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¿Cómo funciona la amplificación de un solo cebador independiente de la secuencia?


Tengo dificultades para encontrar una explicación de cómo funciona la amplificación de ADN con un solo cebador en la literatura disponible para mí, ¿alguien puede explicar la metodología y lo que logra?


Este proceso se denomina amplificación de un cebador único independiente de la secuencia (o, en resumen, SISPA). Se utiliza para amplificar secuencias desconocidas para la amplificación, por ejemplo, en virus desconocidos. Los cebadores utilizados para este proceso contienen secuencias aleatorias que deben unirse al ADN a amplificar y también secuencias conocidas, que pueden utilizarse como adaptadores. En las primeras rondas de PCR, solo los cebadores aleatorios dan lugar a productos específicos, que se amplifican exponencialmente en las últimas rondas de PCR, ya que los cebadores encajan perfectamente en ese momento. Esto se describe en detalle en esta publicación: "Estrategia de PCR de cebado aleatorio para amplificar y clonar trazas de ADN". Otro artículo interesante que describe el método es: "Amplificación de cebador único independiente de secuencia (SISPA) de poblaciones de ADN complejas".


La amplificación de un solo cebador se usa para encontrar regiones desconocidas de ADN si no tiene idea de qué usar como cebador más arriba. Funciona con la idea de que cualquier imprimación a una determinada temperatura se cebará mal. Eso sí, se acoplará a una ubicación no específica. Así que es PCR, pero a esta temperatura, el cebador de las cinco regiones principales se unirá específicamente a su ubicación conocida. En el extremo de los tres primos hasta 3500 bases de distancia, la baja temperatura de hibridación permitirá que este cebador específico se una a algo que se parezca a su secuencia complementaria, pero no exactamente. De esta manera, aún obtendrá una reacción de PCR exitosa. Luego, a medida que continúan los ciclos, el extremo de 3 'se une específicamente a su primer imprimador y puede aumentar la temperatura para hacerlo más específico. El diseño y las temperaturas de la imprimación deben considerarse con mucho cuidado.

Fuentes

Laboratorio Roth


Detección del virus TT mediante amplificación independiente de la secuencia de un cebador único en varias muestras recogidas de un brote de gastroenteritis

Un panel de muestras de brotes de gastroenteritis se sometió a un algoritmo de purificación y concentración de virus seguido de un método de amplificación independiente de la secuencia diseñado para detectar patógenos entéricos virales. La aplicación de estos métodos permitió la identificación de torque teno virus (TTV) en un brote. La secuencia completa del genoma de 3260 nt se obtuvo mediante el "recorrido genómico" y se dedujeron cuatro marcos de lectura abiertos de la secuencia genómica. El análisis filogenético agrupó a este virus en el grupo genético 3 de TTV, agrupándose con el genotipo 27, con un 85% de similitud a nivel nt con la cepa SAa-01.

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Tecnología de cebador específico de secuencia (PCR-SSP)

El análisis del tipo de antígeno leucocitario humano (HLA) es un componente importante de la investigación inmunológica y biofarmacéutica. Tradicionalmente, la micronucleotoxicidad (MLCT) y la citometría de flujo (FC) se utilizaron ampliamente para detectar tipos de HLA. También se emplean varios métodos de biología molecular debido a las limitaciones y deficiencias de MLCT y FC, mientras que esta opción costosa es de alguna manera difícil de costear para los laboratorios con problemas de liquidez. Para ayudar a los científicos a resolver este dilema, Biolabs creativos ha estandarizado la tecnología de cebadores específicos de secuencia (PCR-SSP) y la ha aplicado a la detección del tipo HLA, que puede determinarse mediante análisis electroforético.

Introducción a la tipificación de tejidos HLA

HLA generalmente se refiere a todo el sistema de antígenos leucocitarios, que está controlado por genes en el brazo corto del cromosoma 6, y es parte de la región genética conocida como el complejo principal de histocompatibilidad (MHC). El papel fisiológico del HLA es principalmente controlar la autoidentificación del sistema inmunológico y resistir la invasión de microorganismos. El gen HLA asegura el juicio preciso y la capacidad de ataque de las amenazas externas del cuerpo en virtud de su extrema diversidad. Debido a que algunos antígenos HLA se reconocen en todos los tejidos del cuerpo (en lugar de solo en las células sanguíneas), la identificación de los antígenos HLA se describe como "tipificación de tejidos". Tradicionalmente, los antígenos HLA se han clasificado y definido mediante técnicas serológicas que se basan en la obtención de preparaciones de linfocitos vivos y antisueros adecuados para identificar la disponibilidad de antígenos HLA. En los últimos años, la tecnología del ADN se ha utilizado ampliamente y reemplazó gradualmente a la tecnología serológica en aplicaciones clínicas en el campo de la histocompatibilidad y la inmunogenética. Muchos laboratorios han comenzado a desarrollar y aplicar varios métodos de ADN diferentes para la tipificación del ADN a fin de detectar alelos HLA.

Fig.1 Principio de PCR-SSP.

PCR-SSP para la tipificación de tejidos HLA

La técnica PCR-SSP apareció por primera vez a principios de la década de 1990 y se basó en la amplificación de sistemas de mutación refractarios (ARMS). El principio de este método es que un cebador perfectamente emparejado es más eficaz en una reacción de PCR que uno o más cebadores mal emparejados. La especificidad se determina mediante el uso de cebadores específicos de secuencia, donde un desajuste de una sola base 3 'inhibe el inicio de una reacción no específica. Debido a la falta de actividad exonucleasa 3 'a 5' de la polimerasa Taq, incluso los pares de cebadores no se hibridan específicamente y no se amplifican de manera eficaz. Por lo tanto, solo se amplificará el alelo requerido, y luego el producto amplificado puede detectarse mediante electroforesis en gel de agarosa.

Biolabs creativos ha desarrollado la tecnología PCR-SSP para proporcionar servicios de tipificación de HLA a una amplia gama de investigadores. Este método cuesta mucho menos que los métodos analíticos tradicionales como la citometría de flujo, lo que le permite obtener resultados experimentales a corto plazo y hacer que su proyecto sea más eficiente.

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INTRODUCCIÓN

La amplificación de ácidos nucleicos es una de las herramientas más valiosas en prácticamente todos los campos de las ciencias de la vida, incluidos los campos orientados a la aplicación, como la medicina clínica, en los que el diagnóstico de enfermedades infecciosas, trastornos genéticos y rasgos genéticos se beneficia especialmente con esta nueva técnica. Además de la detección basada en PCR ampliamente utilizada (1,2), se han inventado varios métodos de amplificación. Incluyen la amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) (3), la replicación de secuencia autosostenida (3SR) (4) y la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) (5,6). Cada uno de estos métodos de amplificación tiene su propia innovación para reiniciar nuevas rondas de síntesis de ADN. Por ejemplo, la PCR utiliza la desnaturalización por calor de productos de ADN de doble hebra para promover la siguiente ronda de síntesis de ADN. 3SR y NASBA eliminan la desnaturalización por calor mediante el uso de un conjunto de reacciones de transcripción y transcripción inversa para amplificar la secuencia diana. De manera similar, SDA elimina el paso de desnaturalización por calor en el ciclo de la síntesis de ADN mediante el empleo de un conjunto de digestiones con enzimas de restricción y síntesis de ADN de desplazamiento de cadena con nucleótidos modificados como sustrato.

Estos métodos pueden amplificar los ácidos nucleicos diana a una magnitud similar, todos con un límite de detección de menos de 10 copias y dentro de una hora aproximadamente, pero aún tienen deficiencias que superar (7,8). Requieren un instrumento de precisión para la amplificación o un método elaborado para la detección de los productos amplificados debido a la escasa especificidad de la selección de la secuencia diana. A pesar de la simplicidad y la magnitud de amplificación obtenible, el requisito de un termociclador de alta precisión en la PCR impide que este poderoso método sea ampliamente utilizado, por ejemplo, en clínicas privadas como herramienta de diagnóstico de rutina. Por otro lado, NASBA y 3SR, que no utilizan ciclos térmicos, tienen una especificidad comprometida, como resultado principalmente de la necesidad de utilizar una temperatura relativamente baja de 40 & # x000b0C para la amplificación. SDA supera en gran medida estas deficiencias mediante el uso de cuatro cebadores y condiciones isotérmicas para la amplificación, pero aún tiene puntos débiles: fondos aumentados debido a la digestión del ADN irrelevante contenido en la muestra y la necesidad de usar nucleótidos modificados costosos como sustrato. Aunque el uso de múltiples cebadores, como en PCR anidada y SDA, ha mejorado la especificidad de amplificación para la secuencia diana, la coamplificación residual de secuencias irrelevantes todavía causa un retroceso general en la amplificación de ácidos nucleicos, particularmente para uso diagnóstico.

