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¿Cómo clonar y secuenciar la transcripción de un gen de secuencia desconocida?


¿Cómo podría amplificar una transcripción genética (ARNm) de tejido animal del que se sabe poco sobre el genoma? En algunas aplicaciones, he usado PCR con transcriptasa inversa para amplificar todas las transcripciones de ARNm de células cultivadas, pero esto requería que conociera la secuencia para amplificar por PCR.

¿Cómo hago esto sin conocimiento del gen o transcipt?


Quizás pueda inspirarse en un artículo clásico sobre la clonación de lambda: Maniatis T, Hardison RC, Lacy E, Lauer J, O'Connell C, Quon D, Sim GK, Efstratiadis A. 1978. El aislamiento de genes estructurales a partir de bibliotecas de ADN eucariótico. Celda 15: 687-701.

Intente seleccionar tejidos del animal que crea que está "enriquecido" (es decir, altamente expresado) para el gen específico que está buscando. Esto puede requerir algunas adivinanzas. Por ejemplo, si el gen A está muy expresado en el tejido B, entonces puede "asumir" que la mayoría de las transcripciones de ARNm serán para el del gen A. Realice una purificación de ARN, RT-PCR y clone el ADNc en vectores lambda y recoger placas. Con un poco de suerte, podrá identificar el gen mediante la clonación, la hibridación y la posterior "caminata" cromosómica para determinar su origen estructural.

Esto se hizo en el pasado para identificar genes nuevos mucho antes de la genómica, la secuenciación o incluso la PCR.


Estructura de ARN

El ARN es típicamente monocatenario y está hecho de ribonucleótidos que están unidos por enlaces fosfodiéster. Un ribonucleótido en la cadena de ARN contiene ribosa (el azúcar pentosa), una de las cuatro bases nitrogenadas (A, U, G y C) y un grupo fosfato. La sutil diferencia estructural entre los azúcares le da al ADN una estabilidad adicional, lo que lo hace más adecuado para el almacenamiento de información genética, mientras que la inestabilidad relativa del ARN lo hace más adecuado para sus funciones más a corto plazo.

Figura ( PageIndex <1> ): (a) Los ribonucleótidos contienen el azúcar pentosa ribosa en lugar de la desoxirribosa que se encuentra en los desoxirribonucleótidos. (b) El ARN contiene pirimidina uracilo en lugar de timina que se encuentra en el ADN.

El uracilo de pirimidina específico de ARN forma un par de bases complementarias con la adenina y se usa en lugar de la timina que se usa en el ADN. Aunque el ARN es monocatenario, la mayoría de los tipos de moléculas de ARN muestran un extenso emparejamiento de bases intramoleculares entre secuencias complementarias dentro de la cadena de ARN, creando una estructura tridimensional predecible esencial para su función (Figura ( PageIndex <1> ) y Figura ( PageIndex <2> )).

Figura ( PageIndex <2> ): (a) El ADN es típicamente bicatenario, mientras que el ARN es típicamente monocatenario. (b) Aunque es monocatenario, el ARN se puede plegar sobre sí mismo, con los pliegues estabilizados por áreas cortas de apareamiento de bases complementarias dentro de la molécula, formando una estructura tridimensional.

¿En qué se diferencia la estructura del ARN de la estructura del ADN?


Evaluar la anotación

Obviamente, el problema surge de la confiabilidad de los conjuntos de referencia. Por lo general, las anotaciones manuales verificadas experimentalmente, como las producidas por GENCODE, se consideran los conjuntos de genes humanos de referencia más exhaustivos y confiables. Basados ​​en secuencias de ADNc 'auténticas', los modelos de genes anotados son, en estos casos, generalmente correctos, aunque aún quedan problemas porque, en ocasiones, la misma secuencia de ADNc puede mapearse en el genoma humano a través de estructuras exónicas alternativas. La integridad es más difícil de evaluar, porque no está claro qué tan representativo del transcriptoma humano completo es el conjunto actual de secuencias de ADNc.

Para evaluar la integridad de GENCODE, el experimento comunitario EGASP se organizó en 2005 [31]. En este experimento, se evaluaron varias predicciones computacionales frente a la anotación GENCODE. Luego, se probó un subconjunto de predicciones computacionales de alta confianza que no estaban presentes en la anotación mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) en un panel de tejidos humanos. Solo se pudo verificar un puñado de estas predicciones, lo que sugiere fuertemente la completitud de la anotación GENCODE (con respecto a las predicciones computacionales de genes que codifican proteínas). Un segundo objetivo de EGASP fue evaluar hasta qué punto los métodos puramente computacionales pueden reproducir las lentas y costosas anotaciones manuales. En este sentido, los resultados de EGASP indicaron que aunque los métodos computacionales son bastante precisos para identificar exones que codifican proteínas con una precisión general de más del 80% (en términos tanto de la fracción de exones reales correctamente identificados como de la fracción de exones predichos que son reales ), encontrar la estructura completa de la transcripción es más desafiante, ya que los métodos más precisos predicen correctamente solo alrededor del 60% de las transcripciones codificantes de proteínas anotadas. Esto indica que los métodos computacionales aún no pueden reemplazar totalmente la experiencia humana en la anotación de genes.

