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¿Cuándo y cómo se desarrollan las células marcapasos durante el proceso de agregación celular de Dictyostelium discoideum?

¿Cuándo y cómo se desarrollan las células marcapasos durante el proceso de agregación celular de Dictyostelium discoideum?


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Estaba leyendo un artículo de Tang & Othmer sobre oscilaciones y ondas en Dictyostelium discoideum. Bajo ciertas condiciones como el período de inanición en el ciclo de vida de un Dictyostelium discoideum comunidad, se convierten en un organismo multicelular en un proceso de agregación celular. He leído sobre Marcapasos células entre estos individuos que transmite periódicamente acampar y atrae a otras células hacia ellos.

Entonces me preguntaba: ¿Cuándo y cómo se desarrollan estas células marcapasos de una célula "normal" a una célula marcapasos que excreta cAMP?

Referencias, enlaces o respuestas me serían de gran ayuda.


La desincronización de las células en el camino del desarrollo desencadena la formación de ondas espirales de AMPc durante Dictyostelium & # x02009agregación

Considerando que es relativamente fácil tener en cuenta la formación de ondas concéntricas (objetivo) de cAMP en el curso de Dictyostelium discoideum agregación después de la inanición, el origen de las ondas espirales permanece oscuro. Investigamos un mecanismo fisiológicamente plausible para la formación espontánea de ondas espirales de cAMP en D. discoideum. El escenario se basa en la ruta de desarrollo asociada con los cambios continuos en la actividad de enzimas como la adenilato ciclasa y la fosfodiesterasa que se observan durante las horas que siguen a la inanición. Estos cambios llevan a las células sucesivamente de un estado no excitable a un estado excitable en el que transmiten pulsos de AMPc supraumbrales y luego a oscilaciones autónomas de AMPc, antes de que el sistema vuelva a un estado excitable. Al analizar un modelo de señalización de AMPc basado en la desensibilización del receptor, mostramos que la desincronización de las células en esta ruta de desarrollo desencadena la formación de espirales de AMPc completamente desarrolladas. Los caminos de desarrollo que no corresponden a la secuencia de transiciones dinámicas sin relé-relé-oscilaciones-relé son menos capaces o no dan lugar a la formación de espirales.

La agregación de Dictyostelium discoideum las amebas después de la inanición constituyen uno de los mejores ejemplos de formación de patrones espacio-temporales a nivel supracelular. Esta transición de una etapa unicelular a una multicelular del ciclo de vida se produce por una respuesta quimiotáctica a las señales de AMP cíclico (cAMP) emitidas por los centros de agregación de manera periódica (1 & # x020133). Las amebas son capaces de transmitir las señales emitidas periódicamente por un centro ubicado en su vecindad. Esta respuesta excitable a las señales periódicas explica la naturaleza ondulatoria de la agregación sobre territorios cuyas dimensiones pueden alcanzar hasta 1 cm: dentro de cada territorio de agregación, las amebas se mueven hacia un centro en ondas concéntricas o espirales con una periodicidad del orden de 5 a 10 min. (4 & # x020136). Las ondas de movimiento celular se correlacionan con las ondas de AMPc (7), estas últimas presentan una sorprendente similitud con las ondas observadas en sistemas químicos oscilatorios como la reacción de Belousov & # x02013Zhabotinsky (8).

Como muestran las simulaciones por computadora que utilizan un modelo para la retransmisión de AMPc y oscilaciones basadas en la desensibilización del receptor propuesto por Martiel y Goldbeter (9, 10), las ondas concéntricas pueden explicarse fácilmente asumiendo la existencia de un marcapasos que genera pulsos periódicos de AMPc en medio de un campo de células excitables. Es mucho más difícil explicar el origen de las ondas espirales de AMPc que ocurren espontáneamente. Un artificio común para obtener espirales, también utilizado para Dictyostelium (11 & # x0201314), consiste en romper ondas concéntricas o planas cuando el medio es excitable, se desarrollan espirales en los extremos de la onda rota. Más recientemente, P & # x000e1lsson y Cox (15) han utilizado el modelo antes mencionado (9) para mostrar que la generación aleatoria de pulsos de AMPc después del paso de una onda puede dar lugar a la formación de espirales. Levine et al. (16) también consideraron la generación aleatoria de pulsos de AMPc en un modelo híbrido que incluía la producción de AMPc y el movimiento celular y demostraron que el desarrollo de espirales se ve favorecido por la retroalimentación ejercida por las señales de AMPc sobre la excitabilidad del sistema. También se demostró que la incorporación de la variación de la densidad celular debida a la quimiotaxis (17) favorece, en presencia de un marcapasos, la formación espontánea de ondas espirales.

Aquí proponemos un escenario fisiológicamente plausible, basado únicamente en las propiedades celulares, para la aparición de ondas espirales de AMPc en las primeras etapas de D. discoideum agregación. Tomamos en cuenta la ontogénesis del sistema de señalización cAMP al permitirle evolucionar en la ruta de desarrollo (18, 19) que lleva este sistema sucesivamente de un estado no excitable a un estado en el que muestra la propiedad de retransmisión, y desde un estado tan excitable. estado en el dominio de oscilaciones sostenidas de AMPc, antes de que el sistema se vuelva excitable nuevamente. Las transiciones entre los diferentes modos de comportamiento dinámico son provocadas por cambios continuos en parámetros bioquímicos como la actividad de la adenilato ciclasa y fosfodiesterasa en las horas posteriores a la inanición. Nuestros resultados indican que las ondas espirales de AMPc se originan naturalmente a partir de la desincronización de las células en el camino del desarrollo.

Modelo de señalización cAMP basado en la desensibilización del receptor

En el modelo de oscilaciones de cAMP en Dictyostelium Basado en la desensibilización reversible del receptor cAMP (9, 10), el cAMP extracelular se une al receptor, que existe en dos estados (20), uno de los cuales es activo (R) y el otro desensibilizado (D). Solo el complejo formado por AMPc con el receptor en estado R es capaz de activar la adenilato ciclasa, la enzima que sintetiza AMPc. Un circuito de retroalimentación positiva surge del transporte de AMPc intracelular al medio extracelular donde se une al receptor de AMPc y es hidrolizado por la fosfodiesterasa. Este modelo explica la síntesis oscilatoria de la señal de AMPc, con una periodicidad de 5 a 10 min (21), y la alternancia periódica que la acompaña entre los estados fosforilado (D) y desfosforilado (R) (22). El modelo predice que el intervalo entre dos picos de AMPc & # x02014 y, en consecuencia, el período de las oscilaciones & # x02014 se establece principalmente por el tiempo necesario para la resensibilización del receptor de AMPc.

El modelo de señalización de AMPc se rige por el siguiente sistema de tres ecuaciones diferenciales que dan la evolución en el tiempo de la fracción total del receptor de AMPc activo (& # x003c1T) y las concentraciones normalizadas de AMPc intracelular (& # x003b2) y extracelular (& # x003b3) (9):

Según lo considerado por Tyson y Murray (11), lo hemos incorporado a la ecuación. 1c la difusión de cAMP en el medio extracelular. En este estudio, ignoramos el movimiento quimiotáctico de las células, para enfocarnos mejor en los aspectos bioquímicos y de desarrollo del mecanismo de formación de espirales.

Ruta de desarrollo del sistema de señalización cAMP

Además de tener en cuenta la transmisión de pulsos de AMPc supraumbral y las oscilaciones autónomas de AMPc, el modelo también proporciona una explicación de la secuencia de transiciones de desarrollo sin relé-relé-oscilaciones-relé observadas durante las horas que siguen a la inanición (23). Aunque la ruta de desarrollo real tiene lugar en un espacio de parámetros de dimensiones superiores, el análisis teórico muestra que el aumento continuo de las actividades de la adenilato ciclasa y la fosfodiesterasa después de la inanición (24 & # x0201326) es suficiente para explicar estas transiciones del desarrollo (18, 19). . Desde este punto de vista, los centros de agregación serían aquellas células que serían las primeras en alcanzar el dominio de oscilaciones sostenidas y autónomas de cAMP como resultado de un aumento progresivo de las actividades de la adenilato ciclasa y la fosfodiesterasa. Tal fenómeno proporciona un prototipo para la ontogénesis de los ritmos biológicos, al mostrar cómo los cambios continuos en los parámetros bioquímicos & # x02014 asociados aquí con la síntesis de enzimas o receptores & # x02014 pueden conducir a la aparición de oscilaciones autónomas una vez que se excede un valor crítico de un parámetro de control. (10).

Hemos establecido el diagrama que muestra los diferentes modos de comportamiento dinámico del sistema de señalización cAMP en función de los dos parámetros principales del modelo regido por las Ecs. 1a & # x020131c, es decir, la actividad máxima (& # x003c3) de la adenilato ciclasa y la constante de velocidad de la fosfodiesterasa extracelular (kmi). Los dominios S, E y O en la Fig. & # X200B Fig.1 1 corresponden, respectivamente, a las regiones en las que el sistema de señalización de cAMP alcanza un estado estacionario estable no excitable, un estado estacionario excitable u oscilaciones autónomas de cAMP. La excitabilidad se determina aquí como la capacidad del sistema para propagar sin atenuación una onda de AMPc iniciada por un pulso de AMPc supraumbral aplicado en el centro del sistema distribuido espacialmente.