Recientemente hemos desarrollado un método novedoso que puede amplificar unas pocas copias de ADN a 109 en menos de una hora en condiciones isotérmicas y con mayor especificidad. Describimos el mecanismo, la sensibilidad y la especificidad de este método de amplificación, denominado amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP).


Materiales y métodos

Preparación de ADN

Los aislados bacterianos se etiquetaron como Colección Bacteriana de la Universidad Al-Quds (QUBC). Se trataron células bacterianas puras frescas con 100 & # x000a0 & # x003bcl de lisozima recién preparada (Sigma Chemical Co. ) [23], se incubaron en un tubo de microcentrífuga durante 30 & # x000a0min a 35 & # x000b0C, se recogieron células o células con lisis incompleta por centrifugación, el sedimento se lisó con 20 & # x000a0 & # x003bcl de 0,5 & # x000a0N NaOH y 20 & # x000a0 & # x003bcl de SDS al 1%. El lisado celular se hirvió durante 10 & # x000a0 min, luego se diluyó a 200 & # x000a0 & # x003bcl con agua estéril.

Diseño de imprimación

La secuencia de rDNA 16S de H. pylori HPAG1, seleccionado por su importancia clínica [42], se utilizó para BLAST todos los 940 genomas microbianos. Los resultados de BLAST muestran una similitud mínima con H. pylori, luego se escanearon en busca de regiones conservadas & # x0226516 bases de largo. En la segunda etapa, se buscaron secuencias de rDNA 16S representativas de & # x0003e50 para la presencia o ausencia de cada secuencia de cebador putativa. La presencia de la secuencia del cebador en el ADNr publicado se determinó como se muestra en la Tabla & # x000a0 2. Las secuencias de cebadores se refinaron para llegar a los cebadores finales enumerados en las Tablas & # x000a0 3, & # x200B, 4. 4. Algunos sitios de cebadores se usaron en ambas direcciones hacia adelante y hacia atrás. Los nuevos cebadores generales de la Universidad Al-Quds (QUGP) Forward (F) o Reverse (R) eran cebadores más largos y se basaban en los cebadores generales cortos, sus secuencias se muestran en las Tablas & # x000a0 3, & # x200B, 4 4 Fueron designados QUGP-Fn3, QUGP-Fn5, QUGP-Fn6, QUGP-Rn3 y QUGP-Rn1, se introdujeron cebadores adicionales (QUGP-R2 y su forma larga QUGP-Rn2). QUGP-F4 y QUGP-R4 no se modificaron ya que mostraron alta temperatura de fusión (Tmetro). Los cebadores se sintetizaron comercialmente (Hy Labs, Jerusalem o Danyel, Rehohot). Se prepararon y probaron mezclas multiplex (Tabla & # x000a0 5) para definir una mezcla Dorada (G) que reaccionará positivamente con la gran mayoría, si no con todas, las bacterias. Cada mezcla de imprimación de trabajo contenía 10 & # x000a0pmol de cada imprimación respectiva / & # x003bcl.

Tabla & # x000a03

Cebadores de secuenciación y PCR general 16S de la Universidad Al-Quds (QUGP-16S este estudio a) basado en la secuencia 16S de H. pylori gi | 108562424: c1140006-1138506

CebadorCebadores de secuenciación y PCROligómero: ubicaciónTm (& # x000baC)
QUGP-F15 & ​​# x02032-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3 y # x0203218:10 & # x0201327 a 53.7
QUGP-F1b5 & ​​# x02032-AGTTTGATCATGGCTCAG-3 y # x0203218:10 & # x020132751.40
QUGP-F35 & ​​# x02032-GATACCCTGGTAGTCCA-3 & # x0203217: 753 & # x0201376952.80
QUGP-R35 & ​​# x02032-TGGACTACCAGGGTATC-3 & # x0203217: 769 & # x0201375252.80
QUGP-F45 & ​​# x02032-CCGCCTGGGGAGTACG-3 & # x0203216: 840 & # x0201385659.55
QUGP-R45 & ​​# x02032- CGTACTCCCCAGGCGG-3 & # x0203216: 856 & # x0201384059.55
QUGP-F55 & ​​# x02032-CCTACGGGAGGCAGCAG-3 & # x0203217: 326 & # x0201334354.54
QUGP-R55 & ​​# x02032-CTGCTGCCTCCCGTAGG-3 & # x0203217: 343 & # x0201332654.30
QUGP-F65 & ​​# x02032-GCAGCCGCGGTAATAC-3 & # x0203216: 481 & # x0201349754.51
QUGP-R65 & ​​# x02032-GTATTACCGCGGCTGC-3 & # x0203216: 497 & # x0201348154.30
QUGP-R75 & ​​# x02032-CGATTACTAGCGATTCC-3 & # x0203217: 1319 & # x02013130247.13
QUGP-R25 & ​​# x02032-GACGGGCGGTGTGTAC-3 & # x0203216: 1376 & # x02013139254.85
QUGP-R15 & ​​# x02032-TACCTTGTTACGACTTCACCC-3 & # x0203217: 1468 & # x02013144757.90
QUGP-R1b5 & ​​# x02032-TACCTTGTTACGACTTC-3 & # x0203217: 1468 & # x02013145147.90

Las secuencias en negrita y cursiva son homólogas al GEN humano ID: 100008588 LOC100008588 | ARN ribosómico 18S. Los productos potenciales QUGP-Fn6. Es poco probable que Rn2, 1096 & # x000a0bp y QUGP-Fn6.Rn1, 1226 & # x000a0bp se formen a 58 & # x000b0C debido a 3 & # x02032-desajustes con el ADNr 18S humano cuando las muestras clínicas contienen ADN humano. Esto justifica el cambio del QUGP corto a las nuevas secuencias más largas, mientras que QUGP-R2 coincidirá con el ADN humano, QUGP-Rn2 presenta un desajuste crítico en su extremo 3 & # x02032

a Algunos de los cebadores se superponen a los utilizados por otros, consulte la Tabla & # x000a0 1. La ubicación del cebador difiere ligeramente en diferentes bacterias y puede estar ausente de otras (QUGP R2 / Rn2 está ausente en H. pylori, la ubicación mostrada es para P. fluorescens, algunas bacterias no coincidirán con 5 & # x02032-end de los cebadores

Tabla & # x000a04

Cebadores generales 16S de la Universidad Al-Quds nuevos cebadores largos

CebadorCebadores largos de PCROligómero: ubicaciónTm (& # x000baC)
QUGP-Fn35 & ​​# x02032-CAGGATTA GATACCCTGGTAGTCC -3 & # x0203224: 744 & # x0201376865
QUGP-Fn55 & ​​# x02032-ACTC CTACGGGAGGCAGCAG -3 & # x0203220: 323 & # x0201334365
QUGP-Fn65 & ​​# x02032-CCA GCAGCCGCGGTAAT AC -3 & # x0203219: 479 & # x0201349762
QUGP-Rn15 & ​​# x02032-GGC T ACCTTGTTACGACTT C -3 & # x0203220: 1471 & # x02013146858
QUGP-Rn25 & ​​# x02032-T GACGGGCGGTGTGTACAutomóvil club británicoG-3 & # x0203220: 1406 & # x02013138663
QUGP-Rn35 & ​​# x02032-GGCG TGGACTACCAGGGTATC -3 & # x0203221: 775 & # x0201375265

Se utilizaron QUGP de forma larga para preparar mezclas de oro.

