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¿Qué longitud de onda usar para determinar las algas usando un colorímetro?

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Estoy haciendo un proyecto de biología que involucra las mediciones de la densidad de las algas (Nanocloropsis) utilizando colorimetría de absorbancia. ¿A qué longitud de onda debo configurar mi colorímetro?

El problema es que existen dos tipos de clorofila, cada una con un óptimo de absorbancia diferente, hay que considerar la dispersión espectral, así como la absorción de UV cuando se pasa a longitudes de onda bajas. ¿Qué hacer?


De Biotek Aprendí lo siguiente:

Las exploraciones espectrales de cultivos de algas demuestran una absorbancia significativa por debajo de 400 nm, así como dos picos de absorbancia distintos a 440 nm y 675 nm (Figura 1). La determinación del número de células es más consistente cuando se usa la dispersión de luz en lugar de la absorbancia por los constituyentes celulares. Para evitar la influencia del material absorbente 600 nm [es mejor] para monitorear el crecimiento.


Figura 1. Curva espectral de absorbancia de cultivos en suspensión de Microcystis aeruginosa Fuente: Biotek


Concentración y colorimetría

¿Están sus estudiantes luchando con el concepto de concentración? ¿Tienen problemas para tomar M1V1 = M2V2 más allá de la memorización de memoria a la aplicación real? ¡Intente experimentar con soluciones coloreadas! La intensidad del color proporciona una excelente pista para ayudar a los estudiantes a visualizar el concepto, y el colorímetro PASPORT permite a los estudiantes cuantificar la actividad.

Primero, prepare una solución madre de tinte azul y etiquétela como “1.0 M”. Haga que los estudiantes preparen diferentes concentraciones de la solución madre. Aplicación de M1V1 = M2V2 Es necesario completar la tabla y preparar las soluciones.

Concentración a preparar (M) Volumen de solución madre 1.0 M (mL) Volumen de agua (mL) Volumen total de nueva solución (mL)
0.0 0 10 10
0.2 10
0.4 10
0.6 10
0.8 10
1.0 10 0 10

A partir de este punto podrán distinguir visualmente las concentraciones de las soluciones, y también podrán cuantificar este efecto utilizando el Colorímetro.

Debido a que el colorímetro puede medir el% de transmitancia y la absorbancia simultáneamente en cuatro longitudes de onda, los estudiantes podrán determinar la relación entre el color de la solución que ven y el color de la luz que se ve afectada por la solución.

Ponga en blanco el colorímetro presionando el botón verde con agua destilada en la cubeta, luego cree pantallas de dígitos de los datos de% de transmitancia y absorbancia de las cuatro longitudes de onda. Cambie a muestreo manual e inserte la solución 1.0 M en el colorímetro.

La solución azul transmite principalmente luz azul. Por eso parece azul a nuestros ojos. La solución azul absorbe principalmente la luz naranja porque el naranja es el color complementario. Dado que la luz naranja es la más afectada, el análisis debe realizarse a la longitud de onda de 610 nm.

Ahora que los estudiantes han determinado la mejor longitud de onda para estudiar, pueden comenzar a cuantificar las diferentes concentraciones de la solución. Pero, ¿cómo saben si deben mirar la absorbancia o el% de transmitancia? ¡Pueden hacer ambas cosas y comparar!

Cree una página con una tabla y un gráfico que contenga la concentración (eje x) y el% de transmitancia naranja (eje y). Ahora ingrese las concentraciones de las soluciones que preparó. Una vez ingresados, coloque cada cubeta en el colorímetro y mantenga el valor.

Repita el proceso usando absorbancia naranja en lugar de% transmitancia naranja. Con la función de eje múltiple y en SPARKvue ® puede comparar las dos medidas en un gráfico.

Los datos de absorbancia proporcionan una línea mucho más recta. Esta relación entre absorbancia y concentración es la base de la ley de Beer. Los estudiantes pueden aplicar esta relación recién construida para determinar la concentración de soluciones azules desconocidas según los datos de absorbancia.

Esta sencilla actividad con tinte azul y un colorímetro les ha brindado a sus estudiantes la oportunidad de visualizar y cuantificar la concentración al ver las diferencias en las soluciones y medir con el colorímetro PASPORT. Al mismo tiempo, están construyendo algunos conceptos fundamentales de colorimetría / espectroscopia, incluido cómo seleccionar la longitud de onda adecuada y la ley de Beer.


¿Qué longitud de onda usar para determinar las algas usando un colorímetro? - biología

A espectrofotómetro es un instrumento que pasa una longitud de onda seleccionada de radiación electromagnética a través de una solución y mide la cantidad de esa radiación electromagnética que la solución absorbe (no deja pasar) o transmite (deja pasar). Consulte por un momento el espectro electromagnético que se muestra en la página vinculada, (de Vida, la ciencia de la biología, por Purves et al., 5ª ed., 1998). Un tipo de espectrofotómetro usa longitudes de onda ultravioleta (UV), que son las longitudes de onda que causan quemaduras solares, por ejemplo. Otro tipo usa longitudes de onda infrarrojas (IR), que son más familiares como calor. Es posible que tenga la oportunidad de utilizar uno de estos en otro curso. El tercer tipo de espectrofotómetro, que usaremos en este curso, usa longitudes de onda visibles, que pensamos como los diferentes colores de luz, que van del violeta al rojo. Dado que estos son los colores familiares, este tipo de espectrofotómetro se llama "colorímetro". El modelo particular que utilizaremos es el colorímetro Spectronic 20.

Dado que este semestre utilizará el colorímetro Spectronic 20 en tres tipos diferentes de actividades de laboratorio, debe comprender cómo funciona y cómo utilizarlo correctamente. Colorimetría es un procedimiento en el que se utiliza un colorímetro para analizar la composición de las soluciones, en una de dos formas, como se describe a continuación. También podríamos llamar a esto espectrofotometría visible, ya que estamos usando longitudes de onda visibles. Espectrofotometría ultravioleta y Espectrofotometría de infrarrojos usaría longitudes de onda ultravioleta o infrarroja, respectivamente, por supuesto, que requerirían instrumentos diferentes, ya que el Spectronic 20 está diseñado para producir y detectar solo longitudes de onda visibles.

El fenómeno de la absorción de radiación electromagnética ya le resulta familiar de muchas maneras. Por ejemplo, la exposición de la piel a la luz solar durante un tiempo prolongado produce una "quemadura solar". Ese es el resultado de las moléculas dentro de las células de la piel que absorben la radiación ultravioleta de la luz solar. El propósito de un bloqueador solar que se frota sobre la piel es proporcionar otras moléculas para absorber esa radiación ultravioleta antes de que llegue a la piel. ¿El punto? Las moléculas absorben la radiación electromagnética y esa absorción se puede detectar . una quemadura de sol duele! En otro ejemplo familiar, las moléculas de agua dentro de los alimentos absorben la radiación de microondas (longitudes de onda en el extremo largo del infrarrojo) en un horno de microondas. El resultado, fácilmente detectable, es que la comida se calienta.

Suponga que agregamos una gota de colorante verde a una taza de agua y una gota de colorante amarillo a otra taza de agua. Cada uno de estos colorantes alimentarios (tintes) es un tipo diferente de molécula orgánica. Imagínese poniendo estas dos soluciones en tubos de ensayo separados y sosteniéndolos contra la luz de la ventana. Los ve como colores diferentes porque las moléculas de tinte en solución absorben (es decir, filtran) diferentes longitudes de onda de luz y transmiten (es decir, dejan pasar) diferentes longitudes de onda a su ojo. La solución verde parece verde porque ese tipo de molécula de tinte absorbe principalmente longitudes de onda que no sea verde. De manera similar, la solución amarilla aparece amarilla porque son las longitudes de onda en la parte amarilla del espectro que las moléculas en solución no absorber por lo que son principalmente las longitudes de onda amarillas las que llegan al ojo después de atravesar la solución. Por lo tanto, la calidad de la luz (calidad significa tipo, tipo) que se absorbe depende de la escribe de molécula disuelta en el disolvente. Los diferentes tipos de moléculas, como el tinte verde frente al tinte amarillo, absorberán diferentes tipos (longitudes de onda) de luz.

los cantidad de luz que se absorbe depende de la concentración del soluto disuelto que absorbe la luz. Se absorberá más luz de una longitud de onda determinada si aumenta la concentración del soluto. Para usar el ejemplo del colorante para alimentos nuevamente, dos gotas de colorante verde por taza de agua producirán una solución que parece un poco más verde que una solución hecha con una sola gota de colorante verde. Ambas soluciones absorben las mismas longitudes de onda no verde, pero la cantidad de luz no verde absorbida es mayor en la solución más concentrada. Esta distinción entre la calidad y la cantidad de luz absorbida (o transmitida) por una solución es importante en biología: propiedades cualitativas o fenómenos (de qué tipo o tipo) versus propiedades cuantitativas o fenómenos (cuánto / muchos).