Después de mapear un ADNc en el genoma, es necesario evaluar el estado de codificación de proteínas de la transcripción y delimitar con precisión los límites de las posibles regiones de codificación, de modo que sea posible identificar la secuencia correcta de aminoácidos de la proteína, a partir de la cual Se inferirá la mayor parte de la biología de la transcripción. Como la evidencia directa de la existencia de la proteína generalmente está ausente, el criterio que se usa a menudo para anotar una transcripción como codificadora de proteínas es la existencia de un marco de lectura abierto (ORF). Sin embargo, este criterio ha sido cuestionado recientemente por varios métodos desarrollados para evaluar la calidad de las anotaciones de genes que codifican proteínas. Estos se basan en el principio de que los modelos de genes que entran en conflicto con nuestro conocimiento actual sobre los genes que codifican proteínas funcionales son incorrectos. Por lo tanto, el fundamento del método de Clamp et al. [9] es que los genes que codifican proteínas funcionales están sujetos a selección purificadora y, por lo tanto, se espera que muestren conservación evolutiva. Los autores utilizaron dos tipos de medidas para la evaluación de la conservación evolutiva de los genes humanos predichos: conservación del marco de lectura (RFC basado en la observación de que los indeles no afectan significativamente el tamaño de las proteínas funcionales) y frecuencia de sustitución de codones (CSF basado en la observación de que los patrones de sustitución de nucleótidos en los genes codificantes de proteínas funcionales son diferentes de los observados en el ADN aleatorio). En su análisis de una serie de conjuntos de referencias de genes humanos, Clamp et al. [9] identificó alrededor de 1200 'huérfanos' humanos: ORF que carecen de homología con genes conocidos. Tanto el análisis RFC como el CSF revelaron que el comportamiento de muchos de estos huérfanos humanos es esencialmente indistinguible del de los controles aleatorios emparejados, y es muy diferente del de los genes codificadores de proteínas no huérfanos. A partir de estos resultados, los autores concluyeron que, en general, alrededor del 15% de las entradas en los catálogos de genes investigados no son genes codificadores de proteínas válidos.

Si bien el método de control de calidad de Clamp et al. [9] puede distinguir genes que codifican proteínas de secuencias no codificantes, es menos adecuado para identificar predicciones de genes que sólo son parcialmente correctas. De hecho, si un gen anotado pierde uno o más exones, o una fracción de un exón, aún puede mostrar las características evolutivas esperadas de los genes que codifican proteínas. Para encontrar errores en los genes codificadores de proteínas anotados, el enfoque de MisPred [32-35] utiliza varios criterios que se aplican a diferentes subconjuntos de moléculas de proteína funcionalmente competentes, correctamente localizadas y correctamente plegadas. Las proteínas hipotéticas que violan cualquiera de estas reglas se consideran no funcionales y las regiones codificantes correspondientes están mal identificadas. Por ejemplo, una de las herramientas de control de calidad de este enfoque se basa en la observación de que el número de residuos en miembros estrechamente relacionados de una familia de dominios de proteínas globulares generalmente cae dentro de un rango relativamente estrecho. Por consiguiente, se puede sospechar que las proteínas que contienen dominios que consisten en un número de residuos significativamente mayor o menor que los miembros estrechamente relacionados de la misma familia no son viables y que los genes correspondientes se pueden predecir erróneamente. Varias herramientas de control de calidad en MisPred abordan la cuestión de si la proteína predicha puede llegar al compartimento celular donde podría plegarse correctamente, ser estable y funcional. El fundamento de estas herramientas es que las proteínas mal localizadas suelen estar mal plegadas, son inestables y no funcionan. Por ejemplo, es probable que las proteínas predichas que contienen dominios extracelulares pero que carecen de señales de secuencia que podrían dirigir estos dominios al espacio extracelular estén mal plegadas y no sean funcionales. Los análisis de las secuencias humanas predichas con las herramientas de MisPred revelaron que el 2,3% de las entradas de Ensembl (v41) y el 3,4% de las proteínas predichas por la tubería Gnomon del NCBI probablemente estén mal localizadas y / o mal plegadas ya que carecen de señales de secuencia apropiadas o contienen dominios que se desvían desde el tamaño normal [32].