Las secuencias subrayadas indican el QUGP corto antes de ser rediseñado. QUGP (secuencias subrayadas) se extendieron principalmente en sus extremos 5 & # x02032 con nucleótidos conservados, QUGP-F4 / R4 no se modificaron ya que su Tm era 59,5 & # x000b0C y están flanqueados por nucleótidos variables. Las principales diferencias entre el QUGP y los cebadores rediseñados se limitan a una mayor longitud del cebador y Tm que permitió realizar el recocido a 58 & # x000b0C en lugar de 50 & # x000b0C

Tabla & # x000a05

Mezclas generales y de imprimación dorada

AB
Mezclas generalesQUGPMezcla doradaCebadores QUGP
Nivel I
& # x000a0 Reacción unoF5, F6, R1bG1Fn3, Fn5, Fn6 y # x02022Rn1
& # x000a0Reacción dosF5, F6, R3G2Fn3, Fn5, Fn6 y # x02022Rn2
& # x000a0 Reacción dos (b)F5, F6, R3, R4
& # x000a0Reacción tresF3, F4, R1bG3Fn3, Fn5, Fn6 y # x02022Rn3
Nivel II
& # x000a0 Reacción cuatroF1, R1bG4Fn3, Fn5, Fn6 y # x02022Rn3, Rn2
& # x000a0Reacción cincoF1, R3, R4G5Fn5, Fn6 y # x02022Rn3, R4
& # x000a0 Reacción seisF1, R5. R6G6Fn3, Fn5, Fn6 y # x02022Rn1, Rn2
Nivel III
& # x000a0 Reacción sieteF5, F6, R4G7Fn3, F4, Fn5, Fn6 y # x02022Rn1, Rn2, Rn3
& # x000a0 Reacción ochoF3, R4G8Fn3, Fn5, Fn6 y # x02022Rn1, Rn2, Rn3, R4
& # x000a0Reacción nueveF5, R6G9Fn5, Fn6 y # x02022 Rn1, Rn2, Rn3, R4
Mq4F4, F5, F6, R1b, R2G10Fn3, F4 y # x02022Rn1, Rn2
G11Fn5, Fn3 y # x02022Rn1, Rn2
G12Fn6, F4 y # x02022Rn1, Rn2
G13Fn5, Fn6 y # x02022Rn1, Rn2

Parámetros de amplificación

Se usó un termociclador de tapa calentada MiniCycler (MJ Research, Inc., Watertown, MA) para amplificar el ADN. Se prepararon reacciones de 25 - & # x003bcl añadiendo 8 & # x000a0pmol de cada cebador (0,8 & # x000a0 & # x003bcl de mezcla de cebadores), 0,5 & # x000a0 & # x003bcl de muestra de ADN, 12,5 & # x000a0 & # x003bcl Master Mix de Promega y agua pura estéril a 25 & # x000a0 & # x003bcl. Todas las reacciones de amplificación se iniciaron en caliente a 95º C durante 3º min. El protocolo de PCR utilizado con cebadores generales cortos fue: 94 & # x000b0C 90 & # x000a0s, 48 ​​& # x000b0C 35 & # x000a0s, 50 & # x000b0C 35 & # x000a0s, 72 & # x000b0C 105 & # x000a0s. y 33 ciclos, un paso de extensión final a 72 & # x000b0C durante 3 & # x000a0min, 4 & # x000b0C durante 24 & # x000a0h. Cuando se usaron mezclas de oro (G1 & # x02013G13), los parámetros de PCR fueron los mismos que los anteriores excepto por la temperatura de hibridación que se estableció en 58 & # x000b0C durante 1 & # x000a0min. Se utilizaron cebadores específicos de especie HPU1 y HPU2 [46] para la detección de H. pylori. Las especies específicas PA-SS-F y PA-SS-R se utilizaron para la detección de Pseudomonas aeruginosa. Los cebadores PA-GS-F y PA-GS-R específicos del género se utilizaron para la detección de pag. especie [18].

Detección y documentación

Se utilizaron geles de agarosa que contenían bromuro de etidio (0,1 & # x000a0 & # x003bcg por ml) durante todo el estudio a concentraciones de 1,2 o 1,6% (p / v). Fuente de alimentación LKB (Biochrom, Cambridge, Inglaterra) y transiluminador UV (Dinco y Rhenium Industrial Ltd.), se utilizó una escalera de 100 pb como marcadores de peso molecular. Los geles se fotografiaron usando una cámara digital (Casio Exilim, Tokio, Japón) a 3 & # x020138 & # x000a0mega píxeles con filtro sepia o blanco y negro.

El protocolo del método universal

La Figura & # x000a0 1 ilustra las dos etapas del protocolo UM, la etapa I fue diseñada para permitir la detección de bacterias seguida de la etapa II, que fue diseñada para identificar la bacteria diana. Las dos etapas se detallan a continuación.

Una presentación de diagrama de flujo del protocolo UM a partir de un cultivo bacteriano puro o ADN, que termina con la alineación del ADN (BLAST) y la identificación bacteriana.

Etapa I

Detección de una bacteria: comenzando con una bacteria pura o su ADN, se usa una o más mezclas de cebadores Golden (Tabla & # x200B (Tabla5B) 5 B) para amplificar el rDNA 16S de la bacteria por PCR. La electroforesis en gel de agarosa se utiliza para identificar el tamaño del amplicón de PCR, luego se identifica el par de cebadores activos mediante referencias cruzadas con la Tabla & # x000a0 6. Esta etapa concluyó una vez que se logró la detección de amplicones.

Tabla & # x000a06

Tamaño del producto de PCR con cebadores emparejados según el gen de ADNr publicado H. pylori (HP) HPAG1 gi | 108562424: c1140006-1138506 o P. fluorescens (PF) gi | 70728250: 122811-124349 de Pf-5 <"type": "entrez-nucleotide", "attrs": <"text": "NC_004129", "term_id": "70728250", "term_text": "NC_004129" >> NC_004129

Imprimación directaQUGP-F1QUGP-Fn3QUGP-F4QUGP-Fn5QUGP-Fn6
Imprimación inversaHP / PFHP / PFHP / PFHP / PFHP / PF
QUGP-Rn11463/1503721/743633/6391142/1183995/991
1277 b
QUGP-Rn200/1396623/636532/53600/107300/893
1097 b
QUGP-Rn3764/798NP a notario público465/473287/298
QUGP-R4847/881112notario público530/561374/379
QUGP-Rn5334/344notario públiconotario públiconotario públiconotario público
QUGP-Rn6488/523notario públiconotario público171/199notario público

El tamaño exacto del producto de PCR para cada par de cebadores puede variar de una bacteria a otra. Faltan algunos sitios de imprimación y sus productos se indican como cero (00 & # x000a0bp)

a Los cebadores que no formaron pares de PCR se indican como sin emparejamiento (NP). El tamaño exacto del producto de PCR depende de la especie bacteriana. Los productos en cursiva indican similitud de tamaño

B Homo sapiens La secuencia 18S comparte homologías con estos cebadores y predice la posible amplificación de la región 1277 y 1097 & # x000a0bp

Estadio II

Para identificar la bacteria, el producto de la PCR debe reproducirse en forma pura para la secuenciación del ADN, la alineación BLAST y la interpretación de los resultados. Si se puntuó una identidad alta inequívoca & # x0226598% con una sola especie, se aceptan los resultados. Si se obtuvieron puntajes altos (generalmente entre 95 y 98%) con varias especies, esto puede permitir solo la identificación del género. Deben aplicarse métodos independientes para discriminar entre estas especies e identificar las especies bacterianas. Si se obtuvo una baja identidad (& # x0003c95%), lo más probable es que se deba a la falta de disponibilidad de la secuencia para la alineación o debido a la detección de una nueva especie. Este potencial para descubrir nuevas especies no debe descartarse como un error experimental. Dichas bacterias deben identificarse mediante pruebas bioquímicas clásicas, culturales y mediante secuenciación del genoma completo. La secuencia obtenida (ADNr o genoma completo) debe depositarse luego en una de las bases de datos de nucleótidos. En teoría, solo el 100% de coincidencias deben considerarse como identidad. Sin embargo, debido a mutaciones, duplicación de genes y número de copias, y errores de secuenciación, resulta difícil decidir dónde trazar la línea de identidad.


PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

Estrategia general de clonación

Un método ampliamente utilizado para generar genes recombinantes implica amplificar el gen de interés por PCR y luego ligar el producto de PCR en el vector plasmídico deseado. Para facilitar este proceso, los cebadores de PCR pueden diseñarse para incorporar sitios de restricción apropiados en los extremos del ADN diana para la posterior digestión y ligación en el vector de elección. La adición de sitios de restricción por PCR durante la amplificación de una secuencia genética permite la inserción de prácticamente cualquier gen diana en cualquier vector [12].

Esta estrategia de clonación se utilizó para crear un recombinante M. sexta GFP-His6-construcción de ADNc de serpin insertada en el vector de expresión pGFPuv (Clontech, Palo Alto, CA) (Fig.1A). Específicamente, un M. sexta-clon de cDNA mutagenizado de serpin1B funcional (A343K) previamente diseñado con His6 La etiqueta en el extremo N de la proteína se usó como plantilla en la síntesis de PCR (Fig.1B) [9]. Los cebadores de PCR se diseñaron para agregar un sitio EcoR1 3 '(cadena codificante) y un sitio SacI 5' (cadena codificante) al His6secuencia de -serpin (Fig.2A). Tanto el Su6El producto de PCR -serpin y el vector de expresión pGFPuv fueron digeridos por SacI y EcoRI. El suyo6Luego se insertó el producto de PCR -serpin en el extremo 3 'de la secuencia codificante de GFP utilizando el sitio de clonación múltiple 5' del vector (Fig.1C). La proteína quimérica final lleva GFP en el extremo N-terminal, una His6 etiqueta de afinidad flanqueada por residuos flexibles de glicina en el medio de la construcción, y el ADNc de serpina en el extremo C-terminal (Fig.1D).

Gestión de secuencias

Se utilizó un programa informático a lo largo del curso para documentar y manipular secuencias de ADN, incluida la generación de mapas de restricción y la traducción de secuencias de ADN en secuencias de proteínas. Aunque hay muchos programas de gestión de secuencias disponibles, se utilizó el programa shareware DNA Strider 1.1 (Macintosh) [13]. En muchos casos, las secuencias de plásmido completas pueden descargarse de sitios web comerciales y manipularse con estos programas. El uso de un programa de gestión de secuencias de ADN de este tipo, aunque no es obligatorio, familiariza a los estudiantes con la manipulación de ADN y la gestión de bases de datos. Los programas de gestión de secuencias son extremadamente útiles para desarrollar estrategias de clonación iniciales.

Organización de la serie de laboratorios

Nuestros estudiantes trabajaron individualmente, y cada uno realizó su propio conjunto de reacciones a lo largo del semestre. Sin embargo, participaron en una gran colaboración y apoyo, compartieron materiales, discutieron opciones experimentales, coordinaron el uso del gel de agarosa, etc. Un miembro de la facultad estuvo presente durante todo el período de laboratorio, brindando orientación e intervención adecuada. El período de laboratorio fue un bloque de 3 h una tarde a la semana. En varias ocasiones, se pidió a los estudiantes que realizaran breves preparativos (p.ej. inocular cultivos) en la tarde anterior a nuestra sesión de laboratorio. En la Tabla I se muestra un cronograma propuesto para los ejercicios de laboratorio a lo largo del semestre.

Semana uno

Transformación-

Un M. sexta Serpin cDNA serpin1B (A343K) se clonó previamente en el plásmido de expresión pQME-60, que añadió ADN que codifica una His6 etiqueta de epítopo en el extremo N-terminal de la proteína para crear el plásmido serpin1B (A343K) [9]. En principio, cualquier plásmido, aislamiento de ADN genómico o biblioteca de ADNc podría servir como molde para la PCR al comienzo de este experimento. Nuestros estudiantes realizaron transformaciones separadas del plásmido serpin1B (A343K) y pGFPuv en Escherichia coli-células competentes. Durante todas las manipulaciones genéticas, un estable E. coli cepa de clonación que carece de la recA Se utilizó el gen de recombinación, tal como XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA) o DH5α (Invitrogen, San Diego, CA). Se obtuvieron de fuentes comerciales células competentes de grado de subclonación que producían ~ 1 x 10 6 transformantes por microgramo de ADN. El protocolo de transformación recomendado por el fabricante de células competente tomó menos de 2 h, y las células resultantes se sembraron en placas que contenían ampicilina. Estas placas se mantuvieron a 37 ° C durante la noche (12-16 h) para permitir un crecimiento suficiente de la colonia bacteriana. Al día siguiente de la transformación, los estudiantes que regresaron al laboratorio sacaron sus placas de la incubadora, anotaron sus resultados y almacenaron sus placas a 4 ° C durante el período intermedio. Se pidió a los estudiantes que calcularan el número de colonias por microgramo de ADN para sus reacciones.

Un control negativo (sin ADN plasmídico) y un control positivo (ADN plasmídico de una fuente comercial, p.ej. pUC18) se incluyeron para la transformación. Nuestros estudiantes utilizaron una solución de agar Luria-Bertani (LB) / agar templada preparada previamente y vertieron placas al comienzo del período de laboratorio. Se añadió al agar líquido una cantidad adecuada de solución madre 1000X de ampicilina (0,1 g de ampicilina / ml de solución de etanol / agua al 50%, almacenada a -20ºC) antes del vertido.

Semana dos

Preparación del plásmido

La tarde anterior al segundo período de laboratorio, los estudiantes comenzaron cultivos pequeños (2 ml) de caldo de ampicilina LB de una sola colonia en sus placas de transformación. El cultivo se incubó a 37 ° C con agitación (225 rpm) durante la noche. Los estudiantes realizaron esta inoculación en ∼15 min. Alternativamente, el profesor o asistente de enseñanza puede iniciar estos cultivos. La incubación de los cultivos no debe exceder las 24 h para garantizar que los plásmidos se produzcan en células sanas.

Durante la sesión de laboratorio, se generó ADN plasmídico adecuado para PCR a partir de este cultivo utilizando un kit de aislamiento de ADN miniprep (disponible de Qiagen a un costo de aproximadamente $ 1 por preparación de plásmido). El procedimiento de minipreparación debe tomar al estudiante promedio ∼1 hy producir 50 μl de plásmido purificado a una concentración de ∼200 ng / μl.

Resúmenes de restricción

Para confirmar que la preparación del plásmido fue exitosa, se realizó una digestión de restricción de diagnóstico. A los estudiantes se les dio un mapa de plásmido y se les pidió que diseñaran una digestión de restricción que proporcionara un patrón de fragmentos característico del plásmido correcto. Por ejemplo, la digestión del vector pGFPuv con la enzima SacI o EcoRI debería producir un único fragmento de ADN linealizado de 3,3 kb como se visualiza en un gel de agarosa. Estas enzimas y protocolos de digestión se obtuvieron de fuentes comerciales (p.ej. New England Biolabs, Promega). Generalmente, se digirieron 200 ng de ADN plasmídico purificado en un volumen total de 10 µl. La digestión se puede ampliar fácilmente para digerir grandes cantidades de ADN. El volumen de enzima necesario se calculó usando la actividad de cada preparación de enzima según lo indicado por el fabricante. Una incubación de 30 minutos suele ser suficiente para que una cantidad apropiada de enzima corte específicamente la mayor parte del ADN. Si se desea, se pueden realizar digestiones más complejas utilizando más de una enzima simultáneamente. Si se persigue esta opción, los estudiantes deben seleccionar un tampón de digestión y condiciones de reacción que sean compatibles con todas las enzimas. Los fragmentos de ADN digeridos se almacenaron a -20 ° C hasta la semana siguiente.

