 y T444 fueron sustituidos por Ala. Se analizó la actividad RdRP de la enzima mutante in vitro, mostrando que los reemplazos de T → A en las posiciones 443 y 444 de TaVpol abolir completamente la síntesis de ARN (Fig. S10).

Un sitio de unión de nucleótidos inusual en el dominio del pulgar de TaV RdRP

TaVpol-GTP y TaVpol-También se obtuvieron cocristales de CTP en presencia de MgCl2 y las estructuras correspondientes resueltas a una resolución de 2,3 Å y 2,25 Å, respectivamente (Tabla 1). En ambos casos, se observaron densidades de electrones claras para los restos de trifosfato que interactúan con residuos electropositivos en el túnel rNTP. Sin embargo, las partes de nucleósidos correspondientes estaban desordenadas. Además, estas estructuras revelaron un segundo sitio de unión de nucleótidos en una región totalmente inesperada, una cavidad dentro del subdominio del pulgar, a aproximadamente 30 Å del sitio activo (Fig. 6C). En esta posición, los restos nucleósidos de los NTP unidos contactan con los residuos M556, T560 y D563 de la hélice α19 y con E601 del extremo N-terminal λ6, mientras que los restos trifosfato permanecen parcialmente expuestos al disolvente, apareciendo en su mayoría desordenados. Cabe señalar que los nucleótidos están unidos junto a una región electropositiva fuerte, residuos R564, R545 y R269, que también contienen un pico de densidad extra, interpretado como una molécula de sulfato derivada de la solución de cristalización (Fig. 6C). Cabe destacar que este sulfato está presente en todos los demás TaV analizados.pol estructuras.


Resultados y discusión

Para identificar la desvinculación de VPg, desarrollamos un procedimiento de purificación de varios pasos utilizando nuestro ensayo de actividad de desvinculación de VPg descrito recientemente, que resuelve [35 S] metionina radiomarcada-VPg liberada de poliovirus vRNA (35 S-PV1-RNA) por Tris-tricina SDS / PÁGINA (7). Nuestro ensayo se optimizó para la detección rápida de la actividad de desvinculación de VPg (Materiales y métodos). Durante el desarrollo de este esquema de purificación, seleccionamos diferentes compuestos sintéticos y ácidos nucleicos como inhibidores competitivos para ser utilizados en la purificación por afinidad de VPg unlinkasa. Hicimos una observación fortuita de que el ADN monocatenario (ssDNA) es 100 veces más eficaz para inhibir la actividad desenlazada de VPg que el ARN sintético con o sin un enlace 5'-tirosil-ARN (Fig. S1). Este hallazgo clave nos llevó a incluir celulosa ssDNA en nuestro protocolo de purificación.

Debido a que la actividad desenlazada de VPg se encuentra tanto en extractos citoplásmicos como nucleares (2), iniciamos nuestro procedimiento de purificación utilizando homogeneizado celular total de células HeLa no infectadas. Después de someter el homogeneizado a centrifugación de alta velocidad para sedimentar detritos celulares y complejos grandes que contienen proteínas de unión a ácidos nucleicos, el sobrenadante (S370), que contenía ∼75% de la actividad inicial, se fraccionó secuencialmente con heparina-sefarosa, ssDNA- cromatografía de celulosa, de intercambio aniónico, de exclusión por tamaño y de intercambio catiónico, lo que da como resultado la generación de una preparación enzimática casi homogénea en la que la actividad se enriqueció en & gt10.000 veces (Fig.1 B y C). El polipéptido de 38 kDa resultante (p38) aislado mediante este esquema de purificación (Fig.1B, carril 7, etapa de purificación F) correspondía en tamaño con la desvinculación de VPg detectada durante nuestra caracterización inicial de esta actividad (Fig. S2). El análisis de las fracciones de la etapa de purificación F (cromatografía de intercambio catiónico) verificó la coelución de p38 (Fig.2A, Más bajo) con actividad de desvinculación de VPg (Fig.2A, Superior y Fig. S3).

Identificación de p38 como TDP2. (A) Perfil cuantificado de la actividad de VPg desenlazante (Superior, histograma rojo) y análisis SDS / PAGE (Más bajo) de las fracciones generadas por la etapa de purificación F muestran la coelución de p38 con la actividad desenlazante de VPg. La línea diagonal (marrón) indica el gradiente lineal de concentración creciente de NaCl (150 a 350 mM) usado para eluir VPg unlinkasa. (B) Análisis de espectrometría de masas de p38 aislado del carril 7 (p38-F12, Superior) y carril 8 (p38-F13, Más bajo) del gel de poliacrilamida mostrado en A, Más bajo identificaron varios péptidos trípticos correspondientes a TDP2 (en rojo la secuencia superpuesta está subrayada). (C) El análisis de transferencia de Western usando anticuerpo policlonal anti-TDP2 (Santa Cruz Biotechnology) confirma el aislamiento de TDP2 por nuestro protocolo de purificación (carriles marcados por paso de purificación). (D) Los niveles de expresión relativos de TDP2 en diferentes extractos celulares se correlacionan con la actividad de desvinculación de VPg detectada previamente (7): HeLa (línea celular de carcinoma cervical humano) & gt K562 (línea celular de leucemia mieloide humana) & gt NGP (línea celular de neuroblastoma humano) & gt SKOV3 (línea celular humana) línea celular de carcinoma de ovario) & gt RRL (lisado de reticulocitos de conejo).

La proteína correspondiente a p38 se escindió de dos carriles diferentes de un gel de poliacrilamida (Fig.2A, carriles 7 y 8, Más bajo) correspondiente a las fracciones de elución F12 y F13 en el perfil de actividad (Fig.2A, Superior) y sometido a digestión con tripsina seguida de análisis de MS / MS por cromatografía nano-líquida (nano-LC). Este análisis identificó inequívocamente p38 como TDP2 a través de péptidos únicos resaltados en la Fig.2B, Superior y Más bajo. El TDP2 es una hidrolasa celular dependiente de Mg 2+ / Mn 2+ que se sabe que escinde el enlace 5′-tirosil-ADN generado como resultado del daño del ADN mediado por la topoisomerasa (10). Esta proteína también se conoce como TTRAP y EAPII y se ha demostrado que funciona en la regulación transcripcional, la transducción de señales y las interacciones proteína-proteína relacionadas con posibles roles en el desarrollo neuronal y la progresión del cáncer (11). Además, el TDP2 se encuentra tanto en el núcleo como en el citoplasma de las células de mamíferos (11), de acuerdo con el informe original de la actividad de desvinculación de VPg de Ambros et al. (2).

Verificamos la presencia de TDP2 en las diferentes fracciones (A a F) generadas por nuestro esquema de purificación (Fig.1 B y C) mediante análisis de transferencia Western utilizando un anticuerpo policlonal disponible comercialmente (Fig.2C). Para evaluar la correlación de la actividad desenlazante de TDP2 y VPg, determinamos si los niveles de expresión de TDP2 en diferentes células se correlacionaban con su actividad desenlazante de VPg. El perfil de expresión observado de TDP2 por análisis de transferencia Western (Fig.2D) era coherente con la abundancia relativa de actividad desvinclasa de VPg informada anteriormente (figura 5 en la referencia 7) para extractos de las siguientes células (de mayor a menor actividad): HeLa (línea celular de carcinoma cervical humano) y gt K562 (célula de leucemia mieloide humana línea) & gt NGP (línea celular de neuroblastoma humano) & gt SKOV3 (línea celular de carcinoma de ovario humano) & gt RRL (lisado de reticulocitos de conejo). Cabe señalar que casi no detectamos actividad de desvinculación de TDP2 o VPg en preparaciones comerciales de RRL, mientras que estudios anteriores habían informado actividad de desvinculación de VPg en RRL (2, 6, 12). Aunque desconocemos la razón de esta aparente discrepancia, nuestras observaciones nos permiten concluir que los niveles de expresión de TDP2 se correlacionan con los niveles de actividad de desvinculación de VPg.

Para confirmar que TDP2 tiene una auténtica actividad de desvinculación de VPg, purificamos TDP2 etiquetado con GST recombinante de Escherichia coli y se ensayó para determinar la actividad de desvinculación de VPg. Cuando se incubó el ARN del virión marcado con [35 S] VPg ([35 S] VPg-PV ARN) aislado de poliovirus purificado con GST-TDP2 o desvinculación de VPg parcialmente purificada, se observó la desvinculación de VPg (Fig. 3)A, Superior). El análisis de estas reacciones mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% (p / vol) verificó que la liberación de VPg del ARNv no se debió a la degradación del ARN (Fig.3A, Más bajo). Anteriormente informamos que VPg unlinkase puede eliminar VPg de diferentes sustratos de picornavirus VPg-RNA (7) por lo tanto, incubamos GST-TDP2 con [35 S] VPg-PV RNA o [35 S] metionina rinovirus humano radiomarcado 14 VPg vinculado a un ARN quimérico de poliovirus-rinovirus (7) ([35 S] VPg HRV-PV ARN). GST-TDP2, pero no GST solo, pudo desvincular VPg de cualquiera de los sustratos de VPg-ARN (Fig. 3B). Los perfiles de migración electroforética de VPg generados por GST-TDP2 o desvinculación de VPg parcialmente purificada fueron idénticos, pero distintos de la migración más lenta de VPg-pUp, que se produce por la degradación total de ARNv con ARNasa A (compare las calles 2 a 5 con la calle 6 y carriles 9-12 al carril 13 en la Fig. 3B). Estos resultados demuestran que TDP2 tiene una auténtica actividad desenlazada de VPg.

La GST-TDP2 recombinante tiene una auténtica actividad desenlazada de VPg. (A) Cantidades equivalentes de VPg unlinkasa parcialmente purificada y GST-TDP2, ambas VPg desvinculadas de [35 S] VPg-PV RNA (Superior), sin ninguna degradación aparente del ARN PV (Más bajo). (B) Cantidades crecientes de VPg desvinculado y GST-TDP2 parcialmente purificado, pero no GST, VPg desvinculado de [35 S] VPg-PV RNA y [35 S] VPg HRV-PV RNA. Se incluyeron reacciones que contenían RNasa A para generar marcadores para VPg-pUp (carriles 6 y 13).

Para investigar los posibles mecanismos por los cuales los picornavirus protegen el enlace VPg-ARN del ARN de la progenie durante la replicación y encapsidación, utilizamos microscopía confocal para determinar la localización subcelular de TDP2 y las proteínas virales asociadas con la síntesis de ARN (3A) o encapsidación (cápside proteínas) durante el curso de la infección por poliovirus. Las células HeLa se infectaron de forma simulada o se infectaron con poliovirus, y las células se fijaron y procesaron para obtener imágenes como se describe en Materiales y métodos. En la Fig. 4 se muestran imágenes representativas de células infectadas con poliovirus y simulacros de virus a las 2 o 4 h después de la infección. El TDP2 se localizó predominantemente en el núcleo de las células infectadas de forma simulada, con una tinción de menor intensidad en el citoplasma, y ​​estaba algo más disperso en el núcleo y el citoplasma de las células 2 h después de la infección. Por el contrario, a las 4 h después de la infección, el TDP2 mostró un patrón de distribución subcelular sorprendente y pareció estar secuestrado en regiones específicas del núcleo y en la periferia del citoplasma. Además, observamos regiones dentro del citoplasma de las células a las 4 h después de la infección que estaban en gran parte desprovistas de TDP2 (marcadas con flechas discontinuas), mientras que contenían la proteína viral 3A (Fig.4A) y proteínas de la cápside viral (Fig.4B). En la periferia de la célula infectada, las proteínas TDP2, 3A y de la cápside se encontraron muy próximas entre sí, sin embargo, no parecían colocalizarse (confirmado por z-análisis de pila). A partir de los cambios en la localización subcelular de TDP2 que se producen en momentos posteriores a la infección, proponemos que los picornavirus excluyen a TDP2 de los complejos de replicación de ARN para proteger los ARN de la progenie ligados a VPg necesarios para la encapsidación.

La infección por poliovirus relocaliza el TDP2. (A) Inmunofluorescencia de TDP2 y proteína de replicación de ARN viral 3A. Mock- (Cima) o las células HeLa infectadas con poliovirus se fijaron en momentos específicos después de la infección. Se muestran imágenes generadas a las 2 h (Medio) o 4 h (Fondo) postinfección. Las células se marcaron con cola con anticuerpos dirigidos contra TDP2 (mostrado en rojo) o la proteína de poliovirus 3A (verde), y los núcleos se tiñeron con DAPI. Las flechas discontinuas indican regiones que estaban en gran parte desprovistas de TDP2. Las flechas indican las regiones del poliovirus 3A que se encuentran adyacentes a las regiones de TDP2. (B) Inmunofluorescencia de TDP2 y proteínas de la cápside. Mock- (Cima) o células HeLa infectadas con poliovirus se prepararon como se describe en A anterior, excepto que las células se etiquetaron con anticuerpos anti-TDP2 o anti-cápside de poliovirus. Las flechas discontinuas indican regiones que estaban en gran parte desprovistas de TDP2. Las flechas indican regiones de proteínas de la cápside viral que se encuentran adyacentes a regiones de TDP2.

