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¿Qué es un ensayo de extracción de proteínas?


Estoy leyendo un artículo y los autores mencionan un ensayo de "reducción de proteínas".

Nunca había hecho esto antes, y buscar en Google no trae muchas cosas. ¿Podría obtener un resumen de la teoría básica detrás de esto?

¿También el porcentaje de cobertura tiene algo que ver con este ensayo?


El descenso se refiere principalmente a la inmunoprecipitación, sin embargo, el descenso se puede realizar mediante otras interacciones como estreptavidina-biotina o His-tag-Nickel.

En un pull-down de proteínas, una proteína se enriquece junto con las moléculas unidas a ella. Cuando se estudia el ADN que está unido a una proteína, el experimento se llama ChIP (InmunoPrecipitación de cromatina). Cuando se estudian otras proteínas que están unidas a una proteína determinada, el experimento se denomina Co-IP. De manera similar, también se puede estudiar el ARN unido a la proteína.

También es posible extraer un ARN o un fragmento de ADN utilizando oligonucleótidos complementarios, estreptavidina, anticuerpos, etc. y estudiar sus compañeros de interacción.

En el documento vinculado, han inmunoprecipitado una proteína etiquetada con HA (hemaglutinina) utilizando un anticuerpo anti-etiqueta HA (tenga en cuenta que esta es solo una etiqueta pequeña de 9-10 aminoácidos y no la proteína HA completa. Estas etiquetas son útiles cuando no tiene el anticuerpo para una proteína determinada).

Han hecho tanto co-IP como ChIP:

La proteína PfSET10 de longitud completa etiquetada con HA y las proteínas que interactúan de 3D7 / PfSET10HA y la línea de control 3D7 se purificaron utilizando perlas anti-HA

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y perfiles transcripcionales

El análisis de chips se realizó como se describe (Flueck et al., 2009).

Cobertura es un término utilizado en experimentos de secuenciación que generalmente se refiere al número promedio de lecturas que se asignan a cualquier locus; esto también se llama profundidad. Esto se usa comúnmente en estudios de secuenciación de ARN / ADN (vea también esta publicación). En este documento, como se menciona en la otra respuesta, el término cobertura se usa para lecturas de péptidos (analizadas por espectrometría de masas) y es el cobertura horizontal no una cobertura vertical. La cobertura horizontal se refiere a la fracción de la molécula real (ADN / ARN / proteína) cubierta por el ensamblaje de lecturas.

La cobertura no tiene nada que ver con el ensayo desplegable; se utiliza en el contexto del experimento posterior.


De Life Technologies

El ensayo pull-down es un método in vitro que se utiliza para determinar una interacción física entre dos o más proteínas. Los ensayos pull-down son útiles tanto para confirmar la existencia de una interacción proteína-proteína predicha por otras técnicas de investigación (por ejemplo, co-inmunoprecipitación) como como un ensayo de cribado inicial para identificar interacciones proteína-proteína previamente desconocidas.

Es esencialmente lo mismo que un experimento de inmunoprecipitación pero usando proteínas en lugar de anticuerpos.

La cobertura entra en juego para identificar las proteínas derribadas, ya que utilizaron un análisis LC-MS / MS. Básicamente, debe mapear las lecturas de péptidos cortos que obtiene de la EM a las proteínas reducidas reales, lo que le brinda una puntuación de cobertura, es decir, la cantidad de la secuencia de proteínas completa que cubrió con péptidos cortos.


Consejos útiles antes de su primer ensayo desplegable Rho

Si ha estudiado el movimiento celular o la división celular, se ha encontrado con Rho en la literatura, porque regula ambos procesos. ¡Y la lista de roles para Rho en la celda continúa creciendo! La importancia de Rho en la biología de las células enfermas y no enfermas ha hecho que los investigadores optimicen continuamente el ensayo de reducción de Rho. Este ensayo bioquímico le permite controlar la actividad de Rho.

El principio que subyace a este ensayo es que Rho es inactivo en su forma unida a GDP y activo en su forma unida a GTP. En respuesta a los estímulos, las células aumentan sus niveles de Rho-GTP, que puede controlar cuantificando el nivel de Rho-GTP mediante ELISA o Western blot.


Ensayo de extracción técnica

Profacgen proporciona un servicio profesional para ensayos de extracción de proteínas. Contamos con grupo de servicio técnico y los instrumentos más avanzados para realizar todo el procedimiento con alta eficiencia y alta calidad.

El ensayo de extracción es un método in vitro para detectar la interacción proteína-proteína. La proteína de cebo comúnmente utilizada es una proteína etiqueta GST purificada. El ensayo de extracción suele ir seguido de SDS-PAGE y análisis de espectrometría de masas (MS) para identificar el interactor, y se pueden implementar enfoques genéticos adicionales o análisis de Western Blot para confirmar la interacción directa.

La siguiente figura muestra la función del ensayo desplegable.

Comparación entre el ensayo Pull Down y Co-IP

Diseño experimental

Puede proporcionarnos una muestra de tejido en bruto o una muestra de células.

Preferencia de etiqueta

La etiqueta GST es la más preferida para la purificación de proteínas de cebo, también puede usar la etiqueta de biotina o la etiqueta de proteína de unión a maltosa (MBP).

His-tag no está disponible, ya que las perlas de afinidad metálica se unirán a proteínas de forma no específica.

Todos los grupos de control necesarios se incluirán de acuerdo con la siguiente tabla para verificar la especificidad de la interacción.

Servicio personalizado:

Diseño experimental

Diseñaremos minuciosamente nuestro esquema experimental de acuerdo con la proteína de su interés, por ejemplo, su estructura y dominio funcional, función celular, actividad enzimática o de otro tipo, etc.

Especificidad

A veces, se necesitan muestras de control para aumentar la especificidad del ensayo de extracción. Puede proporcionarnos una serie de truncamientos, deleciones, mutaciones de su proteína de fusión de etiqueta purificada o incluso proteínas relacionadas de otros genes.

Si se necesita un enlace cruzado

Incluiremos el paso de reticulación (proteína etiquetada con perlas) en todo el procedimiento o no, según sus requisitos. El paso de reticulación adicional facilitará el análisis final: dado que la proteína de fusión de la etiqueta está unida covalentemente a la perla y no aparecerá en los geles posteriores. Pero tenga en cuenta: la pérdida de parte o toda la actividad biológica de proteínas específicas (en particular enzimas) puede ocurrir como resultado de la modificación química que ocurre durante la reticulación.

Esquema óptico para el tratamiento de muestras.

Para diferentes propósitos de experimentos, disponemos de diferentes métodos de tratamiento para sus muestras (extracción de proteína citosólica, extracción de proteína periférica o extracción de proteína de membrana).