Diagrama de estabilidad que muestra los diferentes modos de comportamiento dinámico del sistema de señalización de cAMP en la adenilato ciclasa (& # x003c3) -fosfodiesterasa (kmi) espacio de parámetros. Las diferentes regiones son las de un estado estable, no excitable (S), excitabilidad (E) (definida aquí como la capacidad de mantener sin atenuación la propagación de una onda de AMPc sobre una elevación supraumbral de AMPc extracelular), oscilaciones autónomas sostenidas de AMPc (O) y biestabilidad (B), que denota la coexistencia de dos estados estables estables (este último comportamiento, para el cual no existe hasta ahora soporte experimental, no se considera aquí). Las flechas se refieren a posibles rutas de desarrollo seguidas por el sistema de señalización en este espacio de parámetros como resultado de la variación en las actividades enzimáticas durante las horas que siguen a la inanición. Como se muestra en el texto, solo la ruta 3 da lugar a la formación de espirales de AMPc estables y completamente desarrolladas. El diagrama ha sido establecido por análisis de estabilidad lineal e integración numérica de Ecs. 1a & # x020131c para los valores de los parámetros enumerados en la última columna de la tabla 2 en la ref. 9, excepto los valores de k1, k-1, k2, k-2, que se han multiplicado por un factor de 2,5 para obtener ondas con un período del orden de 5 min en la Fig. & # x200B Fig.6. 6. Para la ruta 2, & # x003c3 = 0,6 min & # x022121.

De las tres rutas de desarrollo distintas consideradas en la Fig. & # X200B Fig. 1, solo la ruta 3 representa la secuencia observada de transiciones sin relé-relé-oscilaciones-relé. Este camino corresponde al aumento progresivo de la actividad de las dos enzimas observado durante las horas que siguen a la inanición (24 & # x0201326). Demostraremos que la naturaleza de la variación en & # x003c3 y kmi afecta notablemente a la formación de ondas cAMP. La ruta de desarrollo 3 se comparará con las rutas 1 y 2 para las que kmi o & # x003c3 permanecen constantes, respectivamente, como se desprende de la Fig. & # x200B Fig.1, 1, los dos últimos caminos corresponden a diferentes secuencias de transiciones dinámicas.

Inicio de ondas espirales de cAMP

Ahora determinamos la evolución espacio-temporal de AMPc en un medio bidimensional representado por una cuadrícula espacial de típicamente 100 & # x000d7 100 puntos correspondientes a un área de 1 cm 2 cubierta por una capa de celdas, los resultados permanecen cualitativamente sin cambios cuando se considera una estructura más fina. cuadrícula espacial. Los elementos de la cuadrícula (100 & # x003bcm & # x000d7 100 & # x003bcm) corresponden a grupos de aproximadamente 10 celdas, esto representa una densidad del orden de 10 5 celdas / cm 2, que está por encima de la densidad de celda crítica de 2.5 & # x000d7 Se encontraron 4 celdas / cm 2 para el relé (27). Por lo tanto, las presentes simulaciones se basan en la suposición fisiológicamente plausible (ver Discusión) que grupos de aproximadamente 10 celdas en cada & # x0201cpatch & # x0201d de la cuadrícula se comportan sincrónicamente con respecto a su desarrollo.

A diferencia de otros (15, 16), no sometemos el sistema a ningún tipo de pulsación aleatoria o periódica de cAMP. Buscando condiciones fisiológicamente plausibles que den lugar a la formación espontánea de ondas espirales, primero intentamos incorporar una distribución espacial aleatoria de parámetros como & # x003c3 o / y kmi pero siempre falló en generar espirales estables en tales condiciones. Luego incluimos una variación temporal homogénea en estos parámetros correspondiente a la evolución sincrónica de todas las células a lo largo de las rutas de desarrollo 1, 2 o 3 consideradas en la Fig. & # X200B Fig.1. 1. Una vez más, las espirales estables nunca se generaron de esa manera.

La clave para la formación de espirales estables es la desincronización de las células en el camino del desarrollo. Hasta 10 5 células pueden agregarse alrededor de un centro, es inevitable que estas células en cualquier momento no posean exactamente las mismas cantidades de enzimas y no comiencen su desarrollo después de la inanición en las mismas condiciones iniciales, aunque solo sea porque están atrapadas por la inanición. en diferentes etapas del ciclo celular (29 & # x0201331). Esta heterogeneidad debida a la distribución de fase del ciclo celular se invocó previamente para explicar la asincronía en el desarrollo de la competencia de retransmisión (27) y la aparición de oscilaciones de AMPc (30) en Dictyostelium células. Para caracterizar esta heterogeneidad bioquímica, consideraremos que al comienzo de la inanición las células se distribuyen a lo largo del camino del desarrollo. Como cada punto del camino corresponde a un tiempo particular, esto equivale a considerar una distribución de tiempos de inicio (positivos) (ts) para las células que evolucionan a lo largo de la misma ruta de desarrollo. Esto asegurará que algunas celdas estén más avanzadas que otras en esta ruta: las más grandes ts, más avanzadas están las células en su desarrollo.

La probabilidad de la hora de inicio se tomará como una exponencial decreciente:

El parámetro & # x00394 mide la desincronización de las células en la ruta de desarrollo. Cuanto más grande & # x00394, más heterogénea es la distribución de las células en esta ruta, a la inversa, cuando & # x00394 = 0, todas las células evolucionan sincrónicamente. Integración de Eq. 3 muestra que 90 & # x00025 (99 & # x00025) de celdas tendrán un valor de ts entre 0 y 2,3 (4,6) & # x00394. La distribución exponencial se mantuvo para asegurar que un pequeño porcentaje de celdas esté más avanzado que el resto de la ruta, de modo que una fracción diminuta alcance primero el dominio oscilatorio. Se obtienen resultados similares cuando se utilizan distribuciones distintas de la exponencial, por ejemplo, uniforme durante un intervalo de tiempo prescrito.

En la Fig. & # X200B Fig.2 2 son las distribuciones de los tiempos de inicio a lo largo de la ruta de desarrollo 1 (ver Fig. & # X200B Fig.1) 1) para & # x00394 = 50 min (histograma gris) y 100 min ( histograma en blanco), respectivamente. La curva continua en la Fig. & # X200B Fig.2 2 muestra la variación del parámetro & # x003c3 en función del tiempo (kmi permanece constante a lo largo de este camino). A medida que aumenta & # x003c3, el sistema de señalización cAMP cruza sucesivamente los dominios (separados por las líneas verticales punteadas) de estados estacionarios no excitables (S), estados excitables (E) y comportamiento oscilatorio autónomo (O).

Ruta de desarrollo 1 (ver Fig. & # X200B Fig.1) 1) y distribución de los tiempos de inicio en esta ruta. La línea continua da la evolución temporal del parámetro & # x003c3 (en min & # x022121) según la ecuación & # x003c3 (t) = 0,3 & # x0002b 0,25 tanh & # x0005b (t & # x02212 250) / 90 & # x0005d donde el tiempo t se expresa en min. Se puede obtener una evolución sigmoidea similar utilizando una ecuación logística para & # x003c3 (t). El aumento de & # x003c3 lleva el sistema de señalización sucesivamente a través de las regiones de no excitabilidad (S), excitabilidad (E) y oscilaciones autónomas (O) definidas en la Fig. & # X200B Fig.1. 1. Los histogramas muestran la distribución de los tiempos de inicio agrupados en intervalos de 20 min, generados según la Ec. 3 para & # x00394 = 50 min (barras grises) o 100 min (barras vacías). El tiempo de inicio de una celda en particular viene dado por la abscisa del punto en la curva & # x003c3 (t) en el que esta celda comienza su progresión en esta curva.

Para estudiar la evolución espacio-temporal del sistema de señalización, consideramos una distribución espacialmente aleatoria de los valores del parámetro & # x003c3 en el que este parámetro comienza a aumentar en la ruta de desarrollo. Esta distribución espacial heterogénea de & # x003c3 se sigue de la distribución de probabilidad del inicio. tiempos dados por la Ec. 3. En la Fig. & # X200B Fig.3, 3, mostramos la evolución espacio-temporal obtenida para & # x00394 = 50 min (A) y 100 min (B). En cada caso, la fila superior muestra la concentración de cAMP extracelular (& # x003b3) en los diferentes tiempos indicados en minutos en la esquina superior izquierda de los paneles, la fila inferior muestra la distribución de células en la ruta de desarrollo en los momentos correspondientes ( cada círculo representa 5 & # x00025 del número total de celdas consideradas). Para & # x00394 = 50 min, casi todas las células están inicialmente en el estado no excitable (ver también Fig. & # X200B Fig. 2) 2) Se observa que se desarrollan ondas concéntricas (diana) de cAMP después de aproximadamente 4 h. No se observa ninguna espiral en estas condiciones.

Rutas de desarrollo y patrones ondulatorios de cAMP. Se muestra la distribución espacial bidimensional de cAMP (Superior) en los tiempos indicados (en min) resultantes de la progresión de las células a lo largo de la ruta de desarrollo 1 (Más bajo) que se muestra en la Fig. & # x200B Fig. 2, 2, para un factor de desincronización & # x00394 = 50 min (A) y 100 min (B). Para la distribución de células a lo largo de la ruta de desarrollo, cada círculo representa una fracción de 5 & # x00025 de la cantidad total de células consideradas. Los valores de los parámetros son como en la Fig. & # X200B Fig.1 1 el coeficiente de difusión de cAMP, D& # x003b3, se toma igual a 1,5 & # x000d7 10 & # x022124 cm 2 / min (28). El área de 1 cm 2 se representa como una cuadrícula de 100 & # x000d7 100 puntos. La evolución espacio-temporal del sistema se obtiene integrando las Ecs. 1a & # x020131c por medio de un método de Euler explícito con diferencias finitas para el término espacial en la Ec. 1c, el paso de tiempo utilizado fue 10 & # x022122 min, y la precisión de la integración se comprobó reduciendo a la mitad este paso. Para cada punto de la cuadrícula, se elige un tiempo de inicio en la ruta de desarrollo de acuerdo con la distribución de probabilidad que se muestra en la Fig.& # x200B Fig.2 2 la desincronización resultante de las células en la ruta de desarrollo crea una heterogeneidad espacial en los parámetros que varían en esta ruta.