En algunos tipos de pruebas de laboratorio, el investigador desea saber qué longitudes de onda del espectro son absorbidas por los solutos en una solución. Esto puede ayudar a identificar un soluto, ya que diferentes tipos de moléculas absorben diferentes longitudes de onda. Consulte los espectros de absorción (el espectro es plural de espectro) de los pigmentos fotosintéticos que se muestran en la página vinculada (de Vida, la ciencia de la biología, por Purves et al., 5ª ed., 1998). Tenga en cuenta que cada pigmento tiene un perfil diferente de longitudes de onda que absorbe con mayor o menor intensidad. Ese perfil es un rastro de "picos" y "valles" y algunos picos pueden tener "hombros" en sus pendientes. Comprender que un espectro de absorción es un gráfico de absorción de luz (variable dependiente) en función de la longitud de onda (variable independiente). De nuevo, puede ser posible identificar un tipo de molécula sobre la base de su perfil característico (patrón) de longitudes de onda absorbidas. Producirá un espectro de absorción de este tipo en el laboratorio de hoy, para ver con qué facilidad se puede hacer.

En otros tipos de pruebas de laboratorio, el investigador desea determinar la concentración de un soluto específico en una solución. En este tipo de aplicación de colorimetría, ya se ha determinado el espectro de absorción del soluto de interés. Entonces, en el colorímetro seleccionamos una longitud de onda que se sabe que el soluto absorbe fuertemente. Volviendo a la gráfica de los espectros de absorción, el pigmento llamado ficoeritrina 565 nm sería la mejor longitud de onda. Podríamos decir que esa es la ubicación de la longitud de onda del "pico" más alto en el espectro de absorción de la ficoeritrina. Para usar ese ejemplo del tinte verde nuevamente ahora, una serie de tubos de ensayo que contienen diferentes concentraciones del tinte aparecerían todos verdes pero con diferentes profundidades de verde. Eso significa que todas las soluciones absorberían las mismas longitudes de onda pero diferentes cantidades de luz. Su ojo podría ver diferencias relativas en la profundidad de verde entre los tubos, pero el colorímetro cuantificaría esas diferencias por usted, es decir, asignaría valores numéricos a cuánto de la luz que entraba en la solución fue absorbida y cuánta se transmitió. La cantidad relativa de luz de una longitud de onda dada que es absorbida por una solución se llama absorbancia (A), mientras que la fracción de luz que entra en la solución que pasa sin obstáculos se llama porcentaje de transmitancia (% T). Utilizará este aspecto cuantitativo de la colorimetría la próxima semana en el laboratorio cuando realice el procedimiento de biuret para medir las concentraciones de proteínas de las soluciones.

Observación del espectro visible dentro del colorímetro Spectronic 20

1. Gire el interruptor de alimentación en el sentido de las agujas del reloj para encender el instrumento, oirá / sentirá el clic. los lámpara indicadora debe brillar, y es posible que escuche el suave sonido del ventilador de enfriamiento en el interior. Si la lámpara piloto no brilla en uno de estos instrumentos, no se preocupe. Por el momento puede ignorar los otros usos de las dos perillas en la parte frontal del instrumento.

2. Consulte la ilustración del instrumento a continuación. Cada solución que probará se coloca en un pequeño tubo de ensayo, llamado tubo de colorimetro, que se inserta en el portamuestras. El haz de luz, cualquiera que sea la longitud de onda seleccionada, pasa a través del tubo en el soporte de derecha a izquierda.

3. En su gradilla de tubos de ensayo hay un tubo de colorímetro que contiene una tira rectangular de papel blanco que es un poco más corta que la longitud del tubo y lo suficientemente ancha para caber cómodamente en el tubo del colorímetro. Inserte este tubo en el soporte (empujándolo completamente hacia abajo) y gire el tubo de modo que el débil haz de luz que ingresa al tubo desde la derecha golpee la superficie plana del papel.

4. Coloque su mano alrededor de la parte superior del portamuestras abierto y mire de cerca hacia abajo en el tubo para ver la desmayarse luz reflejada en el papel. Deberá tener el ojo cerca de la mano ahuecada (cerca de la parte superior del tubo) porque la luz es débil. Si la luz de la habitación es demasiado brillante, el instructor apagará las luces de la habitación por un momento.

5. A medida que gira el perilla de control de longitud de onda, verá que la luz reflejada por el papel cambia de violeta / azul (aproximadamente 400 nm) a verde a amarillo a naranja y finalmente a rojo (aproximadamente 700 nm). La lámpara dentro del instrumento produce luz blanca (una mezcla de todas las longitudes de onda), pero la perilla de control de longitud de onda filtra todas menos la que usted seleccione. En funcionamiento normal (es decir, sin el papel en el tubo del colorímetro), la luz que ve reflejada entraría en el tubo que contiene una solución de prueba y una parte de ella pasaría por el otro lado (izquierdo) del tubo para encender un detector, que convertiría esa luz en una señal eléctrica que se registra en el escalas de transmitancia y absorbancia.

6. Retire el tubo de la cámara de muestras y vuelva a colocarlo en la gradilla de tubos de ensayo.

7. En funcionamiento normal, la tapa del portamuestras siempre se cierra después de insertar el tubo de muestra, antes de registrar las mediciones, para bloquear la luz parásita.

Estandarización del colorímetro para determinar el espectro de absorción de la riboflavina, la vitamina

A medida que la luz pasa a través de una solución en un tubo colorimétrico, una pequeña fracción de esa luz puede ser absorbida por el vidrio del tubo y por el disolvente en el que se disuelve la molécula de interés. Además, como verá en su próximo ejercicio de laboratorio (la prueba de biuret para medir proteínas en soluciones), la solución en el tubo puede contener otras sustancias que son necesarias para producir el color que mide. Dado que muchos tipos de moléculas no están coloreadas, deben reaccionar con algo que produzca un color antes de poder usar el colorímetro para medirlas. Cualquier cosa que atraviesa la luz puede absorber parte de la luz e influir en las mediciones. Dado que el objetivo es medir la absorción de un tipo particular de molécula en una solución, es necesario corregir ("restar") la absorción de luz por todo lo demás (el vidrio del tubo de ensayo, el solvente, cualquier color que produzca color). reactivos presentes). Para hacer eso tu estandarizar el instrumento antes de realizar sus mediciones.

La riboflavina es una vitamina soluble en agua. La solución amarilla en uno de los tubos de su gradilla contiene riboflavina disuelta en agua, 0,017 mg / ml no hay nada más. Para obtener los datos más precisos posibles para determinar el espectro de absorción de la riboflavina, debe estandarizar el colorímetro para corregir la absorción de luz por el vidrio y el solvente (agua en este caso). Por lo tanto, tiene otro tubo que contiene solo agua, es decir, todo excepto la molécula de interés, riboflavina este segundo tubo se llama blanco. Utiliza el blanco para estandarizar el instrumento. En efecto, le estará "diciendo al instrumento que ignore" la absorción de luz por todo excepto la molécula de interés, la riboflavina.

Los pasos de la estandarización son pocos y sencillos, pero deben hacerse correcta y cuidadosamente para obtener datos fiables.

1. Si el instrumento aún no estuviera encendido, usaría el interruptor de alimentación para encender el instrumento y dejar que se caliente durante unos 15 minutos.

2. Utilice el control de longitud de onda para seleccionar la longitud de onda deseada, los valores de longitud de onda que se muestran en la dial de longitud de onda la ventana de visualización están graduados en nanómetros (nm). TENGA EN CUENTA BIEN que en el trabajo de la próxima semana usará solo una longitud de onda hoy, sin embargo, medirá la absorción de luz en muchas longitudes de onda para determinar el espectro de absorción de la riboflavina. Entonces, comenzaremos con 340 nm para la longitud de onda. Ajústelo ahora.