Con un espíritu similar, la tubería EPipe [36] del consorcio BioSapiens incorpora una variedad de herramientas para evaluar las propiedades estructurales y funcionales de proteínas hipotéticas. El análisis de los péptidos GENCODE con estas herramientas reveló que muchos de los productos genéticos alternativos potenciales tienen una estructura y función marcadamente diferentes de sus contrapartes empalmadas constitutivamente. Para la gran mayoría de estas formas de empalme alternativo, hay poca evidencia de que tengan un papel como proteínas funcionales, y muchas variantes de empalme codifican proteínas anormales que están mal localizadas y / o mal plegadas [33].


14.2 Estructura y secuenciación del ADN

Al final de esta sección, podrá hacer lo siguiente:

  • Describe la estructura del ADN.
  • Explica el método Sanger de secuenciación de ADN.
  • Discutir las similitudes y diferencias entre el ADN eucariota y procariota

Los componentes básicos del ADN son los nucleótidos. Los componentes importantes del nucleótido son una base nitrogenada (portadora de nitrógeno), un azúcar de 5 carbonos (pentosa) y un grupo fosfato (Figura 14.5). El nombre del nucleótido depende de la base nitrogenada. La base nitrogenada puede ser una purina como adenina (A) y guanina (G), o una pirimidina como citosina (C) y timina (T).

Conexión visual

Las imágenes de arriba ilustran las cinco bases de ADN y ARN. Examine las imágenes y explique por qué se denominan "bases nitrogenadas". ¿En qué se diferencian las purinas de las pirimidinas? ¿En qué se diferencia una purina o pirimidina de otra, por ejemplo, adenina de guanina? ¿En qué se diferencia un nucleósido de un nucleótido?

Las purinas tienen una estructura de doble anillo con un anillo de seis miembros fusionado a un anillo de cinco miembros. Las pirimidinas son de tamaño más pequeño y tienen una estructura de anillo única de seis miembros.

El azúcar es desoxirribosa en el ADN y ribosa en el ARN. Los átomos de carbono del azúcar de cinco carbonos se numeran 1 ', 2', 3 ', 4' y 5 '(1' se lee como “un primo”). El fosfato, que hace que el ADN y el ARN sean ácidos, se conecta al carbono 5 'del azúcar mediante la formación de un enlace éster entre el ácido fosfórico y el grupo 5'-OH (un éster es un ácido + un alcohol). En los nucleótidos de ADN, el carbono 3 'del azúcar desoxirribosa está unido a un grupo hidroxilo (OH). En los nucleótidos de ARN, el carbono 2 'de la ribosa del azúcar también contiene un grupo hidroxilo. La base está adherida al 1'carbono del azúcar.

Los nucleótidos se combinan entre sí para producir enlaces fosfodiéster. El residuo de fosfato unido al carbono 5 'del azúcar de un nucleótido forma un segundo enlace éster con el grupo hidroxilo del carbono 3' del azúcar del siguiente nucleótido, formando así un enlace fosfodiéster 5'-3 '. En un polinucleótido, un extremo de la cadena tiene un fosfato 5 'libre y el otro extremo tiene un 3'-OH libre. Estos se llaman los extremos 5 'y 3' de la cadena.

En la década de 1950, Francis Crick y James Watson trabajaron juntos para determinar la estructura del ADN en la Universidad de Cambridge, Inglaterra. Otros científicos como Linus Pauling y Maurice Wilkins también estaban explorando activamente este campo. Pauling había descubierto previamente la estructura secundaria de las proteínas mediante cristalografía de rayos X. En el laboratorio de Wilkins, la investigadora Rosalind Franklin estaba usando métodos de difracción de rayos X para comprender la estructura del ADN. Watson y Crick pudieron armar el rompecabezas de la molécula de ADN sobre la base de los datos de Franklin porque Crick también había estudiado la difracción de rayos X (figura 14.6). En 1962, James Watson, Francis Crick y Maurice Wilkins recibieron el Premio Nobel de Medicina. Desafortunadamente, para entonces Franklin había muerto y los premios Nobel no se otorgan póstumamente.