Por el contrario, durante & # x00394 = 100 min, la desincronización de las células es más fuerte, de modo que una cantidad significativa de células alcanza rápidamente el dominio oscilatorio e inicia patrones concéntricos, mientras que en ese momento las otras células están todavía en estado excitable o no excitable ( ver Fig. & # x200B Fig.3 3 B a 180 min). Debido a la heterogeneidad en la frecuencia de oscilación entre marcapasos emergentes y en el período refractario entre regiones de células excitables (y no excitables), los frentes de onda concéntricos se distorsionan y algunas veces se rompen. Los extremos sueltos de los frentes rotos se enrollan para formar ondas espirales (ver Fig. & # X200B Fig.3 3 B a 300 min). Sin embargo, estas espirales no se desarrollan completamente para ocupar todo el campo, en contraste con las que se describen a continuación para el camino 3. Además, las oscilaciones masivas ocurren en las regiones no ocupadas por espirales, la razón es que para el camino 1 todos las células terminan en el dominio oscilatorio.

Para determinar si el paso a través de un dominio de excitabilidad antes de la entrada en el dominio oscilatorio influye en el tipo de patrón ondulatorio observado, probamos la ruta de desarrollo 2 de la Fig. & # X200B Fig.1, 1, en la cual kmi (pero no & # x003c3) aumenta. Los resultados (no mostrados) indican que solo se producen oscilaciones masivas sin ondas en estas condiciones.

Pasamos ahora a la ruta 3 de la Fig. & # X200B Fig.1, 1, que combina un aumento en & # x003c3 y kmi. Esta ruta lleva el sistema a través de las regiones S, E, O, E sucesivamente. En la Fig. & # X200B, la Fig.4 4 es la evolución temporal de los dos parámetros. La distribución de los tiempos de inicio obtenida aquí para & # x00394 = 25 min (también se obtienen espirales para valores mayores del factor de desincronización & # x00394 ver Discusión) se muestra en la Fig. & # x200B Fig.5. 5. La secuencia temporal de los patrones espaciales de AMPc asociados con esta evolución de los dos parámetros bioquímicos se muestra en la Fig. & # X200B Fig.6 6 (Superior), junto con la distribución de células a lo largo de la ruta de desarrollo en los momentos considerados (Más bajo). Después de unos 150 min, se forman ondas concéntricas, pero se alteran (ver Fig. & # X200B Fig.6 6 a 180 min) y luego se rompen (ver Fig. & # X200B Fig.6 6 a 240 min), nuevamente como una resultado de la heterogeneidad tanto en la frecuencia del marcapasos como en el período refractario. En contraste con el caso de la ruta 1 ilustrada en la Fig. & # X200B Fig.3, 3, las espirales se apoderan de todo el campo (ver Fig. estado excitable. Habiendo alcanzado los parámetros sus valores asintóticos, que ahora corresponden a una situación en la que todas las células son excitables, estas espirales estables se mantienen, con un período cercano a los 5 min.

Ruta de desarrollo 3 (ver Fig. & # X200B Fig.1). 1). Las líneas continuas dan la evolución temporal del parámetro & # x003c3 (en min & # x022121) según la ecuación & # x003c3 (t) = 0,3 & # x0002b 0,25 tanh & # x0005b (t & # x02212 200) / 50 & # x0005d y del parámetro kmi (en min & # x022121) según la ecuación kmi(t) = 6.5 & # x0002b 3 tanh & # x0005b (t & # x02212 260) / 30 & # x0005d, donde el tiempo t se expresa en min. Estas evoluciones sigmoideas, que también podrían obtenerse mediante el uso de ecuaciones logísticas, se eligen para producir un retraso en el aumento de kmi con respecto al aumento de & # x003c3, como se observa en los experimentos (26). El aumento combinado de & # x003c3 y kmi corresponde a la ruta de desarrollo 3 que se muestra en la Fig. & # x200B Fig.1 1 lleva el sistema de señalización sucesivamente a través de las regiones de no excitabilidad (S), excitabilidad (E), oscilaciones autónomas (O) y nuevamente excitabilidad (E).

Distribución de tiempos de inicio agrupados en intervalos de 10 min, generados según Eq. 3 durante & # x00394 = 25 min. (Recuadro) Evolución temporal de la fracción de células capaces de transmitir un pulso supraumbral de AMPc. Esta curva, a comparar con la curva experimental (ver Fig.1 en la ref.27), se obtiene calculando el número acumulado de celdas que ingresan al dominio E en la ruta 3 (ver Figs. & # X200B Figs.1 1 y & # x200B y4), 4), para la distribución de las horas de inicio mostradas en la presente figura.

Ondas espirales de AMPc completamente desarrolladas desencadenadas por la progresión desincronizada de las células a lo largo del camino del desarrollo. Se muestra la distribución espacial bidimensional de cAMP (Superior) en los tiempos indicados (en min) resultantes de la evolución de las células a lo largo de la ruta de desarrollo 3 en la Fig. & # x200B Fig.1 1 (Más bajo), asociado con la evolución temporal de & # x003c3 y kmi prescrito en la Fig. & # x200B Fig.4. 4. La distribución de los tiempos de inicio se muestra en la Fig. & # X200B Fig.5. 5. Aquí nuevamente, cada círculo representa una fracción de 5 & # x00025 de la cantidad total de celdas consideradas. Los valores de los parámetros son como en la Fig. & # X200B Fig.3 3 el factor de desincronización & # x00394 es igual a 25 min. La escala de colores indica el nivel de concentración normalizada de cAMP extracelular, & # x003b3.

Discusión

Hemos presentado un escenario basado en el desarrollo para la aparición de ondas espirales de AMPc en el curso de D. discoideum agregación. El mecanismo se basa en la evolución desincronizada de las células en una ruta de desarrollo que corresponde a cambios continuos en las actividades enzimáticas después de la inanición, que provocan transiciones entre distintos modos de señalización de cAMP. Hemos comparado tres tipos diferentes de vías de desarrollo y hemos demostrado que solo uno de ellos, que corresponde al aumento observado de adenilato ciclasa y fosfodiesterasa, permite la formación de ondas espirales estables y completamente desarrolladas. Estas espirales se forman espontáneamente sin ningún tipo de perturbación externa (por ejemplo, disparo aleatorio de pulsos de AMPc) o intervención no natural (rompiendo olas). Nuestros resultados indican que de importancia clave para el desencadenamiento de ondas espirales es la creación de defectos en ondas concéntricas, debido a los efectos combinados de la evolución temporal de los parámetros bioquímicos y de la desincronización de estos cambios bioquímicos entre diferentes células, lo que permite la presencia simultánea en el medio de células no excitables, excitables y oscilantes. Un requisito adicional es que las células deben seguir la ruta de desarrollo apropiada cruzando sucesivamente los estados no excitables, excitables y oscilatorios y regresar finalmente a un estado excitable, como se observó en los experimentos.

La comparación de las Figs. & # x200B Figs.3 3 y & # x200B y6 6 sugieren que la formación de espirales completamente desarrolladas se ve favorecida por el eventual retorno del sistema de señalización a un estado excitable. Otro factor que contribuye es la desincronización de las células medida por el parámetro & # x00394 (ver Fig. & # X200B Fig.3). 3). En la Fig. & # X200B Fig.6, 6, se pueden obtener espirales incluso con un valor relativamente pequeño de & # x00394 = 25 min. Desincronizaciones más fuertes favorecerían la creación de un mayor número de espirales más pequeñas. Para este valor de & # x00394, el tiempo requerido para que todas las células pasen del estado no excitable al excitable es del orden de 4,6 & # x00394, es decir, aproximadamente 120 min (ver Fig. & # X200B Fig.5 5 Recuadro). Este valor coincide con el tiempo observado requerido para la adquisición de la competencia de retransmisión en la agregación Dictyostelium células (27). Debe compararse con la duración del ciclo celular, que es de aproximadamente 8 h en condiciones axénicas (29) y más corto, del orden de 4 h, cuando las células se cultivan en un medio bacteriano (32). En contraste, los valores más grandes de & # x00394, del orden de 100 min, que producen espirales menos desarrolladas en la Fig. & # X200B Fig.3 3 para la trayectoria de desarrollo 1, producirían un valor mucho mayor, del orden del duración del ciclo celular, es decir, 8 horas, durante el tiempo requerido para el desarrollo de la competencia de retransmisión en toda la población celular. La elección de un valor & # x00394 = 25 min en las Figs. & # x200B Las figuras 5 5 y & # x200B y 6 6 también son válidas con otro conjunto de resultados experimentales. De hecho, la Fig. & # X200B La Fig.5 5 indica que se tarda aproximadamente 1 hora para que 90 & # x00025 de las células ingresen al dominio oscilatorio autónomo, esto concuerda con la observación de que existe un retraso de 1 hora entre las células que depende del ciclo celular. que son las más rápidas y lentas en producir oscilaciones de AMPc (30).

La discusión anterior plantea la cuestión de si existe un rango óptimo para la desincronización celular con respecto a la formación de espirales. Si la formación de espirales grandes parece verse favorecida desde un punto de vista evolutivo, porque dan como resultado agregados celulares más grandes, valores más pequeños de & # x00394 deberían resultar más efectivos. Sin embargo, las espirales no se desarrollan a partir de ondas concéntricas cuando la desincronización es demasiado baja, porque no aparecen defectos en estas condiciones. El equilibrio entre estos dos efectos antagónicos apunta a la existencia de un rango óptimo de valores & # x00394.