3. Con el portamuestras vacío y con la tapa cerrada, utilice el Control "0" perilla (igual que la perilla de control de potencia) para ajustar la aguja indicadora a cero por ciento en la escala de transmitancia, 0% T. Sin un tubo en la cámara, no entra luz a la cámara (está oscuro como boca de lobo), por lo que ninguna luz incidirá en el detector. En efecto, le está diciendo al instrumento que si hubiera un tubo con una solución en la cámara, esto es lo que vería si absolutamente nada de la luz que entra en el tubo pasara al otro lado, es decir, el 0% del la luz pasó.

4. Inserte el tubo en blanco en el soporte y cierre la tapa. La aguja se desplazará hacia arriba en la escala% T. Dondequiera que la aguja se detenga, use el Control de luz perilla ahora para mover la aguja al 100% T en la escala. En efecto, le está diciendo al instrumento que con una muestra en la cámara, pero sin riboflavina presente, esto es lo que vería si toda la luz (el 100%) que ingresa al tubo pasara al otro lado. Dado que el vidrio y el solvente también estarán presentes con su muestra de riboflavina, este paso le dice al instrumento que ignore la absorción de luz por esos factores. Ahora, si ve valores de% T inferiores al 100%, que debe ser debido a la absorción de luz por parte de la riboflavina con riboflavina presente, pasará menos del 100% de la luz que ingresa al tubo.

5. Retire el blanco del portamuestras y cierre la tapa. La aguja debe volver a caer a cero% T.

6. El instrumento está ahora estandarizado para una longitud de onda de 340 nm. Si fuera a realizar mediciones en muchas muestras en esta única longitud de onda, no tocaría el Control de luz perilla o el Control "0" perilla de aquí en adelante.

Determinación del espectro de absorción de riboflavina

Una gráfica de espectro de absorción absorbancia (A), no el% de transmitancia, en el eje y, en función de la longitud de onda en el eje x. La absorbancia es la otra escala de su colorímetro. Tenga en cuenta que las escalas de absorbancia y% T se ejecutan en direcciones opuestas, lo que significa que están relacionadas recíprocamente a medida que una aumenta y la otra disminuye. Pero tenga en cuenta también los espacios entre las divisiones en las escalas% T tiene una escala lineal, mientras que la absorbancia tiene una escala logarítmica (logaritmo común, es decir, logaritmo de base 10). Específicamente, A = registro (1 / T), donde T es el equivalente decimal de% T. Ejemplo: si% T = 50%, entonces T = 0.5 y (1 / T) = 2.0, y A = 0.301. Asegúrese de comprender esta relación algebraica.

Para recopilar datos del espectro de absorción de riboflavina ahora, debe registrar valores de absorbancia en muchas longitudes de onda, no solo una, en todo el espectro visible. Será suficiente tomar medidas en incrementos de 5 nm. Sin embargo, cada vez que se cambia la longitud de onda, se debe rehacer el ajuste de 100% T porque es posible que el vidrio y el solvente no absorban la luz en el mismo grado en diferentes longitudes de onda. Pero este paso adicional toma poco tiempo. Entonces, proceda de la siguiente manera.

1. Con el colorímetro ya estandarizado para una longitud de onda de 340 nm, inserte el tubo de riboflavina, cierre la tapa de la cámara y registre la lectura de absorbancia. No cambie todavía la configuración de las perillas. Luego retire el tubo de riboflavina y cierre la tapa. La aguja volverá a caer al 0% T, que es A = "infinito" (la máxima absorbancia posible). Establece el 0% T sólo una vez.

2. Restablezca la longitud de onda a 5 nm más alta que la última configuración. Inserte el blanco tubo, cierre la tapa y observe que la aguja no regresa hasta el 100% T. Eso es porque el vidrio del tubo y el agua absorben diferentes cantidades de luz en diferentes longitudes de onda. Por lo tanto, restablezca la aguja al 100% T con el Control de luz perilla ahora. La máquina ahora está estandarizada para la nueva longitud de onda.

3. Retire el tubo en blanco y observe que la aguja vuelve a caer al 0% T (= absorbancia máxima). Inserte el tubo de riboflavina en el portamuestras, cierre la tapa y registre la absorbancia en la nueva longitud de onda. No ajuste ninguna perilla con la muestra de riboflavina en la cámara. Luego retire el tubo de riboflavina y cierre la tapa.

4. Ahora repita los pasos # 2 y # 3: aumente la longitud de onda en pasos de 5 nm, reinicie el 100% T con el espacio en blanco cada vezy registre un nuevo valor de absorbancia para la solución de riboflavina. Su último ajuste de longitud de onda será 530 nm. Este proceso es rápido, pero debe hacerse con cuidado.

5. Vuelva a colocar el tubo en blanco y el tubo de riboflavina en la gradilla de tubos de ensayo. Nunca deje una muestra en el instrumento. Apague el instrumento girando el interruptor de alimentación en sentido contrario a las agujas del reloj, oirá / sentirá el clic.

6. Grafique sus datos en papel cuadriculado que tenga ambos ejes con escalas lineales: absorbancia en el eje y y longitud de onda en el eje x. ¿Cuál es la longitud de onda máxima de absorción de riboflavina? ¿Cuántos "picos" tiene el espectro de absorción? Verifique sus resultados con su instructor de laboratorio.


Actividad I

Para comprender más sobre la eutrofización, realizará un experimento de laboratorio (Parte 1) y utilizará el modelo informático de Silver Springs (Parte 2)

Parte 1

Una forma potencial de disminuir la eutrofización cultural es hacer que los organismos de niveles tróficos superiores consuman las algas. Investigaremos esta posibilidad usando Daphnia, un zooplancton que se alimenta de algas verdes, y una especie de alga llamada Chorella. Aunque la información que obtenemos de esta actividad es útil, es una simplificación excesiva de lo que realmente podría ocurrir en el medio acuático.

Usaremos un colorimetro para medir la población de algas. Un colorímetro mide la absorbancia, la cantidad de luz que es absorbida por una solución en lugar de la cantidad de luz que puede pasar. A medida que aumenta la población de algas (número de células de algas), también aumentará la absorbancia. Es una relación directa.

Procedimiento

  1. Obtenga dos cubetas y una pipeta de transferencia.
  2. Llene una cubeta con agua destilada. Esta cubeta es el blanco
  3. Coloca el blanco en el colorímetro y ponlo a cero. Esto proporciona una medida de referencia para el experimento. Guarde la cubeta en blanco para su uso posterior.
  4. Con la pipeta desechable, llene la segunda cubeta con el Chorella algas. Utilice la pipeta para intentar dispersar las algas uniformemente por toda la cubeta.
  5. Suma 10 dafnia a la cubeta y mida inmediatamente la absorbancia con el colorímetro. Registre su lectura en la tabla a continuación.
  6. Retire la cubeta del colorímetro y déjela reposar sin tocar durante 30 minutos.
  7. Después de 30 minutos, vuelva a colocar la cubeta en blanco (con agua destilada) en el colorímetro. Utilice el espacio en blanco para volver a poner a cero la máquina.
  8. Retire la cubeta en blanco y coloque las algas /Daphnia cubeta en el colorímetro. Mida la absorbancia y registre su lectura en la siguiente tabla.

Preguntas

  1. ¿Cómo cambió la absorbancia del tiempo 0 al tiempo 30 minutos? ¿La absorbancia aumentó, disminuyó o se mantuvo igual?
  2. ¿Qué le dice el cambio del valor de absorbancia acerca de la concentración del Chorella? ¿Aumentó, disminuyó o se mantuvo igual?
  3. ¿Qué le dice la probabilidad del valor de absorbancia sobre el comportamiento del Daphnia? Ellos consumieron Chorella? ¿Cómo lo sabes?
  4. En un ecosistema acuático real, ¿cree que el zooplancton podría disminuir el impacto de la eutrofización cultural y la proliferación de algas? Explica por qué o por qué no.

Parte 2

Ahora que ha observado interacciones tróficas y eutrofización cultural en un experimento de laboratorio, aplique ese conocimiento al modelo de computadora. Utilice el modelo para analizar la sensibilidad del ecosistema de Silver Springs a la eutrofización cultural. Recuerde que el alga es un productor fotosintético en el primer nivel trófico. los Daphnia sería uno de los herbívoros del medio ambiente en el segundo nivel trófico. Cambie los niveles en el modelo para simular una situación de eutrofización. Vea los gráficos para ver cómo cambian las poblaciones de diferentes niveles tróficos a través de la simulación.