Watson y Crick propusieron que el ADN está formado por dos hebras que se enrollan entre sí para formar una hélice a la derecha. El emparejamiento de bases tiene lugar entre una purina y pirimidina en hebras opuestas, de modo que A se empareja con T y G se empareja con C (sugerido por las reglas de Chargaff). Por tanto, la adenina y la timina son pares de bases complementarios, y la citosina y la guanina también son pares de bases complementarios. Los pares de bases están estabilizados por enlaces de hidrógeno: la adenina y la timina forman dos enlaces de hidrógeno y la citosina y la guanina forman tres enlaces de hidrógeno. Las dos hebras son de naturaleza antiparalela, es decir, el extremo 3 'de una hebra mira hacia el extremo 5' de la otra hebra. El azúcar y el fosfato de los nucleótidos forman la columna vertebral de la estructura, mientras que las bases nitrogenadas se apilan en el interior, como los peldaños de una escalera. Cada par de bases está separado del siguiente par de bases por una distancia de 0,34 nm, y cada vuelta de la hélice mide 3,4 nm. Por lo tanto, están presentes 10 pares de bases por vuelta de la hélice. El diámetro de la doble hélice del ADN es de 2 nm y es uniforme en todas partes. Solo el emparejamiento entre una purina y pirimidina y la orientación antiparalela de las dos cadenas de ADN pueden explicar el diámetro uniforme. La torsión de las dos hebras entre sí da como resultado la formación de ranuras mayores y menores uniformemente espaciadas (Figura 14.7).

Técnicas de secuenciación de ADN

Hasta la década de 1990, la secuenciación del ADN (leer la secuencia del ADN) era un proceso relativamente costoso y largo. El uso de nucleótidos radiomarcados también agravó el problema por motivos de seguridad. Con la tecnología disponible actualmente y las máquinas automatizadas, el proceso es más barato, más seguro y se puede completar en cuestión de horas. Fred Sanger desarrolló el método de secuenciación utilizado para el proyecto de secuenciación del genoma humano, que se utiliza ampliamente en la actualidad (Figura 14.8).

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Visite este sitio para ver un video que explica la técnica de lectura de secuencias de ADN que resultó del trabajo de Sanger.

El método de secuenciación se conoce como método de terminación de cadena didesoxi. El método se basa en el uso de terminadores de cadena, los didesoxinucleótidos (ddNTP). Los ddNTPS se diferencian de los desoxinucleótidos por la falta de un grupo 3 'OH libre en el azúcar de cinco carbonos. Si se agrega un ddNTP a una cadena de ADN en crecimiento, la cadena no se puede extender más porque el grupo 3 'OH libre necesario para agregar otro nucleótido no está disponible. Usando una proporción predeterminada de desoxinucleótidos a didesoxinucleótidos, es posible generar fragmentos de ADN de diferentes tamaños.

La muestra de ADN que se va a secuenciar se desnaturaliza (se separa en dos hebras calentándola a altas temperaturas). El ADN se divide en cuatro tubos en los que se añaden un cebador, la ADN polimerasa y los cuatro nucleósidos trifosfatos (A, T, G y C). Además, se añaden cantidades limitadas de uno de los cuatro trifosfatos de didesoxinucleósido (ddCTP, ddATP, ddGTP y ddTTP) a cada tubo, respectivamente. Los tubos están etiquetados como A, T, G y C de acuerdo con el ddNTP agregado. Para fines de detección, cada uno de los cuatro didesoxinucleótidos lleva una etiqueta fluorescente diferente. El alargamiento de la cadena continúa hasta que se incorpora un didesoxi nucleótido fluorescente, después de lo cual no tiene lugar ningún alargamiento adicional. Una vez finalizada la reacción, se realiza la electroforesis. Incluso se puede detectar una diferencia en la longitud de una sola base. La secuencia se lee en un escáner láser que detecta el marcador fluorescente de cada fragmento. Por su trabajo en la secuenciación del ADN, Sanger recibió un Premio Nobel de Química en 1980.

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La secuenciación del genoma de Sanger ha llevado a una carrera para secuenciar genomas humanos a gran velocidad y bajo costo. Obtenga más información viendo la animación aquí.

La electroforesis en gel es una técnica que se utiliza para separar fragmentos de ADN de diferentes tamaños. Por lo general, el gel está hecho de una sustancia química llamada agarosa (un polímero de polisacárido extraído de algas marinas con alto contenido de residuos de galactosa). Se añade agarosa en polvo a un tampón y se calienta. Después de enfriar, la solución de gel se vierte en una bandeja de colada. Una vez que el gel se ha solidificado, el ADN se carga en el gel y se aplica corriente eléctrica. El ADN tiene una carga neta negativa y se mueve desde el electrodo negativo hacia el electrodo positivo. La corriente eléctrica se aplica durante el tiempo suficiente para permitir que el ADN se separe según el tamaño, los fragmentos más pequeños estarán más lejos del pozo (donde se cargó el ADN) y los fragmentos de peso molecular más pesado estarán más cerca del pozo. Una vez que se separa el ADN, el gel se tiñe con un tinte específico de ADN para verlo (Figura 14.9).