El escenario anterior para la aparición de espirales incluye el efecto del inhibidor de la fosfodiesterasa considerado por P & # x000e1lsson y Cox (15), al considerar que este inhibidor arroja un valor efectivo menor de kmi poco después de la inanición. La adición adicional del inhibidor correspondería a doblar el camino 3, que produce espirales de manera más eficiente, hacia la izquierda inicialmente se obtienen resultados similares a los mostrados en la Fig. & # X200B Fig.6 Se obtienen 6 en estas condiciones. En un mutante que carece del inhibidor de la fosfodiesterasa, se observa un gran número de pequeñas ondas concéntricas en lugar de espirales y aparecen más tarde (E. P & # x000e1lsson y E. & # X02009C. Cox, comunicación personal). En el modelo, en consecuencia, las simulaciones numéricas indican que las ondas concéntricas se favorecen sobre las espirales y se forman más tarde cuando la trayectoria 3 se desplaza hacia la derecha, como resultado de la ausencia del inhibidor.

Como se indicó anteriormente, nuestros resultados se han obtenido para una densidad celular tal que aproximadamente 10 celdas ocupan un elemento de la cuadrícula espacial. Implícita en nuestra descripción está la suposición de que las células de este grupo se comportan como sincrónicas en su desarrollo después de la inanición. Tal sincronización local podría resultar del hecho de que pequeños grupos de células cercanas entre sí están casi con certeza relacionadas recientemente por clones y, por lo tanto, han sufrido su última división más o menos al mismo tiempo. Además, la acción de corto alcance de un factor inductor de diferenciación secretado por células hambrientas favorece la sincronía del desarrollo en su vecindad (33).

Las simulaciones preliminares con una cuadrícula espacial más fina, que nos permite considerar la evolución de celdas individuales a expensas de un mayor tiempo de computadora, arrojan resultados similares en cuanto al efecto de la desincronización en la aparición de ondas espirales. Sin embargo, es más difícil generar primero ondas y, una segunda vez, romperlas para obtener espirales si todas las células están desincronizadas. Los grupos pequeños de células coordinadas, desincronizados con respecto a otros grupos de este tipo, son más propensos a superar la nivelación por difusión de las inhomogeneidades espaciales que inician ondas y luego nuclean los defectos necesarios para la formación de espirales. Una cuadrícula espacial más fina nos permite abordar el efecto de la densidad celular si cada elemento de dicha cuadrícula contiene varias celdas (consideradas sincrónicas) y los términos de la reacción química en la ecuación cinética (Ec. 1c) para cAMP extracelular se multiplican por un factor relacionado con la proporción de volúmenes intracelulares a extracelulares. De acuerdo con las observaciones experimentales (34), las simulaciones numéricas indican que el aumento de la densidad celular favorece la formación de espirales.

Muchos estudios sobre la formación de patrones espirales en sistemas químicos (35 & # x0201337) se han centrado en el papel de las heterogeneidades espaciales (incluidos los obstáculos) en la ruptura de los frentes de onda de modo que sus cabos sueltos se enrollen en espirales. El mecanismo descrito aquí para la ruptura de frentes de onda y la posterior formación de espirales en Dictyostelium celdas es diferente en que combina la heterogeneidad espacial con la evolución temporal de las propiedades dinámicas del medio.

El presente análisis pone de manifiesto el posible papel que juega la desincronización de los cambios bioquímicos inducidos tras la inanición en el desencadenamiento de la formación de ondas espirales de AMPc. El modelo predice que una mejor sincronización de las células, por ejemplo, a través del cambio de temperatura (27, 38), la liberación del bloque de nocodazol (30) o la dilución de las células de la fase estacionaria en el medio de crecimiento (29), debería favorecer la aparición de ondas concéntricas sobre espirales. . La desincronización puede ser sólo un factor importante para la aparición de patrones espirales en Dictyostelium, junto con otros factores contribuyentes, incluido el movimiento celular. Nuestros resultados muestran cómo el concepto de ruta de desarrollo, que explica las transiciones secuenciales en el comportamiento dinámico del sistema de señalización cAMP en el transcurso del tiempo, se vincula con la selección de un patrón espacial en forma de espirales de cAMP.


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1. INTRODUCCIÓN

Los organismos multicelulares consisten en una variedad de células diferenciadas, y sus procesos de diferenciación deben estar estrictamente regulados para asegurar que sus funciones adecuadas, los errores que ocurren durante el proceso de diferenciación pueden inducir defectos fatales en los organismos. Así, comprender los mecanismos reguladores que determinan los linajes celulares es una cuestión fundamental para los campos de la biología y la medicina (Avior, Sagi, & Benvenisty, 2016 Castanon & González-Gaitán, 2011 Zakrzewski, Dobrzynski, Szymonowicz, & Rybak, 2019). Al comienzo del proceso de diferenciación celular, aparecen estocásticamente diferentes tipos de células dentro de una población celular genéticamente idéntica, lo que se conoce como modelo de “sal y pimienta” y se ha observado en varios organismos, como gusanos nematodos, moscas y ratones (Chazaud , Yamanaka, Pawson y Rossant, 2006 Miller, Seymour, King y Herman, 2008 Schnabel et al., 2006). En tal diferenciación estocástica, la heterogeneidad celular no genética, que surge de las fluctuaciones de factores intrínsecos y extrínsecos, parece ser un factor clave en la determinación del destino celular. Se ha propuesto que las variaciones intercelulares en la expresión génica, el metabolismo y las respuestas a las señales celulares son factores intrínsecos que afectan el destino celular (Elowitz, Levine, Siggia y Swain, 2002 Evers et al., 2019 Raser y O'Shea, 2004 Yamanaka y Blau , 2010). Entre estos factores potenciales, el metabolismo parece jugar un papel importante en las decisiones sobre el destino celular. La evidencia creciente ha indicado que los niveles de actividad de las mitocondrias, orgánulos importantes asociados con el metabolismo, juegan un papel en la diferenciación de las células humanas (Buck et al., 2016 Khacho et al., 2016). Sin embargo, se desconocen los factores críticos que determinan el destino celular.

El moho de limo celular Dictyostelium discoideum es un amebozoo y representa un buen organismo modelo para estudiar las relaciones entre la heterogeneidad celular y la diferenciación celular durante el desarrollo de organismos multicelulares. Las células ameboides continúan proliferando en condiciones ricas en nutrientes (fase vegetativa). Tras la inanición, las células ameboides inician el proceso de desarrollo multicelular, diferenciándose en 2 tipos de células principales: células de tallo y células de esporas (Figura 1a). En las primeras etapas del desarrollo, las células ameboides se mueven colectivamente hacia oscilaciones de AMPc extracelular, originadas en un centro de agregación, para formar un montículo multicelular. Las células que entran en la fase de montículo comienzan a diferenciarse en células progenitoras de tallo o esporas, llamadas células pretalca y preespora, respectivamente, que surgen estocásticamente en forma de sal y pimienta. Las células de preesporas se clasifican en la parte superior del montículo, formando la región de la punta, que luego forma la región anterior del cuerpo migrante (babosa), mientras que las células de preesporas constituyen la región posterior de la babosa. En el proceso de formación del cuerpo fructífero, las células del tallo se diferencian en células del tallo, penetrando en la región de la prespora de la babosa. Las células de esporas que generan progenies se mueven a la parte superior del cuerpo fructífero a través del soporte de las células del tallo (Maeda, Inouye y Takeuchi, 1997).

En el proceso de desarrollo de D. discoideum, se ha sugerido que las heterogeneidades celulares no genéticas, que se generan por diferencias en las concentraciones de calcio intracelular, los ciclos celulares y los niveles de metabolismo, desempeñan un papel importante en las decisiones sobre el destino celular (Baskar, Chhabra, Mascarenhas y Nanjundiah, 2000 Cubbit, Firtel, Fischer , Jaffe y Miller, 1995 Katz y Bourguignon, 1974 Leach, Ashworth y Garrod, 1973 Maeda, 2005, 2011 Maeda, Ohmori, Abe, Abe y Amagai, 1989 Saran, Azhar, Manogaran, Pande y Nanjundiah, 1994 Tasaka Y Takeuchi, 1981 Thompson y Kay, 2000 Zada-Hames y Ashworth, 1978). Al igual que en los seres humanos y otros eucariotas superiores, la actividad mitocondrial parece ser crucial cuando se pasa del crecimiento a la diferenciación en el moho mucoso celular. Además, estudios previos han informado que la diferenciación celular puede ser regulada por la presencia o ausencia de glucosa, que es un componente esencial de la vía de la glucólisis, en el medio de cultivo (Leach et al., 1973 Tasaka & Takeuchi, 1981 Thompson & Kay, 2000). Estos factores que generan heterogeneidades reflejan las condiciones celulares en la fase vegetativa, lo que implica que los linajes celulares se determinan antes de la diferenciación según las heterogeneidades presentes en la fase vegetativa.

De hecho, un estudio reciente ha demostrado que el destino de las células en D. discoideum Las células están predeterminadas en la fase vegetativa, antes de la formación multicelular, y pueden predecirse por los niveles de expresión del omt12 gen (Kuwana, Senoo, Sawai y Fukuzawa, 2016). Células vegetativas que expresan altos niveles de omt12, que se denominan células pstV A en Kuwana et al. (2016), están destinadas a diferenciarse en células del tallo (designadas como células "destinadas al tallo", en adelante), mientras que las células vegetativas que expresan niveles bajos de omt12 están destinadas a diferenciarse en células de esporas (designadas como células "destinadas a esporas", en lo sucesivo). Sin embargo, omt12 es simplemente un gen marcador, y los cambios en sus niveles de expresión no influyen en el destino celular (Kuwana et al., 2016). Las identidades de los factores que impulsan la diferenciación de las células destinadas al tallo (que expresan alta omt12 niveles) y células destinadas a esporas (que expresan bajos niveles omt12 niveles) siguen siendo desconocidos.