Preguntas

Según sus hallazgos con el modelo, responda las siguientes preguntas:

  1. ¿Cuál es el número máximo de productores que puede soportar el ecosistema antes de que los niveles tróficos más altos comiencen a disminuir?
  2. ¿Qué sucede con la respiración de la comunidad en la floración de algas simulada? ¿Aumenta, disminuye o permanece igual?
  3. ¿Qué sucede con la población de descomponedores en la floración de algas simulada? ¿Aumenta, disminuye o permanece igual? ¿Por qué?
  4. ¿Qué grupo de carnívoros (qué nivel trófico) se ve más afectado por la floración de algas? ¿Por qué crees que es así?

Seguimiento del crecimiento de las algas mediante sus propiedades intrínsecas

El costo creciente del combustible, así como el impacto del cambio climático, ha incrementado dramáticamente el interés en fuentes alternativas de combustible. La producción de biocombustible a partir de algas es un área de intensa investigación en curso. Un elemento clave en esta investigación consiste en monitorear el crecimiento de algas bajo una variedad de condiciones a lo largo del tiempo. Aquí describimos el uso del lector de microplacas multimodo Synergy & trade H4 para monitorear diferentes cepas de algas usando las propiedades de dispersión de luz (turbidez) de las algas en solución o la excitación por fluorescencia de la clorofila de algas.

Introducción

El crecimiento de organismos unicelulares en cultivo en suspensión se puede controlar usando mediciones de turbidez o dispersión de luz. A medida que aumenta el número de células, la solución se vuelve cada vez más turbia porque la luz que pasa a través de ella es dispersada por los microorganismos presentes [1]. Si bien no obedece la ley de Beer & rsquos, a medida que aumenta la dispersión de luz, el porcentaje del haz de luz total que llega al detector disminuye y se registra como absorbancia. La cuantificación de las suspensiones celulares basadas en la dispersión de la luz fue descrita por primera vez por Lord Rayleigh alrededor de 1900. La luz no se absorbe, sino que las moléculas dentro de la célula difractan la luz incidente. Gran parte de la luz difractada se desviará del camino óptico hacia el detector y el lector la registrará como densidad óptica. El grado de pérdida de luz debido a la dispersión de la luz está influenciado tanto por la partícula suspendida como por la configuración de la óptica del instrumento. Los efectores celulares específicos incluyen: tamaño celular, composición de la membrana, anatomía del orgánulo celular interior y densidad celular. Las dimensiones ópticas del instrumento, como la distancia entre el material absorbente y el detector, la presencia o ausencia de lentes de enfoque y el tamaño del haz, influyen en la señal de & ldquolight scatter & rdquo. Los organismos fotosintéticos como las algas también se pueden monitorear usando clorofila. Si bien hay varias estructuras de clorofila diferentes, la clorofila a se distribuye uniformemente entre todas las especies de plantas. Se han encontrado varias otras formas de clorofila en cianobacterias y algas que difieren en las cadenas laterales de la estructura del anillo central. Independientemente del tipo, la clorofila es una molécula que puede detectarse por absorbancia o fluorescencia. En esta nota de aplicación, demostraremos el uso efectivo tanto de la dispersión de luz a 600 nm como de la fluorescencia basada en clorofila para monitorear el crecimiento de algas sin la necesidad de agregar reactivos, utilizando solo las propiedades intrínsecas de las células.

Materiales y métodos

Los cultivos de Chlorella vulgaris (2714) y dos aislados diferentes de cepas de Microcystis aeruginosa (LB2238 y LB2061) se obtuvieron de la Colección de Cultivos de Algas UTEX de la Universidad de Texas en Austin. Las células se cultivaron en medios BG11, TAP y TP según fuera necesario.

Se cultivaron cultivos de células de algas en medios BG11, TAP o TP durante un período de días en matraces Erlenmeyer estériles de 250 ml. Los cultivos en suspensión se mantuvieron a temperatura ambiente y se agitaron usando un agitador rotatorio a 100 RPM con iluminación de luz constante. Se retiraron alícuotas (200 µl) y se pipetearon en placas Corning 3603 de fondo transparente de lados negros. Las mediciones de absorbancia y fluorescencia se realizaron utilizando un lector de microplacas multimodo Synergy H4 (BioTek Instruments, Winooski, VT) utilizando la función de cinética discontinua [2] de Gen5 & trade Data Analysis Software (BioTek Instruments, Winooski, VT) para gestionar los datos.

Se produjeron curvas de calibración de dispersión de luz y fluorescencia de cada tipo de célula diluyendo en serie cultivos celulares de densidades conocidas (células / ml) que se habían determinado mediante recuento celular usando un hemocitómetro. A continuación, se interpolaron las curvas de calibración para proporcionar información sobre el número de células utilizando medidas de absorbancia a 600 nm.

Se realizaron exploraciones espectrales fluorescentes y de absorbancia utilizando los monocromadores de un lector de microplacas multimodo Synergy & trade H4. La absorbancia de los cultivos de M. aeruginosa 2061 se midió de 300 nm a 700 nm en incrementos de 1 nm y se trazó utilizando el software de análisis de datos Gen5. También se determinaron los espectros de fluorescencia utilizando los mismos cultivos. El espectro de emisión se determinó de 500 nm a 850 nm en incrementos de 1 nm usando una longitud de onda de excitación fija de 440 nm. Para el análisis espectral de excitación, la longitud de onda de emisión se estableció en 685 nm y las longitudes de onda de excitación variaron de 300 nm a 500 nm en incrementos de 1 nm. Los datos para ambos escaneos se normalizaron a un valor máximo de 10,000 RFU y se trazaron usando el software de análisis de datos Gen5 & trade (BioTek Instruments).

Resultados

Las exploraciones espectrales de cultivos de algas demuestran una absorbancia significativa por debajo de 400 nm, así como dos picos de absorbancia distintos a 440 nm y 675 nm (Figura 1). La determinación del número de células es más consistente cuando se usa la dispersión de luz en lugar de la absorbancia por los constituyentes celulares. Para evitar la influencia del material absorbente, se eligió 600 nm como longitud de onda para controlar el crecimiento.

Figura 1. Curva espectral de absorbancia de cultivos en suspensión de Microcystis aeruginosa.

Las suspensiones celulares se cuantificaron usando un hemocitómetro y se diluyeron en serie. Las mediciones de absorbancia, que reflejan el grado de dispersión de la luz por las células, cuando se representan frente al número de células demuestran una relación lineal para las tres líneas celulares de algas probadas (Figura 2). Las curvas de calibración como estas se pueden utilizar para determinar el número de células en función de la lectura de absorbancia. Notamos una marcada diferencia en la respuesta de absorbancia por célula con la absorbancia entre diferentes cepas y organismos (Figura 2).

Figura 2. Curva de calibración para cepas de algas cultivadas en medio BG11 basada en la medición de la absorbancia inducida por la dispersión de la luz.

También se realizaron exploraciones espectrales fluorescentes en cultivos de algas. Como se demuestra en la Figura 3, se observaron picos de excitación y emisión significativos que corresponden a los picos esperados para la fluorescencia de la clorofila a. Se observó un pico de excitación a 434 nm, mientras que se encontró un pico de emisión a 684 nm. Las determinaciones fluorescentes posteriores utilizaron una longitud de onda de excitación de 440 nm y una longitud de onda de emisión de 685 nm. También se realizaron mediciones de fluorescencia con diluciones de células de algas. También se encontró que la respuesta fluorescente era lineal con respecto al número de células para las tres especies de algas probadas (Figura 4). La observación de que tanto la absorbancia basada en la dispersión de luz como la fluorescencia de la clorofila son lineales y que la respuesta de las tres cepas de algas tuvo la misma relación sugiere que cualquiera de los métodos de determinación podría usarse para evaluar el crecimiento celular.

Figura 3. Análisis espectral de emisión y excitación de fluorescencia de cultivos en suspensión de Microcystis aeruginosa.

Esto se corrobora cuando se grafica la fluorescencia a 685 nm (excitación de 440 nm) frente a la absorbancia a 600 nm de los pocillos de microplacas individuales de diluciones de Chlorella vulgaris. Se observa una correlación directa entre las dos mediciones con un coeficiente de correlación alto (& gt 0,97) cuando se realiza una regresión lineal en un diagrama de dispersión (Figura 5).

Figura 4. Curvas de calibración para cepas de algas cultivadas en medio BG11 basadas en la excitación por fluorescencia de la clorofila.

These data suggest that under the constant light illumination growth conditions used for these experiments either 600 nm absorbance based light scatter or fluorescence based chlorophyll determinations can potentially be used to monitor algal culture growth in suspension.

Figura 5. Correlation between absorbance and fluorescence measurements of Chlorella vulgaris dilutions.