Conexión Evolution

Genoma neandertal: ¿cómo nos relacionamos?

El primer borrador de secuencia del genoma neandertal fue publicado recientemente por Richard E. Green et al. en 2010. 1 Los neandertales son los antepasados ​​más cercanos de los humanos actuales. Se sabía que habían vivido en Europa y Asia occidental (y ahora, quizás, en el norte de África) antes de que desaparecieran de los registros fósiles hace aproximadamente 30.000 años. El equipo de Green estudió restos fósiles de casi 40.000 años que fueron seleccionados de sitios en todo el mundo. Se emplearon medios extremadamente sofisticados de preparación de muestras y secuenciación de ADN debido a la naturaleza frágil de los huesos y la fuerte contaminación microbiana. En su estudio, los científicos pudieron secuenciar unos cuatro mil millones de pares de bases. La secuencia neandertal se comparó con la de los humanos actuales de todo el mundo. Después de comparar las secuencias, los investigadores encontraron que el genoma del neandertal tenía entre un 2 y un 3 por ciento más de similitud con las personas que viven fuera de África que con las personas en África. Si bien las teorías actuales han sugerido que todos los humanos de hoy en día se pueden rastrear hasta una pequeña población ancestral en África, los datos del genoma neandertal sugieren cierto mestizaje entre los neandertales y los primeros humanos modernos.

Green y sus colegas también descubrieron segmentos de ADN entre personas en Europa y Asia que son más similares a las secuencias de Neandertal que a otras secuencias humanas contemporáneas. Otra observación interesante fue que los neandertales están tan estrechamente relacionados con la gente de Papúa Nueva Guinea como con los de China o Francia. Esto es sorprendente porque los restos fósiles de neandertales se han localizado solo en Europa y Asia occidental. Lo más probable es que el intercambio genético tuvo lugar entre los neandertales y los humanos modernos cuando los humanos modernos emergieron de África, antes de la divergencia de europeos, asiáticos orientales y Papúa Nueva Guinea.

Varios genes parecen haber sufrido cambios con respecto a los neandertales durante la evolución de los humanos actuales. Estos genes están involucrados en la estructura craneal, el metabolismo, la morfología de la piel y el desarrollo cognitivo. Uno de los genes de especial interés es RUNX2, que es diferente en los humanos y los neandertales de hoy en día. Este gen es responsable del hueso frontal prominente, la caja torácica en forma de campana y las diferencias dentales que se observan en los neandertales. Se especula que un cambio evolutivo en RUNX2 fue importante en el origen de los seres humanos de hoy en día, y esto afectó el cráneo y la parte superior del cuerpo.

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Vea la charla de Svante Pääbo que explica la investigación del genoma neandertal en la conferencia anual TED (Tecnología, Entretenimiento, Diseño) de 2011.

Empaquetado de ADN en células

Los procariotas son mucho más simples que los eucariotas en muchas de sus características (figura 14.10). La mayoría de los procariotas contienen un cromosoma circular único que se encuentra en un área del citoplasma llamada región nucleoide.

Conexión visual

En las células eucariotas, la síntesis de ADN y ARN se produce en un compartimento separado de la síntesis de proteínas. En las células procariotas, ambos procesos ocurren juntos. ¿Qué ventajas podría tener separar los procesos? ¿Qué ventajas podría tener que ocurran juntos?

El tamaño del genoma en uno de los procariotas mejor estudiados, E. coli, es de 4,6 millones de pares de bases (aproximadamente 1,1 mm, si se corta y se estira). Entonces, ¿cómo encaja esto dentro de una pequeña célula bacteriana? El ADN se tuerce mediante lo que se conoce como superenrollamiento. El superenrollamiento sugiere que el ADN está "subenrollado" (menos de una vuelta de la hélice por cada 10 pares de bases) o "sobreenrollado" (más de 1 vuelta por cada 10 pares de bases) de su estado relajado normal. Se sabe que algunas proteínas están involucradas en el superenrollamiento de otras proteínas y enzimas como la ADN girasa ayudan a mantener la estructura superenrollada.