Aunque TDP2 es la única fosfodiesterasa de 5′-tirosil-ADN conocida que se encuentra en células de vertebrados (13), inicialmente se descartó como un posible candidato de desvinculación de VPg por varias razones. En primer lugar, se ha informado de que la desvinculación de VPg no puede escindir el enlace tirosil-ácido nucleico de un sustrato sintético de 5'-tirosil-ADN (14). Sin embargo, en un esfuerzo por comprender por qué la desvinculación de VPg tampoco puede hidrolizar el enlace serina-ARN de la proteína ligada al genoma del virus del mosaico del caupí (15, 16), consideramos la posibilidad de que las interacciones electrostáticas con la tirosina (ligadas al ARN genómico ) son determinantes importantes para el reconocimiento del sustrato por VPg unlinkasa, similares a los mecanismos utilizados por la endonucleasa apurínica / apirimidínica (17), las proteínas de unión al casquete (18) y una amplia gama de otras interacciones proteína-ligando (revisadas en la ref. 19) . Este modelo predice que el sustrato sintético de 5′-tirosil-ADN marcado con 3,5- [125 I] diyodotirosina utilizado en el trabajo mencionado anteriormente es incompatible con el sitio activo de la desvinculación de VPg. En segundo lugar, el análisis por espectrometría de masas de las fracciones que contenían VPg desvincinasa generada por protocolos de purificación anteriores no había detectado TDP2 (7). Teniendo en cuenta que TDP2 es una enzima rápida (20) y de baja abundancia (21), es probable que la pureza de la proteína en relación con la abundancia de TDP2 sea insuficiente para la identificación en estas fracciones. En tercer lugar, el peso molecular de TDP2 de longitud completa no se correlacionó con ninguno de los pesos moleculares informados anteriormente para VPg unlinkasa [∼27 kDa (3) y 24-30 kDa (22)]. Aunque esto es cierto para las formas predominantes de TDP2 descritas en la literatura (revisada en la ref.11), hemos detectado al menos tres formas de TDP2 con masas moleculares aparentes que van de 26 a 50 kDa (Fig. S4B). Las tres formas de TDP2 coeluyeron con las especies correspondientes de actividad desenlazante de VPg detectadas en el extracto crudo (Fig. S4A). Debido a que el dominio fosfodiesterasa de TDP2 está dentro de la porción C-terminal de esta proteína (23), predecimos que los grupos anteriores pueden haber purificado parcialmente una forma truncada de TDP2.

Actualmente, el papel funcional de TDP2, si lo hay, durante una infección por picornavirus no está claro. Se ha sugerido que la actividad desenlazante de VPg está implicada en la maduración del ARNv de picornavirus en ARNm asociados con la traducción de polirribosomas (2, 3, 8), posiblemente como un requisito previo para la iniciación de la traducción mediada por el sitio de entrada del ribosoma interno. Un papel regulador adicional para la desvinculación de VPg por TDP2 puede ocurrir al nivel de encapsidación de ARNv (6, 9, 12). Debido a que solo el ARN ligado a VPg está encapsidado, es posible que se requiera TDP2 para estimular la replicación eficaz del ARN viral inhibiendo el empaquetamiento prematuro del ARNv. Debido a que los niveles de actividad desenlazante de VPg no parecen cambiar durante la infección por poliovirus (7), este escenario sugiere que el TDP2 y las proteínas virales involucradas en el empaquetamiento del ARNv compiten por los ARNv nacientes. Dada la evidencia genética y bioquímica de que la replicación y encapsidación del ARN de los picornavirus están acopladas (24, 25), el TDP2 puede bloquearse o secuestrarse de los ARNv nacientes después de que se hayan acumulado niveles suficientes de proteínas virales, lo que aumenta la producción de viriones de la progenie. Este posible escenario, apoyado por nuestros datos de imágenes confocales, se muestra en el modelo que se muestra en la Fig. 5. Implícita en nuestro modelo está la predicción de que la infección viral modula la actividad o la ubicación celular de TDP2 / VPg unlinkasa para restringir su acceso a los ARN virales al final del ciclo infeccioso. Será necesario llevar a cabo infecciones por picornavirus en cultivo celular en ausencia de TDP2 (después de la caída del ARNi o la ablación genética) para determinar si hay una reducción resultante en los niveles de replicación del ARN viral (y en última instancia, en los rendimientos de virus) debido a el empaquetamiento prematuro de los ARNv o el inicio de la traducción ineficaz al inicio de la infección. Esta predicción, de ser cierta, haría de la actividad desenlazante de VPg de TDP2 un objetivo atractivo para las terapias antivirales destinadas a reducir la carga viral en individuos infectados con picornavirus como el rinovirus humano o el enterovirus 71 (EV71), especialmente dada la morbilidad en lactantes y niños. infectados con estos virus (26, 27). Una advertencia sobre el TDP2 como objetivo terapéutico para controlar las infecciones por picornavirus son los posibles efectos tóxicos que dichos tratamientos podrían tener en las células, dados los roles normales que desempeña esta proteína en la reparación del ADN y la señalización celular. Sin embargo, es posible diseñar inhibidores de moléculas pequeñas que se dirijan al mecanismo utilizado por el virus para secuestrar TDP2 sin afectar su función celular.

Modelo de protección de ARNv de secuestro-progenie de TDP2. (A) El enlace VPg-ARN del ARN del virión (ARNv) después de su liberación de un virión infectante es escindido por TDP2 (símbolo amarillo “pac-man”), que genera ARNm viral y VPg libre (esfera verde). Después de la traducción, el ARNm viral se usa como molde para la síntesis de ARN de cadena (-) por la polimerasa viral (3D pol) (óvalos naranjas). El ARN de la cadena (-) es luego utilizado por el pol 3D como plantilla en la síntesis de ARN de la cadena (+) para generar ARNv, que está encapsidado o desvinculado para participar en la traducción viral y la replicación del ARN. (B) Durante la última etapa del ciclo de replicación, TDP2 se excluye de los sitios de síntesis y encapsidación del ARN viral, lo que permite la generación de viriones descendientes.

En resumen, nuestros hallazgos sugieren una solución a un misterio huésped-patógeno que había permanecido esquivo durante más de tres décadas. Hasta donde sabemos, la enzima TDP2 es única porque se le atribuye una actividad 5′-tirosil-ARN fosfodiesterasa. La enzima de mamífero capaz de la actividad 3′-tirosil-ADN fosfodiesterasa (Tdp1) alberga una actividad 3′-nucleosidasa limitada capaz de actuar sobre sustratos de ADN y ARN (28). Sin embargo, hasta la fecha no se ha informado que esta enzima rompa los enlaces tirosil-ARN. La actividad única de TDP2 en la hidrolización de los enlaces tirosil-ARN y tirosil-ADN puede ser, en parte, una consecuencia de las similitudes que comparten el ADN y el ARN. También podría ser una consecuencia de la evolución de las vías bioquímicas que utilizan enzimas similares a TDP2 para la reparación o regulación funcional de especies únicas de proteínas y ácidos nucleicos. La capacidad de TDP2 para hidrolizar los enlaces proteína-ARN viral puede ser el rastro restante de una enzima ancestral en el mundo del ARN que, en el curso de la evolución, adquirió la capacidad de escindir los enlaces proteína-ADN y mediar en nuevas funciones (p. Ej., Transcripcional regulación y transducción de señales) a través de interacciones proteína-proteína sin interrumpir la antigua actividad de la fosfodiesterasa específica de ARN.


Resultados

Análisis de secuencia, patrón de expresión y localización subcelular de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 y NbPARN

Iniciamos este estudio clonando y secuenciando cuatro claves 5’RDG de norte. Benthamiana, incluyendo NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 y NbPARN. El análisis de secuencia reveló que los marcos de lectura abiertos (ORF) de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 y NbPARN contienen 1113 nt (número de acceso de GenBank: KY402210), 966 nt (número de acceso de GenBank: KY402211), 2949 nt (número de acceso de GenBank: KY402212) y 2056 nt (número de acceso de GenBank: KY402213), respectivamente. Las secuencias de aminoácidos deducidas de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 y NbPARN comparten 70,2%, 68,4%, 67,1% y 62% de identidad con sus homólogos AtDCP1, AtDCP2, AtXRN4 y AtPARN de Arabidopsis, respectivamente. Para documentar las características biológicas básicas de estos 5’RDG de norte. Benthamiana, determinamos el patrón de expresión de estos genes y la localización subcelular de sus proteínas codificadas. Se realizó una PCR cuantitativa de transcripción inversa en tiempo real (qRT-PCR) utilizando ARN total aislado de diferentes norte. Benthamiana tejidos como plantilla. Los cuatro genes se expresaron constitutivamente, pero sus niveles de expresión variaron en diferentes tejidos (Figura 1A). En general, los cuatro genes mostraron el nivel de expresión más alto en el tejido de la raíz y el más bajo en el tejido del tallo.

(A) Análisis qRT-PCR de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 y NbPARN niveles de expresión en diferentes tejidos de norte. Benthamiana. La expresión se normalizó contra NbActin transcripciones, que sirven como estándar interno. Cada valor medio se derivó de tres experimentos independientes (n = 3 muestras). Los valores representan la media ± desviación estándar (DE). (B) Micrografías que muestran células de hojas de transgénico H2B-RFP norte. Benthamiana que expresan YFP-NbDCP1, YFP-NbDCP2, YFP-NbXRN4 o YFP-NbPARN. Barras = 50 μm. (C) Análisis de transferencia Western (WB) de extractos de proteínas totales de hojas infiltradas como se indica en (B) a las 32 horas después de la infiltración (hpi), se aplicó anticuerpo contra GFP (WB: GFP). Los asteriscos rojos indican los tamaños de banda esperados. La subunidad grande Rubisco teñida de azul brillante de Coomassie se utilizó como control de carga.

Para examinar la localización subcelular de estos cuatro norte. Benthamiana 5’RDG, sus regiones codificantes se introdujeron en primer lugar en el vector pDNOR221 mediante la reacción de BP (Invitrogen), seguido de la recombinación en el marco aguas abajo de la secuencia codificante de la proteína de fluorescencia amarilla (YFP) mediante la reacción LR (Invitrogen). Los genes quiméricos se expresaron transitoriamente en hojas de H2B-RFP transgénica. norte. Benthamiana plantas, y se examinó la fluorescencia en hojas transgénicas agroinfiltradas a las 32 horas después de la infiltración (hpi) mediante microscopía confocal (Figura 1B). YFP-NbDCP1 estaba presente predominantemente en el citoplasma, formando los gránulos redondos, mientras que los otros tres, incluidos YFP-NbDCP2, YFP-NbXRN4 e YFP-NbPARN, eran evidentes tanto en el citoplasma como en el núcleo, y algunos de YFP-NbDCP2, YFP-NbXRN4 y YFP-NbPARN agregados para formar gránulos en el citoplasma también (Figura 1B). Western blot con anticuerpo GFP (WB: GFP) (Figura 1C) detectaron la banda esperada y específica correspondiente a las proteínas NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 y NbPARN etiquetadas con YFP, lo que confirma la presencia de proteínas recombinantes de longitud completa.

La interacción y la co-localización de NbDCP1, NbDCP2 y NbXRN4

Para determinar si NbDCP1, NbDCP2 y NbXRN4 interactúan entre sí, realizamos ensayos de complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) [25]. Las proteínas etiquetadas con N y C-YFP se coexpresaron en hojas de H2B-RFP transgénicas norte. Benthamiana plantas y analizadas por microscopía de fluorescencia de células vivas a 32 hpi (Figura 2A). Tanto la propia como todas las combinaciones mutuas de NbDCP1, NbDCP2 y XRN4 mostraron interacciones positivas. P3N-PIPO, que es una proteína de movimiento dedicada de TuMV [26], se fusionó con N- o C-YFP para servir como control negativo (Figura 2A). Las proteínas virales P3N-PIPO y CI que interactúan para formar un complejo para el movimiento viral de célula a célula [27] se utilizaron como control positivo (S1 Higo). Curiosamente, el complejo de auto-interacción NbDCP2 estaba presente en el citoplasma y también en el núcleo. Excepto el complejo de auto-interacción NbDCP2 y la combinación NbDCP2-N-YFP y NbXRN4-C-YFP, ambos distribuidos uniformemente en el citoplasma, las combinaciones restantes formaron focos citoplasmáticos, independientemente de la fusión recíproca con un N- o C -YFP (Figura 2A).