When the growth of different algal strains in BG11 media is compared using absorbance at 600 nm in conjunction with the cell calibration curve strain to strain differences are observed (Figure 6). All three strains exhibit classical sigmoidal shaped growth patterns. An initial lag phase after inoculation where cells are adapting to the new environment and growing slowly, which is followed by a log-phase were cells are rapidly growing and dividing and as nutrients become scarce and metabolic by-products increase the cells enter a stationary phase.

As demonstrated in Figure 6 aliquots of all three strains increased in 600 nm absorbance until reaching stationary or plateau phase at approximately 10 days. C. vulgaris and M. aeruginosa 2383 resulted in very similar absorbance values, while M. aeruginosa 2061 plateaus at cell densities about one third of the other two strains of algae (Figure 6).

Figura 6. Comparison of cell number from different algal strains grown in BG11 media.

When fluorescence is measured in the same cultures a different pattern of cell growth than what was seen with absorbance is observed. As shown in Figure 7 cell density of the green algae C. vulgaris appeared to increase rapidly with little evidence of a lag phase. M. aeruginosa 2383 required a significantly longer period of time to reach maximal levels, while M. aeruginosa 2061 lagged behind even after 15 days. Despite the patterns being significantly different the basic relationship between the three strains was similar. M. aeruginosa 2061 signal for both absorbance and fluorescence was significantly less than the other two strains at the end of 15 days, while the maximal levels of M. aeruginosa 2383 and C. vulgaris were similar (Figure 7).

Figura 7. Comparison of fluorescence of Algal strains grown in BG11 media.

When cell number and fluorescence from the same cultures are plotted together and compared differences between the strains become apparent. With C. vulgaris cultures increases in chlorophyll as measured by fluorescence closely parallel increases in cell number as interpolated from 600 nm absorbance (Figure 8). This suggests that the amount of chlorophyll per cell remains relatively constant through the growth cycle.

Figura 8. Cell density (from absorbance measurements) and Fluorescence of Chlorella vulgaris culture in BG11 media.

In the M. aeruginosa cultures increases in fluorescence lagged behind increases in cell number (Figure 9). This suggests that the number of cells initially increases faster than the amount of chlorophyll resulting in less chlorophyll per cell. Only when the change in cell number rate begins to slow does the rate of chlorophyllincrease match that of cell number. Eventually both cell number and chlorophyll reach a steady state.

Figura 9. Cell density (from absorbance measurements) and Fluorescence of Microcystis aeruginosa 2383 culture in BG11 Media.

The nutritional effects of different media formulations can markedly influence the growth rate and final cell density of the algal cultures. C. vulgaris cultures grown in different media formulations, with varying amounts of total carbon, have markedly different final cell densities as measured by absorbance at 600 nm (Figure 10). Cultures grown in TAP, which has high amounts of carbon, grow to an absorbance density approximately 10 fold greater than cultures grown in BG11, which is carbon poor. Cultures grown in TP media, which has less carbon than TAP, have an intermediate final density. Interestingly, while maximal absorbance is less with TP media log phase growth of C. vulgaris begins sooner in TP media than TAP despite having less carbon initially (Figure 10).

Figura 10. Comparison of A600 growth curves of Chlorella vulgaris grown in different complete media formulations.

Carbon content is not the only critical constituent of algal growth media. C. vulgaris cultures grown in TAP media deficient in either nitrogen or sulfur grow at considerably slower rates and much lower final densities (Figure 11).

Figure 11. Comparison of A600 growth curves of Chlorella vulgaris grown in complete TAP media or TAP deficient in nitrogen or sulfur.

Discusión

These data demonstrate the utility of monitoring algal cell growth using either absorbance of fluorescence. Assessment of cell density and growth state is a critical element in algae-based biodiesel production. The use of light scatter to measure suspended objects, such as cells, has been used for decades. While most often associated with bacterial cell growth, it has also been used for mammalian cells [1]. The basis of which is the diffraction of light by suspended moieties. A number of variables affect the amount of measured absorbance from a known concentration of cells. The size, shape and interior structure of the cells being monitored will affect the amount of light scatter. The physical make up of the microplate reader&rsquos optical path will also influence the absorbance reading when making light scatter measurements. Differences in light beam diameter, focal distance and detector size between different readers makes direct comparison of light scatter results difficult.

As such, for the most accurate results, it is necessary to generate calibration curves not only for each algal cell type, but for different instrument types. There are marked differences in the response between absorbance and cell number for different algal strains and species. As such, comparisons should employ the use of calibration curves to normalize the data on cell number. Comparisons of results within the same species can be accomplished without normalization on cell number. Any conversion would be the same for all data sets.

The constituents of the growth media are a critical variable in defining not only growth rate, but final cell density of algal cultures. Media formulations, such as TAP and TP containing relatively high carbon content are much better able to support rapid and dense algal cell growth than carbon poor media formulations such as BG11. Likewise, carbon rich growth conditions that lack other key elements such as nitrogen or sulfur also suffer from poor growth. These nutritional restrictions often result in decreases in protein or DNA synthesis as a result of the lack of key building block components [3].

Microalgae strains can have different growth patterns when inoculated at low concentration. C. vulgaris responds to inoculation by increasing cell number and chlorophyll content in parallel. This suggests that these cells maintain a constant amount of chlorophyll per cell. M. aeruginosa cultures increase in cell number much quicker than chlorophyll content, which indicates that initially the amount of chlorophyll per cell decreases. Only as the rate of increase in cell number slows does the amount of chlorophyll per cell increase. This suggests that M. aeruginosa uses media components rather than light as it preferred means to provide energy.

Quantitation of total protein has been used as a means to normalize cellular reactions for several decades based on the premise that on average, each cell has the same amount of protein Unlike animal cells in culture, most algae contains significant amounts of chlorophyll, which can easily be detected in vivo by its inherent fluorescence and can be used in lieu of measuring total cellular protein. Using this specific protein has the marked advantage of being non-invasive and nondestructive. As is the case with total cellular protein, cellular chlorophyll levels are not constant. Chlorophyll levels can change not only as cells grow and divide, but also in response to changes in light levels. Care should be taken when comparison of chlorophyll levels between cultures in different growth conditions are made.

There are advantages and disadvantages for the use of either light scatter absorbance-based or chlorophyll protein fluorescence-based measurements as a means to generate calibration curves in order to determine cell numbers from experimental cultures Light scatter measurements require separate curves for each cell type and each different reader. The calibration curves need only be made once or at most periodically to identify instrument drift over time. Values generated for each cell density will represent an average cell size from a spectrum in the specimen. Because absorbance measurements have a defined unit, comparisons from experiment to experiment are easily made. Fluorescence based calibration is often used if the instrument being used only has one read-mode and can provide greater resolution in terms of signal-change than absorbance, but suffers a number of drawbacks. Protein fluorescence is an average of not only cell size (larger cells will have more protein), but also that of cell expression (some cells have expressed more protein). In addition many algal cell types will express very little chlorophyll when grown in a high carbon environment. In addition, the lack of a defined standard for fluorescence makes all measurements relative rather than absolute. In essence, any comparison requires a calibration curve for each experiment. These issues have made the use of light scatter using 600 nm optical density measurements the preferred method to normalize and compare algal experimental data.

The Synergy&trade H4 Multi-Mode Microplate Reader is an ideal detection platform to monitor algal cell growth. The Synergy H4 has optics modules for absorbance, fluorescence and luminescence. Absorbance maxima, as well as fluorescence excitation and emission peaks can be identified using spectrum analysis. The ability to measure both absorbance and fluorescence on the same sample at the same time provides unique measurement flexibility. Cells number can be assessed using light scatter absorbance measurements at 600 nm or with chlorophyll detection by fluorescence. Because both measurements are non-invasive both can be performed on the same samples in microplates. In addition, microplates not only offer the ability to measure samples in small volumes, but the flexible array of wells density (6-, 12-, 24-, 48-, 96-, 384-, and 1536-) allows the researcher to choose the best reaction volume and sample number combination to suit their needs. Because microplates have industry defined and accepted geometries, automation can easily be employed for many routine measurements.


Enzymes in Action- Quantifying Milk Proteins

Trypsin is an enzyme which hydrolyses proteins into peptides, ready for other enzymes to cut them further down to their amino acids for use in the body. Enzymes are catalysts, which means they help or cause a reaction to occur without being consumed themselves. Trypsin works in the small intestine, after acid and pepsin in the stomach have commenced the work of breaking down the proteins.