Semana tres

Visualización de fragmentos de ADN por electroforesis a través de un gel de agarosa

Los geles E de agarosa (Invitrogen) proporcionan un método rápido y seguro para visualizar los fragmentos de ADN. Los geles no requieren tampón de electroforesis y se ejecutan en menos de 45 min. El gel de agarosa que contiene el bromuro de etidio fluoróforo está sellado entre dos placas de plástico, minimizando así la exposición de los estudiantes a este carcinógeno. Además, no se requiere tampón de carga de ADN, lo que agiliza el proceso de carga. Alternativamente, se puede usar un gel de agarosa estándar que los estudiantes vierten y que se tiñe adecuadamente para visualizar el ADN. Después de la electroforesis, los fragmentos de ADN se visualizaron usando una fuente de luz ultravioleta. En la Fig. 3 se muestra un ejemplo de un gel E al 1,2% en un transiluminador. Se cargaron aproximadamente 200 ng de ADN en cada carril (equivalente a aproximadamente 1 µl de preparación de ADN). Esta cantidad de ADN dio una banda fácilmente aparente. Es posible que se necesiten mayores cantidades de ADN para ver múltiples bandas o fragmentos de ADN más pequeños (menos de 1.0 kb de longitud). El ADN linealizado se comparó con una escalera de ADN (Sigma o New England Biolabs) para comprobar que se había obtenido un fragmento de la longitud correcta. El ADN plasmídico sin cortar produce un patrón de múltiples bandas de ADN que no se corresponden directamente con la longitud real del plásmido debido al superenrollamiento diferencial del ADN del plásmido circular. Este fue un control útil para determinar si los ADN experimentales estaban completamente cortados.

Semanas tres y cuatro

Diseño de imprimación

Para amplificar la His6-secuencia de ADNc de serpin del plásmido serpin1B (A343K), se diseñaron cebadores de PCR personalizados. Con la ayuda de los instructores, los estudiantes diseñaron y solicitaron cebadores de PCR que introdujeron sitios de restricción en los extremos del ADNc. Los cebadores constaban de dos regiones distintas: los extremos 3 'de los cebadores son complementarios al ADNc y sirvieron como molde para la extensión de la polimerasa. Los extremos 5 'de los cebadores no son complementarios del ADNc de serpina y permiten la introducción de secuencias de ADN específicas al final del producto de PCR (ver Fig.2A).

El cebador "frontal" se diseñó para introducir un nuevo sitio SacI en el producto de amplificación de ADNc de serpina de PCR, que permite la ligación al sitio SacI en el vector pGFPuv (ver Fig.2B). El extremo 3 'del cebador consistía en una región complementaria al extremo 5' de la cadena codificante de His6-cDNA de serpin. los Tmetro de esta interacción del cebador con la plantilla de ADN debe ser ∼60 ° C o superior. Una regla general es que un par G-C complementario contribuye a la Tmetro alrededor de 4 ° C, mientras que un par A-T contribuye a la Tmetro alrededor de 2 ° C. La región no complementaria 5 'del cebador incluía ADN que codificaba un residuo de glicina aguas arriba de His6 etiqueta para permitir que el dominio GFP se oriente independientemente de His6 etiqueta y la proteína serpina. La adición de la glicina también eliminó el codón de parada endógeno de GFP, lo que permitió la traducción de la secuencia de serpina-GFP de longitud completa. Finalmente, el extremo 5 'del cebador se diseñó para reconstruir los últimos codones del gen GFP, agregar un sitio SacI y una proyección de ADN para permitir la escisión del sitio SacI en His6-producto de PCR de serpin. Las enzimas de restricción a menudo requieren una proyección de ADN para escindir de manera eficiente el sitio de restricción [14]. Puede obtener más información sobre los salientes de ADN apropiados para las enzimas de restricción individuales en New England Biolabs (Beverly, MA www.neb.com).

El cebador de PCR "inverso", diseñado para unirse al extremo 5 'de la secuencia de la cadena no codificante del cDNA de serpina, introduce un sitio EcoR1 en el cDNA de serpina (ver Fig.2C). El extremo 3 'de este cebador constaba de una secuencia complementaria al ADNc de serpina. Esta sección complementaria terminaba en el codón de terminación del ADNc de serpina. La parte no complementaria de este cebador (extremo 5 ') añadió un codón de parada adicional para asegurar la terminación de la traducción y contenía el sitio de restricción EcoRI introducido. Finalmente, el extremo 3 'del cebador "trasero" contenía una proyección de ADN multibase más allá del sitio de restricción EcoRI.

Durante la última década, el costo de los cebadores de oligonucleótidos de ADN ha disminuido drásticamente y ahora se pueden solicitar cebadores en línea a compañías como Integrated DNA Technologies o Life Technologies y llegar en menos de 3 días a un costo de aproximadamente

Agradecimientos

Agradecemos a Ishan Dillon, Lacey Verkamp, ​​Monica Silver, Kate Ware, Abigail Gay, Kjersti Knox, Lauren Phillips y Zachary Seymour por su entusiasmo, diligencia y perseverancia durante el transcurso del semestre. La generosa donación de His6El ADNc de -serpin de Mike Kanost y Haobo Jiang es muy apreciado. Además, agradecemos a Melissa Foster, William Harvey, el Instituto Médico Howard Hughes (HHMI) y los Departamentos de Biología y Química de Earlham College, por la provisión de materiales y equipos utilizados en el curso de la secuencia del laboratorio. J. A. B. would like to thank HHMI and the members of Earlham College for making an enjoyable postdoctoral teaching experience possible.

.50/DNA base for a 100-nmol preparation. Therefore, primers were designed and ordered online in one laboratory period. They arrived prior to the next weekly meeting. The lyophilized primers were resuspended by vortexing to a concentration of 100 μ M in molecular biology-grade water and subsequently aliquoted and stored at −20 °C.

Week 5

PCR Amplification of the Target Sequence—

Amplification of the target sequence by PCR was performed utilizing the thermophilic enzyme Pfu Turbo (Stratagene), which has a higher fidelity than many other traditional PCR enzymes (p.ej. Taq polymerase), reducing the frequency of errors in the amplification product. A detailed protocol for PCR utilizing Pfu turbo can be obtained from Stratagene. To run the reaction, 100 ng of plasmid DNA, 100 ng of each primer, 5 μl of 10 × Pfu buffer mix, dNTPs to a concentration of 500 n M each, deionized water to 50 μl, and 1 μl of enzyme (2.5 U) were mixed in a thin-walled PCR tube. A single cycle consisted of a denaturing phase at 95 °C for 2 min, an annealing phase at 67 °C for 30 s, and finally an extension phase at 72 °C for 3 min. This sequence was repeated for 25 cycles. The following considerations should be taken into account when designing a PCR cycle. The polymerase extension time should be at least 2 min/kb of PCR product. The annealing temperature should be 5 °C lower than the lowest primer Tmetro. If a thermocycler is used without a heated lid, 30 μl of mineral oil should be laid on top of each reaction to prevent evaporation of the reaction mixture. As the PCR run time can take 3–4 h, the reactions can be started during the laboratory period and the thermocycler can be programmed to hold the reactions at 4 °C or 10 °C overnight. PCR products can then be stored for extended periods at −20 °C.

Week 6

Restriction Digestion of the PCR Product and Gene Vector—

The presence of a PCR product of the appropriate size (1.2 kb) was verified by E-gel (see Fig. 3). The concentration of PCR product may vary greatly so both a relatively large (5 μl) and small amount (1 μl) of the PCR should be loaded into the gel. The desired PCR insert should be the major product visible on the gel.

In preparation for directional insertion of the PCR fragment into the pGFPuv vector, both the PCR product and vector were cut with SacI and EcoR1. This digestion yields complementary “sticky” single-stranded ends that facilitate ligation of the insert into the linearized vector. Restriction digestions using two different enzymes can be performed simultaneously if both enzymes are active in the same buffer. The results of the restriction digestions of the vector and the PCR product were analyzed on an E-gel to ensure that they gave DNA fragments of the expected lengths. Because the restriction sites are near the end of the amplified insert, the mobility of this PCR product does not change appreciably upon digestion. Similarly, the digested vector closely resembled the singly cut vector as only a short DNA piece (less than 100 bases) was excised from the vector. This step was used to ensure that no uncut vector remained and that there were no unintended digestions in the vector and PCR product. Following the digestion, the DNA was stored at −20 °C. The single-stranded DNA “sticky” ends are especially sensitive to degradation, thus nuclease free reagents were used during all manipulations and care was taken to avoid contamination of the reactions. Finally, a preparation of vector digested with only EcoR1 was also produced in this manner for use as a positive control in the subsequent ligation reaction.

Semana 7

Spin Column Purification of Large DNA Fragments—

Large DNA fragments produced by restriction digests of the PCR product in the previous week were purified by a spin column protocol to remove contaminants. Large DNA fragments were rapidly (in less than 30 min) recovered in high purity using Qiaquick PCR spin purification columns according to the vendor's protocol (Qiagen, Valencia, CA). This step was used to remove enzymes, small DNA fragments (less then 100 bases) and undesirable buffer components. In many cloning schemes, the use of a DNA purification column may provide a rapid alternative to gel-purification techniques.