Diagrama de flujo del ensayo de descenso:

Protocolo para el ensayo de extracción (proteína etiquetada con GST como ejemplo)

Construcción del plásmido de expresión de proteínas marcado con GST

I. Elija el vector de expresión adecuado de acuerdo con la información de la proteína objetivo proporcionada por los clientes.
ii. Inserte la secuencia de ADN de la proteína diana en el vector para generar el plásmido de expresión recombinante.
iii. Secuenciar el plásmido recombinante para asegurar que no haya mutación en la secuencia.
iv. Transforma el plásmido recombinante en E. coli componente celular y cribado de clones positivos.

Expresión y purificación de proteínas fusionadas con GST [1]

I. Después de la verificación positiva de la colonia, extraiga el plásmido y transfórmelo en E. coli BL21 para la expresión de la proteína diana.
ii. Elija una sola colonia en medio LB con los antibióticos adecuados, cultivo durante la noche.
iii. Amplíe el cultivo, para alcanzar la fase exponencial temprana, agregue inductor para inducir la expresión de la proteína fusionada con GST (grupo libre de inductor como control).
iv. Coseche las células bacterianas y resuspenda con tampón de lisis celular helado.
v. Pase la suspensión bacteriana a través de dos ciclos de congelación / descongelación.
vi. Someter a ultrasonidos en hielo para romper las células bacterianas y romper el ADN.
vii. Agregue la cantidad adecuada de DNasa I y Triton X-100 en el lisado celular, incube durante 30 min a 4 ° C con rotación.
viii. Centrifugue la muestra durante 30 min a 4 ° C. Al mismo tiempo, tratar las perlas de glutatión (GSH) -agarosa con una pequeña cantidad de tampón de lisis, centrifugar y retirar con cuidado el sobrenadante.
ix. Añadir el sobrenadante de lisado en perlas pretratadas, incubar durante 1 ha 4 ° C con rotación.
X. Centrifugar la mezcla durante 5 min a 4 ° C, decantar con cuidado el sobrenadante de las perlas.
xi. Enjuague las perlas con tampón de lavado, centrifugue durante 5 min a 4 ° C. Repita de 3 a 4 veces.
xii. Agregue el volumen adecuado de tampón de almacenamiento de perlas a las perlas y almacénelo a -20 ° C. Nunca se debe permitir que las perlas se congelen, o de lo contrario se agrietarán. Se puede agregar 50% de glicerol en el tampón de almacenamiento de perlas para evitar esto.
xiii. Realice SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie para analizar la purificación y cuantificar la cantidad de proteína unida a las perlas de GSH (incluido el inductor (+), el inductor (-), el sobrenadante, el sedimento, el flujo y la muestra de perlas).

La normalización de las proteínas unidas a las perlas es necesaria cuando se utilizan diferentes proteínas fusionadas con GST como proteínas de cebo.

Reticulación de la proteína diana con perlas

I. Agregue el volumen requerido de perlas de proteína de fusión GST para reticular en una columna de plástico de tamaño adecuado. Lavar la columna con tampón PBS dos veces.
ii. Reticular las perlas de proteína de fusión GST y la columna con reticulante, incubar durante 45 min a temperatura ambiente con mezcla continua.
iii. Vacíe la columna.
iv. Agregue el volumen apropiado de tampón de extinción a la columna, mezcle suavemente durante 10 min a temperatura ambiente (bloquee los sitios reactivos con amina).
v. Lave a fondo las perlas a 4 ° C, almacénelas para su uso.

Preparar proteínas de fusión GST y lisado tisular

I. Prepare proteínas de fusión GST recombinantes unidas a perlas de agarosa-GSH y almacénelas a -20 ° C en tampón de almacenamiento de perlas durante un máximo de 6 meses.
ii. Prepare un lisado de tejido (elija un método de lisis adecuado para diferentes ubicaciones de proteínas: citosólico, periférico o de membrana).

Asegúrese de que el lisado no contenga ni siquiera pequeños rastros de contaminación por partículas. La contaminación dará como resultado grandes cantidades de proteína inespecífica en el gel. Si están presentes, es muy importante eliminarlos mediante centrifugación a alta velocidad.

Lisado preaclarado con perlas de GSH

I. Lave un lote de (según la cantidad de muestra) perlas de agarosa GSH frescas o recicladas con tampón de lavado, centrifugue durante 5 min a 4 ° C, elimine el sobrenadante y recoja las perlas en un volumen mínimo de tampón.
ii. Combinar las perlas de GSH lavadas con lisado de tejido e incubar durante 30 min a 4 ° C. (Aclare previamente el lisado de tejido con las perlas de GSH lavadas para eliminar las GST endógenas presentes en el lisado y las proteínas de unión no específica)
Esto eliminará la mayor parte del GST celular endógeno.
iii. Recoger las perlas por centrifugación y verter cuidadosamente el sobrenadante en tubos frescos enfriados en hielo. (Lisado de tejido previamente aclarado)
iv. Repetir.

Esto es especialmente importante para los lisados ​​de tejidos que son ricos en GST endógenas (particularmente extractos citosólicos y lisados ​​de tejidos específicos, por ejemplo, testículos o hígado).

Unir el lisado de tejido a las perlas de proteína de fusión GST

Agregue el volumen apropiado de lisado previamente aclarado al volumen correspondiente de perlas de proteína fusionadas con GST. Incubar durante 1 ha 4 ° C con rotación.

Recuperar y lavar perlas

I. Centrifugue la mezcla de lisado y perlas a 4 ° C, retire con cuidado el sobrenadante.
ii. Lavar las perlas con tampón de lavado helado, centrifugar y desechar el sobrenadante.
iii. Repita de 5 a 6 veces.

Eluir proteínas para análisis SDS-PAGE

I. Agregue 1 × tampón de carga SDS en las perlas y colóquelo en un baño de agua a 85 ° C durante 5 min.
ii. Centrifugue la muestra, guárdela en hielo para su uso inmediato o en el congelador para análisis futuros.
iii. Analizar la muestra por SDS-PAGE durante la noche a 10 ° C. (Para una resolución óptima de proteínas, los geles deben ser lo suficientemente largos)
iv. Teñir el gel mediante una técnica adecuada compatible con la espectrometría de masas.

Analizar resultados

I. Compare las bandas entre los carriles de gel entre el grupo experimental y el grupo de control, e identifique el interactor refiriéndose a la base de datos correspondiente.
ii. Confirme aún más la interacción proteína-proteína mediante co-inmunoprecipitación, levadura-dos híbridos, etc.

En algunos pasos, las columnas de centrifugación se pueden utilizar para mejorar la velocidad del ensayo, la recuperación de proteínas, la reproducibilidad y disminuir los volúmenes de elución [2].

Guías de solución de problemas [3]:

Pregunta 1 (P1): En el análisis de EM, muchas o todas las bandas se identifican como GST.
Causa posible: Gran cantidad de proteína recombinante GST utilizada como cebo.
Solución posible: Reticular la proteína de fusión GST con las perlas de GSH o reducir la cantidad de proteína de fusión GST utilizada.