(A) Ensayos BiFC entre NbDCP1, NbDCP2 y NbXRN4 en transgénicos H2B-RFP norte. Benthamiana sale a 32 hpi. La fluorescencia amarilla (verde) resultó de la interacción de dos proteínas probadas marcadas por la mitad C-terminal de YFP (C-YFP) o la mitad N-terminal de YFP (N-YFP). Los núcleos de células epidérmicas de la hoja de tabaco están indicados por la expresión del transgén H2B-RFP (rojo). P3N-PIPO etiquetado con C-YFP o N-YFP sirve como control negativo. Barras = 50 μm. (B) Co-localización de NbDCP1, NbDCP2 y NbXRN4 en el transgénico H2B-RFP norte. Benthamiana células foliares a 32 hpi. Las señales amarillas resultan de la superposición de NbDCP1-CFP (verde) con YFP-NbDCP2 (rojo) o YFP-NbXRN4 (rojo), o NbDCP2-CFP (verde) con YFP-NbXRN4 (rojo). Los recuadros son las imágenes ampliadas de las áreas en cuadros blancos en los paneles correspondientes. H2B-RFP se muestra en azul. Barras = 50 μm.

Además, realizamos un ensayo de co-localización para confirmar si estos complejos de interacción se forman en los mismos complejos de proteínas. Proteína fluorescente cian C-terminal (CFP) fusionada NbDCP1 (NbDCP1-CFP) y N-terminal YFP fusionada NbDCP2 (YFP-NbDCP2) o NbXRN4 (YFP-NbXRN4), o C-terminal CFP fusionada NbDCP2 (NbDCP2-CFP) y YFP -NbXRN4 se coexpresaron en las hojas de H2B transgénico norte. Benthamiana plantas, y se realizó microscopía confocal a 32 hpi. Encontramos que NbDCP1-CFP y YFP-NbDCP2 o YFP-NbXRN4 co-localizados en el citoplasma para formar los gránulos brillantes (Figura 2B). Estos focos brillantes también se observaron en el citoplasma de las células que coexpresan NbDCP2-CFP y YFP-NbXRN4 (Figura 2B). En conjunto, estos datos sugieren que NbDCP1, NbDCP2 y NbXRN4 pueden formar complejos de proteínas a través de interacciones proteína-proteína.

La sobreexpresión de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN no logra suprimir el silenciamiento del ARN inducido por GFP

Varios estudios recientes han informado que los componentes esenciales de la vía de desintegración del ARN 5'-3 'citoplásmico, incluidos XRN4 y DCP2, pueden suprimir las PTGS inducidas por ARN sentido (S-PTGS), pero no las PTGS inducidas por ARN de repetición invertida (IR-PTGS) en Arabidopsis, lo que sugiere que el silenciamiento del ARN y las vías de desintegración del ARN 5'-3 'están interconectadas, posiblemente al compartir el mismo sustrato de ARN [28, 29]. Consistentemente, comprometer la actividad de descomposición, desadenilación o exosoma mediada sin sentido mejora la S-PTGS, que requiere ARN polimerasa 6 (RDR6) dependiente del ARN del huésped y SUPPRESSOR OF GENE SILENCING 3 (SGS3) para la transformación del ARN monocatenario en ARNdc para desencadenar PTGS [30,31]. Para determinar si el norte. Benthamiana Los 5’RDG también afectan a S-PTGS e IR-PTGS como los de Arabidopsis, Agrobacterium Cultivos que expresan 35S-GFP, 35S-GF (GF: un fragmento de GFP que puede inducir S-PTGS, Figura 3A) y NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN etiquetados con N-Myc se infiltraron conjuntamente en norte. Benthamiana sale de. Las hojas co-infiltradas con 35S-GFP, 35S-GF y vector vacío (Vec) o el vector para la expresión de TBSV P19 (un conocido supresor de silenciamiento de genes) sirven como controles. Agroinfiltración de norte. Benthamiana hojas con 35S-GFP, 35S-GF y Vec inducido GFP Silenciamiento de ARN y condujo a una reducción de la fluorescencia de GFP bajo luz ultravioleta a los 5 días después de la infiltración (dpi) (Figura 3B). Si bien la intensidad de la fluorescencia verde aumentó sustancialmente en los parches de hojas que coexpresan GFP y P19, no se observaron diferencias obvias de fluorescencia entre los parches de hojas que coexpresan NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN etiquetados con Myc o co-infiltrados con el control del vector (Figura 3B). Por lo tanto, la expresión transitoria de los cuatro 5'RDG no pudo suprimir el desencadenante del ARN sentido (35S-GF) inducido GFP silenciar. Por el contrario, la expresión de estos 5'RDG condujo a la generación de más ARNip derivados de GFP y a niveles reducidos de GFP ARNm y proteína, mejorando el silenciamiento del ARN inducido por GFP sentido (Fig 3D y 3F). También examinamos los posibles efectos de los cuatro 5'RDG sobre el silenciamiento génico inducido por dsRNA. De manera similar a las observaciones anteriores [28-30], no hubo una supresión o mejora obvia del silenciamiento del ARN, cuando 35S-dsGF (dsRNA de GF) como el desencadenante del silenciamiento co-expresado con 35S-GFP y N-Myc-tagged NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN en norte. Benthamiana sale de (Fig 3C, 3E y 3G). Como control positivo, P19 suprimió S-PTGS e IR-PTGS e intensificó la fluorescencia de GFP, lo que se confirmó mediante análisis de inmunotransferencia y transferencia de ARN (Fig. 3). Tomados en conjunto, estos datos demuestran que los cuatro norte. Benthamiana Los 5’RDG probablemente estén involucrados en S-PTGS inducidos por GFP, pero no en IR-PTGS.

(A) Representación esquemática del fragmento de ARN derivado de los vectores de expresión GFP, GF y dsGF. (ANTES DE CRISTO) Fotografías de hojas agroinfiltradas representativas tomadas a 5 dpi bajo luz ultravioleta. Los parches de hojas se agroinfiltraron con tres vectores, incluidos 35S-GFP, 35S-GF (o 35S-dsGF) y uno de los siguientes vectores: un vector vacío (Vec), Myc-tagged-NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4, NbPARN y TBSV p19 (B). Se obtuvieron resultados similares a partir de tres experimentos independientes. (D, E) Análisis de acumulaciones relativas de GFP ARNm por qRT-PCR específica en las hojas infiltradas que se muestran en (B, C) a 5 dpi. NbActin sirve como estándar interno. Cada valor medio se calculó en base a tres experimentos independientes (n = 3 muestras). Los valores representan la media ± DE. Los asteriscos dobles indican una diferencia muy significativa en comparación con 35S-GFP + 35S-GF + Vec (D) o 35S-GFP + 35S-dsGF + Vec (E) (PAG & lt 0.01, Student's t prueba). (F, G) Acumulaciones de proteína GFP, NbDCP1 etiquetada con Myc, NbDCP2, NbXRN4, proteína NbPARN, GFP ARNm y ARNip en las hojas infiltradas que se muestran en (B, C) a 5 dpi. Los niveles de proteína se analizaron mediante análisis de inmunotransferencia utilizando anticuerpos contra GFP (WB: GFP) o Myc (WB: Myc). La tinción con azul brillante de Coomassie (CBB) de la subunidad grande de Rubisco, la tinción con bromuro de etidio del ARNr y U6 sirven como control de carga para inmunotransferencia, transferencia de ARNm y transferencia de ARNip, respectivamente. Los valores de ARNip de GFP / U6 se cuantificaron mediante el software ImageJ y luego se normalizaron frente al valor medio correspondiente al tratamiento con Vec, que se estableció en 1,00.

Derribo de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 y NbPARN inhibe S-PTGS, no IR-PTGS

Para determinar más a fondo si NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN está involucrado en el silenciamiento del ARN, tres vectores de expresión que incluyen 35S-GFP, 35S-GF y una construcción de ARNi en horquilla que contiene NbDCP1 (dsNbDCP1), NbDCP2 (dsNbDCP2), NbXRN4 ( (dsNbPARN) bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), se agroinfiltraron en hojas de norte. Benthamiana plantas. En comparación con la débil fluorescencia de GFP en norte. Benthamiana parches foliares infiltrados con 35S-GFP, 35S-GF y Vec, la expresión de dsNbDCP1, dsNbDCP2, dsNbXRN4 o dsNbPARN condujo a un aumento de la fluorescencia verde en las regiones co-infiltradas (Figura 4A), lo que indica que el silenciamiento de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN silenciamiento de ARN inducido por GFP de sentido suprimido. En consecuencia, los análisis de qRT-PCR, RNA blot y protein gel blot revelaron que la supresión del silenciamiento de GFP por dsNbDCP1, dsNbDCP2, dsNbXRN4 o dsNbPARN estaba acompañada por el aumento de los niveles de GFP ARNm y proteína, y los niveles reducidos de ARNip específicos de GFP en las hojas infiltradas (Fig 4B y 4C). Como control, una construcción de ARNi en horquilla de GUS no logró suprimir S-PTGS (Higo S2B), lo que indica que el derribo de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 y NbPARN inhibe especialmente S-PTGS, y la expresión de dsRNA no relacionado no sobrecarga ni inhibe la maquinaria de silenciamiento. Cuando 35S-GFP y 35S-dsGF se coexpresaron con dsNbDCP1, dsNbDCP2, dsNbXRN4 o dsNbPARN en norte. Benthamiana, no se detectó fluorescencia de GFP en las áreas co-infiltradas, similar a los parches foliares infiltrados por Vec (Figura 4D). Por el contrario, se evidenciaron fuertes señales de GFP en los parches de coexpresión de P19. Las transferencias de ARNip específicas de GFP mostraron que, en comparación con Vec, el silenciamiento de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN suprimió drásticamente la producción de ARNip secundarios (ARNip 'P') durante S-PTGS, pero no mostró cambios obvios en la acumulación de ARNip primarios (ARNip 'GF') durante IR-PTGS (Fig 4E y 4F). Estos datos apoyan que NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN participan en S-PTGS inducidos por GFP, pero no están involucrados en IR-PTGS.

(A, D) Visualización de fluorescencia verde de hojas agroinfiltradas representativas. Los parches de hojas se agroinfiltraron con tres vectores de expresión, incluidos 35S-GFP, 35S-GF (o 35S-dsGF) y uno de los siguientes vectores: un vector vacío (Vec), dsNbDCP1, dsNbDCP2, dsNbXRN4, dsNbPARN, P19, Myc-tagged- NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 y NbPARN. Las fotografías se tomaron a 5 dpi bajo luz ultravioleta. Se obtuvieron resultados similares a partir de tres experimentos independientes. (SER) Acumulación relativa de GFP ARNm en parches agroinfiltrados de las hojas infiltradas indicados en (A) y (D), respectivamente. El ARN total se aisló a 5 dpi y GFP El ARNm se analizó mediante qRT-PCR. NbActin sirve como estándar interno. Cada valor medio se derivó de tres experimentos independientes (n = 3 muestras). Los valores representan la media ± DE. Los asteriscos dobles indican una diferencia muy significativa en comparación con 35S-GFP + 35S-GF + Vec (B) o 35S-GFP + 35S-dsGF + Vec (E) (PAG & lt 0.01, Student's t prueba). (C, F) Acumulación de proteína GFP, GFP ARNm y ARNip en las hojas infiltradas que se muestran en (A) y (D), respectivamente. Las muestras se recogieron a 5 dpi. La tinción con CBB de la subunidad grande de Rubisco, la tinción con bromuro de etidio del ARNr y U6 sirven como control de carga para inmunotransferencia, transferencia de ARNm y transferencia de ARNip, respectivamente. Los valores de ARNip de GFP / U6 se cuantificaron mediante el software ImageJ y luego se normalizaron frente al valor medio correspondiente al tratamiento con Vec, que se estableció en 1,00.

NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 y NbPARN degradan GFP ARN a través de la vía de desintegración del ARN en plantas deficientes en RDR6

Para analizar el papel de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 y NbPARN en la desintegración del ARN en ausencia de S-PTGS, utilizamos plantas transgénicas dsRDR6, en cuyo sentido GFP la S-PTGS inducida está comprometida [32]. Tres vectores de expresión que incluyen 35S-GFP, 35S-GF y uno de los siguientes vectores: NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4, NbPARN y un vector vacío (Vec) se infiltraron conjuntamente en dsRDR6 transgénico norte. Benthamiana sale de. A 5 dpi, el parche de la hoja infiltrado con 35S-GFP, 35S-GF y Vec todavía mostraba una fuerte fluorescencia de GFP debido a la supresión de S-PTGS en dsRDR6 norte. Benthamiana hojas en comparación con el parche correspondiente en tipo salvaje (Wt) norte. Benthamiana sale de (Figura 5A). La expresión de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN en plantas transgénicas dsRDR6 redujo la fluorescencia de GFP en comparación con el control Vec (Figura 5A). Los análisis de qRT-PCR, ARN y transferencia de gel de proteínas revelaron que la fluorescencia reducida en los parches de hojas que expresan NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN se acompañó de una reducción de ambos GFP ARNm y proteína, pero sin un aumento de ARNip específicos de GFP (Fig 5B y 5C). Estos datos sugieren que en plantas deficientes en RDR6, NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN suprime GFP expresión a través de la vía de desintegración del ARN. Además, 35S-GFP y 35S-GF también se infiltraron conjuntamente con dsNbDCP1, dsNbDCP2, dsNbXRN4 o dsNbPARN en parches foliares de dsRDR6. De acuerdo con nuestros datos en Figura 4, se observó una fluorescencia mucho más fuerte y más acumulaciones de ARN de GFP cuando dsNbDCP1, dsNbDCP2, dsNbXRN4 o dsNbPARN se coexpresaron con 35S-GFP y 35S-dsGF en comparación con Vec a 7 dpi (S3 Higo). En conjunto, estos datos sugieren que los cuatro 5'RDG promueven el silenciamiento del ARN para apuntar GFP ARN en peso norte. Benthamiana plantas y degradar GFP transcripciones a través de la descomposición del ARN en las plantas deficientes en RDR6 donde se bloquea S-PTGS. Por lo tanto, el silenciamiento del ARN en comparación con la desintegración del ARN tiene la prioridad de degradar GFP ARN.