Treatment of the Vector with Calf Alkaline Intestinal Phosphatase—

After restriction digestion, the vector was treated with calf intestinal alkaline phosphatase (CIAP Promega, Madison, WI) to prevent self-ligation in the subsequent step. CIAP removes 5′ phosphates from DNA. Circular plasmids transform and replicate much more efficiently than linearized DNA. While the digestion of the vector with two different enzymes should prevented ligation of the vector alone, the use of CIAP prevents ligation of any singly cut vector, reducing the number of false positives in the subsequent ligation reactions. An excess of CIAP was used in a 30-min reaction to treat sufficient linearized vector. The vector was then immediately purified using a PCR spin column (Qiagen) to remove the CIAP enzyme. Purified vector was stored at −20 °C until the following week. An aliquot of digested vector not treated with CIAP was reserved for use as a control reaction in the ligation step. EcoRI singly cut vector was also treated with CIAP as a control.

Week 8

Reaction Ligation and Transformation—

Purified digested PCR insert and vector (treated with CIAP) were ligated to form the new recombinant plasmid pMAJILK containing the GFPuv- His6-serpin sequence (see Fig. 1). Utilizing a recently introduced quick ligation kit (New England Biolabs), the ligation incubation time was 5 min at room temperature. This allowed the ligation reaction and transformation to be completed in a single laboratory period. A molar ratio of ∼2:1 insert-to-vector was used in the reaction. At least 200 ng of linearized vector should be utilized. Initially, only half of the ligation product was used in the transformation in case the transformation was unsuccessful. Unused insert and vector were stored at −80 °C for future ligation attempts.

Transformations of the ligation products were done using high-efficiency competent cell preparations with transformation efficiencies of at least 10 6 transformants per microgram of viable plasmid DNA. The transformation reactions were plated on LB agar plates containing the appropriate antibiotic. Multiple agar plates should be used in order to plate the entire ligation reaction volume. To check the effectiveness of ligation, a sample of expression vector cut only with EcoR1 (no CIAP) was treated with ligase and compared with an untreated sample. To check the CIAP reaction, a sample of the EcoRI cut vector treated with CIAP also was included. As a negative control, a sample containing the CIAP-treated vector and insert but not exposed to ligase was also transformed. Finally, positive and negative control transformation reactions as described previously were employed to verify the effectiveness of the transformation procedure.

Week 9

Restriction Analysis of the Gene Products—

Following plating of the transformation reaction, a small number of colonies were typically observed (less than 50). A limited number of colonies (∼5) were grown in separate 2-ml cultures containing antibiotic, and a plasmid DNA isolation of each culture was performed. As described previously, these cultures were inoculated the day prior to the laboratory meeting. A diagnostic restriction digestion using EcoRI and SacI was performed to assay whether the isolated plasmids contained the recombinant insert. The digestions were stored at −20 °C until the following week.

Week 10

Agarose Gel of the Diagnostic Restriction Digest—

The diagnostic restriction digestions were visualized on an E-gel (see Fig. 3). Digestion of plasmids without the recombinant insert yielded only linearized vector. Digestion of the desired recombinant plasmids from recombinant colonies resulted in the obsevation of a liberated insert (1.2 kb) containing the His6-serpin gene as well as the linearized vector. Utilizing this procedure, our students consistently observed insert in ∼50% of the plasmid preparations. While the observation of an insert in these diagnostic restriction digests strongly indicates successful completion of the subcloning process, plasmids with inserts should be investigated further by sequencing.

Design and Ordering of Sequencing Primers—

Primers for sequencing were 22–25 bases in length and were completely complementary to the gene of interest. Selection of the site on the gene for the design of primers was based on several factors. First, the spacing of primers was approximately every 400 bases to enable complete and accurate sequencing of the entire sequence of interest. Second, the melting temperature was 55–60 °C, with a GC content of 45–60% in accordance with the requirements of the sequencing facility. Third, primers were checked for self-priming and loops using software from Integrated DNA Technologies (www.IDTDNA.com). Finally, the primers were located ∼50 bases upstream (3′) of the beginning of the sequence to be read. For some commonly used plasmids, commercially prepared sequencing primers are available.

Week 11

Sequencing of the Plasmids Containing the DNA Insert—

A crucial test of a successful cloning experiment is the sequencing of the gene insert along with flanking sections of the vector. Although automated sequencers are generally too expensive for small, liberal arts colleges, DNA sequences can be easily and inexpensively obtained through outside vendors. These vendors typically require that they be sent purified plasmid and sequencing primer. This process typically requires less than 10–12 μl of spin-column-purified plasmid sample with a concentration of 150–200 ng/μl. A typical sequencing reaction yields about 700 bases of readable sequences and costs $9–13 per reaction, depending on the company. We used Genegateway (www.genegateway.com), which cost $9 per reaction and had a very short turn-around time (less than 3 days).

Semana 12

Interpretation of the Plasmid Sequencing Results—

The sequence was transmitted from Genegateway by E-mail in a compressed file which, when expanded, gave both the original sequence chromatogram and a sequence file. An example chromatogram is shown in Fig. 4. In this method of automated sequencing, each terminal base is labeled with a different fluorescent dye [ 15 ]. As the different DNA fragments migrate through a matrix and pass a detector, the observed relative fluorescent intensities are used to determine the identity of the terminal DNA base. The automated sequence read can be aligned with the expected vector/gene sequence using a program such as ClustalW. There are many ClustalW sites on the web, such as pir.georgetown.edu/pirwww/search/multaln.html. Discrepancies between the expected and obtained DNA sequences must be investigated further. Because there can be errors in the automated reading of bases, it is highly recommended that students edit the chromatogram where discrepancies occur to ensure that the sequence read correctly corresponds with the chromatogram. Special attention should be paid to the regions of the primers because error in primer synthesis can result in unexpected mutations, and did so in one of our selected clones.


Conclusión

DNA containing d5SICS-dNaM is PCR-amplified by OneTaq polymerase with both high efficiency and fidelity. Importantly, the efficiencies and fidelities seem excellent regardless of the natural sequence context of the unnatural base pair. Moreover, the error rate with which the unnatural base pair is lost or gained, which ranges from 10 −3 to 10 −4 per nucleotide, overlaps with the error rate of fully natural DNA with commonly used commercial PCR systems, which ranges between 10 −4 and 10 −7 (40). Thus, at least for in vitro applications, d5SICS-dNaM represents a fully functional base pair, and along with the natural base pairs, it represents a fully functional, expanded genetic alphabet. It is remarkable that this unnatural base pair with proven functional equivalence to the natural base pairs relies on hydrophobic interactions for replication, without the aid of complementary H-bonding. Clearly, the natural purine and pyrimidine scaffolds that pair through complementary H-bonding are not unique solutions to the challenge of biological information storage and retrieval. With linkers added to the unnatural nucleotides (2), the unnatural base pair could be used to site-specifically modify DNA or RNA with any functionality of interest, and should find uses in different in vitro applications, even those requiring massive and sequence-independent amplification. Moreover, the efficient and high-fidelity replication and transcription of d5SICS-dNaM also suggest that it might allow for the in vivo expansion of the genetic alphabet and the creation of a semisynthetic organism with an increased potential for information storage and retrieval. Efforts toward these goals are currently underway.


Discusión

In this study, we traced a diverse panel of qPCR amplicons through the standard Illumina library construction process to define sources of bias in the Illumina sequencing process and to enable us to develop protocols that ameliorate bias. We identified the enrichment PCR step as the primary source of base-composition bias in fragment libraries and developed an optimized PCR protocol that produces libraries that are far less skewed than standard PCR-amplified Illumina libraries. We note that substantial bias is added at downstream steps on the Illumina instrument. Two of these steps, cluster amplification and sequencing-by-synthesis, also involve primer extension by DNA polymerases. Nonetheless, the benefit of a more evenly amplified fragment library carries through to the very end of the process with sequencing reads covering GC-rich and AT-rich loci that had little if any coverage before.