P2: Tinción intensa de cuatro a cinco proteínas de 20-30 KDa en gel SDS-PAGE, que interfieren con la detección de otras proteínas.
Causa posible: Gran cantidad de GST tisular endógena presente en el lisado tisular, que se une a los sitios de glutatión libre restantes de las perlas de GSH.
Solución posible: Realice un aclarado previo riguroso del lisado con perlas de GSH si la proteína de fusión GST está entrecruzada con las perlas, lavar las perlas de 2 a 3 veces para eluir específicamente las GST.

Q3: No se observan proteínas de unión específicas para la proteína de interés en relación con el control.
Posible causa A: Las proteínas de fusión GST producidas por bacterias no se pliegan correctamente ni se modifican postraduccionalmente.
Posible solución A: Cambie el sistema de expresión de acuerdo con la literatura sobre proteínas de interés y sobre sistemas de expresión bacterianos, o use un sistema de expresión no bacteriano, por ejemplo, traducción in vitro, siempre que pueda obtenerse suficiente proteína de fusión GST para el pull-down.
Posible causa B: Fuente de tejido para lisado inapropiada para la proteína de interés.
Posible solución B: Cambiar la fuente del tejido: utilice un tejido que se sepa que expresa la proteína de interés, o seleccione varios tejidos y analícelos simultáneamente por SDS-PAGE, para comparar proteínas de unión de diferentes tejidos, escale el tejido elegido por 10 veces los tejidos de prueba aislados de animales de diferentes etapas de desarrollo.
Posible causa C: Los tampones de lavado o unión pueden ser demasiado estrictos (la concentración de sal y detergente interfiere con la unión).
Posible solución C: Diluya la sal o el detergente para homogeneizar aún más los gránulos en volúmenes más pequeños o utilice tampones para la extracción de tejidos que tengan diferentes propiedades.

Q4: Una gran cantidad de proteínas inespecíficas se eluyen de las perlas de proteína de fusión GST después de la extracción.
Causa posible: Las proteínas hidrófobas (principalmente de membrana) pueden adherirse a las perlas cuando se lavan sin detergente.
Solución posible: Lave las perlas con tampón de lavado que contenga Triton X-100, luego vuelva a lavar a fondo las perlas con tampón de lavado libre Triton X-100.

Q5: Todavía hay proteína de fusión GST eluida de las perlas después de la reticulación química, lo que interfiere con el experimento de reducción.
Posible causa A: La reacción de reticulación fue incompleta o ineficaz, o el reticulante se ha degradado.
Posible solución A: Asegúrese de que se utilice suficiente reticulante y reconecte el nivel de proteína unida a la reticulación de las perlas de GSH durante períodos más largos (hasta 2 h). Utilice un nuevo reticulante para cambiar a un reticulante más soluble.
Posible causa B: El lavado con GSH para eliminar una pequeña cantidad de proteína de fusión no reticulada fue inadecuado o ineficaz.
Posible solución B: Lave la columna después de la reticulación con tampón de reciclaje de perlas y deje pasar la solución.

P6: La proteína que interactúa no se aisló.
Posible causa A: Interacciones débiles o transitorias.
Posible solución A: Disminuya los tiempos de lavado o disminuya la concentración de iones del tampón.
Posible causa B: Nivel de expresión bajo de proteína de presa.
Posible solución B: Aumenta la cantidad de proteína de presa.

Referencia:

[1] Coligan J E, Dunn B M, Ploegh H L, et al. Protocolos actuales en la ciencia de las proteínas [M]. John Wiley & amp Sons Inc., Nueva York, 2007.
[2] Brymora A, Cousin M A, Roufogails B D, et al. Recuperación y reproducibilidad de proteínas mejoradas a partir de ensayos de extracción e inmunoprecipitaciones utilizando columnas de centrifugación [J]. Anal Biochem, 2001, 295 (1): 119-22.
[3] Thery C, Amigorena S, Raposo G, et al. Protocolos actuales en biología celular [M]. John Wiley, Nueva York, 2006.


Métodos de análisis de interacción de proteínas

Desplegable GST

Las técnicas de ensayo pull-down son in vitro métodos para determinar la interacción física entre dos o más proteínas. El principio del ensayo pull-down es usar etiquetas (como GST, poli-His y biotina) para atrapar la proteína diana, que es esencialmente una purificación por afinidad.

El pull-down de GST es una técnica de ensayo de pull-down que se puede utilizar para confirmar las interacciones proteína-proteína existentes descubiertas por otras técnicas o como un cribado inicial para identificar nuevas interacciones proteína-proteína. Mediante elución y análisis posteriores mediante transferencia de Western o espectrometría de masas, se puede confirmar una interacción predicha o se pueden descubrir interacciones previamente desconocidas. La técnica desplegable se ha convertido en una herramienta invaluable para el científico de la vida interesado en estudiar las vías celulares a través de interacciones proteína-proteína.
Para obtener más información sobre este servicio, consulte nuestra página desplegable de GST.

La inmunoprecipitación (IP) es una técnica que se utiliza para aislar una proteína o ácidos nucleicos específicos de una solución, y es similar al ensayo de extracción, excepto que este método utiliza un anticuerpo, en lugar de una proteína de cebo, para atrapar la proteína o el ácido nucleico diana. ácidos. Co-IP es una versión más delicada de una IP tradicional.

Usando anticuerpos específicos de la proteína diana para atrapar indirectamente proteínas que están unidas a una proteína diana específica, co-IP puede separar la proteína diana de una muestra (como suero y lisado celular) que contiene miles de proteínas diferentes. Durante el ensayo de co-IP, las proteínas interactúan en condiciones no desnaturalizantes, que se aproximan a las condiciones fisiológicas. Después del ensayo, pueden recolectarse complejos inmunes inmovilizados, eluirse del soporte e identificarse, revelando así la composición de los multímeros recuperados. Obtenga más información sobre nuestro servicio de co-IP.

BLI mide las interacciones biomoleculares analizando los patrones de interferencia de la luz blanca reflejada desde la superficie de la punta de un biosensor. Al igual que la resonancia de plasmón de superficie (SPR), BLI también es una técnica sin etiquetas ópticas bien establecida para detectar y monitorear interacciones biomoleculares en tiempo real.

SPR se basa en los índices de refracción de la solución y el analito. Si la diferencia en los índices de refracción es insuficiente o las muestras contienen altos niveles de glicerol, el SPR no puede funcionar. BLI mide solo lo que está unido al biosensor, lo que nos permite trabajar directamente con muestras crudas y sin purificar.

En el experimento BLI, una molécula (como una proteína) se inmoviliza en un biosensor y se mide la unión a una segunda molécula. La interacción ocurre en la punta de un biosensor BLI basado en fibra de vidrio. La luz blanca que atraviesa la fibra de vidrio se refleja tanto desde la superficie interna como desde la interfaz externa (con la solución de muestra). A medida que más moléculas se unen al sensor, la variación en el grosor de la capa externa de proteína inmovilizada provoca cambios en el patrón de interferencia. El patrón se puede trazar como un cambio nanométrico de intensidad relativa frente a la longitud de onda que se puede registrar en tiempo real con alta precisión y exactitud. Consulte nuestra página de interferometría de biocapa para obtener más detalles.