This experiment uses milk which contains the protein casein. As the casein in milk break down, the smaller molecules become soluble, thereby reducing the opacity of the fluid. The time taken to break down the molecules can be measured and comparison of known values against unknown values will allow the unknowns to be calculated. As the milk will not become entirely clear due to the inevitable presence of fat, some error will be introduced by varying decisions of the endpoint, not only amongst the class but each student may have their own inconsistencies. A colorimeter in transmittance mode may be used instead to reduce this type of error, however the visual assessment should be enough to demonstrate the basic principle. This experiment starts with known concentrations of skim milk powder. The concentration of protein itself can be calculated if you wish, from the information on the packet of milk we have found skim milk generally contains around 9g of protein per 25g of powder (36%).

PREPARATION : LAB TECHNICIAN

  1. Dissolve 30g of milk powder in 250mL of distilled water (dH2O)
  2. Add distilled water to make 300mL for a 10% stock solution. (Adjust as appropriate for your class size &ndash 300mL of stock should be enough for 12 groups with allowance for spillage). Dilute as follows:
        • 5% standard &ndash 75mL of stock in 75mL of dH2O
        • 4% standard &ndash 60mL of stock in 90mL of dH2O
        • 3% standard &ndash 45mL of stock in 105mL of dH2O
        • 2% standard &ndash 30mL of stock in 120mL of dH2O
        • 1% standard &ndash 15mL of stock in 135mL of dH2O
        1. Use the remaining milk to create two unknown samples (X and Y) within the range 1-5% eg 47mL of stock in 103mL of dH2O and 28mL of stock in 122mL of dH2O. Keep note of the concentration but do not reveal to students.

        Trypsin stock solution:

        1. Dissolve 1g Trypsin in 100mL dH2O to make a 1% solution.
        2. Run a quick assay (see method below) to make sure that the 5% protein standard will take about 2-3 minutes to the end point.
        3. If the timing is appropriate, dissolve 4g Trypsin in 400mL dH2O to make the remainder of your 1% solution. If it&rsquos too fast or too slow, adjust the dilution appropriately.

        METHOD: STUDENT ACTIVITY

        1. Label your test tubes 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, X and Y.
        2. To each tube add 10mL of the appropriate milk solution.
        3. Mark a black cross, approximately the size of the diameter of your test tubes, on the white paper.
        4. To the first tube (1%) add 5mL Trypsin solution. Start the timer and shake gently to mix. If you are wearing gloves, you may prefer to hold your thumb over the top of the tube and mix by inverting the tube, taking very good care that you have covered the top completely.
        5. Hold the cross behind the test tube and record the time it takes for it to become just visible.
        6. Repeat with the remaining tubes &ndash keep consistent the point at which you determine the cross to be visible.
        7. Plot your results for the standards on your graph paper to more easily check for anomalies. If any result seems out of place and you need to re-run that standard, it is best to use clean test tubes as the enzyme can be difficult to clean out. If you need to re-use a tube, first place the 5mL of Trypsin and start your timer from when you add the milk.
        8. Once you are satisfied that your calibration curve makes sense, plot the results for your two unknowns to estimate the concentration of milk in each.
        9. The class results are to be collated and averaged out to make an aggregate calibration curve and estimate. Consider what you expect to see from aggregate results compared to individual.

        OBSERVATIONS AND RESULTS

        Below is an example of expected results. It is a guide only as individual results will vary.


        The bluest of blue: A new algae-based switch is lighting up biological research

        Several organisms possess "ion channels" (gateways that selectively allow charged particles called ions to enter the cells and are integral for cell function) called "channelrhodopsins," that can be switched on and off with the help of light. Different channelrhodopsins respond to different wavelengths in the light spectrum. These channels can be expressed in foreign organisms (animals even in human) by means of genetic engineering, which in turn finds applications in optogenetics, or the application of light to modulate cellular and gene functions. So far, the shortest wavelength that a channelrhodopsin responds to was blue.

        However, recently, a group of scientists from the Nagoya Institute of Technology, Japan, and Jawaharlal Nehru University, India, have identified a channelrhodopsin that responds to an even shorter indigo blue wavelength of light. In their study published in Nature's Communications Biology, the group of researchers, led by Professor Hideki Kandori and Associate Professor Satoshi P. Tsunoda, identified a novel channelrhodopsin, which they named KnChR, from a species of terrestrial alga called Klebsormidium nitens. "We chose this alga, because it is known to be responsive to light, but its photoreceptor domain has not been established," reports Prof. Kandori. Unlike other discovered channelrhodopsins, KnChR was found to respond to indigo blue light.

        It is known that KnChR is made up of a seven-cell membrane spanning region, which forms the pore that allows the entry and exit of different ions. This region is followed by a protein moiety including a peptidoglycan binding domain. In order to investigate the properties of KnChR, the researchers performed extensive genetic and electrophysiological experiments.

        What was perhaps the most exciting result was that they could identify the role of the "cytoplasmic domain." All known channelrhodopsins have a large "cytoplasmic domain," or region that is located in the internal area of the cell. As Prof. Kandori explains, "All currently known channelrhodopsins comprise a large cytoplasmic domain, whose function is elusive. We found that the cytoplasmic domain of KnChR modulates the ion channel properties."

        Accordingly, the results of the experiments showed that changing the lengths of the cytoplasmic domain caused the changes in ion channel closure. Particularly, the shortening of the domain resulted in increased channel 'open time' by more than ten-fold. In addition, the researchers also identified two arginine amino acid residues, namely R287 and R291, in the same region, which played an important role in the properties of generated light currents. They found that KnChR exhibited maximal sensitivity at 430 nm and 460 nm, making it the 'bluest' channelrhodopsin.

        Overall, the researchers have faith in the KnChR being helpful in biological systems requiring specific excitation parameters. When asked about the implications of these findings, Prof. Tsunoda, who is the corresponding author of the study suggests, "KnChR would expand the optogenetics tool kit, especially for dual light applications when short-wavelength excitation is required." What this means is that the light-operated property of KnChR can be applied in targeted manipulation of an organism's biological functions, in a research setting. A few examples would include manipulation of neuronal and myocyte activities.


        Experimental

        Preparation of the Original Fe Solution

        To an accuracy of ± 0.1 mg weigh out enough ferrous ammonium sulfate, Fe(NH 4 ) 2 (ASI QUE 4 ) 2 6H 2 O, gfw = 392.14, to prepare 250 mL of a solution which is 0.00200 M with respect to that compound. Quantitatively transfer the salt into a 250 mL volumetric flask, add sufficient water to dissolve the salt, add 8 mL of 3 M H 2 ASI QUE 4 , dilute to the mark with distilled water and mix well. We shall call this the Stock Fe Solution. Pipet 10 mL of this solution into a 100 mL volumetric flask, add 4 mL of 3 M H 2 ASI QUE 4 and dilute to the mark with distilled water and mix well. Label this solution as Original Fe Solution and calculate the concentration of Fe, in ppm, in this solution.

        Measurement of the Absorbance Spectrum

        In order to determine the wavelength of maximum absorbance it is necessary to obtain the absorbance spectrum of the iron-bipyridyl complex. Readings taken at 10 nm intervals are sufficient to outline an absorbance spectrum except perhaps at absorbance peaks where additional points may be required to characterize the curve more completely. Pipet 10 mL of the Original Fe Solution into a 50 mL volumetric flask. Into a second 50 mL volumetric flask do not add any of the iron solution, but add about 10 drops of 3 M H 2 ASI QUE 4 . Then, in the order stated, add to each flask 1 mL of 10% hydroxylamine hydrochloride solution, 10 mL of 0.1% bipyridyl solution and 4 mL of 10% sodium acetate solution. The purpose of the sodium acetate is to buffer the mixture. The sodium acetate plus the sulfuric acid already present gives an acetic acid-acetate buffer in the pH region of about 4.5 to 5. Be sure to mix well after the addition of each reagent. Then fill each flask to the mark with distilled water and mix well by inverting and shaking. The flask containing iron has the same concentration as the Standard Fe Solution which will be prepared in the next section. Now take absorbance readings for this solution from 400 nm to 600 nm, in intervals of 10 nm, except where additional points are needed better to define the shape of the curve. Use the solution not containing Fe as a blank. Neatly plot the absorbance (vertical axis) against wavelength (horizontal axis) on a piece of millimeter graph paper. Use the long side of the paper as the horizontal axis. From this graph select the wavelength which exhibits the maximum absorbance. That is the wavelength to be used for the measurement of the unknown solution. It is called lambda (max).