Para abordar esta pregunta, primero llevamos a cabo análisis de secuenciación de ARN (ARN-seq) para examinar las diferencias en los niveles de expresión génica entre las células destinadas a tallo y a esporas clasificadas por citometría de flujo en función de omt12 niveles de expresión. El análisis posterior de RNA-seq y el ensayo de luciferasa sugirieron que las diferencias en los niveles de ATP pueden ser un factor que afecta la diferenciación. A continuación, monitoreamos los niveles de ATP intracelular durante la diferenciación, utilizando sondas de sensor de ATP que optimizamos para su uso en Dictyostelium. También investigamos los roles de ATP en D. discoideum diferenciación mediante el uso de inhibidores específicos de la producción de ATP.


Eventos celulares en desdiferenciación

La desdiferenciación es un proceso de múltiples etapas

Durante y después del evento de borrado, la desdiferenciación puede describirse por la progresión de varios eventos celulares específicos (Fig. 2). Primero, durante el evento de borrado, las células pierden la capacidad de liberar un quimioatrayente (Varnum y Soll 1981). Poco después, en paralelo con la estabilización por borrado, las células también pierden la quimiotaxis dirigida por AMPc (Varnum y Soll 1981). Después de la estabilización por borrado, las células retienen la motilidad no dirigida estimulada por AMPc y la adhesión resistente al ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), mediada por CsA / gp80 (Finney et al. 1979), durante unas horas, y luego estas características también se pierden en distintos pasos (Soll & Mitchell 1982 Finney et al. 1983). Finalmente, después de varias horas en medios nutritivos, las células comienzan la síntesis de ADN y eventualmente comienzan a dividirse y reanudar los comportamientos normales de la etapa de crecimiento, lo que indica la finalización de la desdiferenciación (Takeuchi & Sakai 1971 Katoh et al. 2004 ).

Durante la desdiferenciación, se produce un cambio en los niveles de proteínas y transcripciones, acompañado de cambios en los eventos celulares, liberación y respuesta de quimioatrayentes, adhesión y motilidad. Después de la desdiferenciación, se reanudan los comportamientos normales de crecimiento vegetativo.

Muchos de los eventos celulares anteriores requieren de novo síntesis de proteínas. Por ejemplo, antes o después del evento de borrado, la adición de cicloheximida, un inhibidor del evento de borrado (Soll & Waddell 1975 Waddell & Soll 1977), inhibe completamente la pérdida de adhesión resistente al EDTA. Incluso después del período de estabilización, la cicloheximida todavía inhibe parcialmente esta pérdida (Soll y Mitchell 1982). Por lo tanto, los inhibidores de la síntesis de proteínas interfieren con algo más que la etapa de borrado de la desdiferenciación: varios eventos celulares durante la desdiferenciación probablemente también requieran de novo síntesis de moléculas específicas.

Cambios a nivel de proteínas durante la desdiferenciación.

A nivel de proteínas, Takeuchi & Sakai (1971) analizaron la desdiferenciación por inmunohistoquímica, cuantificando la detección de una sustancia específica de presporas usando un suero anti-esporas conjugado con fluorescencia. Cuando es de tipo salvaje Dictyostelium Las células NC4 se desagregaron de la etapa de desarrollo de babosa y se incubaron en condiciones de sal estándar (Bonner 1947), la tinción de la sustancia específica de presporas disminuyó gradualmente dentro de las 5 h de la desdiferenciación. Este proceso fue sensible a la temperatura, cicloheximida, el inhibidor transcripcional actinomicina D y concentraciones específicas de cAMP (1 mmol / L pero no 100 nmol / L). Sin embargo, la presencia o ausencia de bacterias no tuvo ningún efecto.

Finney et al. (1987) estudiaron adicionalmente la abundancia de proteínas, utilizando electroforesis en gel 2-D para analizar 33 polipéptidos asociados con el crecimiento y 53 asociados con el desarrollo durante la desdiferenciación. Estos autores informaron que la mayoría de las proteínas vegetativas (85%) aumentaron dramáticamente dentro de las primeras 5 h después de la desagregación, y algunas (18%) aumentaron en abundancia durante el período previo al borrado, la mayoría de ellas (61%) aumentaron alrededor del tiempo. del punto de borrado, y solo unos pocos (9%) no aumentan en absoluto durante el tiempo de análisis. En contraste, la mayoría de las proteínas de desarrollo examinadas (77%) comenzaron a disminuir en abundancia dramáticamente dentro de las primeras 5 h, especialmente en el período del punto previo al borrado, y nuevamente solo algunas de las proteínas examinadas no disminuyeron dentro del tiempo. de análisis. Estos autores también demostraron que la síntesis de un polipéptido asociado al crecimiento, V28, ocurre de manera concomitante con el evento de borrado, es sensible a la misma concentración de AMPc que inhibe el evento de borrado y es bloqueada por el redesarrollo.

Cambios a nivel transcripcional durante la desdiferenciación.

En 2004, utilizamos la tecnología de microarrays para examinar casi 8000 objetivos, incluidos los ADNc vegetativos y de desarrollo y los ADN genómicos (Van Driessche et al. 2002), encontrando que los cambios transcripcionales globales ocurren temprano durante la desdiferenciación (Fig.2) (Katoh et al. 2004). Independientemente de en qué punto se desagregan las células en desarrollo, la regulación a la baja de aproximadamente 700 genes del desarrollo comienza durante la primera hora de incubación en medio nutritivo, y la transcripción de 1300 genes vegetativos también comienza durante este tiempo (lo que representa cambios en la expresión del 26,7% de la micromatriz objetivos). También propusimos que el proceso de desdiferenciación podría dividirse en tres fases en función de los cambios transcripcionales observados (Fig.3) (Katoh et al. 2004). La fase I es el período que precede a los cambios transcripcionales descritos anteriormente, y esta fase de 1 h es constante independientemente de en qué etapa se solicite a las células que se desdiferencian (las células en desarrollo se desagregaron de las etapas agregada, babosa y sombrero mexicano). A continuación, el cambio transcripcional global descrito anteriormente de aproximadamente 2000 genes ocurre en la fase II, que abarca la amplitud del cambio transcripcional. La duración de esta fase depende de la etapa en la que se solicita a las células en desarrollo que se desdiferencian; las células más desarrolladas necesitan más tiempo para completar este período (Fig. 3). La fase III consiste en un intervalo entre el momento en que las transcripciones vegetativas se han acumulado al nivel de las células vegetativas y el momento en que se reanuda la síntesis de ADN y la división celular posterior (Fig.3) (Katoh et al. 2004 ).

Las tres fases de la desdiferenciación se basan en cambios transcripcionales globales. El tiempo necesario para que las células completen la fase de desdiferenciación II (que consiste en la mayor parte de los cambios transcripcionales) depende de la etapa en la que las células en desarrollo se desagregaron y expusieron a los nutrientes.

También identificamos 272 transcripciones que se regulan positivamente durante la fase II de desdiferenciación (Katoh et al. 2004). Casi todas estas transcripciones también se regulan positivamente durante el desarrollo, lo que sugiere que algunos genes del desarrollo también tienen un papel en la fase II de la desdiferenciación, quizás permitiendo que las células tengan la plasticidad para adaptarse a los rápidos cambios ambientales. Sin embargo, también identificamos 122 transcripciones que estaban reguladas solo durante la desdiferenciación y no durante el desarrollo. Utilizando la ontología genética (GO), analizamos estos dos grupos y encontramos un enriquecimiento de los genes regulados positivamente de fase II en las categorías GO, incluido el metabolismo del ARN, el metabolismo de la reserva de energía, el transporte de proteínas, la biogénesis del ribosoma y la transducción de señales de dos componentes. Por el contrario, el subconjunto específico de desdiferenciación pertenecía a categorías de GO como respuesta al estímulo biótico, ciclo de ubiquitina, metabolismo de aminoácidos, metabolismo de nitrógeno y dirección de proteínas (Katoh et al. 2004 ).


Resultados

Propiedades enzimáticas de las dos enzimas de degradación D -Ser DSD y DAO

los D. discoideum genoma codifica SR (DDB0230209) y, a diferencia de los mamíferos, dos putativos D-Enzimas de degradación del Ser: DAO (DDB0238432) y DSD (DDB0305709). La proteína DDB0238432 exhibe un 33 y un 32% de identidad de secuencia con DAO humana y D-aspartato oxidasa, respectivamente. La proteína DDB0305709 comparte un 21,5% de identidad de secuencia con DSD de S. cerevisiae (Dsd1p). Para obtener una idea de la importancia de D-Ser y sus supuestas enzimas metabólicas en D. discoideum, analizamos las propiedades de las enzimas.

El supuesto DSD (proteína DDB0305709) se expresó en E. coli utilizando el sistema de vector pET y purificado hasta homogeneidad mediante cromatografía de afinidad de Ni. El espectro UV-visible de la proteína DDB0305709 mostró un máximo de absorbancia a 420 nm, que es característico de la formación de la base de Schiff entre PLP y aminoácido (Figura 1A), lo que indica la capacidad de unión de PLP de la proteína. La proteína DDB0305709 exhibida D-Ser actividad deshidratante en un pH óptimo de 8.0. los kgato y Kmetro valores para el DLa deshidratación -Ser catalizada por la enzima fue de 2,6 s -1 y 0,19 mM, respectivamente (Tabla 1). D-Thr y & # x03B2-Cl-D-alanina (una DSe sabe que los análogos de -Ser en los que el grupo OH se reemplaza con un Cl) son sustratos de Dsd1p. La proteína DDB0305709 también mostró reactividad hacia D-Thr y & # x03B2-Cl-D-alanina con una eficiencia catalítica de 0,9 y 5,3%, respectivamente, en comparación con la de D-Ser (Tabla 1). Al igual que con Dsd1p (Ito et al., 2008) y DSD de pollo (Tanaka et al., 2011), la proteína DDB0305709 requirió Zn 2+ para obtener el máximo D-Ser actividad de deshidratación: DLa actividad de deshidratación de -Ser se redujo en gran medida por el tratamiento con EDTA y se restauró mediante la adición de Zn 2+ (Figura 1B). La adición de otros iones metálicos divalentes como Mg 2+, Ca 2+, Mn 2+, Ni 2+ y Fe 2+ a la enzima tratada con EDTA no restauró la actividad enzimática (Figura 1B). Estos resultados indican que la proteína DDB0305709, en adelante DSD, es dependiente de PLP y Zn 2+. DSD.