Comparación de diferentes métodos de análisis de interacciones proteicas

Además de los tres métodos anteriores, las interacciones de proteínas generalmente requieren una combinación de técnicas para validarlas, caracterizarlas y confirmarlas. A continuación se muestran algunos otros enfoques contemporáneos utilizados para la detección y el análisis de interacciones proteína-proteína, cada uno con sus propias ventajas y debilidades.

Técnicas Principio
Levadura de dos híbridos (Y2H) Supervisa la formación de complejos mediante la activación transcripcional de genes indicadores.
Blot del lejano oeste Estrategia similar a la de Western Blot con una diferencia clave. La sonda de anticuerpo en una detección de transferencia Western típica se sustituye por una proteína cebo marcada como sonda.
Masa de purificación por afinidad en tándem
espectroscopia
(TAP-MS)
TAP-MS se basa en el marcado doble de la proteína de interés en su locus cromosómico, seguido de un proceso de purificación de dos pasos y análisis espectroscópico de masas.
Matriz de proteínas Es un método de alto rendimiento que se utiliza para rastrear las interacciones y actividades de las proteínas y para determinar la función a gran escala.
Tecnología de visualización de fagos Obtenga una unión a proteínas óptima mediante la inmovilización de un antígeno en perlas magnéticas y el cribado contra una biblioteca de presentación de fagos.


Pregunta sobre el ensayo de reducción de proteínas

Actualmente estoy haciendo mi doctorado en alguna proteína / gen que parece tener influencia en algunas formas de cáncer. Tengo como 3 o 4 proyectos más pequeños en marcha al mismo tiempo, todos con métodos más o menos bien establecidos en nuestro laboratorio. ahora mi pi tuvo esta idea de que tenemos que averiguar con qué proteínas interactúa esta proteína, a qué receptores se une, etc. No hay candidatos conocidos y nadie ha hecho algo así en mi laboratorio. Me siento bastante abrumado, no quiero decir estrictamente "no", pero me temo que esto podría llevar años antes de obtener resultados útiles ... ¿o veo esto mal? Realmente ni siquiera sé por dónde empezar ... ¿Conoce alguna buena crítica sobre los ensayos desplegables y la secuenciación de proteínas (la secuenciación podría hacerse con otra persona). ¿Cuáles son los primeros pasos que debo tomar? cuanto trabajo sera esto? ¿Alguno de ustedes ha establecido esto por su cuenta?

ya gracias por una respuesta, ya me has ayudado mucho :)

Querrás etiquetar tu proteína y transfectarla en células. Transfecte el vector solo como control. Haga un tirón hacia abajo con anticuerpo inmovilizado con perlas o Ni-NTA si la proteína está marcada con His. Ejecuta un gel y haz una mancha plateada. Habrá bandas en ambos carriles, pero primero corte las bandas que son mucho más fuertes en el carril de proteínas etiquetadas y envíelos para la identificación de espectrometría de masas. Si viene de un laboratorio con dinero, puede obtener una lista completa de posibles interactuantes haciendo el etiquetado SILAC y el análisis de especificación de masa líquida (consulte los artículos de Matthias Mann para obtener una buena base y las aplicaciones de este método). El método más económico descrito anteriormente (cortar bandas que son claramente diferentes entre la muestra y el control y enviarlas para la especificación de masas) debería brindarle algunos buenos candidatos para interactores solubles de alta abundancia, alta afinidad. ¡Buena suerte!

De hecho, ya tengo mi gen clonado en un vector con myc y su etiqueta. el anticuerpo contra la proteína se une a ella en el

tamaño correcto, por lo que realmente debería ser así. ¿Conoces algún kit que pueda comprar para los siguientes pasos o es mejor hacerlo todo desde cero? de todos modos, muchas gracias por la respuesta!

Aquí hay muchas variables, pero la respuesta corta es que se puede hacer. Probablemente, el lugar donde comenzará será un experimento básico de co-ip (con los controles y todo) en el que simplemente ejecute el material y tiñe el gel con plata. Después de esto, podría agotar las proteínas inmunoprecipitadas en un gel 2D, luego escindir y enviar a otra persona para la secuenciación de péptidos. Alternativamente, y tal vez de manera más realista, puede hacer una pantalla híbrida de levadura 2 contra una biblioteca para buscar socios potenciales. Cualquiera de estas técnicas le dirá si tiene socios interactivos potenciales / interesantes. Por supuesto, la mayoría de estos serán artefactos (las proteínas son pegajosas, los anticuerpos no son específicos, etc.), pero este es un punto de partida, eventualmente probablemente conducirá a otros experimentos de confirmación relacionados con la activación de la vía, caídas basadas en ARNip, medicamentos. inhibiciones basadas, etc.

En resumen, hacer esto realmente no es un asunto trivial, pero se puede hacer con un poco de enfoque y algo de impulso. No será fácil. Sugiero consultar / colaborar con un laboratorio de su institución que se especialice en este tipo de cosas. No tiene sentido reinventar la rueda.

No pierda el tiempo tratando de usar un anticuerpo contra la proteína para extraerla de las células. Para estos proyectos de identificación, la proteína etiquetada / sobreexpresada transfectada transitoriamente en células (293 o 293T) y derribada con perlas de anticuerpo etiqueta (V5, flag, TAP, etc.) da resultados mucho más limpios. Necesitará un control de una proteína irrelevante con una etiqueta similar para controlar las proteínas inherentemente pegajosas.

Básicamente, implica reducir la proteína en condiciones suaves (bajo contenido de sal, NP-40, pH fisiológico) como lo haría en un IP. Excepto que estás interesado en todo lo que no sea la proteína que ingieres. Por lo general, usted hará una IP, lavará las perlas y eluirá con tampón de muestra SDS antes de analizarlo en un gel teñido con coommassie / sypro para ver si puede detectar alguna proteína que baje con la proteína etiquetada que no aparezca. en tu control irrelevante. Si hay alguno, tendrá que identificarlos cortándolos del gel, digiriéndolos y secuenciando por MS / MS (la mayoría de las instalaciones centrales de la universidad tendrán a alguien capaz de al menos la digestión, por lo que debería tener que hacerlo como máximo). hacer es cortar las bandas).

Entonces, la esencia es que, si puede IP la proteína, probablemente pueda realizar este procedimiento sin demasiados problemas. Los principales puntos conflictivos son que su proteína objetivo puede tener una gran cantidad de unión de fondo a las cuentas y tendrá que probar algunas condiciones de lavado / bloqueo de cuentas diferentes para evitarlo. Además, para este tipo de análisis, suele ser útil fraccionar las células en citoplasma y núcleo, porque normalmente un compartimento mostrará más interacciones inespecíficas.