(A) Visualización de fluorescencia verde de hojas agroinfiltradas representativas. Se tomaron fotografías de hojas agroinfiltradas representativas a 5 dpi bajo luz ultravioleta. Tipo salvaje (peso) norte. Benthamiana o dsRDR6 transgénico norte. Benthamiana (dsRDR6) se agroinfiltraron plantas con tres vectores de expresión que incluían 35S-GFP, 35S-GF y uno de los siguientes vectores: un vector vacío (Vec) como control, Myc-tagged-NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 y NbPARN. Se obtuvieron resultados similares a partir de tres experimentos independientes. (B) Acumulación de proteína GFP, GFP ARNm y ARNip en las hojas infiltradas que se muestran en (A) a 5 dpi. La tinción con CBB de la subunidad grande de Rubisco, la tinción con bromuro de etidio del ARNr y U6 sirven como control de carga para inmunotransferencia, transferencia de ARNm y transferencia de ARNip, respectivamente. (C) Acumulación relativa de GFP ARNm analizados por qRT-PCR específica en las hojas infiltradas mostradas en (A) a 5 dpi. NbActin sirve como estándar interno. Cada valor medio se calculó en base a tres experimentos independientes (n = 3 muestras). Los valores representan la media ± DE. Los asteriscos dobles indican una diferencia muy significativa en comparación con 35S-GFP + 35S-GF + Vec / dsRDR6 (PAG & lt 0.01, Student's t prueba). Los valores de ARNip de GFP / U6 se cuantificaron mediante el software ImageJ y luego se normalizaron frente al valor medio correspondiente al tratamiento Vec en Wt norte. Benthamiana plantas, que se estableció en 1.00.

La infección viral regula al alza la vía de desintegración del ARN

Para aclarar el papel de la desintegración del ARN en la infección por TuMV, determinamos los niveles de expresión de los cuatro 5’RDG en hojas locales y sistémicas infectadas con TuMV de norte. Benthamiana plantas a 3 y 10 dpi usando qRT-PCR (Fig. 6A y 6B). Los niveles de expresión de los cuatro 5’RDG se regularon significativamente en las hojas tanto locales como sistémicas en respuesta a la infección por TuMV (Fig 6A y 6B). Además, comprobamos si las proteínas de replicación de TuMV o las vesículas de replicación están asociadas con los cuerpos P. La proteína de descascarado DCP1 es un marcador bien establecido para los cuerpos P en las plantas [11, 33]. Coexpresamos NbDCP1-CFP y tres proteínas de replicación requeridas codificadas por TuMV, incluidas 6K2 (que induce la formación de vesículas de replicación viral para la replicación del virus), 6K2-NIa-VPg (que contiene la proteína viral ligada al genoma VPg) y NIb ( la única ARN polimerasa viral dependiente de ARN) con YFP etiquetado en sus respectivos extremos C-terminales. No se observaron señales de co-localización típicas entre NbDCP1 y estas proteínas virales (Figura 6C). También se probó la posible co-localización entre 5'RDG y proteínas de replicación viral utilizando dos clones infecciosos de TuMV, TuMV-6K2-mCherry y TuMV-CFP-NIb [34, 35]. El primero contiene una copia adicional de 6K2 etiquetado con mCherry, y en el segundo, NIb está etiquetado por una CFP N-terminal. No se encontró co-localización entre NbDCP1 y las vesículas de replicación viral marcadas con 6K2 o NIb marcadas con CFP (Figura 6D). Estos sugieren que la infección por TuMV regula al alza la vía de desintegración del ARN que aparentemente no está asociada con el complejo de replicación del virus.

(A, B) Los niveles de expresión de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 y NbPARN fueron analizados por qRT-PCR en simulacro (tampón de infiltración) o infiltrado con TuMV norte. Benthamiana hojas a 3 ppp (A) o hojas nuevas superiores a 10 ppp (B). NbActin se utilizó como patrón interno. Cada valor medio se calculó en base a tres repeticiones biológicas independientes (n = 3 muestras). Los valores representan la media ± DE. Los asteriscos dobles indican una diferencia muy significativa en comparación con la simulación a 3 ppp (A) o 10 ppp (B) (PAG & lt 0.01, Student's t prueba). (C) Análisis de microscopía confocal de células que coexpresan NbDCP1-CFP (verde) y 6K2-YFP (panel I, rojo), o 6K2-NIa-VPg-YFP (panel II, rojo), o NIb-YFP (panel III, rojo ) a 32 hpi. Barras, 25 μm. (D) Microscopía confocal de células que coexpresan NbDCP1-YFP (verde) y TuMV-6K2-mCherry (panel I y panel II, rojo) o TuMV-CFP-NIb (panel III, rojo) a 72 hpi. La imagen ampliada del área en el cuadro blanco del panel I se muestra en el panel II. Barras = 50 μm.

La coexpresión de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN inhibe la acumulación de ARN de TuMV

Para examinar si estos norte. Benthamiana 5’RDGs afectan la acumulación de ARN de TuMV, TuMV-GFP se co-infiltró en norte. Benthamiana hojas con NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4, NbPARN o un vector vacío (Vec). A 3 dpi, los parches de hojas infiltrados con estos norte. Benthamiana Los 5’RDG mostraron una fluorescencia de GFP más débil en comparación con el control Vec (Figura 7A). Como la GFP se originó a partir del virus recombinante, su intensidad fluorescente podría considerarse un indicador de la replicación de TuMV. Los análisis de qRT-PCR confirmaron la reducción de los niveles de ARN viral en parches de hojas que coexpresan NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN (Figura 7C). Consistentemente, esta reducción fue acompañada con un aumento de TuMV-siRNAs (Figura 7F). También verificamos si NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN afectan la infección por TuMV en dsRDR6 transgénico norte. Benthamiana plantasFigura 7B).La sobreexpresión de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN en plantas transgénicas dsRDR6 también inhibió la infección por TuMV, evidenciada por fluorescencia atenuada de GFP y niveles reducidos de ARN virales (Fig 7B y 7C). Curiosamente, se detectaron cantidades notables de ARNip derivados de TuMV en la muestra de control infiltrada por Vec de plantas transgénicas dsRDR6, posiblemente debido al silenciamiento primario inducido por ARNdc viral (intermedios replicativos del ARN viral) durante la replicación viral robusta (Figura 7F). Estos datos demuestran que la expresión de 5'RDG inhibe la acumulación de ARN de TuMV en plantas transgénicas tanto Wt como dsRDR6.

(A, B) Fluorescencia de GFP en Wt o deficiente en RDR6 (dsRDR6) norte. Benthamiana hojas co-infiltradas con TuMV-GFP y uno de los siguientes vectores: Vec, NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN a 3 dpi. (C) Análisis de qRT-PCR de los niveles de ARN de TuMV. Se extrajo ARN de los parches infiltrados que se muestran en (A) a 3 dpi. Cada valor se normalizó contra NbActin transcripciones en la misma muestra. Las barras de error representan SD (n = 3 repeticiones biológicas independientes). Los asteriscos dobles indican una diferencia muy significativa en comparación con el tratamiento de Vec (PAG & lt 0.01, Student's t prueba). (D, E) Fluorescencia de GFP en Wt o deficiente en RDR6 (dsRDR6) norte. Benthamiana hojas co-infiltradas con TuMV-GFP-ΔGDD (un mutante de replicación defectuosa) y uno de los siguientes vectores: Vec, NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN a 3 dpi. (F) Acumulación de ARNip de TuMV en los parches infiltrados que se muestran en (A, B, D, E) a 3 dpi. La transferencia Northern se realizó utilizando sondas de ADN marcadas con DIG complementarias al genoma de TuMV. U6 sirve como control de carga para la transferencia de ARNip, respectivamente. Los valores de ARNip de GFP / U6 se cuantificaron mediante el software ImageJ y luego se normalizaron frente al valor medio correspondiente al tratamiento con Vec, que se estableció en 1,00.

Examinar la defensa antiviral mediada por 5’RDG sin silenciamiento primario mediado por dsRNA en transgénicos Wt y dsRDR6 norte. Benthamiana, utilizamos un clon infeccioso de TuMV de replicación deficiente, TuMV-GFP-ΔGDD [36]. Este clon permite la transcripción de ARN virales de longitud completa en la célula vegetal y la posterior traducción de proteínas virales. A medida que se muta el motivo GDD altamente conservado en NIb, el clon pierde la capacidad de biosintetizar ARN y generar intermedios replicativos de ARN viral. En comparación con el control Vec, la expresión de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN en Wt norte. Benthamiana suprimió la acumulación de ARN de TuMV-GFP-ΔGDD y aumentó notablemente el nivel de ARNip de TuMV (Figura 7F). En plantas transgénicas dsRDR6, la sobreexpresión de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN redujo la acumulación de transcripciones de TuMV-GFP-ΔGDD y suprimió la generación de ARNip derivados de transcripciones de TuMV-GFP-ΔGDD (Figura 7F). Estos datos sugieren que NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN pueden degradar el ARN de TuMV a través de la ruta de desintegración del ARN cuando se interrumpe la PTGS.

Para minimizar la interferencia del ARN de entrada, también realizamos este ensayo con una concentración muy baja de cultivos de agrobacterias (DO600 = 0.05) que albergan TuMV o TuMV-ΔGDD. Como era de esperar, en plantas transgénicas Wt o dsRDR6 infiltradas con TuMV, la acumulación de ARN viral fue significativamente mayor que en las hojas infiltradas con TuMV-ΔGDD (Higo S4A). La sobreexpresión de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN, en comparación con Vec, redujo las acumulaciones de ARN de TuMV o TuMV-ΔGDD. La sobreexpresión de estos componentes de desintegración del ARN también resultó en una disminución obvia de los ARNsi derivados de TuMV (S4B, figura 7F). Debido a la infiltración con una concentración muy inferior de cultivo de agrobacterias, no se encontraron ARNip virales detective en hojas infiltradas con TuMV-ΔGDD. Estos resultados sugieren además que durante la replicación viral, los ARNip se derivan principalmente de intermedios replicativos de ARN viral, que son proporcionales a las acumulaciones de ARN viral, en lugar de ARNsi secundarios dependientes de RDR6. En conjunto, estos datos respaldan que los 5'RDG actúan como defensa de la planta contra la acumulación de ARN de TuMV.

Derribo de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN mejora las infecciones virales locales y sistémicas

Para investigar más a fondo el efecto del silenciamiento de 5’RDG sobre la infección por TuMV, norte. Benthamiana los parches foliares se agroinfiltraron con TuMV-GFP y uno de los siguientes vectores: un vector vacío (Vec) como control, NbDCP1, dsNbDCP1, dsNbDCP2, dsNbXRN4 y dsNbPARN. A 4 ppp, eliminación de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN condujo a un aumento de los niveles de fluorescencia de TuMV-GFP, proteínas GFP y ARN de TuMV, y un nivel reducido de ARNip de TuMV (Figura 8A y 8B y S5 Figura). Por lo tanto, el silenciamiento de NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN promovió acumulaciones de ARN de TuMV posiblemente a través de la supresión de la producción de ARNip derivado de TuMV. Para verificar si esto también es cierto para la infección sistémica de TuMV, un vector TRV VIGS modificado que lleva la secuencia parcial de GUS (como control), NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN fue pre-inoculado en norte. Benthamiana derribar NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN expresión (S6 Higo). Las plantas silenciadas se inocularon luego con TuMV-GFP. A 6 dpi, las señales de GFP comenzaron a aparecer a lo largo de las venas en hojas recién desarrolladas bajo lámpara UV en plantas tratadas con TRV-GUS (Figura 8C). Sin embargo, todos NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 o NbPARN-las plantas silenciadas desarrollaron señales de GFP mucho más fuertes en las hojas correspondientes (Figura 8C). De manera consistente, se encontraron niveles más altos de ARN víricos y proteínas GFP en el 5’RDG-plantas silenciadas (Fig 8D y 8E). También se evidenció que el silenciamiento de 5’RDG inhibió los ARNip derivados de TuMV (Figura 8E). Estos datos sugieren que la eliminación de 5’RDG facilita la infección por TuMV y suprime los ARNip virales en norte. Benthamiana.