Los eucariotas, cuyos cromosomas consisten cada uno en una molécula de ADN lineal, emplean un tipo diferente de estrategia de empaquetamiento para encajar su ADN dentro del núcleo (Figura 14.11). En el nivel más básico, el ADN está envuelto alrededor de proteínas conocidas como histonas para formar estructuras llamadas nucleosomas. Las histonas son proteínas conservadas evolutivamente que son ricas en aminoácidos básicos y forman un octámero compuesto por dos moléculas de cada una de cuatro histonas diferentes. El ADN (recuerde, está cargado negativamente debido a los grupos fosfato) está envuelto firmemente alrededor del núcleo de histonas. Este nucleosoma se vincula al siguiente con la ayuda de un ADN enlazador. Esto también se conoce como estructura de “cuentas en una cuerda”. Con la ayuda de una quinta histona, una cadena de nucleosomas se compacta aún más en una fibra de 30 nm, que es el diámetro de la estructura. Los cromosomas en metafase se condensan aún más por asociación con proteínas de andamiaje. En la etapa de metafase, los cromosomas son más compactos, aproximadamente 700 nm de ancho.

En la interfase, los cromosomas eucariotas tienen dos regiones distintas que se pueden distinguir por tinción. La región compacta se conoce como heterocromatina y la región menos densa se conoce como eucromatina. La heterocromatina generalmente contiene genes que no se expresan y se encuentra en las regiones del centrómero y los telómeros. La eucromatina generalmente contiene genes que se transcriben, con ADN empaquetado alrededor de nucleosomas pero no más compactado.

Notas al pie

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    • Autores: Mary Ann Clark, Matthew Douglas, Jung Choi
    • Editor / sitio web: OpenStax
    • Título del libro: Biología 2e
    • Fecha de publicación: 28 de marzo de 2018
    • Ubicación: Houston, Texas
    • URL del libro: https://openstax.org/books/biology-2e/pages/1-introduction
    • URL de la sección: https://openstax.org/books/biology-2e/pages/14-2-dna-structure-and-sequencing

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    Reacción en cadena de la polimerasa

    El análisis de ADN a menudo requiere centrarse en una o más regiones específicas del genoma. También implica con frecuencia situaciones en las que sólo una o unas pocas copias de una molécula de ADN están disponibles para su posterior análisis. Estas cantidades son insuficientes para la mayoría de los procedimientos, como la electroforesis en gel. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica utilizada para aumentar rápidamente el número de copias de regiones específicas de ADN para análisis adicionales (Figura 10.4). La PCR utiliza una forma especial de ADN polimerasa, la enzima que replica el ADN, y otras secuencias cortas de nucleótidos llamadas cebadores que se emparejan con una parte específica del ADN que se replica. La PCR se usa para muchos propósitos en los laboratorios. Estos incluyen: 1) la identificación del propietario de una muestra de ADN dejada en la escena del crimen 2) el análisis de paternidad 3) la comparación de pequeñas cantidades de ADN antiguo con organismos modernos y 4) la determinación de la secuencia de nucleótidos en una región específica.

    Figura 10.4 La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, se usa para producir muchas copias de una secuencia específica de ADN usando una forma especial de ADN polimerasa. Figura que muestra la PCR en 4 pasos. Primero, la doble hebra de ADN se desnaturaliza a 95 grados Celsius para separar las hebras. A continuación, se recocen las 2 hebras a aproximadamente 50 grados Celsius utilizando imprimaciones. La ADN polimerasa luego extiende las nuevas hebras a 72 grados Celsius. El cuarto paso muestra que este procedimiento se lleva a cabo muchas veces, lo que resulta en un aumento de copias del ADN original.

    ¿Cómo puede un ARN & # x27 saber & # x27 qué hebra de ADN copiar durante la transcripción?

    Dado que el ARN es monocatenario y cada codón de base codifica un aminoácido, la cadena de ADN que se copia influye en gran medida en la proteína que se forma. Si ambas hebras tuvieran la posibilidad de ser copiadas, entonces podría tener dos proteínas codificadas por un gen. Proteínas que podrían tener funciones muy diferentes. ¿Es correcto mi entendimiento? Pregunta adicional: Además, ¿ya que tiene dos copias de cada gen a lo largo de cada cromosoma? ¿Qué determina qué cromosoma se copia?

    A modo de introducción, el ADN está formado por nucleótidos, que a su vez están formados por las nucleobases que probablemente conozca (A, T, G y C en el ADN). Cada uno de estos nucleósidos contiene un azúcar de cinco carbonos (desoxirribosa, en el ADN). Todos los azúcares en el ADN se juntan en la misma dirección, de modo que el quinto carbono de un azúcar se une con el tercer carbono del siguiente azúcar, su quinto carbono se une al tercer carbono del siguiente azúcar y así sucesivamente.