Ensayos de co-inmunoprecipitación y pull-down

Los ensayos de co-inmunoprecipitación (CoIP) y pull-down son métodos estrechamente relacionados para identificar interacciones proteína-proteína estables. Estos métodos están relacionados con la inmunoprecipitación, un método para separar una proteína diana unida a un anticuerpo de las proteínas no unidas. En CoIP, una proteína unida a un anticuerpo se une a otra proteína que no se une al anticuerpo, a esto le sigue un proceso de separación que conserva el complejo proteína-proteína. La diferencia en los ensayos pull-down es que las proteínas de cebo marcadas por afinidad reemplazan a los anticuerpos, y la cromatografía de afinidad se usa para aislar complejos proteína-proteína.

Este video explica CoIP, ensayos de extracción y su implementación en el laboratorio. Se cubre un protocolo paso a paso para cada técnica, incluidos los reactivos, aparatos e instrumentos utilizados para purificar y analizar proteínas unidas. Además, la sección de aplicaciones de este video describe un procedimiento para estudiar cómo las proteínas del mixovirus inhiben la nucleoproteína de la influenza, una investigación sobre el papel de los iones de calcio en la calmodulina mediante un ensayo de reducción y un ensayo de reducción modificado para caracterizar interacciones proteicas transitorias.

Las interacciones proteína-proteína juegan un papel importante en una amplia variedad de funciones biológicas. La mayoría de las interacciones proteína-proteína y sus efectos biológicos aún no se han identificado. La coinmunoprecipitación, o CoIP, y los ensayos de extracción son dos métodos estrechamente relacionados para la identificación de interacciones proteína-proteína estables. Este video cubrirá los principios de los dos ensayos, sus procedimientos generales de laboratorio y las aplicaciones de estas técnicas.

Los ensayos CoIP y pull-down son variantes de inmunoprecipitación, un método para aislar selectivamente una especie de proteína de una solución compleja. En un experimento de inmunoprecipitación, se permite que un anticuerpo específico de una proteína diana forme un complejo inmune con esa diana en la muestra. A continuación, el complejo se captura en un soporte sólido, típicamente proteína A unida a una perla de sefarosa. Las proteínas no capturadas se eliminan mediante pasos de centrifugación. A continuación, la proteína se libera del anticuerpo y del soporte sólido hirviéndola en tampón de carga de muestra SDS-PAGE reductor.

La coinmunoprecipitación se realiza de la misma manera, excepto que los complejos de proteínas intactos se capturan sobre el soporte sólido. El anticuerpo se une a la proteína objetivo, que, a su vez, se une a otra proteína que no es el objetivo del anticuerpo. Al igual que en la inmunoprecipitación, el complejo proteico se libera del anticuerpo y el soporte sólido hirviéndolo en tampón de carga de muestra SDS-PAGE reductor.

Los ensayos pull-down son similares a la co-inmunoprecipitación, y solo se diferencian en el uso de una proteína & # 34bait & # 34, en contraposición a un anticuerpo. Mediante técnicas de biología molecular, esta proteína de cebo se modifica con una etiqueta de afinidad, como una serie de residuos de histidina. Estas etiquetas de afinidad se describen en Separaciones de biomoléculas basadas en cromatografía. A continuación, la proteína se captura en un ligando de afinidad inmovilizado específico para la etiqueta. La proteína capturada se incuba luego con una muestra que contiene proteínas que forman complejos con el & # 34bait & # 34. El complejo proteico se libera del soporte de afinidad lavando con una solución que contiene un analito competitivo específico para la etiqueta de la proteína & # 34bait & # 34. Los ensayos pull-down son útiles para confirmar las interacciones de proteínas predichas por co-inmunoprecipitación y para descubrir interacciones de proteínas desconocidas.

Ahora que se han discutido los principios de la coinmunoprecipitación y los ensayos de extracción, echemos un vistazo a sus procedimientos de laboratorio.

Primero hablemos de la co-inmunoprecipitación. A una serie de tubos de microcentrífuga, se agrega lo siguiente: tampón PBS y una solución al 50% de proteína A-sefarosa, un complejo de resina-proteína que se une al anticuerpo. Los tubos de microcentrífuga se rotan para asegurar una distribución adecuada y luego la resina se lava con tampón PBS adicional. Se añaden lisado celular, que contiene la proteína deseada, y 2 & # 956 g de anticuerpo a los tubos de microcentrífuga, y la mezcla se hace girar durante 1 ha 4 & # 176ºC. Las perlas se sedimentan mediante centrifugación, el sobrenadante se descarta y las perlas se vuelven a lavar tres veces con tampón para eliminar la proteína no unida. Las perlas que contienen el complejo anticuerpo-proteína están en tampón de carga de muestra SDS-PAGE reductor, para la eliminación del complejo del anticuerpo y para el análisis por SDS-PAGE e inmunotransferencia.

Ahora discutiremos el procedimiento para los ensayos pull-down: La proteína & # 34bait & # 34 se expresa en un plásmido con la etiqueta de afinidad apropiada. Después de alcanzar el crecimiento en fase logarítmica, las células se lisan y luego se centrifugan. Se pipetean perlas de estreptavidina-sefarosa suspendidas, que capturan la proteína & # 34bait & # 34 marcada con biotina, en un tubo de microcentrífuga. A continuación, las perlas se centrifugan y el sobrenadante se elimina cuidadosamente por aspiración. A continuación, las perlas se lavan con tampón, se centrifugan y se elimina el sobrenadante.

Las células que contienen la supuesta proteína & # 34prey & # 34, que tiene afinidad por la proteína & # 34bait & # 34, se recolectan por centrifugación. A continuación, se añade el sobrenadante al tubo de microcentrífuga que contiene la resina y se incuba a 4 ° C durante 3 h en un agitador. Luego se centrifuga la resina, se elimina el sobrenadante y se lava la resina para eliminar la proteína no unida. Se añade tampón de elución a la resina y la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 30 min en un agitador. A continuación, la resina se centrifuga y el sobrenadante que contiene el complejo deseado se analiza mediante inmunotransferencia.

Ahora que hemos revisado los procedimientos, veamos algunas de las aplicaciones útiles de los ensayos de co-inmunoprecipitación y pull-down.

La coinmunoprecipitación puede ser útil para comprender mejor el mecanismo de acción de las enzimas. Las proteínas de resistencia al mixovirus o Mx inhiben una amplia gama de virus, incluida la influenza A, cuyo mecanismo es poco conocido. La co-inmunoprecipitación se utilizó para estudiar la interacción entre la proteína Mx1 de ratón y la nucleoproteína de la influenza.