FIGURA 1. Caracterización de recombinante D-Ser deshidratasa (DSD) y D-aminoácido oxidasa (DAO) de Dictyostelium discoideum. (A, B) Espectros UV-vis de DSD purificado (A) y DAO (B). (C) Actividades relativas de DSD tratado con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en presencia de varios iones metálicos. La actividad de DSD tratada con EDTA se ensayó en presencia de 10 mM D-Ser y varias concentraciones (10 & # x03BC, 100, & # x03BC y 1000 & # x03BCM) de iones metálicos. Los datos se representan como el promedio de las mediciones duplicadas. (D) Actividad relativa de la actividad de desaminación de DAO con varios D-aminoácidos. La DAO purificada se incubó con 10 mM de D-aminoácido y el H resultante2O2 se cuantificó en presencia de peroxidasa de rábano picante (HRP), TOOS y 4-aminoantipirina (4-AAP) a 550 nm. Los datos se representan como el promedio de las determinaciones duplicadas.

TABLA 1. Parámetros cinéticos de SR, DSD y DAO recombinantes de Dictyostelium discoideum.

También construimos un sistema de expresión para el supuesto D. discoideum DAO (DDB0238432). La proteína DDB0238432 purificada mostró máximos de absorción alrededor de 360 ​​y 450 nm, lo que indica que posee una forma oxidada del cofactor de flavina (Figura 1C). La proteína DDB0238432 desaminó varios D-aminoácidos. Entre ellos, D-Ala fue el mejor sustrato: kgato y Kmetro valores para el DLa actividad de la -Ala oxidasa fue de 0,53 s -1 y 0,78 mM, respectivamente (Tabla 1). Se observó poca reactividad para D-Asp y D-Glu (Figura 1D). Estos resultados demostraron que DDB0238432 codifica DAO funcional. D-Ser no era un buen sustrato para DAO (Figura 1D), con kgato y Kmetro valores de 0,05 s -1 y 6,1 mM, respectivamente (Tabla 1).

Ha quedado claro que D. discoideum posee tres enzimas funcionales capaces de degradar D-Ser: DSD, DAO y SR. La RS se caracterizó previamente (ver Ito et al., 2012b, 2013b Tabla 1). A juzgar por kgato/Kmetro valores, el DLa actividad de degradación de -Ser de DSD es varios cientos de veces mayor que la de las otras dos enzimas (Tabla 1). Estos resultados indican que, a diferencia de los mamíferos, que utilizan DAO como principal D-Enzima de degradación del Ser, D-Ser probablemente degradado por DSD en D. discoideum.

La mutación DSD suprimió la actividad de degradación de D -Ser en la célula

Examinar la importancia fisiológica del DSD en D-Ser metabolismo, construimos un dsd-mutante nulo (& # x0394DSD). En la cepa mutante, dsd fue reemplazado por el gen de resistencia a blasticidina S (Figura complementaria S1). La exitosa generación de dsd-células nulas demostraron que dsd no es necesario para el crecimiento unicelular de D. discoideum en las condiciones probadas.

Primero determinamos el D- y L-Actividades de degradación del Ser en WT y dsd-células nulas. D- o L-Ser se incubó con extracto libre de células de WT o dsd-células nulas, y las tasas de D- o LSe cuantificó la descomposición de -Ser. Disminución dependiente del tiempo de D-Ser se observó solo con el extracto libre de células de WT (Figura 2A). La media DLa tasa de descomposición de -Ser durante 7,5 h de incubación fue de 15 nmol.h -1. Mg de proteína -1 con el extracto libre de células WT. En contraste, la tasa fue menor que el límite de detección (& # x003C0.2 nmol.h -1 .mg de proteína -1) con el extracto libre de células de dsd-células nulas (Tabla 2 y Figura 2A). Se realizaron experimentos similares usando células en etapa multicelular (células a las 12 h después de la inducción del desarrollo). Nuevamente, el extracto libre de células de WT exhibió D-Ser actividad de degradación, mientras que la de dsd-Las celdas nulas no lo hicieron (datos no mostrados).

FIGURA 2. Actividad de degradación de Ser de tipo salvaje (WT) y dsd-tensión nula. (A) D-Ser actividad de degradación en el extracto libre de células de WT () y dsd-células nulas (). Los datos se representan como la media & # x00B1 SD (norte = 3). (B) Identificación del producto cetoácido formado a partir de D-Ser por el extracto libre de células de WT (3) y dsd-células nulas (4). Los perfiles de elución del piruvato (1) e hidroxipiruvato (2) derivatizados con MBTH también se muestran como controles. Se usó & # x03B1-cetoglutarato como patrón interno para la derivatización de cetoácidos como se describió anteriormente (Ito et al., 2008). Para este análisis se utilizaron muestras después de 7,5 h de incubación.

TABLA 2. Actividad de degradación de Ser en el extracto libre de células de WT, dsd-null y & # x0394DSD /dsd +.

En los mamíferos, la DAO juega un papel importante en D-Ser descomposición. Nuestros datos sugieren que la enzima primaria que se degrada D-Ser en D. discoideum es DSD. De D-Ser, DSD genera piruvato, mientras que DAO produce hidroxipiruvato como cetoácido. Examinar la contribución de DAO en D-Ser metabolismo en D. discoideum, el cetoácido generado a partir de D-Ser identificado. Como se muestra en la Figura 2B, con el extracto libre de células WT, el cetoácido producido a partir de D-Ser era piruvato. No se observó formación de piruvato con dsd-células nulas. El hidroxipiruvato no se formó tanto con WT como con dsd-células nulas (Figura 2B). De los datos anteriores, concluimos que DSD es responsable de D-Ser degradación en D. discoideum.

L-Ser actividad de degradación en extractos libres de células de WT y dsdTambién se analizaron las células nulas. los L-La actividad de degradación del Ser no se vio afectada por dsd mutación (Tabla 2). Poco D-Ser se formó a partir de L-Ser, que indica que SR no juega un papel significativo en L-Ser degradación en las condiciones probadas.

Efectos de dsd Mutación en el crecimiento y el desarrollo

Para examinar los efectos de la dsd mutación en el crecimiento unicelular, WT y dsd-se cultivaron células nulas en placas de agar 5LP junto con Klebsiella aerogenesy se midió el tamaño de las placas formadas en el césped bacteriano como indicador de la tasa de crecimiento. En ausencia de D-Ser, la tasa de crecimiento de placa fue de 0,23 cm / día con WT y de 0,32 cm / día con dsd-células nulas, lo que indica que dsdLas células nulas crecieron ligeramente más rápido que WT (Figura 3A). En las placas 5LP, dsd-Células nulas aparentemente formaron menos estructuras multicelulares (como babosas, montículos, cuerpos fructíferos) que WT, según se juzgó por ambas fotografías en diámetros de placa idénticos (aparecieron como puntos, ver paneles a y B en la Figura 3B). Esto indica que el dsd la mutación induce el inicio retardado del desarrollo multicelular.

FIGURA 3. Crecimiento y desarrollo de WT y dsd-células nulas y el efecto de exógenos D-Ser. D. discoideum las células se cultivaron en Klebsiella aerogenes en placas de agar 5LP que contienen el indicado D-Concentraciones de Ser. (A) Las tasas de aumento del diámetro de la placa de WT (barras cerradas) y dsd-células nulas (barras abiertas). Los datos se representan como la media & # x00B1 SD (norte = 3). Los asteriscos indican diferencias significativas (Student & # x2019s t-prueba, PAG & # x003C 0,05). (B) Fotografías de placa de WT (arriba) y dsdSe tomaron células nulas (abajo) cuando el diámetro de la placa alcanzó aproximadamente 1 cm (4 días en b, d, 5 días en a, c, e & # x2013i, 7 días en j). Las estructuras multicelulares se indican con flechas. (C) D. discoideum Las células se cultivaron en medio líquido HL5 en presencia o ausencia de 10 mM D-Ser. Los datos se representan como la media & # x00B1 SD (norte = 3).

Para examinar con más precisión el efecto de la dsd mutación en el proceso de desarrollo, WT y dsdLas células nulas se cultivaron axénicamente en medio HL5, después de lo cual se indujo el desarrollo en las membranas de nitrocelulosa por inanición. A las 14 h después de la inducción del desarrollo, las células WT estaban en la última etapa de montículo (etapa de formación de punta), pero dsd-células nulas estaban en etapas de agregación y / o montículo (Figura 4, paneles a y B). Las células WT formaron babosas a las 16 h (panel C) y cuerpos fructíferos a las 24 h (panel gramo). En contraste, en dsd-células nulas, los agregados formadores de puntas se formaron a las 18 h de desarrollo (panel F). Estas observaciones indicaron que dsdLas células nulas muestran un retraso en el desarrollo y aparentemente pasan un período prolongado en la etapa de montículo antes de continuar con el desarrollo. Curiosamente, dsdLas células nulas formaron menos cuerpos fructíferos que WT. Después de 72 h, el número de esporas formadas en dsd-células nulas fue 6 & # x00B1 2% de la de WT.