We found that hidden factors in the protocol, in particular the thermocycler and temperature ramp rate, can play a surprisingly big role in introducing bias. We reasoned that it would be impractical to standardize the make and model of PCR machines across the Illumina sequencing community. It would be similarly difficult to universally calibrate machine performance by adjusting the temperature ramp rates of different types of instruments. We therefore optimized the reaction conditions on the PCR machine with the fastest heating and cooling rate - the machine that performed most poorly with the standard protocol. We extended the denaturation step to provide sufficient time above the temperature threshold necessary for complete denaturation of GC-rich DNA fragments no matter how steep the thermoprofile.

Long and, presumably, complete denaturation alone does not rescue extremely GC-rich fragments in PCR reactions with Phusion HF polymerase, an enzyme with relatively weak strand-displacement activity, potentially limiting its ability to polymerize through hairpins on the template strand. Betaine may help to keep a GC-rich template single-stranded, but it may also cause premature dissociation of the newly synthesized strand from an AT-rich template.

AccuPrime Taq HiFi is a blend of taq polymerase, pyrococcus polymerase and a proprietary accessory protein added by the manufacturer to improve the priming specificity. It is conceivable that this accessory protein (which may have single-strand binding and stabilization activity) also helps to displace strands and melt hairpin structures during the polymerization. It is also possible that the excellent performance is simply due to the complementary strengths and synergy of two different enzymes working together, or to the chemical composition of the reaction buffer.

Experimental noise and imperfections in the data notwithstanding, the qPCR-based GC-bias profiles were reproducible and highly informative and predictive. Our test loci appear to be good proxies for their respective %GC bins that allow extrapolation to the genome at large - despite distinct amplification 'personalities' of individual loci.

Interestingly, PCR-induced depletion of the high-GC fraction can largely be prevented whereas under-representation of AT-rich fragments can only be slightly ameliorated at best - for example, by lowering the temperature during the primer extension. Testing additional PCR enzymes, buffers and reaction conditions will be necessary to further improve the representation of the AT-rich fraction. Ironically, it was our inability to find PCR conditions that work well for AT-rich fragments that led us to posit anti-AT bias during end-repair of adapter ligation as the root cause of the AT-deficit. However, when we examined this hypothesis directly using biotinylated adapters, we did not see significant ligation bias of a magnitude that could possibly explain the lack of AT-rich fragments in PCR-amplified fragment libraries (Figure 1).

We note that none of our conditions work equally well at rescuing, at the same time, under-representation of regions that are either extremely GC-rich or GC-poor. At the time of this writing, by our assay, PCR with AccuPrime Taq HiFi at a low primer-extension temperature is the best compromise. We did not screen and test an exhaustive list of PCR enzymes and reaction conditions. It is possible that other enzymes would perform as well or even better. Some of them may be superior in other respects, such as fidelity, size bias, cross-platform compatibility, costs or lot-to-lot variability. However, our simple and quick qPCR bias assay will enable a wider search for optimal PCR reagents and amplification conditions.

Obviously, the best way to avoid bias during PCR is to avoid library amplification by PCR altogether [6, 21]. On the other hand, PCR-free libraries require relatively large amounts of input DNA and are thus impractical for many sample types. Furthermore, there is no enrichment of sequenceable fragments carrying adapters on both ends, and the yield of such fragments is very sensitive to variations in DNA quality and purity, which in turn can affect the efficiency of end repair and adapter ligation. We also note that preparing PCR-free libraries alone does not necessarily guarantee unbiased sequencing data as significant bias is introduced elsewhere in the process.

Importantly, PCR-free protocols are not readily amenable to automation and are therefore not the best choice as the default protocol in high-throughput sequencing facilities such as the Broad Institute Genome Sequencing Platform, where currently about 1,000 Illumina sequencing libraries are made per week to support a diverse portfolio of sequencing projects. Improved PCR conditions like the one described here will likely satisfy the vast majority of projects. Enhancing the coverage of high-GC loci is critical for human genome and exome sequencing in cancer and medical genetics, the major sequencing applications in terms of bases generated. Solving the loss of AT-rich loci remains a challenge, but has less of an impact on human genome sequencing and on the sequencing field as a whole. We expect that PCR-free methods, which are invaluable and superior for extreme base compositions at both ends of the %GC spectrum, will be reserved for projects that are most sensitive to base-composition bias and can supply input DNA of sufficient quality and quantity.


Advances in Molecular Diagnosis of Malaria

Zhi Zheng , Zhibin Cheng , in Advances in Clinical Chemistry , 2017

3.2.1 LAMP

LAMP is a rapid molecular method that enables DNA amplification under isothermal conditions [52] . Turbidity caused by magnesium pyrophosphate, a by-product of the amplification reaction, is produced in proportion to the amount of amplified products. The presence of turbidity indicates the presence of amplicon. The white turbidity can be measured with a turbidimeter or observed by the naked eye, thereby eliminating dependence on expensive devices and making possible point-of-care (on-site) molecular diagnosis of malaria. In addition, result can also be interpreted using other indicates such as fluorescent dyes (e.g., SYBR green) or colorimetric dyes (e.g., Hydroxynaphthol blue) [53] . This technology is originally introduced by Notomi et al. [54] . As the developer has described, LAMP is characterized by the use of four different primers specifically designed to recognize six distinct regions on the target gene and the reaction process proceeds at a constant temperature using strand displacement reaction. Amplification and detection of gene can be completed in a single step, by incubating the mixture of samples, primers, DNA polymerase with strand displacement activity, and substrates at a constant temperature (about 65°C). It provides high amplification efficiency, with DNA being amplified 109–1010 times in 15–60 min [55] . Fig. 9 is an illustration of LAMP's basic mechanism [56] .

Figura 9. Schematic representation of the LAMP mechanism [56] . Design of the primers for LAMP. Forward inner primer (FIP): F2 sequence with F1c sequence at the 5′ end. Backward inner primer (BIP): B2 sequence with B1c sequence at the 5′ end. Outer primers are designed at the regions of F3 and B3. The LAMP method employs a single strand of DNA shaped like a dumbbell with loops at both ends. This starting material is used to initiate a cycle of amplification reactions. DNA having an inverse structure relative to the starting material is produced, and the starting material is formed again by the same reaction. This cycle produces amplified DNA products that are connected to an inverted repeat structure at the amplified region. The amplified products again pass through repeated elongation reactions, which generate amplified DNA products of various stem lengths.

LAMP was adopted for testing of P. falciparum in 2006 by Poon et al. [57] . To avoid dependence on turbidity meter and other laboratory-based equipment and thereby make possible point-of-care/field applicable DNA amplification test, Poon et al. detectado P. falciparum DNA directly from heat-treated blood by LAMP, where 50 μL of each specimen were heated at 99°C for 10 min and 2 μL of the supernatant was directly added to each LAMP assay with final volume of 25 μL. This direct LAMP assay achieved an analytical LOD of 10 copies of the plasmid DNA. The LOD for clinical samples were evaluated by serially diluting 10 clinical samples with parasite counts ranging from 72 to 46,890 parasites/μL, and the average minimal parasite counts in blood for a positive reaction was ∼ 6 parasites/μL [57] . It should be called to attention that, for samples with relatively low concentrations of parasites, only those reactions with less diluted samples were positive in the assay, indicating a compromised sensitivity in real settings for low-density infections.

The application of LAMP for the identification of other Plasmodium species was introduced by Han et al. [58] . In this study, LAMP showed a detection limit of 10 copies/reaction of the target 18S rRNA genes for P. malariae y P. ovale, and 100 copies for the genus Plasmodium: P. falciparum y P. vivax. Sensitivity and specificity of LAMP was evaluated in comparison with that of microscopic examination and nested PCR. Using microscopy as reference method, LAMP has a sensitivity of 98.5% and a specificity of 94.3%, while four samples (3.3%) had nonconcordant results between nested PCR and LAMP. Han et al. then concluded that the LAMP assay they developed for Genus- and Species-Specific Plasmodium identification can be useful for clinical diagnosis and active surveillance of malaria parasites in countries where malaria is endemic, because it (1) has a sensitivity and a specificity similar to those of nested PCR, (2) requires minimal laboratory facilities, and (3) is simpler and less expensive to perform than nested PCR [58] . While the last two points are widely accepted as key features of LAMP assay, it is still too early to conclude that LAMP, at least for this assay, is as sensitive and specific as nested PCR, since only 3 out of 71 (identified either by microscopy or nested PCR) positive samples were microscopy negative, and having high concordance with nested PCR for high-parasitemia samples does not guarantee high concordance for low-parasitemia samples. In fact, the analytical LOD of this LAMP assay was about 10–100 copies of DNA, which is inferior to qPCR assay developed by Rougemont et al. [27] , and nested PCR is usually thought to be even more sensitive than qPCR, indicating that 18S rRNA gene-based LAMP might miss a significant portion of asymptomatic infections, the parasitemia of which is usually lower than 5–10 parasites/μL.