Los ensayos pull-down han demostrado ser útiles para estudiar los efectos de los segundos mensajeros, que son proteínas que comunican una señal del entorno celular. Son un componente de una vía de señalización donde múltiples proteínas interactúan en respuesta a señales ambientales. Calcium ions act as secondary messengers by binding to calmodulin, which, in turn, binds to a wide variety of proteins, mediating many types of biological responses. Without the calcium, the protein can't bind to the calmodulin. A pull-down assay was conducted to test the ability of proteins to bind to calmodulin in the presence or absence of calcium ions.

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are generally used for analyzing stable or strong protein interactions, but not transient ones. A recent development in pull-down assays, the HaloTag, has simplified the study of transient protein interactions HaloTag is a genetically-encoded protein fusion tag, fused to the protein of interest, capable of chemically reacting with a haloalkane solid support. If functional analysis is desired, the protein complex, minus the tag, in its entirety could then be isolated by incubating with tobacco etch virus protease.

You've just watched JoVE's video on co-immunoprecipitation and pull-down assays. This video described the principles of the two methods, the general laboratory procedures, and some of their applications.

Procedimiento

Co-immunoprecipitation (CoIP) and pull-down assays are closely related methods to identify stable protein-protein interactions. These methods are related to immunoprecipitation, a method for separating a target protein bound to an antibody from unbound proteins. In CoIP, an antibody-bound protein is itself bound to another protein that does not bind with the antibody, this is followed by a separation process that preserves the protein-protein complex. The difference in pull-down assays is that affinity-tagged bait proteins replace antibodies, and affinity chromatography is used to isolate protein-protein complexes.

This video explains CoIP, pull-down assays, and their implementation in the laboratory. A step-by-step protocol for each technique is covered, including the reagents, apparatus, and instruments used to purify and analyze bound proteins. Additionally, the applications section of this video describes a procedure to study how myxovirus proteins inhibit influenza nucleoprotein, an investigation into the role of calcium ions in calmodulin via a pull-down assay, and a modified pull-down assay for characterizing transient protein interactions.

Protein-protein interactions play a significant role in a wide variety of biological functions. The majority of protein-protein interactions and their biological effects have yet to be identified. Co-immunoprecipitation, or CoIP, and pull-down assays are two closely related methods for the identification of stable protein-protein interactions. This video will cover the principles of the two assays, their general laboratory procedures, and applications of these techniques.

CoIP and pull-down assays are variants of immunoprecipitation, a method for selectively isolating a protein species from a complex solution. In an immunoprecipitation experiment, an antibody specific to a target protein is allowed to form an immune complex with that target in the sample. The complex is then captured on a solid support, typically protein A bound to a sepharose bead. Any proteins not captured are removed by centrifugation steps. The protein is then released from the antibody and solid support by boiling in reducing SDS-PAGE sample-loading buffer.

Co-immunoprecipitation is conducted in the same manner, except that intact protein complexes are captured onto the solid support. The antibody binds to the target protein, which, in turn, is bound to another protein that is not targeted by the antibody. As in immunoprecipitation, the protein complex is released from the antibody and solid support by boiling in reducing SDS-PAGE sample loading buffer.

Pull-down assays are similar to co-immunoprecipitation, differing only in the use of a "bait" protein, as opposed to an antibody. Through molecular biology techniques, this bait protein is engineered with an affinity tag, such as a series of histidine residues. These affinity tags are described in "Chromatography-based Biomolecule Separations." The protein is then captured on an immobilized affinity ligand specific for the tag. The captured protein is then incubated with a sample that contains proteins that form complexes with the "bait". The protein complex is released from the affinity support by washing with a solution containing a competitive analyte specific for the tag on the "bait" protein. Pull-down assays are useful for confirming protein interactions predicted by co-immunoprecipitation, and for discovering unknown protein interactions.

Now that the principles of co-immunoprecipitation and pull-down assays have been discussed, let's look at their laboratory procedures.

First let's discuss co-immunoprecipitation. To a series of microfuge tubes, the following is added: PBS buffer, and a 50% solution of protein A-sepharose, a resin-protein complex that binds to the antibody. The microfuge tubes are rotated to ensure proper distribution, and then the resin is washed with additional PBS buffer. Cell lysate, containing the desired protein, and 2 μg of antibody are added to the microfuge tubes, and the mixture is rotated for 1 h at 4 °C. The beads are pelleted by centrifugation, the supernatant is discarded, and the beads re-washed three times with buffer to remove non-bound protein. The beads containing the antibody-protein complex are in reducing SDS-PAGE sample-loading buffer, for removal of the complex from the antibody and for analysis by SDS-PAGE and immunoblotting.

Now we will discuss the procedure for pull-down assays: The "bait" protein is expressed in a plasmid with the appropriate affinity tag. After reaching log-phase growth, the cells are lysed, and then centrifuged. Suspended streptavidin-sepharose beads, which capture biotin-tagged "bait" protein, are pipetted into a microfuge tube. The beads are then centrifuged and the supernatant carefully removed by aspiration. The beads are then washed with buffer, centrifuged, and the supernatant removed.

Cells containing the putative "prey" protein, which has an affinity for the "bait" protein, are harvested by centrifugation. The supernatant is then added to the microfuge tube containing the resin, and incubated at 4 °C for 3 h on a shaker. The resin is then centrifuged, the supernatant removed, and the resin washed to remove non-bound protein. Elution buffer is added to the resin, and the mixture is incubated at room temperature for 30 min on a shaker. The resin is then centrifuged, and the supernatant containing the desired complex is analyzed by immunoblotting.

Now that we've reviewed the procedures, let's look at some of the useful applications of co-immunoprecipitation and pull-down assays.

Co-immunoprecipitation can be useful in better understanding of enzymes' mechanism of action. Myxovirus-, or Mx-, resistance proteins inhibit a wide range of viruses, including influenza A, for which the mechanism is poorly understood. Co-immunoprecipitation was used to study the interaction between mouse Mx1 protein and influenza nucleoprotein.

Pull-down assays have proven useful in studying the effects of second messengers, which are proteins that communicate a signal from the cellular environment. They are a component of a signaling pathway where multiple proteins interact in response to environmental cues. Calcium ions act as secondary messengers by binding to calmodulin, which, in turn, binds to a wide variety of proteins, mediating many types of biological responses. Without the calcium, the protein can't bind to the calmodulin. A pull-down assay was conducted to test the ability of proteins to bind to calmodulin in the presence or absence of calcium ions.

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are generally used for analyzing stable or strong protein interactions, but not transient ones. A recent development in pull-down assays, the HaloTag, has simplified the study of transient protein interactions HaloTag is a genetically-encoded protein fusion tag, fused to the protein of interest, capable of chemically reacting with a haloalkane solid support. If functional analysis is desired, the protein complex, minus the tag, in its entirety could then be isolated by incubating with tobacco etch virus protease.

You've just watched JoVE's video on co-immunoprecipitation and pull-down assays. This video described the principles of the two methods, the general laboratory procedures, and some of their applications.