(A) Fluorescencia de GFP en norte. Benthamiana hojas co-infiltradas con TuMV-GFP y uno de los siguientes vectores de expresión: un vector vacío (Vec) como control, NbDCP1, dsNbDCP1, dsNbDCP2, dsNbXRN4 y dsNbPARN a 4 dpi. (B) Niveles relativos de ARN de TuMV determinados por qRT-PCR. Se extrajo ARN de los parches infiltrados que se muestran en (A) a 4 dpi. Cada valor se normalizó contra NbActin transcripciones en la misma muestra. Las barras de error representan SD (n = 3 repeticiones biológicas independientes). *, PAG & lt 0.05 **, PAG & lt 0.01 (Student's t prueba). (C) La fluorescencia de GFP en hojas sistémicas de plantas pretratadas con TRV-GUS, TRV-NbDCP1, TRV-NbDCP2, TRV-NbXRN4 o TRV-NbPARN y luego infectadas por TuMV-GFP se fotografió bajo luz UV a 6 dpi. (D) Niveles relativos de ARN de TuMV determinados por qRT-PCR. Se extrajo ARN de plantas en (C) a 14 dpi. *, PAG & lt 0.05 **, PAG & lt 0.01 (Estudiante t prueba). (mi) Acumulación de proteína GFP y ARNip de TuMV en las hojas sistémicas de plantas en (C) a 14 dpi. La tinción con CBB de la subunidad grande de Rubisco y U6 sirve como control de carga para inmunotransferencia, transferencia de ARNm y transferencia de ARNip, respectivamente. Los valores de ARNip de GFP / U6 se cuantificaron mediante el software ImageJ y luego se normalizaron frente al valor medio correspondiente al tratamiento TRV-GUS, que se estableció en 1,00.

Para examinar más a fondo si estos 5'RDG también inhbit la infección por TuMV en Arabidopsis, obtuvimos mutantes de caída de Arabidopsis de DCP2 y PARNy mutantes knockout de DCP1 y XRN4 (S7 Higo). En comparación con las plantas Wt Arabidopsis, todos los mutantes mostraron una mayor susceptibilidad a la infección por TuMV por la acumulación de niveles más altos de ARN viral (S8 Higo). Claramente, los 5'RDG juegan un papel anti-TuMV en ambos norte. Benthamiana y especies de Arabidopsis.

VPg interactúa con DCP2 y lo dirige al núcleo para inhibir la formación de los gránulos citoplásmicos de DCP1 / DCP2.

Para detectar posibles interacciones proteína-proteína entre las cuatro 5'RDG y las 11 proteínas TuMV, realizamos ensayos de levadura de dos híbridos (Y2H). Todas las proteínas analizadas se fusionaron con el dominio de activación de la transcripción (AD) de GAL4 y el dominio de unión al ADN de GAL4 (BD). Como se resume en Fig 9A y 9B, independientemente de si se utilizaron fusiones AD o BD para el ensayo, solo se encontraron interacciones positivas entre NbDCP2 y VPg, y entre NbXRN4 y HC-Pro.

(A, B) Resumen de los resultados del ensayo Y2H. Las cepas de levadura Y2H Gold cotransformadas con los plásmidos indicados se sembraron en placa en medio de dextrosa sintética (SD) / -Trp, -Leu, -His, -Ade para identificar interacciones de proteínas 3 días después de la transformación. Las proteínas se fusionaron con el dominio de unión al ADN de Gal4 (BD) o de activación (AD). No significa que no hay interacción positiva entre dos proteínas probadas, Sí significa interacción positiva entre dos proteínas probadas y "-" significa que NbDCP1 tiene actividad de autoactivación cuando se fusiona con el vector BD, lo que indica una interacción no auténtica. (CD) Ensayos de Y2H para NbDCP2 y VPg (C), y NbXRN4 y HC-Pro (D). Las cepas de levadura Y2H Gold cotransformadas con los plásmidos indicados se sometieron a diluciones seriadas de 10 veces y se sembraron en medio SD / -Trp, -Leu, -His, -Ade para identificar interacciones de proteínas 3 días después de la transformación. Las células cotransformadas con AD-T7-T + BD-T7-53 sirven como controles positivos. Las células cotransformadas con AD-NbDCP2 o AD-NbXRN4 y el BD vacío, o el AD vacío y BD-NbDCP2 o BD -NbXRN4 son controles negativos.

La interacción entre NbDCP2 y VPg fue confirmada por BiFC en transgénicos norte. Benthamiana expresando H2B-RFP como marcador nuclear (Figura 10A). La interacción NbDCP2 y VPg se detectó en el núcleo (Figura 10A y S10 Figura). De manera constante, NbDCP2 interactuó con NbDCP1 (que sirve como control positivo) y formó gránulos brillantes en el citoplasma, y ​​no se encontró interacción entre NbDCP1 y VPg (Figura 10A). El hecho de que NbDCP2 interactúe con VPg en el núcleo y con NbDCP1 en el citoplasma para formar el complejo de desencadenamiento que se requiere para la desintegración del ARN 5'-3 '[11,33] nos llevó a investigar si TuMV VPg regula negativamente el ensamblaje de el complejo de desencadenamiento de NbDCP1 / NbDCP2. Para probar esta hipótesis, YN-NbDCP1 y YC-NbDCP2 o YN-NbDCP2 y YC-NbDCP1 se infiltraron conjuntamente con VPg en las hojas de H2B-RFP. No se detectaron señales de interacción entre NbDCP1 y NbDCP2 cuando se coexpresó VPg (Figura 10A), lo que sugiere que VPg de hecho interrumpe la interacción NbDCP1 y NbDCP2.

(A) Ensayos BiFC para posibles interacciones proteína-proteína en planta. NbDCP1, NbDCP2 y VPg se fusionaron con YN o YC. Las proteínas fusionadas se expresaron transitoriamente en H2B-RFP transgénica norte. Benthamiana sale de. Se realizó microscopía confocal a 32 hpi. Se observó fluorescencia amarilla (verde) en las células de la hoja que coexpresaban NbDCP1 + NbDCP2 o NbDCP2 + VPg, pero no en las células que coexpresaban NbDCP1 + VPg o NbDCP1 + NbDCP2 en presencia de VPg. Los núcleos de células epidérmicas de la hoja de tabaco están indicados por la expresión del transgén H2B-RFP (rojo). Barras = 25 μm. (B) Co-localización de VPg + NbDCP1, VPg + NbDCP2, NbDCP1 + NbDCP2 en presencia de un vector vacío (+ Vec) o VPg (+ VPg) en tipo salvaje norte. Benthamiana células foliares. Se realizó microscopía confocal a 32 hpi. Barras = 25 μm. (C) El número medio de gránulos de co-localización de NbDCP1 / NbDCP2 (por 10 células) cuando se co-infiltraron con Vec (+ Vec) o VPg (+ VPg). Los experimentos de infiltración independientes se repitieron tres veces y se utilizaron 30 células en total para cuantificar. Los valores representan el número medio de gránulos de NbDCP1 / NbDCP2 (por 10 células) ± DE. Estudiantes t Se realizó una prueba para comparar diferencias, y los asteriscos dobles indican una diferencia altamente significativa (PAG & lt 0,01). (D) Análisis de inmunotransferencia de NbDCP2-CFP a 2 dpi. Las proteínas totales o las proteínas aisladas del citoplasma o los núcleos se sondaron con anticuerpos GFP, y las proteínas totales también se incubaron con anticuerpos Myc para detectar Myc-VPg. La carga igual para las muestras de proteína nuclear y total se controló mediante sondeo con anticuerpos de histona H2B y tinción con CBB, respectivamente.

Además, observamos la co-localización subcelular de VPg, NbDCP1 y NbDCP2. norte. Benthamiana las hojas se infiltraron conjuntamente para coexpresar transitoriamente VPg-YFP y NbDCP1-CFP o NbDCP2-CFP. No se observó co-localización para VPg-YFP y NbDCP1-CFP, mientras que VPg-YFP co-localizó con NbDCP2-CFP en el núcleo (Figura 10B, dos filas superiores). Además, la coexpresión de VPg suprimió notablemente la formación de gránulos de NbDCP1 / NbDCP2 en el citoplasma, en comparación con el control del vector (Figura 10B, dos filas inferiores, y 10C). Inicialmente, se especuló que la interacción reducida NbDCP1 / NbDCP2 se debía al nivel reducido de proteína NbDCP2 inducido por VPg. Para probar esta posibilidad, se extrajeron proteínas totales de las hojas co-infiltradas con NbDCP2-CFP y vector vacío (Vec) o Myc-VPg, y se realizó un análisis de Western blot para determinar la acumulación de NbDCP2-CFP. La coexpresión de Myc-VPg no afectó obviamente el nivel de proteína NbDCP2-CFP (Figura 10D). Posteriormente, se consideró la posibilidad de que la interacción VPg-NbDCP2 pudiera regular negativamente la distribución de NbDCP2 en el citoplasma para inhibir la formación de gránulos citoplásmicos de NbDCP1 / NbDCP2. Para probar esta suposición, extrajimos las proteínas citoplasmáticas y nucleares por separado y realizamos un análisis de transferencia Western para determinar la acumulación de NbDCP2-CFP en el citoplasma y nuclear. De hecho, cuando se coexpresó Myc-VPg, la cantidad de NbDCP2-CFP obviamente disminuyó en el citoplasma pero aumentó notablemente en el núcleo (Figura 10D). Estos datos sugieren que TuMV VPg interfiere con la interacción entre NbDCP1 y NbDCP2 dirigiendo NbDCP2 desde el citoplasma al núcleo.

HC-Pro interactúa con XRN4 y suprime la actividad de XRN4

La interacción entre HC-Pro y NbXRN4 se verificó mediante ensayos BiFC en norte. Benthamiana. Los vectores de expresión YN-HC-Pro, YC-HC-Pro, YN-NbXRN4 y YC-NbXRN4 se generaron para expresar fusiones de HC-Pro o NbXRN4 con YN o YC, respectivamente. La expresión por pares de YN-HC-Pro y YC-NbXRN4 o YN-NbXRN4 y YC-HC-Pro por agroinfiltración dio como resultado fuertes señales de fluorescencia de YFP en el citoplasma a 32 hpi (Figura 11A). No se detectó fluorescencia de YFP en la muestra de hoja que coexpresa HC-Pro y NbDCP1, que sirve como control negativo (Figura 11A). También examinamos la localización subcelular de HC-Pro y NbXRN4 en norte. Benthamiana células epidérmicas foliares que coexpresan HC-Pro marcado con CFP (HC-Pro-CFP) y NbXRN4 marcado con YFP (YFP-NbXRN4). Encontramos que HC-Pro-CFP se localiza en el citoplasma y el núcleo, y algunos gránulos formados en el citoplasma (Figura 11B, panel I). HC-Pro-CFP co-localizado con NbXRN4-CFP para formar un punto brillante en el citoplasma (Figura 11B, panel III). Estos resultados confirman que TuMV HC-Pro interactúa con NbXRN4.