        Determination of the Absorbance of the Standard Fe Solution.

        Before beginning this part of the procedure be sure to record the number of the colorimeter that you are using for this part of the analysis. The number of the colorimeter is found on a small blue tag on the front of the colorimeter. A11 further absorbance measurements must be made with the same colorimeter and the same cuvettes in order for this method to work. Discard both of the solutions in the 50 mL volumetric flasks. Thoroughly rinse both volumetric flasks and then prepare a new set of solutions from the Original Fe Solution using the same amounts according to the previous procedure. Label the solution containing the Fe as Standard Fe Solution and calculate its Fe concentration in ppm. Determine the absorbance of this solution at the wavelength of maximum absorbance previously determined. For a blank use the solution which does not contain Fe. Make at least three measurements. In each case reset the zero and the 100% transmission. Record both the percent transmission and absorbance values. Empty your cuvette and refill it with another portion of the same solution and again determine the absorbance value. Calculate the average of all six absorbance values.

        Analysis of the Fe Unknown

        Clean a 100 mL volumetric flask, place your initials on the ground glass area and hand it to your instructor who will pipet 10 mL of unknown solution into it and who will also give you an unknown number for it. Then add 4 mL of 3 M H 2 ASI QUE 4 , mix well and then make up to the calibration mark with distilled water. Mix well by inverting and shaking the stoppered flask. Label this solution as First Unknown Dilution (FUD). Pipet 10 mL of this solution into a 50 mL volumetric flask and then in this exact order add 1 mL of 10% hydroxylamine hydrochloride solution, 10 mL of 0.1% bipyridyl solution and 4 mL of 10% sodium acetate solution. Be sure to mix well after the addition of each reagent, by gently shaking or swirling, but not inverting, the flask. After all reagents have been added fill the flask to the mark with distilled water and mix well by inverting and shaking. This solution will be called the Second Unknown Dilution (SUD). Determine the absorbance of the this solution using the previous blank solution as the reference and the wavelength of maximum absorbance determined earlier. Measure the absorbance at least three times. Empty the cuvette and refill it with another portion of solution and again determine the absorbance.

        Analysis of city tap water

        If samples of city tap water are supplied in this experiment, you will determine the iron concentration in two samples. The concentration of iron in city tap water approaches the level of precision of this method because the concentration of iron in most water of southern California is very low. Iron pipes offer the most abundant source for the iron in our water. The K sp of Fe(OH) 3 is 4.0 x 10 -38 . Calculation yields a concentration of Fe 3+ in neutral water to be so low as to be undetectable -- on the order of one part iron per one quintillion parts of water (10 -18 ). Still, whatever iron that finds its way into our water supply may end up in the form of a colloidal precipitate of ferric hydroxide. To bring that small amount of iron into solution we acidify tap water and boil it for two minutes, cool it to room temperature in ice and carry out the procedure now familiar to you.

        Procedimiento

        The absorbance you observe may be lower than that which you observed for your known and unknown samples. If you have really low absorbance readings, a slight difference in the shape of two cuvettes is enough to make detection of the presence of any iron impossible unless a correction for the systematic error between the two cuvettes is taken into account. Clean two cuvettes and fill both with the blank solution. Calibrate the spectrophotometer using one, then take an absorbance reading with the other. Make sure that the vertical line on the cuvettes is adjacent to the mark on the plastic cuvette holder in the spectrophotometer for both the calibration and all future readings. If the vertical line is in a different position during any reading, the absorance will change slightly. The second cuvette will be the one in which you place your sample. We will call this absorbance A systematic error . The absorbance you measure is the systematic error between the two cuvettes, using the first cuvette as the blank. This absorbance will be subtracted from the readings you get using the iron samples, as follows: Using a 50 mL graduated cylinder, obtain two samples of city tap water, 50 mL each, from two different cities. Place each sample in a clean 250 mL beaker. Add 10 drops of 3 M H2SO4 to each. Boil each sample on a hot plate for 2 minutes. Cool the two samples in ice until they are no longer warm to the touch. Pour each in turn back into the 50 mL graduated cylinder and add enough distilled water to bring each back to 50 mL volume. Pour contents of each into the same 250 mL beakers to mix. Pipet 35 mL of the first sample into a 50 mL volumetric flask (use a 25 mL volumetric pipet and a 10 mL volumetric pipet), then in this exact order add 1 mL of 10% hydroxylamine hydrochloride solution, 10 mL of 0.1% bipyridyl solution and then finally, using an eye dropper, add up to 4 mL of 10% sodium acetate solution to the mark. Be sure to mix well after the addition of each reagent, by gently inverting the flask. This sample will be called the city reaction flask in the description of calculations below. Determine the absorbance of this solution using the previous blank solution as the reference at the wavelength of maximum absorbance determined earlier. Measure the absorbance at least three times. Repeat this section with the second boiled sample of tap water from a diferente ciudad. Subtract the absorbance which represents the systematic error between the cuvettes from each of these experimental values.

        The calculation of the Fe concentration of the unknown can be made by a comparison method. This, however, can only be done if the system adheres to Beer's Law in the range of concentrations involved. In the case of the iron-bipyridyl complex that range is 0.5 to 8 ppm. The appropriate relationship for the calculation of the Fe concentration in the Second Unknown Dilution es:

        "A" is the absorbance, the subscript "S" refers to the absorbance and concentration, respectively, of the Standard Fe Solution while the subscript "SUD" refers to the absorbance and concentration of the Second Unknown Dilution. For the absorbance value of the unknown solution use the average of the three readings obtained for each sample taken. From the value obtained for [Fe] SUD , calculate the concentration of iron, in parts per million, of the original unknown Fe solution given to you by your instructor.

        If city water was provided for this experiment, the equation above is used to determine [Fe] for the solution whose absorbance you measured. Since this solution was made to 50 mL but in the process you used 15 mL of reagents prepared with distilled water, [Fe] for the city water can be found through a simple modification of the equation above:


        Colorimetry, turbidity, and spectrophotometry meters for water analysis

        You can choose from 134 preprogrammed methods to measure the concentrations of sample components with our colorimetry meters. These portable meters can go with you anywhere to test drinking water or wastewater

        Take your portable turbidity meter to the source for on-site measuring. Our turbidity meters feature white and infrared light sources allowing you to meet regulatory methods.

        Achieve simple and efficient water and wastewater analysis with our UV-Vis and Vis spectrophotometers. These meters include over 260 preprogrammed methods using common reagent chemistries, making them the ideal instruments to include in your laboratory.


        Activity I

        To understand more about eutrophication, you will conduct a laboratory experiment (Part 1) and use the Silver Springs computer model (Part 2)

        Parte 1

        One potential way to decrease cultural eutrophication is by having higher trophic level organisms consume the algae. We will investigate this possibility using Daphnia, a zooplankton that feeds on green algae, and an alga species called Chorella. Although the information we gain from this activity is useful, it is an over simplification as to what might really occur in the aquatic environment.

        We will use a colorimeter to measure the algae population. A colorimeter measures absorbance, the amount of light that is absorbed by a solution rather than the amount of light that can pass through. As the algae population increases (number of algae cells), the absorbance will also increase. It is a direct relationship.

        Procedimiento

        1. Obtain two cuvettes and a transfer pipette.
        2. Fill one cuvette with distilled water. This cuvette is the blank
        3. Place the blank into the colorimeter and zero it. This provides a baseline measure for the experiment. Save the blank cuvette for later use.
        4. Using the disposable pipette, fill the second cuvette with the Chorella algas. Use the pipette to try and disperse the algae evenly throughout the cuvette.
        5. Add 10 dafnia to the cuvette and immediately measure the absorbance using the colorimeter. Record your reading in the table below.
        6. Remove the cuvette from the colorimeter and allow it to sit, undisturbed for 30 minutes.
        7. After 30 minutes, place the blank cuvette (with distilled water) back into the colorimeter. Use the blank to re-zero the machine.
        8. Remove the blank cuvette and put the algae/Daphnia cuvette into the colorimeter. Measure the absorbance and record your reading in the table below.

        Preguntas

        1. How did the absorbance change from time 0 to time 30 minutes? Did the absorbance increase, decrease, or stay the same?
        2. What does the absorbance value change tell you about the concentration of the Chorella? Did it increase, decrease, or stay the same?
        3. What does the absorbance value chance tell you about the behavior of the Daphnia? Did they consume Chorella? How do you know?
        4. In a real aquatic ecosystem, do you think zooplankton could decrease the impact of cultural eutrophication and algae blooms? Explain why or why not.