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Protein-protein interactions play a significant role in a wide variety of biological functions. The majority of protein-protein interactions and their biological effects have yet to be identified. Co-immunoprecipitation, or CoIP, and pull-down assays are two closely related methods for the identification of stable protein-protein interactions. This video will cover the principles of the two assays, their general laboratory procedures, and applications of these techniques.

CoIP and pull-down assays are variants of immunoprecipitation, a method for selectively isolating a protein species from a complex solution. In an immunoprecipitation experiment, an antibody specific to a target protein is allowed to form an immune complex with that target in the sample. The complex is then captured on a solid support, typically protein A bound to a sepharose bead. Any proteins not captured are removed by centrifugation steps. The protein is then released from the antibody and solid support by boiling in reducing SDS-PAGE sample-loading buffer.

Co-immunoprecipitation is conducted in the same manner, except that intact protein complexes are captured onto the solid support. The antibody binds to the target protein, which, in turn, is bound to another protein that is not targeted by the antibody. As in immunoprecipitation, the protein complex is released from the antibody and solid support by boiling in reducing SDS-PAGE sample loading buffer.

Pull-down assays are similar to co-immunoprecipitation, differing only in the use of a "bait" protein, as opposed to an antibody. Through molecular biology techniques, this bait protein is engineered with an affinity tag, such as a series of histidine residues. These affinity tags are described in "Chromatography-based Biomolecule Separations." The protein is then captured on an immobilized affinity ligand specific for the tag. The captured protein is then incubated with a sample that contains proteins that form complexes with the "bait". The protein complex is released from the affinity support by washing with a solution containing a competitive analyte specific for the tag on the "bait" protein. Pull-down assays are useful for confirming protein interactions predicted by co-immunoprecipitation, and for discovering unknown protein interactions.

Now that the principles of co-immunoprecipitation and pull-down assays have been discussed, let's look at their laboratory procedures.

First let's discuss co-immunoprecipitation. To a series of microfuge tubes, the following is added: PBS buffer, and a 50% solution of protein A-sepharose, a resin-protein complex that binds to the antibody. The microfuge tubes are rotated to ensure proper distribution, and then the resin is washed with additional PBS buffer. Cell lysate, containing the desired protein, and 2 μg of antibody are added to the microfuge tubes, and the mixture is rotated for 1 h at 4 °C. The beads are pelleted by centrifugation, the supernatant is discarded, and the beads re-washed three times with buffer to remove non-bound protein. The beads containing the antibody-protein complex are in reducing SDS-PAGE sample-loading buffer, for removal of the complex from the antibody and for analysis by SDS-PAGE and immunoblotting.

Now we will discuss the procedure for pull-down assays: The "bait" protein is expressed in a plasmid with the appropriate affinity tag. After reaching log-phase growth, the cells are lysed, and then centrifuged. Suspended streptavidin-sepharose beads, which capture biotin-tagged "bait" protein, are pipetted into a microfuge tube. The beads are then centrifuged and the supernatant carefully removed by aspiration. The beads are then washed with buffer, centrifuged, and the supernatant removed.

Cells containing the putative "prey" protein, which has an affinity for the "bait" protein, are harvested by centrifugation. The supernatant is then added to the microfuge tube containing the resin, and incubated at 4 °C for 3 h on a shaker. The resin is then centrifuged, the supernatant removed, and the resin washed to remove non-bound protein. Elution buffer is added to the resin, and the mixture is incubated at room temperature for 30 min on a shaker. The resin is then centrifuged, and the supernatant containing the desired complex is analyzed by immunoblotting.

Now that we've reviewed the procedures, let's look at some of the useful applications of co-immunoprecipitation and pull-down assays.

Co-immunoprecipitation can be useful in better understanding of enzymes' mechanism of action. Myxovirus-, or Mx-, resistance proteins inhibit a wide range of viruses, including influenza A, for which the mechanism is poorly understood. Co-immunoprecipitation was used to study the interaction between mouse Mx1 protein and influenza nucleoprotein.

Pull-down assays have proven useful in studying the effects of second messengers, which are proteins that communicate a signal from the cellular environment. They are a component of a signaling pathway where multiple proteins interact in response to environmental cues. Calcium ions act as secondary messengers by binding to calmodulin, which, in turn, binds to a wide variety of proteins, mediating many types of biological responses. Without the calcium, the protein can't bind to the calmodulin. A pull-down assay was conducted to test the ability of proteins to bind to calmodulin in the presence or absence of calcium ions.

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are generally used for analyzing stable or strong protein interactions, but not transient ones. A recent development in pull-down assays, the HaloTag, has simplified the study of transient protein interactions HaloTag is a genetically-encoded protein fusion tag, fused to the protein of interest, capable of chemically reacting with a haloalkane solid support. If functional analysis is desired, the protein complex, minus the tag, in its entirety could then be isolated by incubating with tobacco etch virus protease.

You've just watched JoVE's video on co-immunoprecipitation and pull-down assays. This video described the principles of the two methods, the general laboratory procedures, and some of their applications.


Pull Down Assay

Protein pull down assay is an in vitro affinity purification method that uses a bait protein to enrich proteins that interact with the bait protein. It can be used for confirmation of existing protein-protein interactions discovered by other techniques or initial screening to identify novel protein-protein interactions. Profacgen provides you protein pull down service for the detection of possible interacting proteins of your target proteins.

The basic principle of pull down assay is to utilize a etiqueta fused protein (such as GST-tag, His-tag and biotin-tag) immobilized to affinity resin como el bait protein. Proteins binding to the bait protein (prey protein) can be captured and &ldquopulled down&rdquo when the target protein or cell lysate flows through. By subsequent elution and analysis using Western Blot or Mass Spectrometry (MS), a predicted interaction can be confirmed or previously unknown interactions can be discovered. Pull down assay service provided by Profacgen can efficiently and specifically verify the predicted protein-protein interactions or identify novel interactions.

Illustration of Pull Down Assay

Both bait protein and prey protein can be obtained from cell lysis, protein expression system o in vitro transcription and translation system through our carefully designed experimental scheme. Pull down assay is easy to operate and cost-saving.

Our services include:

Construction of recombinant expression plasmid

Bait protein expression and purification

Identification of protein-protein interaction by Western Blot or MS

Data retrieval and bioinformatics analysis

Our advantages:

Fully customerized high quality service
Stringent quality control and consistent results
Short turn-around time
Best price in the market
Detailed experimental report

Please contact us for more details of our professional pull down assay service.

See more details on the principle and protocol of pull down assay on our website. We also provide troubleshooting guides for the problems you may account in your experiment. See more.


How to pulldown membrane-bound protein? - co-immune precipitation (Oct/06/2008 )

Hola, todos. I now encountered a difficult problem here.
I suspect one of the protein I work with interact directly with a membrane-bound protein and my boss asked me to prove this. I already have the fluorescent colocalization in vivo but she think it is not good enough and I should at least have a co-IP result or other biochem result. The protein I work with is a cytosolic protein but its interacting partner is a membrane bound protein, and I wonder if I can use a regular co-IP with it?