(A) Ensayos BiFC para confirmar la interacción HC-Pro y NbXRN4 en H2B-RFP norte. Benthamiana sale a 32 hpi. HC-Pro y NbXRN4 se fusionaron con YN e YC. Se observó fluorescencia amarilla (verde) en las células que coexpresaban YN-HC-Pro + YC-NbXRN4 o YC-HC-Pro + YN-NbXRN4. La coexpresión de YN-HC-Pro + YC-NbDCP1 o YC-HC-Pro + YN-NbDCP1 no dio como resultado ninguna fluorescencia detectable en H2B-RFP norte. Benthamiana sale a 32 hpi, lo que reveló que HC-Pro no interactuaba con NbDCP1. Barras = 25 μm. (B) Análisis de co-localización de HC-Pro-CFP y YFP-NbXRN4 en norte. Benthamiana sale a 32 hpi. Panel I: HC-Pro-CFP se expresó solo, Panel II: YFP-NbXRN4 se expresó solo, Panel III: HC-Pro-CFP e YFP-NbXRN4 se expresaron juntos. Barras = 25 μm. (C) Ensayos de Y2H para AtXRN4 y HC-Pro. Las cepas de levadura Y2H Gold cotransformadas con los plásmidos indicados se sometieron a diluciones seriadas de 10 veces y se sembraron en medio SD / -Trp, -Leu, -His, -Ade para identificar interacciones de proteínas 3 días después de la transformación. Las células cotransformadas con AD-T7-T + BD-T7-53 sirven como controles positivos. Las células cotransformadas con AD-HC-Pro y el BD vacío, o el AD vacío y el BD-AtXRN4 son controles negativos. (D) Los ensayos BiFC revelaron que HC-Pro interactuó con AtXRN4 en H2B-RFP norte. Benthamiana sale a 32 hpi. P3N-PIPO y AtXRN4 sirvieron como control negativo para el ensayo de interacción proteína-proteína. Barras = 25μm. (MI) Fenotipos de Col-0, xrn4 plantas de Arabidopsis mutantes y transgénicas transformadas con 35S: Myc-AtXRN4, 35S: HC-Pro-CFP-1, 35S: HC-Pro-CFP-2 y 35S: HC-Pro-CFP-1 / 35S: Myc-AtXRN4 en 20 días después de la siembra. Se obtuvieron plantas 35S: HC-Pro-CFP-1 / 35S: Myc-AtXRN4 mediante cruces genéticos entre plantas 35S: HC-Pro-CFP-1 y 35S: Myc-AtXRN4 Arabidopsis. Se utilizaron plantas de generación T2 en los experimentos anteriores. La confirmación de xrn4 plantas transgénicas mutantes que expresan 35S: Myc-AtXRN4, 35S: HC-Pro-CFP-1, 35S: HC-Pro-CFP-2 y 35S: HC-Pro-CFP-1 / 35S: Myc-AtXRN4 se mostró en S7 Higo y S10 Higo. (F, G, H) Análisis qRT-PCR de AtEBF1, AtRAP2.4, AtNMT expresión en Col-0, xrn4 plantas mutantes y transgénicas portadoras de 35S: Myc-AtXRN4, 35S: HC-Pro-CFP-1 y 35S: HC-Pro-CFP-1 / 35S: Myc-AtXRN4 a los 20 días después de la siembra (F), en Col-0 y xrn4 hojas mutantes infiltradas por vector vacío (Vec) y HC-Pro a 3 dpi (G), y en Col-0 hojas recién emergidas de plantas infectadas con TuMV o simulacro 12 dpi (H). AtActinII El gen se utilizó como control interno. Los datos se analizaron utilizando Student's t la prueba y los asteriscos denotan diferencias significativas entre tratamientos (* PAG & lt0.05, ** PAG & lt0.01).

Para evaluar la relevancia biológica de la interacción HC-Pro y XRN4, utilizamos la planta modelo Arabidopsis. Al principio, confirmamos que TuMV HC-Pro de hecho interactúa con AtXRN4, el ortólogo de NbXRN4 en Arabidopsis mediante la realización de ensayos de Y2H en levadura (Figura 11C) y ensayos BiFC en norte. Benthamiana (Figura 11D). Entonces, obtuvimos una Arabidopsis xrn4 plantas de Arabidopsis transgénicas mutantes y generadas que expresan HC-Pro y AtXRN4. Curiosamente, el fenotipo del xrn4 mutante imitaba el fenotipo leve de las plantas de Arabidopsis transgénicas HC-Pro (Figura 11E), que presentaba bordes de hojas dentados. Dado que el cuerpo P es el sitio de descomposición del ARN, y HC-Pro interactúa con XRN4 en los gránulos citoplasmáticos que se asemejan al cuerpo P (Fig 11A y 11D), especulamos que la expresión de HC-Pro podría suprimir la función de AtXRN4 en la descomposición del ARN. Para probar esta idea, tres posibles sustratos de AtXRN4 en la desintegración del ARN, que incluyen AtEBF1, AtRAP2.4 y AtNMT [37] fueron analizados. Descubrimos que los niveles de ARNm de estos tres genes aumentaron significativamente en la xrn4 plantas de Arabidopsis mutantes y disminuyó en las plantas transgénicas de sobreexpresión de XRN4 (Figura 11F). La sobreexpresión de HC-Pro mejoró significativamente la acumulación de ARNm de AtEBF1, AtRAP2.4 y AtNMT, que fue antagonizado por la sobreexpresión conjunta de AtXRN4 (Figura 11F).De manera constante, la co-sobreexpresión de AtXRN4 remediaba parcialmente el fenotipo típico inducido por la sobreexpresión de HC-Pro (Figura 11E) y los niveles de expresión de AtEBF1, AtRAP2.4 y AtNMT fueron similares en Wt que expresa HC-Pro (Col-0) y xrn4 plantas mutantesFigura 11G). Además, en plantas infectadas con TuMV, el nivel de estos sustratos XRN4 fue elevado (Figura 11H), posiblemente debido a HC-Pro. En conjunto, estos datos sugieren que HC-Pro interactúa con XRN4 y la interacción inhibe la actividad de XRN4.


Abstracto

La uridilación del cebador peptídico VPg es la primera etapa en la replicación del ARN de picornavirus. Este proceso se puede lograr in vitro utilizando componentes purificados, incluido 3B (VPg) con la ARN polimerasa dependiente de ARN (3D pol ), el precursor 3CD y una plantilla de ARN que contiene el cre/autobús. Mostramos que ciertas secuencias de ARN dentro de la región no traducida del virus de la fiebre aftosa (FMDV) 5 & # x02032 pero fuera de la cre / bus puede mejorar la actividad de uridilación de VPg. Además, hemos demostrado que la proteína 3C del virus de la fiebre aftosa sola puede sustituir a la 3CD, aunque de forma menos eficaz. Además, los precursores de VPg, 3B33C y 3B1233C, pueden funcionar como sustratos para la uridilación en ausencia de 3C o 3CD añadidos. Residuos de la proteína 3C del virus de la fiebre aftosa implicados en la interacción con el cre / bus Se han identificado ARN y se encuentran en la cara de la proteína opuesta al sitio catalítico. Estos residuos dentro de 3C también son esenciales para la actividad de uridilación de VPg y la replicación eficaz del virus.

La familia Picornaviridae incluye patógenos importantes de humanos y otros mamíferos, por ejemplo, poliovirus (PV), rinovirus humano (HRV) y virus de la fiebre aftosa (FMDV). Los genomas de picornavirus son moléculas de ARN de sentido positivo de aproximadamente 8 kb que funcionan como ARNm (para producir las proteínas codificadas por virus) y como moldes para la producción de nuevas transcripciones de ARN (4, 32). El ARN genómico está descubierto (compárese con los ARNm de células eucariotas) pero está unido en su extremo 5 & # x02032 al péptido VPg (o 3B) codificado por el virus. Todos los genomas de picornavirus tienen una secuencia 5 & # x02032-terminal de VPgpUpU & # x02026, y esto se deriva del uso de VPg como cebador peptídico para la síntesis del ARN. La unión de este péptido al ARN se produce a través de un residuo Tyr (Y) y es realizada por la ARN polimerasa viral (3D pol ). Para PV, HRV y FMDV, se ha demostrado que la uridilación de VPg se puede lograr in vitro usando VPg purificado (como péptido sintético) con 3D pol , el precursor 3CD, UTP y una plantilla de ARN que incluye una estructura de tallo-bucle frecuentemente denominada cis-Elemento de replicación que actúa (cre) (15, 29, 33). Esta reacción produce VPgpU y VPgpUpU [denominados colectivamente VPgpU (pU)]. Se había previsto que dichos cebadores funcionarían para la formación de ARN de sentido positivo y negativo (32). Inesperadamente, dentro de un sistema de replicación in vitro, los experimentos muestran que la PV cre no es necesario para la síntesis de ARN de sentido negativo (19, 26, 28). Sin embargo, recientemente se ha informado que ciertas mutaciones en el coxsackievirus B3 cre han afectado la síntesis de ARN de cadena positiva y negativa (43). Por lo tanto, el mecanismo involucrado en el inicio de la síntesis de ARN de sentido negativo aún no está resuelto.

De forma única, el virus de la fiebre aftosa codifica y utiliza tres péptidos VPg distintos, que tienen 23 o 24 aminoácidos de longitud (21). Cada una de las VPg del virus de la fiebre aftosa puede uridilarse in vitro, aunque la VPg3 (3B3) parece ser el sustrato más eficaz (29). Es interesante que la modificación de solo la secuencia codificante de VPg3 dentro del contexto del ADNc infeccioso de longitud completa (FL) dio como resultado la producción de una transcripción de ARN no infecciosa (13).

El primero cre identificado dentro de picornavirus El ARN estaba dentro de la secuencia que codifica la proteína 1D (VP1) de HRV tipo 14 (HRV-14). Se ha demostrado que este elemento es necesario en forma de ARN para la replicación del ARN viral (24, 25). Posteriormente, se han identificado elementos similares en otros genomas de picornavirus (15, 17, 22). Cada uno de estos cre Las estructuras (alrededor de 50 a 60 nucleótidos [nt] de longitud) incluyen un motivo de secuencia conservada, AAACA, ubicado dentro de un bucle al final de un tallo estable. Estos elementos se encuentran en diferentes lugares dentro de varios genomas de picornavirus. cre las estructuras de HRV-14, HRV-2, cardiovirus y PV están dentro de las regiones codificantes de 1D, 2A, 1B y 2C, respectivamente (15, 22, 25, 33). Excepcionalmente, el FMDV cre se encuentra dentro de la región no traducida 5 & # x02032 (5 & # x02032 UTR) del ARN (23), justo aguas arriba del sitio de entrada del ribosoma interno (IRES). los cre las estructuras se pueden mover sin función de bloqueo (18, 23).

El motivo A 1 A 2 A 3 CA dentro del cre actúa como molde para la uridilación de VPg, y dentro de este motivo, el nucleótido A 1 es absolutamente esencial para la reacción, mientras que la modificación de A 2 o A 3 lo inhibe severamente (35). Se ha demostrado que un mecanismo & # x0201cslideback & # x0201d está implicado en la uridilación de PV VPg y que el nucleótido A1 actúa como molde para la adición de ambos grupos uridilo al péptido. Los datos sobre los requisitos para este motivo dentro del elemento FMDV son consistentes con el mismo mecanismo (29). Recientemente, la estructura de la cre de HRV se ha determinado usando resonancia magnética nuclear (40), pero sorprendentemente, el motivo AAACA no estaba muy expuesto. Los estudios genéticos han indicado que el virus de la fiebre aftosa cre puede funcionar en trans (41) y, por lo tanto, se ha sugerido que este elemento debería denominarse sitio de uridilación 3B (autobús). El PV cre también puede funcionar en trans dentro de los ensayos in vitro (19), y los datos recientes de Crowder y Kirkegaard (11) mostraron que las mutaciones dentro de la PV cre puede inhibir la replicación de PV en un trans- Manera dominante dentro de las células.

La naturaleza del papel esencial de 3CD en la reacción de uridilación no está del todo clara. Es bien sabido que PV 3CD puede unirse al ARN y es capaz de interactuar con la estructura de hoja de trébol 5 & # x02032-terminal en PV ARN (1) y también específicamente con PV cre (48). Se han identificado residuos específicos, dentro de una secuencia KFRDI (Lys-Phe-Arg-Asp-Ile) conservada que se requieren para la interacción de las proteínas 3C del picornavirus con el ARN (1, 5, 27, 44). También se ha demostrado que el papel de PV 3CD en la reacción de uridilación puede ser cumplido por 3C solo, aunque la reacción es menos eficiente (31). Las estructuras de varias proteínas 3C de picornavirus se han determinado mediante cristalografía de rayos X, incluida la codificada por el virus de la fiebre aftosa (5, 7, 27), pero actualmente no se ha informado de la estructura de una proteína 3CD. Las regiones de unión de ARN de las proteasas 3C del PV y del virus de la hepatitis A (HAV) se han mapeado en secuencias en la cara de la molécula opuesta al sitio catalítico activo (5, 27, 33, 47). La modificación tanto de R84 como de I86 dentro del motivo K 82 FRDI 86 de la proteasa PV 3C bloqueó la capacidad de la proteína para unirse al ARN de & # x0201ccloverleaf & # x0201d y para soportar la uridilación de PV VPg (1, 33). Ahora hemos explorado las funciones de las secuencias dentro de la proteína 3C del virus de la fiebre aftosa que se requieren para la uridilación de VPg del virus de la fiebre aftosa in vitro. Hemos identificado aminoácidos individuales en la superficie de la proteína 3C del VFA que son críticos para la uridilación y que también modifican la interacción de la proteína con el cre / bus. Además, hemos investigado la naturaleza de la plantilla de ARN involucrada en la reacción de uridilación y hemos demostrado que la presencia del IRES del virus de la fiebre aftosa dentro de la transcripción de ARN mejora la actividad de la plantilla de las células adyacentes. cre / bus estructura.