FIGURA 4. Fenotipos de desarrollo de dsd-mutante nulo. WT (arriba) y dsdSe desarrollaron células nulas (abajo) en la membrana del filtro a una densidad de 5,0 & # x00D7 10 7 células / cm 2. los dsdLas células nulas exhibieron un retraso de agregación y una eficiencia de formación de esporas deteriorada en comparación con WT. En el recuadro se muestran fotografías del cuerpo fructífero. Las barras indican 1 mm y 0,5 mm (inserción). Los experimentos se realizaron al menos dos y más de tres veces.

Acumulación de D -Ser en dsd-Células nulas y su efecto sobre el crecimiento y el desarrollo

Nuestros datos sugieren que dsd-probablemente se acumulan células nulas D-Ser, causando potencialmente el retraso en el desarrollo y el defecto de formación de esporas. Por lo tanto, cuantificamos el intracelular D-Niveles de Ser en WT y dsd-células nulas (Figura 5). DLa concentración de -Ser estaba por debajo del límite de detección en células WT en la fase unicelular (& # x003C0.003 nmol / mg) (Figura 5 y Tabla 3). En dsd-células nulas, fue de 0.026 nmol / mg, lo que demuestra la acumulación de D-Ser en dsd-células nulas. D-Las concentraciones de Ser durante el desarrollo se examinaron más a fondo en WT y dsd-células nulas. D-Ser no se detectó durante el desarrollo en WT. Durante el desarrollo de dsd-células nulas, D-Ser estaba presente en las células a niveles de 0,01 y # x20130,03 nmol / mg de células (Figura 5B). Esto indica que D-Ser probablemente pueda influir en todas las etapas de desarrollo de la cepa mutante.

FIGURA 5. Efecto de dsd knockout en la concentración de Ser intracelular. Concentraciones de aminoácidos intracelulares de WT, dsd-null y & # x0394DSD /dsd + fueron determinados. (A) Cromatogramas representativos de análisis de aminoácidos intracelulares de WT, dsd-null y & # x0394DSD /dsd + de células de fase unicelular. Pico de D-La derivada de Ser se indica con una flecha. Los picos pequeños en el tiempo de retención 23,5 min en WT y & # x0394DSD /dsd + las muestras no son para D-Ser derivado (porque no disminuyeron / desaparecieron por incubación con Dsd1p). (B) Intracelular D-Ser y L-Concentraciones de ser durante el desarrollo. WT y dsdLas células nulas se cultivaron en medio HL5 y se dejaron desarrollar en una membrana de filtro por inanición. Las células se recolectaron en diferentes etapas de desarrollo y las concentraciones intracelulares de D-Ser y L-Ser fueron cuantificados por HPLC. Intracelular D-Los niveles de Ser estaban por debajo del límite de detección en WT. Los datos se representan como la media & # x00B1 SD (norte = 3).

TABLA 3. Niveles de serina intracelular de WT, dsd-nully & # x0394DSD /dsd + .

Nuestros datos sugieren fuertemente que la acumulación de D-Ser causa el dsd-Fenotipos nulos. Para examinar si D-Ser muestra de hecho efectos inhibidores sobre D. discoideum desarrollo, las células se cultivaron junto con K. aerogenes en placas 5LP que contienen diversas concentraciones de DLuego se examinó el efecto sobre el crecimiento y / o desarrollo. En presencia de 0,5 & # x201310 mM de D-Ser, no se observó ningún efecto significativo sobre el crecimiento o desarrollo en WT (Figura 3). Se observó un retraso en el desarrollo y un efecto inhibidor sobre el crecimiento unicelular de WT cuando se observaron 25 mM D-Se agregó Ser a las placas (Figuras 3A, panel B I). Por el contrario, el crecimiento unicelular de dsd-las células nulas fueron inhibidas de forma dosis-dependiente por D-Ser, y no se observó crecimiento con 25 mM D-Ser (Figuras 3A, panel B j). En todas las condiciones, dsd-Las células nulas aparentemente formaron menos estructuras multicelulares (como babosas, montículos, cuerpos fructíferos) que WT, según se juzgó cuando los diámetros de la placa alcanzaron 1 cm, y el número de estructuras multicelulares disminuyó al aumentar la cantidad de exógenos D-Ser (B > D > F > h, Figura 3B). Esto muestra que el retraso en el desarrollo fue aún más pronunciado por exógenos D-Ser en dsd-células nulas. Además, la alteración de la capacidad de formación de esporas de dsd- las células nulas se pronunciaron aún más mediante la adición de exógenos D-Ser. El número de esporas cayó a 1.3 & # x00B1 0.3% y 0.3 & # x00B1 0.1% de WT en presencia de 1 y 10 mM de D-Ser en el tampón KK2 utilizado para los experimentos, respectivamente. El ensayo de crecimiento también se realizó con el medio líquido HL5 en presencia o ausencia de 10 mM D-Ser. En ausencia de D-Ser, el dsdLas células nulas crecieron ligeramente más rápido que WT en la fase logarítmica, pero a partir de entonces el aumento del número de células se ralentizó. El crecimiento de WT no se vio afectado por exógenos D-Ser. Por el contrario, el crecimiento de dsd-Las células nulas se vieron obstaculizadas significativamente por D-Ser (Figura 3C). Estas observaciones confirman que D-Ser inhibe y / o retrasa el crecimiento unicelular, la agregación y los procesos de formación de esporas de D. discoideum.

Complementación de dsd

Para demostrar que el dsd-los fenotipos nulos son de hecho causados ​​por dsd mutación, construimos una dsd cepa complementaria (& # x0394DSD /dsd +). En esta cepa, dsd se expresó constitutivamente bajo el control del promotor de actina15 usando el plásmido pDEX-RH. El extracto sin células de & # x0394DSD /dsd + ameba unicelular exhibió 312 nmol.h -1 .mg proteína -1 de D-Ser actividad de degradación, correspondiente a la expresión 20 veces mayor de dsd en & # x0394DSD /dsd + que en WT (Tabla 2). El análisis de aminoácidos intracelulares demostró que el & # x0394DSD /dsd + la tensión no se acumula D-Ser tanto en fase unicelular (Figura 5A) como multicelular. En membranas de nitrocelulosa, & # x0394DSD /dsd + las células se desarrollaron aparentemente normalmente y formaron cuerpos fructíferos 24 h después de la inducción del desarrollo (Figura 6A). Sobre dsd sobreexpresión, la eficiencia de la formación de esporas aumentó significativamente (pero no a los niveles de WT). Los datos sugirieron que la expresión controlada de dsd es necesario para la restauración completa de los fenotipos de dsd-células nulas. El número de esporas formadas en & # x0394DSD /dsd + fue 53 & # x00B1 10% de eso en WT. El inicio tardío del desarrollo en placas de agar 5LP con K. aerogenes también fue rescatado (Figura 6). Estos resultados demuestran claramente que los fenotipos observados en dsd-Las células nulas son causadas por dsd mutación.

FIGURA 6. Efecto de dsd expresión en dsd-Células nulas en desarrollo. (A) WT y dsd-Células nulas que albergan el vector vacío pDEX-RH (WT / - y dsd-null / -) y & # x0394DSD /dsd + se desarrollaron en una membrana de filtro a una densidad de 5,0 & # x00D7 10 7 células / cm 2. Se tomaron fotografías en los horarios indicados. El número de esporas se contó a las 72 h después de la inanición. La cantidad total de esporas formadas en WT se consideró como 100%. (B) PESO / -, dsd-null / - y & # x0394DSD /dsd + se cultivaron en placa 5LP con K. aerogenes a 22 & # x00B0C. Se tomaron fotografías cuando el diámetro de la placa alcanzó aproximadamente 1 cm (4 días para WT / -, 3 días para dsd-null / - y & # x0394DSD /dsd +). Todos los experimentos se realizaron al menos dos y más de tres veces.

Dsd La mutación afecta al relé de señalización cAMP

En el desarrollo temprano de D. discoideum, el AMPc juega un papel importante en la señalización intracelular y extracelular (Konijn et al., 1967 Dinauer et al., 1980 Williams et al., 1984 Mahadeo y Parent, 2006). El cAMP es necesario para la quimiotaxis de Dictyostelium células y para la activación del receptor de AMPc CarA. CarA se expresa en el desarrollo temprano para iniciar una cascada de señalización para el desarrollo programado. La cascada conduce a una síntesis rápida de AMPc por la adenilil ciclasa AcaA y a la secreción de AMPc. A esto le sigue la degradación del AMPc mediada por la fosfodiesterasa PsdA del AMPc secretada (Faure et al., 1990).

Planteamos la hipótesis de que el retraso del desarrollo en dsd-Las células nulas pueden ser causadas por un defecto y / o perturbación en el relé de señalización de AMPc. Para examinar esto, la expresión de los genes clave de señalización de cAMP, cocheA y acaA se analizó (Figuras 7A, B). Se sabe que, en WT, los niveles de ARNm de cocheA y acaA pico a las 4 & # x20138 h después de la inanición (Faure et al., 1990 Narita et al., 2014). De hecho, en WT, los niveles de ARNm de acaA alcanzó su punto máximo a las 8 hy aumentó 50 veces después de la inanición (Figura 7A). En dsd-células nulas, expresión de acaA alcanzó su punto máximo a las 8 h, pero aumentó sólo 17 veces. Lo mismo se observó para cocheA. En WT, los niveles de ARNm de cocheA aumentó seis veces a las 8 h, pero sólo tres veces en dsd-células nulas (Figura 7B). Aunque no se observaron diferencias significativas, la pdsA La expresión se retrasó un poco. La expresión de pdsA alcanzó su punto máximo a las 4 h en WT y a las 8 h en dsd-células nulas (datos no mostrados). Además, encontramos que dsd se expresa constitutivamente durante el desarrollo, y se expresa más en el desarrollo temprano (Figura 7C). Esto puede reflejar la importancia de D-Ser reglamento particularmente en el inicio del desarrollo. La expresión disminuida de los genes clave de señalización de cAMP durante la agregación puede servir para explicar el proceso de agregación retardado en dsd-células nulas. Nuestros datos sugieren que la DSD juega un papel importante en la regulación de los genes de señalización de cAMP en el desarrollo temprano en D. discoideum.