        Parte 2

        Now that you have observed trophic interactions and cultural eutrophication in a lab experiment, apply that knowledge to the computer model. Use the model to analyze the sensitivity of the Silver Springs ecosystem to cultural eutrophication. Remember that alga is a photosynthetic producer on the first trophic level. los Daphnia would be one of the herbivores in the environment on the second trophic level. Change the levels in the model to simulate a eutrophication situation. View the graphs to see how the different trophic level populations change through the simulation.

        Preguntas

        Based on your findings with the model, answer the following questions:

        1. What is the maximum number of producers the ecosystem can support before higher trophic levels begin to decline?
        2. What happens to community respiration in the simulated algae bloom? Does it increase, decrease, or stay the same?
        3. What happens to the decomposer population in the simulated algae bloom? Does it increase, decrease, or stay the same? ¿Por qué?
        4. Which group of carnivores (which trophic level) is more greatly impacted by the algae bloom? ¿Por qué crees que es así?

        Algal Ball Photosynthesis

        In eukaryotic cells, specialised organelles facilitate biochemical processes of photosynthesis, cellular respiration, the synthesis of complex molecules (including carbohydrates, proteins, lipids and other biomacromolecules), and the removal of cellular products and wastes (ACSBL049)

        ANTECEDENTES:

        During photosynthesis, radiant energy is converted into organic substances that can be stored within the plant to support growth, reproduction, and metabolism. Plants metabolise the sugars that form as a result of sunlight, Carbon Dioxide, and water reacting. Reliably studying photosynthesis first hand can be difficult and require precise setting up. Algal ball photosynthesis kits offer an easier, more accurate method of studying photosynthesis that is perfect for use within the classroom. Algal balls are stored in small vials filled with Hydrogen Carbonate indicator solution. When exposed to light, the encapsulated algae absorb the CO2 from the solution they are stored in during the process of photosynthesis. As a result of the lowered CO2 levels, the pH of the solution will rise. When no light is available, respiration will dominate and the pH will decrease through the release of CO2. Changes in the levels of carbonic acid can be monitored via the colour changes that occur due to the hydrogen carbonate indicator.

        In this practical, students have the opportunity to tangibly observe photosynthesis. They are tasked with observing how the colour changes from yellow/orange to purple when the algal balls and solution are placed under a light source as photosynthesis takes up dissolved CO2 and the pH rises. Additionally, students create a light filter to test whether the wavelength of light affects their photosynthetic rate. This is a great practical to introduce students to the basic principles of photosynthesis in a fun, simple and interactive way.

        PREPARATION- LAB TECHNICIAN

        Making Algal Balls (If making your own algal balls)

        1. To make a 3% solution of sodium alginate, add 3g sodium alginate to 100mL of distilled water in an Erlenmyer flask. Stir continuously for at least 4 hours, or overnight using a magnetic stirrer. Do not apply any heat.
        2. To make 500mL of 2% calcium chloride, add 10g of calcium chloride to 500mL of distilled water and stir to dissolve.
        3. To prepare chlorella culture: Once your chlorella culture has grown enough to be a bright to darkish-green, siphon out as much of the denser areas into a measuring cylinder. Leave the culture to rest overnight to allow the algae to settle to the bottom of the cylinder. After this time, there should be a dark &ldquoplug&rdquo of dense algae at the bottom.
        4. To prepare chlorella alginate solution, take note of the volume of the plug, then carefully remove the supernatant until it accounts for 2/3 of the total volume in the measuring cylinder, with 1/3 dense alginate. For example, if you have 10mL of chlorella down the bottom, remove all but 20mL of supernatant so that you are left with 30mL in total. Keep the supernatant aside. If the mixture is too thick later to drop easily through the syringe, then you can use this to thin it out a little. Mix the remaining chlorella and supernatant in the measuring cylinder and add to an equal volume of your sodium alginate, e.g., 30mL of chlorella and 30mL of alginate to make 60mL altogether.
        5. To set up retort stand apparatus, attach a 30mL syringe barrel to the retort stand clamp so that the outlet is pointing downwards. Position the syringe barrel over a beaker of calcium chloride solution.
        6. To make algal balls, transfer your algae/alginate mix to the syringe, and allow it to drop through into the solution. Check the rate of the drops and the shape of the balls as they fall to the bottom.
                • If the rate is slower than a drop or two per second, add a small amount of the supernatant.
                • If the balls flatten on entering the liquid, the syringe is too high and should be lowered.
                • If the mixture comes through the syringe is too low, you may end up with &ldquosausages&rdquo of algae rather than balls.
        7. Algal Ball Culture Care (If you purchase the algal balls)

          1. The algal balls will arrive stored in a container of distilled water.
          2. The Chlorella within the balls is alive and therefore needs light to stay active. We recommend that you leave the balls in the container that they arrive in, and that you place this vial in a well lit area until required. Do not place in direct sunlight, nor expose to hot light sources, as the heat will be detrimental.
          3. It will also help to loosen the lid of the container to allow air access.
          4. Use the algal balls as early as you can otherwise, they are best used within 2 weeks.

          Vial Preparation

          Rinse the vials for your experiment using hydrogen carbonate indicator solution. To do this, add

          METHOD-STUDENT ACTIVITY

          1. Separate the algal balls from the surrounding liquid using the strainer. To do this, pour the algal balls into a strainer over a small beaker.
          2. Use the spoon to place an equal number of balls into each dram vial.
          3. Using a plastic pipette, fill all the vials with the hydrogen carbonate indicator. Make sure the caps are secured.
          4. Keep one vial to act as your control.
          5. Wrap a different piece of coloured cellophane around the other three vials.
          6. Place each vial approximately 10 cm away from your light source. Make sure the vials do not get hot.
          7. Copy the results table into your logbook and complete column A by comparing the colour of the hydrogen carbonate indicator to the set of pH standard solutions. You can use the image below (Figure 1) as a guide if standards are not available, however comparing the colour of the liquid in your vials to actual pH standard solutions will provide the most accurate results.
          8. After 40 minutes complete column B of the results table by comparing the colour of the hydrogen carbonate indicator to the set of standard references.
          9. Complete the final column of the results table by subtracting the amount in column A from the amount in column B.

          OBSERVATION AND RESULTS

          After exposing the vial to a light source, the colour in the solution should change from yellow/orange to purple as photosynthesis absorbs the CO2 and the pH rises. The pH of vials wrapped red, blue or purple cellophane will experience a greater rise than vials wrapped orange, yellow or green. This is due to the way the algae absorb light - we observe them as green because that is the colour that bounces off them out of the spectrum that makes up white light and so that is the colour that is not used in photosynthesis. Some change should be expected by the end of the class, however if it is too slight to notice you can return at the end of the day or the next day to check your vials.

          INVESTIGACIÓN

          • Carbon dioxide dissolved in water forms carbonic acid. Hydrogen carbonate indicator is used to measure the acidity of a system. The pH of the system is low (yellow) when there is a lot of dissolved CO2. Como CO2 is removed, the pH rises and the colour becomes purple. Use this information to construct a bar graph of CO2 changes as a function of wavelength.
          • Why do we include a control in the experiment? What does this control represent in term of light wavelength?
                • The control represents all of the wavelengths of light, as it is not obscured by a colour filter. This control is used to compare the level of photosynthesis that takes place in the vials. All three vials are placed under the same conditions, to see whether the colour filters slow down photosynthesis or block usable wavelengths entirely.
                    • Both photosynthesis and respiration are happening all of the time, with photosynthesis dominating when light is available and respiration dominating in the absence of light. During photosynthesis, carbon dioxide and water plus the energy from light synthesise glucose and oxygen. As carbon dioxide is used up, carbonic acid in the water is converted to carbon dioxide, raising the pH of the water.
                    • During respiration, glucose is broken down along with oxygen to make carbon dioxide and water. As carbon dioxide enters the water, excess molecules are converted to carbonic acid, lowering the pH of the water.

                    EXTENSION EXERCISE

                    • Light availability is another factor that affects photosynthesis. Design an experiment to test how distance from light effects the rate of photosynthesis.

                    TEACHER TIP

                    Requisitos de tiempo
                    Material List
                    Safety Requirements
                    1. Wear appropriate personal protective equipment (PPE).
                    2. Know and follow all regulatory guidelines for the disposal of laboratory wastes.

                    Avoid direct contact with any culture.

                    Reference Kits