By the way, I have already considered using membrane raft pulldown but it is not an acceptable method on this particular case because the protein I work with has been shown to interact with another (different) membrane-bound protein. So if I just break down the membrane to lipid vesicles it will contain BOTH membrane bound proteins and I won't be able to distinguish exactly which one pull down my protein with.
Thanks in advance!

hey there. in my understanding of your problem, i somehow think that immunoprecipitation would be more applicable here. ifthe protein in colocalizing with another protein then you can see the expression by western blotting using antibody agunst your original protein. then immunoprecipitation with respectable antibodies should give you the result. also you might have to work with different concentrations of SDS for immunoprecipitation to optimize your receptor expression.


THE BIOCHEMICAL CYCLE OF IMPEDANCE VARIATION IN AXONAL MEMBRANES

Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS

A known volume of solution is collected from the dialysing bag. One aliquot is used for protein determination according to Udenfriend and colleagues (1972) . To a known volume one adds 10 μl of tracking dye (bromophenol) and 50 μl of a saturated solution of sucrose.

Two concentrations of polyacrylamide have been used. In a first set of experiments the stacking gel had a concentration of 5 % while that of the resolving gel was 10 %. In subsequent experiments the concentrations were 3.2 % and 5 % respectively.

The electrophoresis was run for about 4 hours at a constant current of 4 mA per cylindrical gel with a running buffer of 50 mM Tris HCl, 2 mM EDTA, 375 mM glycine, 0.1 % SDS, adjusted at pH 8.3. The gel was stained for protein with 0.06 % Coomassie blue (G 250) in 45 % methanol-7 % acetic acid for at least 4 hours. It was destained overnight in 7 % acetic acid with several changes.

The gels were sliced according to the positions of some bands ( Schoffeniels, 1978a , b ) and the radioactivity measured by liquid scintillation counting (Lumagel) after dissolving the gel in 0.5 ml H2O2 overnight in an oven at 50°C. The results are expressed in counts per 10 min. after correction for the protein concentration.

In some experiments the sub-bands 1, 2 or 3 were not separated, therefore when the results are given for a letter without a numeral they refer to the total activity of the slice identified by the letter.


RhoA Pull-down Activation Assay Biochem Kit (bead pull-down format) - 80 Assays

Introducción
The Rho switch operates by alternating between an active, GTP-bound state and an inactive, GDP-bound state. Understanding the mechanisms that regulate activation / inactivation of the GTPases is of obvious biological significance and is a subject of intense investigation. The fact that many Rho family effector proteins will specifically recognize the GTP bound form of the protein has been exploited experimentally to develop a powerful affinity purification assay that monitors RhoA protein activation. The assay uses the Rho binding domain (RBD) of the Rho effector protein, Rhotekin. The RBD motif has been shown to bind specifically to the GTP-bound form of RhoA. The fact that the RBD region of Rhotekin has a high affinity for GTP-RhoA and that Rhotekin binding results in a significantly reduced intrinsic and catalytic rate of GTP hydrolysis make it an ideal tool for affinity purification of GTP-RhoA from cell lysates. The Rhotekin-RBD protein supplied in this kit contains Rhotekin residues 7-89 and is in the form of a GST fusion protein, which allows one to "pull-down" the Rhotekin-RBD/Rho-GTP complex with brightly colored glutathione affinity beads. The assay therefore provides a simple means of quantitating RhoA activation in cells. The amount of activated RhoA is determined by a western blot using a RhoA specific antibody.

Kit contents
The kit contains sufficient materials for 80 assays depending on activation levels of Rho in cells and includes reagents for positive and negative controls. The following components are included:

  1. GST-tagged Rhotekin-RBD protein on colored agarose beads (Cat. # RT02)
  2. RhoA-specific monoclonal antibody (Cat. # ARH03)
  3. His-tagged RhoA protein (Cat. # RH01)
  4. GTPγS: (non-hydrolyzable GTP analog) (Cat. # BS01)
  5. GDP
  6. Cell lysis Buffer
  7. Wash Buffer
  8. Loading Buffer
  9. STOP Buffer
  10. Protease inhibitor cocktail (Cat. # PIC02)
  11. Manual with detailed protocols and extensive troubleshooting guide

Figura 1. The brightly colored glutathione agarose beads in BK036 makes the kit easy to use.

Equipment needed

    SDS-PAGE minigel system and western blotting transfer apparatus

Example results
The RhoA activation assay was tested by loading the RhoA protein in cell lysates with either GTPγS or GDP. As expected, the GTPγS-loaded RhoA is very efficiently precipitated while very little GDP-loaded RhoA is precipitated (Fig. 2).

Figura 2. Results from BK036 RhoA activation assay. Activated Rho was precipitated and detected in a Western blot using kit BK036. The first lane shows a 50 ng recombinant His-tagged RhoA standard (Rec. His-RhoA). The following lanes shows the pull-down of inactive, GDP-loaded RhoA (RhoA-GDP PD) or active, GTPγS-loaded RhoA (RhoA-GTP PD) from equal amounts of cell lysates.

Please check out the new version of the Rac Activation Assay and associated products:

G-LISAProducts:
Cdc42 G-LISA™ Activation Assay, colorimetric format (Cat.# BK127)
Rac1 G-LISA™ Activation Assay, luminescence format (Cat.# BK126)
Rac1,2,3 G-LISA™ Activation Assay, colorimetric format (Cat.# BK125)
RhoA G-LISA™ Activation Assay, colorimetric format (Cat.# BK124)
RhoA G-LISA™ Activation Assay, luminescence format (Cat.# BK121)

Associated Products:
Anti-Cdc42 monoclonal antibody (Cat.# ACD03)
Anti-Rac1 monoclonal antibody (Cat.# ARC03)
Anti-RhoA monoclonal antibody (Cat.# ARH03)

For product Datasheets and MSDSs please click on the PDF links below. For additional information, click on the FAQs tab above or contact our Technical Support department at [email protected]

Iweka, A. et al. The lipid phosphatase‐like protein PLPPR1 associates with RhoGDI1 to modulate RhoA activation in response to axon growth inhibitory molecules. J. Neurochem. jnc.15271 (2021) doi:10.1111/jnc.15271.

Zhou, Y. et al. Upregulation of ARHGAP30 attenuates pancreatic cancer progression by inactivating the β-catenin pathway. Cancer Cell Int. 20, 1–12 (2020).

Ramírez‐Ramírez, D. et al. Rac1 is necessary for capacitation and acrosome reaction in guinea pig spermatozoa. J. Cell. Biochem. 121, 2864–2876 (2020).

Guo, Y. et al. Cytotoxic necrotizing factor 1 promotes bladder cancer angiogenesis through activating RhoC. FASEB J. 34, 7927–7940 (2020).

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Ver el vídeo: TestLab: Qué es la desnaturalización de las proteínas? (Enero 2022).