FIGURA 7. Patrones de expresión de genes de señalización de cAMP en dsd-mutante nulo y los de dsd y dao en PESO. WT y dsdLas células nulas que crecen exponencialmente en medio HL5 se desarrollaron en filtros saturados con tampón. El ARN total se extrajo en los puntos de tiempo indicados y los niveles de expresión de acaA (A), cocheA (B), dsd (C), y dao (D) se cuantificaron mediante qRT-PCR. El nivel de ARNm de cada gen se normalizó mediante la expresión de ig7 ARNm en la muestra respectiva. Los valores se representan como la media & # x00B1 SD (norte = 3). Los asteriscos indican diferencias significativas entre WT y dsd-células nulas (Student & # x2019s t-prueba, PAG & # x003C 0,05).


INTRODUCCIÓN

En presencia de nutrientes, el moho del limo celular Dictyostelium discoideum crece como amebas unicelulares de vida libre, pero al morir de hambre, estas amebas se agregan en un organismo multicelular que progresa a través de una etapa de babosa móvil para formar una masa de esporas o soro sostenido por un tallo (Kessin, 2001). La agregación ocurre en respuesta al AMP cíclico (cAMP), que se sintetiza y secreta poco después del inicio de la inanición. El AMPc se une a los receptores de AMPc de la superficie celular, lo que resulta en la disociación y activación de una proteína G heterotrimérica, y esto a su vez conduce a la señalización a través de varios efectores descendentes que median la quimiotaxis a AMPc y al relé de AMPc, el proceso por el cual la señal pasa por todas partes. la población celular. La respuesta quimiotáctica implica la activación de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y la proteína quinasa B (PKB Iijima et al., 2002 Manahan et al., 2004 Postma et al., 2004), mientras que el relé cAMP implica la activación de la adenilil ciclasa (ACA Parent y Devreotes, 1996).

Las proteínas Ras son pequeñas GTPasas monoméricas que funcionan como interruptores moleculares, ciclando entre estados unidos a GTP activos e inactivos unidos a GDP (Bourne et al., 1991). La activación está regulada por factores de intercambio de guanina-nucleótido (GEF) y la inactivación está regulada por proteínas activadoras de GTPasa (GAP) que estimulan la hidrólisis del GTP unido a GDP (Boguski y McCormick, 1993). La superfamilia Ras se puede dividir, sobre la base de comparaciones de secuencia, en varias subfamilias distintas, una de las cuales es la subfamilia Ras (Colicelli, 2004). La subfamilia Ras humana consta de 36 productos génicos distintos que se pueden dividir en varios grupos (Mitin et al., 2005). La búsqueda de efectores descendentes ha revelado cierta especificidad, pero también una enorme complejidad de funciones superpuestas, incluso entre miembros de los diferentes grupos dentro de la subfamilia (Rodríguez-Viciana et al., 2004). A pesar de tener un genoma relativamente pequeño, Dictyostelium posee un gran número de GTPasas de la subfamilia Ras (Semanas et al., 2005), y hay evidencia de que cada proteína realiza una función distinta (Weeks y Spiegelman, 2003). Dictyostelium por tanto, proporciona un modelo experimental útil para el estudio de la función Ras.

La evidencia inicial de un papel de las vías de señalización de Ras en la regulación de la Dictyostelium proceso de agregación fue la interrupción de un gen que codifica un RasGEF, RasGEFA, que impidió la agregación (Insall et al., 1996). La evidencia directa de un papel para Ras vino con la interrupción de la rasc gen, que produjo células que no se agregaron (Lim et al., 2001). rasc Las células nulas mostraron una activación reducida de ACA y una fosforilación reducida de PKB en respuesta a cAMP, lo que sugiere un papel de RasC en las vías de transducción de señales que regulan tanto el relé de cAMP como la quimiotaxis.

Recientemente descubrimos que tanto RasC como RasG se activaron en respuesta a cAMP, lo que sugiere un posible papel de RasG en el proceso de agregación (Kae et al., 2004). Sin embargo, las propiedades de los dos previamente aislados rasg cepas nulas, IR15 e IR17, habían sugerido que el papel principal de RasG estaba en Dictyostelium crecimiento y otras funciones de las células vegetativas (Tuxworth et al., 1997 Khosla et al., 2000), y el único defecto observado en el desarrollo fue un retraso leve pero inconsistente en el inicio de la agregación (R. H. Insall, comunicación personal). En vista de los defectos variables en el desarrollo y la relativa inestabilidad de lo descrito anteriormente rasg cepas nulas (Khosla et al., 2000 R. H. Insall y G. Weeks, observaciones no publicadas), nuevo rasg Se generaron cepas nulas, para estudiar de manera más definitiva el posible papel de RasG en el desarrollo temprano. A modo de comparación, también generamos un rasC rasG doble nulo y rasc cepas nulas en un fondo isogénico. Los estudios de estas cepas han revelado que las ramas de la vía bipartita de transducción de señales de AMPc dependen principalmente de RasG o RasC, aunque también existe cierta superposición de la función de la proteína Ras.


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Dictyostelids

Los mohos de limo celular existen como células ameboides individuales que se agregan periódicamente. La amebe individual se puede ver agregando en la Figura ( PageIndex <1> ) (a). El agregado luego forma un cuerpo fructífero (Figura ( PageIndex <2> )) que produce esporas haploides. Un moho de limo celular, Dictyostelium discoideum, ha sido un organismo de estudio importante para comprender la diferenciación celular, porque tiene etapas de vida unicelulares y multicelulares, y las células muestran cierto grado de diferenciación en la forma multicelular. Mire el video ( PageIndex <1> ) para ver cómo estos individuos se agregan en un solo cuerpo fructífero.

Video ( PageIndex <1> ): Observe el extraño comportamiento del moho celular. Dictostelium discoideum a medida que las amebas individuales responden a una señal de agregación (cAMP), forman una babosa móvil y, finalmente, producen una estructura fructífera con tallos y esporas. Obtenido de YouTube.

Los organismos de este grupo tienen un ciclo de vida complejo (Figura ( PageIndex <3> )) durante el transcurso del cual pasan por etapas unicelulares, multicelulares, productores de esporas y ameboides. Miles de amebas individuales se agregan en una masa viscosa, cada célula conserva su identidad (a diferencia de los mohos de lodo plasmodial). Las células agregadas son atraídas entre sí por el AMP cíclico (AMPc) que liberan cuando las condiciones se vuelven estresantes, como un agotamiento de los alimentos. Las amebas individuales responden a la señal química moviéndose a áreas de mayor concentración de cAMP (quimiotaxis), eventualmente agregándose en una sola babosa. La babosa puede responder a la humedad y los gradientes de luz, navegando hacia un buen lugar para la producción de esporas. Algunas células de la babosa contribuyen a un tallo de 2 & ndash3 milímetros, secándose y muriendo en el proceso. Las células encima del tallo forman un cuerpo fructífero asexual que contiene esporas haploides. Las esporas se diseminan y pueden germinar si aterrizan en un ambiente húmedo.

Figura ( PageIndex <3> ): ciclo de vida de Dictyostelium (texto de la leyenda de la figura original). & quot (A) Durante la fase de crecimiento del desarrollo, las células ameboides se alimentan de bacterias y se replican por fisión binaria. El ciclo de desarrollo se inicia con el agotamiento de los recursos y la agregación se produce cuando las células hambrientas secretan AMP cíclico para reclutar células adicionales (B). Las células agregadas se organizan para formar la etapa de montículo encerrada dentro de una matriz extracelular compuesta de celulosa y mucopolisacárido (26) (C) y continúan desarrollándose hasta convertirse en la babosa en pie (D). Dependiendo de su entorno, la babosa en pie se cae para convertirse en una babosa migratoria que se mueve hacia el calor y la luz (e) o pasa directamente a las etapas de culminación (F) que finalmente producen el cuerpo fructífero, que consiste en una estructura que contiene esporas. , el soro, sostenido en alto por un tallo de células muertas (g). Las esporas se liberan del soro y germinan en células en crecimiento (H). En condiciones óptimas, el ciclo de desarrollo dura alrededor de 24 h. Si la babosa se forma bajo tierra, migra hacia la superficie para maximizar la diseminación de las esporas. Para protegerse de la infección durante la migración, la babosa posee un sistema inmunológico rudimentario que comprende células centinela fagocíticas. Estas células se mueven a lo largo de la babosa, absorben bacterias y toxinas y se eliminan junto con la matriz extracelular a medida que la babosa se mueve (e). En respuesta a las bacterias, las células centinela liberan trampas extracelulares, derivadas del ADN mitocondrial, a través de un mecanismo desconocido que involucra especies reactivas de oxígeno (ROS) generadas por NADPH oxidasa (NOX) y TirA, una proteína soluble que contiene un dominio receptor de peaje / interleucina 1 (i ). & quot Cifra extraída de la publicación Eat Prey, Live: Dictyostelium discoideum como modelo para las defensas autónomas de células. Dunn y col., (2018). CC BY 4.0 DOI: 10.3389 / fimmu.2017.01906


Agregación de Dictyostelium ¿Cómo puede la formación de patrones informar la biología celular? - Presentación de PowerPoint PPT

Título: Detección de gradientes Autor: Herbert Levine Última modificación por: Herbert Levine Fecha de creación: 17/02/2005 9:17:52 PM Formato de presentación del documento: Presentación en pantalla y presentación PowerPoint PPT ndash

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Comentarios:

  1. Arkwright

    que lindo pensamiento

  2. Geffrey

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  3. Cronus

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  5. Al-Hadiye

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  6. Holdin

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  7. Cartere

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