    Esto significa que cada hebra tiene dos extremos, uno termina en el quinto carbono (el extremo 5 & # x27 (5 principal)), mientras que el otro extremo es el tercer carbono (el extremo 3 & # x27). La otra hebra se invierte, de modo que donde una hebra tiene el extremo 5 & # x27, la otra tiene el extremo 3 & # x27.

    Ahora la transcripción en eucariotas solo ocurre en una dirección: 3 & # x27 a 5 & # x27. Es decir, la ARN polimerasa desciende una hebra desde el extremo 3 & # x27 hacia el extremo 5 & # x27. La hebra que lee se llama hebra antisentido, porque el ARN que sale se verá como la otra hebra, la hebra con sentido (debido al emparejamiento complementario de los nucleótidos, a excepción de U que reemplaza a T).

    Ahora, cada hebra tiene una dirección en 3 & # x27 a 5 & # x27, por lo que ambos pueden ser leídos por ARN, siempre que haya una secuencia de inicio que diga & quot; ¡Aquí & # x27 hay un gen para leer! & Quot. Curiosamente, esto significa que los genes pueden superponerse, y la hebra antisentido de un gen podría ser la hebra con sentido de un gen diferente que lee esa hebra desde la otra dirección para un gen diferente.

    EDITAR: Me acabo de dar cuenta de que olvidé responder a su pregunta original. El ARN sabe cuales hebra para copiar porque encuentra la secuencia de código que dice "Aquí" hay un gen para leer, denominado promotor, que hace que una ARN polimerasa se una a la hebra y transcriba el código en la dirección 3 & # x27 a 5 & # x27, creando ARNm, hasta que alcanza una secuencia que le dice a la polimerasa que se detenga.


    & ltp> Esta sección proporciona información sobre la proteína y los nombres y sinónimos del gen y sobre el organismo que es la fuente de la secuencia de la proteína. & ltp> & lta href = '/ help / names_and_taxonomy_section' target = '_ top'> Más. & lt / a> & lt / p> Nombres y taxonomía i

      & ltp> Un UniProt & lta href = "http://www.uniprot.org/manual/proteomes%5Fmanual"> proteoma & lt / a> puede constar de varios componentes. & ltbr> & lt / br> El nombre del componente se refiere a la codificación del componente genómico un conjunto de proteínas. & ltp> & lta href = '/ help / proteome_component' target = '_ top'> Más. & lt / a> & lt / p> Componente i: Cromosoma 3

    Bases de datos de organismos específicos

    Portal de información de Arabidopsis

    El recurso de información de Arabidopsis


    ¿Cómo funciona el ADN?

    En el genoma humano hay entre 50.000 y 100.000 genes. A medida que la ADN polimerasa copia la secuencia de ADN, se producen algunos errores. Por ejemplo, una base de ADN en un gen puede sustituirse por otra. A esto se le llama mutación (específicamente un mutación puntual) o variación en el gen. Debido a que el código genético tiene redundancias incorporadas, este error podría no tener mucho efecto sobre la proteína producida por el gen. En algunos casos, el error puede estar en la tercera base de un codón y aún especificar el mismo aminoácido en la proteína. En otros casos, puede estar en otra parte del codón y especificar un aminoácido diferente. Si el aminoácido modificado no se encuentra en una parte crucial de la proteína, es posible que no haya efectos adversos. Sin embargo, si el aminoácido modificado se encuentra en una parte crucial de la proteína, entonces la proteína puede ser defectuosa y no funcionar tan bien o, en absoluto, este tipo de cambio puede provocar una enfermedad.

    Otros tipos de mutaciones en el ADN pueden ocurrir cuando pequeños segmentos de ADN se desprenden del cromosoma. Estos segmentos pueden volver a colocarse en otro lugar del cromosoma e interrumpir el flujo normal de información. Este tipo de mutaciones (deleciones, inserciones, inversiones) suelen tener graves consecuencias.

    Como se señaló anteriormente, hay mucho ADN adicional en el genoma humano que no codifica proteínas. Lo que hace este ADN extra no codificante está siendo investigado activamente. Quizás algo sea simplemente espaciamiento para mantener los genes a cierta distancia separados para las enzimas de transcripción. Algunos pueden ser lugares donde los productos químicos ambientales pueden unirse y afectar la transcripción y / o traducción del ADN. Además, dentro de este ADN adicional, hay muchas secuencias de variación que se utilizan en la tipificación del ADN (consulte Cómo funciona la evidencia de ADN).