To further reduce turnaround time and increase sensitivity, Polley et al. introduced a mitochondrial DNA-based LAMP test for malaria, in which amplification is complete within 30–40 min and is assessed by real-time turbidometry, allowing routine identification of infected samples with as few as 5 parasites/μL of blood [59] . This assay has recently been designed into a high-throughput platform using a 96-well plate format, processing 85 samples and 11 controls, using hydroxynaphthol blue as a colorimetric indicator [60] . LAMP kit based on mitochondrial gene targets for genus- and falciparum-specific detection is now commercially available, and has been tested for malaria screening in real settings in several studies since 2013 [61–63] .

In one study, at a rural Ugandan clinic, LAMP kit was evaluated for samples from 272 febrile outpatients and compared with expert microscopy, nested PCR, and quantitative PCR (qPCR). Study selection criteria included patient with documented presence of fever or self-reported history of fever within the previous 24 h, and absence of evidence of severe illness [61] . The result is shown ( Table 3 ). The study demonstrated that LAMP, using blood samples prepared with two simple methods and visualized by fluorescence under a blue light-emitting diode, far exceeded the sensitivity of expert microscopy and compared well with a reference standard of 3-well nested PCR, with very high sensitivity for infections of ≥ 1 parasite/μL. In another similar study, the kit was evaluated for screening of imported malaria among febrile returned travelers [62] . For the 705 samples tested in the survey, LAMP resulted in a sensitivity and specificity of 98.4% and 98.1%, respectively, for the LAMP P. falciparum primers and 97.0% and 99.2%, respectively, for the Plasmodium genus primers, as compared to gold standard nested PCR. Out of 15 samples with discrepant results, 11 were all negative by further analysis, suggesting false-positive LAMP results. Five of which were suspected to be resulted from a temporary source of DNA contamination in the laboratory, while six apparent false-positive LAMP results remain unexplained. These findings indicate that LAMP is capable of dramatically reduce false negative in routine malaria-endemic settings, but attentions should be paid for the occasional unexplained false positives.

Table 3 . Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Sensitivity, Compared With 3-Well Nested PCR, Stratified by qPCR–Determined Parasite Density

P. falciparum Density, a Preparation MethodSubjects, Proportion b Sensitivity, % (95% CI)
&lt 1 Parasite/μL
PURE33/50 c,d 66.0 (51.2–78.8)
Boil and spin33/50 c,d 66.0 (51.2–78.8)
≥ 1 Parasite/μL
PURE145/14997.3 (93.3–99.3)
Boil and spin146/14998.0 (94.2–99.6)
≥ 2 Parasites/μL
PURE134/13797.8 (93.7–99.5)
Boil and spin134/13797.8 (93.7–99.5)
≥ 5 Parasites/μL e
PURE119/12297.5 (93.0–99.5)
Boil and spin119/12297.5 (93.0–99.5)

Abreviaturas: CI, confidence interval P. falciparum, Plasmodium falciparum.

a Determined by qPCR. b Data are no. of samples positive by LAMP/no. of samples positive by the gold standard of nPCR. c Includes 23 samples with parasites detected by nPCR with 3-well assay but not detectable by multiplex real-time qPCR. These results are therefore assumed to represent very-low-density infections below the limit of detection of the qPCR assay (i.e., 1 parasite/μL for P. falciparum). d Of the 50 samples positive by 3-well nPCR and with a P. falciparum titer of &lt 1 parasite/μL by qPCR, 29 (58%) had parasites detected by LAMP with both PURE and boil and spin sample-preparation methods, 4 each (8%) had parasites detected only with either PURE or boil and spin, and 13 (26%) did not have parasites detected by LAMP with either sample-preparation method. e Five parasites per microliter is the lower limit of detection targeted in LAMP product specifications.

Studies discussed earlier focused on application of LAMP on diagnosis of malaria among symptomatic patients that represent majority of infections in endemic regions. Identification of which is of vital importance for successful control of the diseases. Asymptomatic and low-density malaria infections, however, are a significant challenge for areas targeting elimination, as they have been estimated to result in 20%–50% of all transmission episodes [4] . Identification of this portion of infections is now considered as top priority for malaria elimination [64] .

cocinera et al. for the first time evaluated LAMP as the diagnostic tool in a routine mass screening and treatment intervention (MSAT) and assessed its practicality and performance for detection of malaria infection compared to RDT and PCR [63] . From 996 people are being screened. RDT detected 10 infections (1.0% (95% CI 0.3–1.6)), both LAMP and PCR detected 18 (1.8% (95% CI 0.9–2.6)) infections ( Fig. 10 ). Three PCR-positive infections were not confirmed using LAMP and these three samples all had parasite densities no higher than 2 parasites/μL. Meanwhile, LAMP also detected three positive samples that were not confirmed using PCR. This discrepancy is not uncommon with a test that has a similar detection threshold as the reference standard, and the situation was also observed in previous studies [61,62] . The discrepancy could be attributed to false-positive LAMP [62] or chance discrepancy/target degradation due to the low concentration of targeted DNA [65] . This study demonstrated that LAMP, as a simple, field-friendly diagnostic which can be performed outside of laboratory conditions, could detect a higher number of infections than the currently used RDT in active screening, and therefore offers an alternative for point-of-care molecular diagnosis of malaria. But as LAMP would still miss small portion of low-density infections, and current price of commercial LAMP kit is relative high, improvement is still needed for it to replace RDT or PCR, especially in malaria elimination programs.

Figura 10. Diagram showing the distribution of positive RDT, Pan-LAMP, and PCR results [63] .


16S rRNA detection: Complete process

The first step in the detection process is sample collection and DNA extraction. Routine DNA extraction protocols like PCI or proteinase K can’t work here, we need to use a standard bacterial DNA extraction protocol or the ready to use DNA extraction kit to obtain the bacterial DNA.

In the next step, quantify the DNA and check the purity of extracted DNA. Select only the good quality DNA, if not obtained, repeat DNA extraction.

In the next step, design or select the primer pair for PCR amplification. Usually, a single set of primers specific to the 16S rRNA gene is enough to do amplification. Select only the 500bp amplification region. However, as the gene is too small we can also amplify the entire gene as well.

The reaction preparation process and quantity of each ingredient are given into the figure below. Also, the cyclic PCR conditions are given in the figure below.

The whole process, ingredients, temperature conditions and primer information are given into the figure.

PCR protocol for 50microliter PCR reaction.

  • Genomic DNA: 50 to 100ng
  • Primers: 1micromol
  • Reaction buffer 1X (Tris-KCl)
  • dNTP mix: 0.2mM
  • Taq DNA polymerase: 5U/microliter
  • MgCl2: 2mM (if required)

PCR cycling conditions:

  • Initial denaturation: 94C for 2 minutes
  • Denaturation: 94C for 1 minute
  • Annealing: 55C for 2 minutes
  • Elongation: 72C for 2 minutes
  • Final extension: 72C for 5 minutes
  • Perform PCR for 30 cycles.

Once the reaction is completed, confirm the complications on the agarose gel electrophoresis. Use only 2% or 1.8% agarose to do so. The entire process of agarose gel electrophoresis is given into the article below,

Now in the next step, purify the amplicons again using the ready to use DNA purification kit and send it for DNA sequencing.

Using a set of primers and probe the sequencing machine identifies the whole sequence of a 16S rRNA gene. After completion of the sequencing process, the data are sent to the bioinformatics lab for the evaluation of the results.

Now in the computational analysis, the entire sequence of the 16S rRNA gene is compared with the available sequence. An expert identifies alterations or variations in the hypervariable region of a gene and tries to find out its relation with other available sequences.