Propiedades enzimáticas de Calicivirus RdRps

Fidelidad de la polimerasa, velocidad de replicación y tasas de evolución

Se sabe que las RdRps de calicivirus, así como las RdRps de otros virus de ARN, son enzimas propensas a errores, porque carecen de las actividades de corrección de pruebas de muchas ADN polimerasas. Aproximadamente se produce un error por ciclo de replicación para los virus de ARN en comparación con un error por cada 300 ciclos para los virus de ADN (Drake, 1991, 1993). Comparar estudios con diferentes unidades de notificación de errores es algo desafiante, pero surgen ciertas tendencias. La tasa de error promedio para AVC (familia Flaviviridae) es 3.8 & # x00D7 10-5, medido como sustituciones por nucleótido por ciclo de infección (s / n / c) (Sanju & # x00E1n y Domingo-Calap, 2016 Selisko et al., 2018), y la frecuencia de error de la La RdRp del poliovirus varía de 7 & # x00D7 10 -4 a 5,4 & # x00D7 10-3, según se determina por la relación de incorporación de nucleótidos no complementarios al número total de nucleótidos (Ward et al., 1988). Se determinaron tasas de error de RdRp similares para varios virus de la familia Caliciviridae, por ejemplo, 6,8 & # x00D7 10 -4 para MNV, 1,6 & # x00D7 10 -4 para sapovirus GI y 9,0 & # x00D7 10 -4 sustituciones de nucleótidos / sitio para norovirus GII.4 (Bull et al., 2010b).

Las propiedades de la ARN polimerasa dependiente de ARN, como la fidelidad y la tasa de replicación, son factores importantes que dan forma a la evolución del virus. Por ejemplo, RdRps de cepas de norovirus GII.4 tenían tasas de mutación más altas (determinadas utilizando in vitro ensayos de fidelidad) en comparación con los de las cepas GII.by GII.7 estrechamente relacionadas pero detectadas con menor frecuencia (5,5 & # x20139,1 & # x00D7 10 -4 sustituciones por sitio para GII.4 RdRps frente a 1,5 & # x00D7 10 -4 y 2,2 & # x00D7 10-5 sustituciones por sitio para GII.by GII.7, respectivamente). Curiosamente, el linaje GII.4 mostró una tasa de evolución de las secuencias de la cápside aproximadamente 1,7 veces mayor y una mayor frecuencia de cambios no sinónimos en comparación con las cepas de norovirus no pandémicas (Bull et al., 2010a). Además, Mahar et al. (2013) informaron que la adquisición (por recombinación) de nuevas variantes de GII.3 RdRp con tasas de mutación más altas puede aumentar la diversidad genética y mejorar la aptitud general de las poblaciones virales bajo presiones selectivas. En conjunto, una tasa de fidelidad baja parece correlacionarse con una tasa evolutiva más alta.

La tasa de replicación de un virus es otro determinante de la aptitud viral, ya que los virus con una tasa de replicación aumentada pueden producir más copias de su genoma, lo que daría lugar a más variantes incluso si la tasa de error RdRp sigue siendo la misma. Por ejemplo, las RdRps de las cepas pandémicas GII.4 de 2006 tuvieron una tasa de incorporación de nucleótidos más alta (es decir, se replicaron más rápido) que las RdRps GII.4 recombinantes de brotes anteriores y la cepa GII.4 pandémica similar a US95 / 96, aunque la las tasas de error fueron muy similares. El aumento observado en la tasa de incorporación se ha asociado con la aparición de una mutación fuera del sitio activo, es decir, una sustitución de Lys291 a Thr en el dominio de dedo RdRp (Bull et al., 2010a). Por lo tanto, la alta tasa de mutación y / o replicación dentro del linaje GII.4 parece correlacionarse con la evolución de las cepas pandémicas. Sin embargo, las altas tasas de replicación no siempre se correlacionan con una alta aptitud general de un virus, lo que sugiere que la velocidad debe equilibrarse con las tasas de mutación adecuadas. Por ejemplo, el linaje del norovirus GII.7, a pesar de tener una tasa de replicación alta, tiene una tasa de mutación baja y una extensión geográfica limitada (Bull et al., 2010a). Es posible que la velocidad a la que se replicaba este virus en particular no fuera lo suficientemente rápida como para equilibrar su capacidad limitada para producir nuevas variantes mediante la incorporación de mutaciones.

La contribución de RdRp a la tasa de evolución de los calicivirus se hizo aún más clara con el reciente éxito de los virus recombinantes GII.2 y GII.4 que adquirieron una nueva variante de polimerasa. Por ejemplo, el norovirus recombinante resurgido GII.P16-GII.2 que difiere de las cepas GII.P16-GII.2 anteriores en 5 aminoácidos en la RdRp (Ruis et al., 2017), da como resultado altas cargas de virus en las heces, posee una tasa de evolución relativamente alta (5.5 & # x00D7 10-3 sustituciones / sitio / año) y se ha extendido rápidamente por todo el mundo (Ao et al., 2018 Cheung et al., 2019). Se ha sugerido que los cambios de aminoácidos en el nuevo RdRp afectan las propiedades cinéticas y la fidelidad de la enzima, pero se desconocen los detalles mecánicos exactos.

También se han observado eventos de recombinación genética entre diferentes lagovirus. El RHDV2, originalmente un virus con virulencia moderada y rango geográfico limitado (Le Gall-Recul & # x00E9 et al., 2013), parece haber evolucionado a un virus más virulento (Capucci et al., 2017), un cambio que se cree que ser al menos parcialmente una consecuencia de la recombinación con otros lagovirus (Lopes et al., 2015). Se descubrió que algunos de estos virus recombinantes poseían las proteínas no estructurales de los virus similares al calicivirus Australia-1 (RCV-A1) de conejo benigno (Lopes et al., 2015 Hall et al., 2018). RHDV y RCV-A1 tienen tasas de evolución de 2.8 & # x00D7 10-3 y 5.0 & # x00D7 10-3 sustituciones / sitio / año, respectivamente (Eden et al., 2015 Mahar et al., 2016). La mayor tasa de evolución de RCV-A1 se correlaciona con una mayor velocidad de su RdRp, según lo determinado por in vitro ensayos (Urakova et al., 2016). Es tentador especular que RHDV2 podría haber adquirido una polimerasa relativamente rápida, lo que podría explicar su mayor virulencia y aparente éxito evolutivo. En los 18 meses posteriores a su llegada, el RHDV2 reemplazó en gran medida a las cepas endémicas de RHDV en Australia (Mahar et al., 2017).

La generación de un conjunto de genomas genéticamente muy diverso proporciona una ventaja evolutiva, porque una población de virus diversa puede adaptarse más fácilmente a las presiones selectivas (Domingo, 2002 Lauring y Andino, 2010). Si la diversidad es el resultado de una tasa de error más alta, esto también puede aumentar la probabilidad de adquirir mutaciones perjudiciales y, por lo tanto, se ha sugerido que la mayoría de los virus de ARN se replican al borde de un umbral de error que está determinado por una interacción compleja de varios parámetros. como el tamaño del genoma, las tasas de error y la velocidad de replicación (Duffy et al., 2008). Como tal, no debería sorprender que tanto los aumentos como las disminuciones en la fidelidad de RdRp puedan afectar la aptitud viral (Pfeiffer y Kirkegaard, 2005 Xie et al., 2014 Arias et al., 2016 Agol y Gmyl, 2018).

Efectos de las condiciones de temperatura, pH y sal en el rendimiento de RdRp

Se determinaron las condiciones para un rendimiento óptimo de las RdRps de calicivirus para virus de los géneros Norovirus, Sapovirus, y Lagovirus (Tabla 3). La actividad de las RdRps virales depende de la temperatura, aunque la temperatura óptima no es necesariamente la del cuerpo del anfitrión. En los primeros estudios, la actividad RdRp de sapovirus más alta se detectó a 37 ° C (Fullerton et al., 2007). Sin embargo, estudios más recientes indican que muchos calicivirus RdRps funcionan en un entorno que no permite el máximo rendimiento. Por ejemplo, un norovirus RdRp humano demostró una actividad más alta a 30 que a 37 & # x00B0C según in vitro ensayos (Rohayem et al., 2006a). Además, cuando se estudió un rango de temperatura más amplio (es decir, 5, 25, 37, 55, 65 y 75 & # x00B0C) con RdRps de norovirus y sapovirus humanos, la actividad fue más alta a 25 & # x00B0C, y solo alrededor del 50% de la La actividad enzimática óptima se mostró a 37 ° C (Bull et al., 2010b). Además, los RdRps de norovirus y sapovirus mostraron sólo aproximadamente el 20% de su actividad óptima a 5 & # x00B0C y sólo alrededor del 1% a 55 & # x00B0C. No se detectó actividad a 65 o 75 & # x00B0C para ninguna de las RdRps excepto sapovirus RdRp, que todavía exhibía el 13% de la actividad óptima a 65 & # x00B0C (Bull et al., 2010b). Curiosamente, la temperatura óptima para algunos, si no todos los lagovirus, es más alta que la de los norovirus y sapovirus humanos. Usando proteínas recombinantes, se encontró que las RdRps del RCV no patógeno y del RHDV altamente patógeno se comportaron mejor entre 40 y 45 & # x00B0C (Urakova et al., 2016), una característica que puede explicarse como una adaptación de calicivirus de conejo. a sus anfitriones, ya que la temperatura corporal de conejos sanos oscila entre 38,3 y 39,4 & # x00B0C. Además, la fiebre asociada con la enfermedad hemorrágica del conejo a menudo eleva la temperatura corporal a 42 & # x00B0C (Strive et al., 2010), pero esta temperatura no es lo suficientemente alta como para ralentizar la actividad del RHDV RdRp (Urakova et al., 2016). ). Actualmente se desconoce la razón por la cual los calicivirus distintos de los lagovirus parecen poseer una temperatura óptima que es diferente de la temperatura corporal central del huésped y se requiere más investigación para responder a esta pregunta.

Tabla 3. Propiedades enzimáticas de calicivirus RdRps.

Se encontró que el pH óptimo para las RdRps de calicivirus de conejo era 8.5, que es más alto que el de RdRps de norovirus (7.0 & # x20138.0) (Bull et al., 2010b Urakova et al., 2016). Para una función catalítica óptima, los RdRps de norovirus y lagovirus pueden utilizar Mn 2+ o Mg 2+, pero no Fe 2+ (Vazquez et al., 1998 Rohayem et al., 2006a Urakova et al., 2016). El sapovirus RdRp demostró una mayor actividad con Mn 2+, pero también fue activo cuando se añadió Mg 2+ como cofactor a la reacción, lo que indica cierta flexibilidad en el uso de cofactores (Fullerton et al., 2007).


Resultados

Estrategia para la expresión de las formas nativas de ARN genómico y subgenómico NV. Dos especies de ADNc de NV, genómico y subgenómico (Fig.1B ), se utilizaron porque dichos ARN virales se han detectado en células infectadas con calicivirus animales (5). La construcción del ADNc de NV subgenómico utilizado para este experimento se basó en las secuencias de nucleótidos del ARN subgenómico que se encuentran en calicivirus animales (5). Los ADNc de NV genómicos y subgenómicos que tienen tractos poli (A) se colocaron aguas abajo del promotor T7 y aguas arriba de la ribozima del virus de la hepatitis delta (HδR) y la señal de terminación de Pol de ARN de T7 (T7ϕ) para permitir la generación de transcripciones con el 5 'exacto y extremos 3 ′ del genoma NV (Fig.1B ). Debido a que el inicio de la transcripción de las construcciones de plásmido bajo el control del promotor T7 está en un nucleótido G (19) y el nucleótido inicial para el ARN NV es un G, la transcripción de los ADNc de NV ocurre en el origen de la inserción de NV. La escisión autocatalítica de las transcripciones primarias se produce entre la A final de la región poli (A) y la primera G del sitio HδR, lo que da como resultado ARN virales que terminan con una cola poli (A).

Expresión de ARN genómico en células de mamíferos. Para determinar si la construcción de ADNc genómico de NV es un clon infeccioso funcional, se expresó ARN genómico de NV en células 293T mediante el uso del sistema MVA / T7. La expresión de proteínas no estructurales virales Pro y ARN dependiente de ARN Pol se detectó mediante radioinmunoprecipitación e inmunofluorescencia en células que expresan ARN genómico (Fig.2A ).

Expresión y replicación de ARN NV genómico en células de mamíferos. Se infectaron células 293T con MVA / T7 y luego se transfectaron con plásmidos que codifican ADNc de NV. (A) Detección de proteínas NV estructurales y no estructurales en células que expresan ARN NV por radioinmunoprecipitación (Izquierda) e inmunofluorescencia (Derecha) con antisueros para las proteínas. Proteínas NV radiomarcadas sintetizadas por in vitro la traducción se procesó en paralelo.Los marcadores de tamaño molecular (kilodaltons) están a la derecha. Las flechas resaltan las proteínas NV. (B) Detección de ARN subgenómico sintetizado en células que expresan ARN genómico. Poli (A) + ARN, aislado a las 4-12 h pt, y se sometió a transferencia Northern. In vitro Las transcripciones de ARN subgenómico se analizaron en paralelo. La flecha indica ARN subgenómico. Los marcadores de tamaño de ARN (nucleótidos) están a la izquierda.