    Secuencia ADN

    El Proyecto del Genoma Humano (HGP) se inició en la década de 1990 con el objetivo de determinar la secuencia de todo el genoma humano. ¿Qué genes estaban presentes? ¿Dónde estaban ubicados? ¿Cuáles fueron las secuencias de los genes y el ADN intermedio (ADN no codificante)? Esta tarea fue monumental, siguiendo la orden del Proyecto Apolo de EE. UU. Para colocar a un hombre en la Luna. Los científicos y contratistas de HGP desarrollaron nuevas tecnologías para secuenciar el ADN que eran automatizadas y menos costosas.

    Básicamente, para secuenciar el ADN, colocas todas las enzimas y nucleótidos (A, G, C y T) necesarios para copiar el ADN en un tubo de ensayo. Un pequeño porcentaje de los nucleótidos tiene un tinte fluorescente adherido a ellos (un color diferente para cada tipo). Luego, coloca el ADN que desea secuenciar en el tubo de ensayo y déjelo incubar por un tiempo.

    Durante el proceso de incubación, la muestra de ADN se copia una y otra vez. Para cualquier copia dada, el proceso de copia se detiene cuando se le coloca un nucleótido fluorescente. Entonces, al final del proceso de incubación, tiene muchos fragmentos del ADN original de diferentes tamaños y terminando en uno de los nucleótidos fluorescentes. Para ver una animación de este proceso de secuenciación de ADN, visite DNA Interactive, vaya a Técnicas, luego Clasificación y secuenciación.

    La tecnología del ADN seguirá desarrollándose a medida que intentemos comprender cómo funcionan e interactúan los elementos del genoma humano con el medio ambiente.

    Para obtener mucha más información sobre el ADN y temas relacionados, consulte los enlaces a continuación.

    Un gen en su ADN codifica para un enzima (tipo de proteína que acelera una reacción química) que le permite descomponer un aminoácido específico llamado fenilalanina encontrado en la leche. En algunas personas, este gen falta o está defectuoso. No producen la enzima y no pueden degradar la fenilalanina. Cuando son bebés, si estas personas reciben leche o productos lácteos con regularidad, la fenilalanina ininterrumpida se acumulará y causará daño cerebral (la enfermedad se llama fenilcetonuria). Afortunadamente, se realiza una prueba genética al nacer que puede identificar a estos bebés, que luego pueden ser alimentados con productos lácteos que carecen de fenilalanina (como la leche de soja).


    Transcripción inversa (síntesis de ADNc)

    La síntesis de ADN a partir de una plantilla de ARN, mediante transcripción inversa, produce ADN complementario (ADNc). Las transcriptasas inversas (RT) utilizan una plantilla de ARN y un cebador corto complementario al extremo 3 'del ARN para dirigir la síntesis de la primera hebra de ADNc, que se puede usar directamente como plantilla para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta combinación de transcripción inversa y PCR (RT-PCR) permite la detección de ARN de baja abundancia en una muestra y la producción del ADNc correspondiente, facilitando así la clonación de genes de baja copia. Alternativamente, el ADNc de la primera hebra puede hacerse de doble hebra usando ADN polimerasa I y ADN ligasa. Estos productos de reacción se pueden utilizar para la clonación directa sin amplificación. En este caso, se requiere la actividad de la ARNasa H, ya sea de la RT o suministrada de forma exógena.

    Muchos RT están disponibles en proveedores comerciales. La transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV) y la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV, MMLV) son RT que se utilizan comúnmente en los flujos de trabajo de biología molecular. La transcriptasa inversa M-MuLV carece de actividad exonucleasa 3 & aguda & rarr 5 & aguda. La transcriptasa inversa ProtoScript & reg II es una transcriptasa inversa M-MuLV recombinante con actividad de RNasa H reducida y termoestabilidad aumentada. Puede usarse para sintetizar el ADNc de la primera hebra a temperaturas más altas que el M-MuLV de tipo salvaje. La enzima es activa hasta 50 ° C, proporcionando mayor especificidad, mayor rendimiento de cDNA y más producto de cDNA de longitud completa, hasta 12 kb de longitud.

    El uso de RT modificadas mejora la eficiencia de la formación de productos de longitud completa, asegurando que la copia del extremo 5 'de la transcripción de ARNm sea completa y permitiendo la propagación y caracterización de una copia fiel de ADN de una secuencia de ARN. El uso de RT más termoestables, donde las reacciones se realizan a temperaturas más altas, puede ser muy útil cuando se trata de ARN que contiene grandes cantidades de estructura secundaria.

    Si necesita ayuda para comparar los reactivos de síntesis de ADNc y RT disponibles, consulte nuestra tabla de selección de síntesis de ADNc / RT.

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    Ver el vídeo: Técnicas, Clonación y PCR (Enero 2022).