Debido a que ORF1 del genoma NV codifica una poliproteína no estructural (Fig.1 A ) que se escinde en las proteínas no estructurales correspondientes por Pro (4, 20-25), la detección de los tamaños correctos de Pro y RNA Pol, ubicados en el extremo 3 'de ORF1, por radioinmunoprecipitación indica que la poliproteína no estructural se tradujo de el ARN genómico expresado en células 293T y las proteínas no estructurales individuales se generaron posteriormente mediante escisión con un Pro biológicamente activo. Tanto Pro como RNA Pol también fueron detectados por inmunofluorescencia en el citoplasma de las células que expresan.

La expresión de la proteína de la cápside viral VP1 también se detectó mediante radioinmunoprecipitación e inmunofluorescencia (Fig.2 A ). En calicivirus animales como el calicivirus felino (FCV) y el virus de la enfermedad hemorrágica del conejo, el ARN subgenómico transcrito a partir del ARN genómico sirve como molde para la traducción de VP1 (5). In vitro La traducción de ARN genómico no produjo VP1 (Fig.6, que se publica como datos de apoyo en el sitio web de PNAS), lo que indica que la VP1 detectada en células que expresan ARN genómico no se generó mediante un mecanismo de traducción interno basado en iniciación. Por tanto, la detección de VP1 en células que expresan ARN genómico sugirió que se tradujo a partir de ARN subgenómico, que se transcribió a partir de ARN genómico replicado por las proteínas no estructurales de NV expresadas. La expresión de poli (A) + ARN subgenómico en las células que expresan ARN genómico se examinó a las 4, 6, 8, 10 y 12 h después de la transfección (pt) mediante análisis de transferencia Northern con una sonda de ARN específica de cadena positiva correspondiente a la Región VP1 del genoma NV (Fig.2B ). El ARN genómico (7,6 kb) se detectó por primera vez a las 4 h pt (carril 1) y los niveles de ARN genómico disminuyeron con el tiempo (carriles 2 a 5). Ejecutar como controles, células transfectadas con ADNc subgenómico (carril 7) y in vitro las transcripciones de ADNc subgenómico (carril 8) produjeron dos bandas de tamaño ligeramente diferente de 2,3 kb y 2,5 kb, en las que el ARN subgenómico carecía y contenía HδR ​​y T7ϕ, respectivamente. En células transfectadas con ADNc genómico, la expresión del ARN subgenómico esperado de 2,3 kb se detectó por primera vez a las 6 h pt (carril 2). No se detectó ARN subgenómico a las 4 h pt a pesar de la expresión de ARN genómico (carril 1) y estaba ausente en las células transfectadas simuladas (carril 6). El ARN subgenómico no fue un producto de degradación o un intermedio del ARN genómico, porque el nivel de expresión del ARN subgenómico cayó entre 6 y 8 h pt (carriles 2 y 3), luego permaneció relativamente constante hasta las 12 h pt (carriles 3-5) a pesar de niveles decrecientes de ARN genómico observados a lo largo del tiempo (carriles 3 a 5). El mapeo del extremo 5 'del ARN subgenómico por extensión del cebador indicó que la secuencia de ARN subgenómico detectada en células que expresan ARN genómico comenzaba en el sitio de inicio de la transcripción conservado del ARN de calicivirus subgenómico (5) (Fig. 5). Además, el ARN subgenómico expresado a partir del ARN genómico se extrajo de un gel de agarosa y luego se sometió a análisis 5'-RACE (Fig. 7, que se publica como información de apoyo en el sitio web de PNAS). La secuencia del extremo 5 'del ARN subgenómico comenzó en el sitio de transcripción conservado del ARN subgenómico del calicivirus, que tiene similitud con los primeros cuatro nucleótidos del ARN genómico (GTAA), seguido del primer AUG en marco de ORF2. También examinamos la expresión de ARN subgenómico a partir de ARN genómico, en el que el ARN Pol se inactivó mediante la deleción de la secuencia de aminoácidos de GDD que es el sitio activo conservado de ARN Pols. No se detectó expresión de ARN subgenómico en células que expresan ARN genómico con un ARN Pol inactivado (Fig. 8, que se publica como información de apoyo en el sitio web de PNAS). Estas observaciones indican que el ARN subgenómico detectado se generó por transcripción a partir de ARN genómico y no se debió a una transcripción promiscua de T7 (Fig. 9, que se publica como información de apoyo en el sitio web de PNAS).

En conjunto, la detección de la proteína de la cápside VP1 y el ARN subgenómico en células que expresan ARN genómico indica que se produjo la replicación del ARN genómico expresado por el sistema MVA / T7, es decir, el ARN subgenómico generado a partir del ARN genómico por las proteínas no estructurales expresadas y funcionales, y fue traducido a VP1. Por tanto, se ha construido un clon de ADNc de NV que es un clon infeccioso biológicamente funcional, y las células de mamífero son capaces de replicar este clon.

Empaquetado de ARN genómico viral en partículas de virus. Se pueden producir partículas vacías de virus NV, que son morfológica y antigénicamente similares a los viriones de tipo salvaje, cuando las proteínas estructurales virales VP1 y VP2 se expresan en células Sf-9 de insecto mediante el uso de baculovirus recombinantes que contienen ADNc subgenómico (8). Expresamos la forma nativa del ARN subgenómico viral en células de mamíferos y examinamos si se generaron partículas de virus. Las partículas de virus derivadas de células que expresan ARN subgenómico se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivo mediante centrifugación en gradiente de CsCl isopícnico, seguido de fraccionamiento, y las supuestas partículas de virus se sedimentaron de cada fracción para su análisis. Tanto VP1 como VP2 se detectaron en la misma fracción mediante Western blot (Fig.3A , fracciones 4-6) se detectó un pico de cosedimentación de VP1 y VP2 en la fracción 5. La presencia de partículas de virus en la fracción 5 se confirmó mediante microscopía electrónica de tinción negativa (Fig. 3B ). Estos resultados proporcionan evidencia de que la expresión de una forma nativa de ARN subgenómico NV en células de mamífero genera partículas de virus compuestas tanto por VP1 como por VP2.

Generación de partículas virales a partir de células que expresan ARN subgenómico. Las partículas de virus se aislaron de los sobrenadantes del cultivo mediante centrifugación en gradiente de CsCl isopícnico y se sedimentaron las partículas en fraccionamientos de gradiente individuales. (A) La presencia de partículas de virus en cada fracción se examinó mediante transferencia Western con suero hiperinmune anti-rNV que reacciona con VP1 (18) (Superior) y anticuerpo anti-VP2 (24) (Más bajo). Como control positivo, se analizaron en paralelo las partículas de virus producidas por el sistema de expresión de baculovirus (24). Las flechas indican proteínas virales detectadas. Los marcadores de tamaño (kilodaltons) están a la derecha. (B) Micrografía electrónica de partículas de virus purificadas teñidas negativamente de la fracción 5. (Barra de escala: 100 nm.)

A continuación, buscamos determinar si el ARN genómico viral estaba empaquetado en las partículas de virus producidas por células de mamíferos que expresan ARN viral utilizando el sistema MVA / T7. Para este propósito, las partículas de virus, aisladas de las fracciones en gradiente como se describió anteriormente, se trataron con DNasa I y RNasa A para eliminar el ADN plasmídico o el ARN viral que puede haberse unido de forma inespecífica a la superficie de la partícula. A continuación, se extrajo el ARN viral de las partículas de virus y se cuantificó mediante RT-PCR en tiempo real. Para detectar el ARN genómico, se utilizaron cebadores específicos de la región de ARN Pol, presentes en el ARN genómico pero ausentes en el ARN subgenómico. Cuando se fraccionaron partículas de virus de células que expresaban ARN genómico solo, se detectó una señal positiva débil que indicaba la incorporación de ARN genómico viral en partículas de virus en la fracción 8 (datos no mostrados). Sin embargo, la presencia de la proteína de la cápside VP1 no pudo detectarse en la fracción 8 debido a los límites de detección de la transferencia Western. El nivel de expresión de VP1 en células que expresan ARN genómico fue mucho más bajo que en células que expresan ARN subgenómico (Fig.2 A ). Por lo tanto, para aumentar la expresión de las proteínas de la cápside VP1 y VP2 y aumentar la probabilidad de empaquetar el genoma viral, se aislaron partículas de virus de células que coexpresan ARN genómico y subgenómico. Una señal positiva que indica la incorporación de ARN genómico viral en partículas de virus se detectó nuevamente en la fracción 8 (Fig.4A ). Esta señal positiva se detectó en presencia de transcriptasa inversa pero no en su ausencia, lo que indica que esta señal se debió a la incorporación de ARN genómico viral pero no a ADNc de NV. La proteína de la cápside VP1 también se detectó en la fracción 8 mediante transferencia Western con suero anti-NV hiperinmune (Fig.4A ). Las partículas de virus se detectaron en las fracciones 2-5 mediante microscopía electrónica de tinción negativa (datos no mostrados); sin embargo, no se detectó una señal positiva que indica el empaquetamiento de ARN genómico en estas fracciones, lo que indica que estas partículas de virus estaban vacías. Estos resultados indican que un pequeño porcentaje de partículas de virus podría empaquetar ARN genómico, y la densidad de estas partículas se cambió de las fracciones 2-5 (baja densidad donde se agrupan las partículas vacías) a la fracción 8 (alta densidad). También examinamos la incorporación de ARN viral en partículas de virus, generadas en dos condiciones de expresión diferentes (ARN subgenómico solo o ARN subgenómico y genómico), mediante el uso de cebadores específicos de la región de la cápside que pueden detectar ARN genómico y subgenómico. Nuevamente, se detectó una señal positiva en la fracción 8 en partículas generadas al coexpresar ARN genómico y subgenómico (Fig.4Bi ). Sin embargo, las partículas de virus generadas por la expresión de ARN subgenómico solo no mostraron ninguna señal de ARN positiva (Fig.4Bii ). Aunque se detectaron altos niveles de proteína de la cápside en las fracciones 2-5 (Fig.4Bii ), las partículas de virus parecían vacías por microscopía electrónica de tinción negativa (datos no mostrados). Por tanto, las partículas generadas por la expresión de ARN subgenómico solo eran partículas de virus vacías que carecían del ARN viral. Las partículas de virus que contienen el ARN genómico generado por coexpresión de ARN genómico y subgenómico se aislaron a una densidad de CsCl de 1,32–1,36 g / ml, similar a las densidades informadas anteriormente para NV purificado de heces (10, 26–29). Por el contrario, las partículas virales vacías generadas por la expresión de subgenómico tenían una densidad de CsCl de 1,27 a 1,29 g / ml. Por tanto, la densidad de la fracción que contenía el ARN genómico era mayor que la de las partículas virales vacías y cercana a la de las partículas virales detectadas en las heces humanas. Estos datos indican claramente que el ARN viral se incorpora a las partículas de virus generadas al coexpresar ARN genómico y subgenómico.

Incorporación de ARN viral en partículas virales. Las partículas de virus se aislaron de los sobrenadantes del cultivo de células que expresan ARN subgenómico o coexpresan ARN genómico y subgenómico, seguido de sedimentación como se describe en la Fig. 3. Las partículas sedimentadas de las fracciones individuales se trataron con DNasa I y RNasa A, y se analizó el ácido nucleico. extraídos y sometidos a RT-PCR cuantitativa en tiempo real, realizada con o sin transcriptasa inversa. El número de copias de ARN viral presente en cada fracción se determinó mediante comparación con una curva estándar, y los resultados se representan frente a la densidad. Cada fracción también se examinó mediante transferencia Western para determinar la presencia de VP1, y los resultados se muestran en los insertos. (A) Detección de ARN genómico incorporado a partículas virales generadas por la coexpresión de ARN genómico y subgenómico mediante el uso de cebadores correspondientes a la región Pol. (B) Detección de ARN subgenómico incorporado en partículas de virus generadas por coexpresión de ARN genómico y subgenómico (I) o ARN subgenómico solo (ii) mediante el uso de cebadores correspondientes a la región de la cápside.


Un virus cuyos viriones infecciosos contienen el genoma en una forma de ARN de sentido mensajero monocatenario.

Un virus cuyos viriones infecciosos contienen el genoma en una forma de ARN de sentido anti-mensajero monocatenario.

Plásmido de ADN que se replica mediante transcripción y transcripción inversa de un intermedio de ARN.

Etiquetado de ARN reemplazando el sustrato UTP con 5-bromo-UTP (BrUTP). El ARN marcado se puede localizar mediante microscopía electrónica después del marcaje inmunológico con un anticuerpo dirigido contra BrU.

Un cambio programado y específico del sitio de algunos ribosomas que traducen de un marco de lectura a otro, lo que permite extender una fracción de los productos de traducción en el nuevo marco.

Traducción programada de algunos ribosomas a través de un codón de terminación, lo que permite que una fracción de los productos de traducción se extienda más allá del sitio de parada normal.



Comentarios:

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