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¿Qué porcentaje de isoformas de proteínas tienen funciones diferentes?

¿Qué porcentaje de isoformas de proteínas tienen funciones diferentes?


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Estoy buscando estudios sobre cuántas isoformas de proteínas tienen diferentes funciones, preferiblemente en humanos. Sabemos que muchos, si no la mayoría, de los genes humanos se empalman alternativamente y que muchos producen diferentes isoformas de proteínas. ¿Alguien ha mirado cuántas de estas isoformas tienen diferentes funciones celulares? Si alguien pudiera señalarme un artículo publicado, sería genial.

Si no se ha realizado tal estudio, ¿alguien puede recomendar una base de datos de la que se pueda extraer esta información? GeneOntology se basa en genes, por lo que la información no se puede encontrar allí. Los genes se anotarán en términos específicos, no en sus isoformas de proteínas. Además, necesitaría poder hacer esto de una manera de alto rendimiento, no estoy interesado en proteínas específicas, pero en qué porcentaje de todas las isoformas tienen funciones diferentes.

Idealmente, me gustaría poder extraer, para cada gen humano, la lista de las diferentes isoformas de proteínas que codifica y si sus funciones difieren, o al menos cuáles son esas funciones.


Parece que la mayor parte de la anotación funcional en estos días se infiere a partir de la similitud de secuencia con genes / proteínas previamente anotados: esto es ciertamente cierto para la anotación funcional de alto rendimiento. Es difícil saber cuántas capas de inferencia hay entre su secuencia de consulta y un experimento real que verifica la función (posiblemente específica de tejido o condición) de un gen / proteína. Pero ay, estoy divagando ...

Un factor de confusión es que las isoformas empalmadas alternativamente comparten muchas secuencias en común, lo que significa que pueden compartir los mejores resultados cuando buscan en una base de datos de transcripciones anotadas y terminan recibiendo los mismos términos GO.

Pero como han mencionado otros, creo que el mayor factor limitante que encontrará es el paso de bajo rendimiento: en muchos casos, el trabajo experimental requerido para caracterizar las funciones de las isoformas alternativas simplemente aún no se ha realizado.


Para empezar, echaría un vistazo a UniProt. Es mi opción siempre que necesite buscar isoformas o datos funcionales, por lo que también debería ayudarlo. Puede comenzar comparando la información en Swiss-Prot con TrEMBL, que se anotan manual y automáticamente, respectivamente. Un problema con el que me he encontrado en mi investigación sobre las isoformas es que a menudo no se sabe mucho sobre ellas, ya que los estudios pueden haberse centrado en solo una o unas pocas de las muchas posibles. Una forma de evitar esto podría ser usar predicciones de estructura / función basadas en la secuencia, luego intentar predecir variaciones observando lo que se agrega o falta en las diversas isoformas.

Espero que esto ayude…


Tiendo a estar de acuerdo en que hay muy pocos datos sobre esto, especialmente teniendo en cuenta la cantidad de isoformas que hay. Creo que incluso algunos casos de pseudogenes pueden tener una función como proteína. Apuesto a que la mayoría de ellos tienen algunos aspectos funcionales únicos.

Creo que todos estaríamos de acuerdo en que no podemos probar que lo hacen en todos los casos, pero permítanme esbozar cómo pueden surgir o se conocen estas diferentes funciones.

Las isoformas de proteínas suelen tener dos causas. La primera es que hay dos copias muy similares del mismo gen, a partir de un evento de duplicación de genes. El segundo procede del empalme alternativo.

Las isoformas de empalme alternativas a menudo faltan o añaden algunos aminoácidos; la secuencia es diferente. Esto puede deberse al truncamiento de una gran parte de la proteína, como el receptor de leptina. El receptor de leptina tiene dos variantes de longitud completa que tienen diferentes patrones de expresión a diferentes temperaturas e importan leptina a la célula con diferentes eficiencias. La leptina también tiene varias isoformas cortas, donde solo se produce una pequeña porción que mira hacia el interior de la célula. Estas variantes compiten con el receptor completo para modular la sensibilidad de las células a la leptina.

Como puede imaginar, el mapeo de todo esto en un solo caso requirió años de trabajo. La caracterización completa de todas las isoformas humanas llevaría mucho tiempo.

Las isoformas de la duplicación de genes tienen muchas de las mismas propiedades que las isoformas variantes de empalme; pueden tener una maquinaria reguladora completamente diferente, apareciendo en diferentes estados biológicos que el gen principal y pueden variar en secuencia un poco o mucho. Se ha dado a entender que estos genes duplicados persisten en el genoma porque encuentran rápidamente un nuevo papel de nicho. Este artículo muestra que el 30% de 195 genes nuevos que han aparecido desde que dos cepas de mosca han divergido son necesarios para la viabilidad.

La evolución no deja que los genes se sientan porque son completamente idénticos; pueden eliminarse tan fácilmente como aparecen, solo la función diferencial mantendrá una isoforma en el repertorio de ARNm durante un tiempo prolongado.


¿Qué porcentaje de isoformas de proteínas tienen funciones diferentes? - biología

Las isoformas de la proteína quinasa C (PKC) tienen funciones cruciales en la señalización cutánea. Curiosamente, carecemos de información sobre su participación en la biología de las glándulas sebáceas humanas. Por lo tanto, en este estudio actual, investigamos las funciones del sistema PKC en sebocitos SZ95 inmortalizados humanos. Utilizando enfoques de biología molecular, imágenes y ensayos funcionales, informamos que los sebocitos SZ95 expresan el cPKCα convencional, el nuevo nPKCδ, ε y η y el aPKCζ atípico. La activación del sistema PKC por el 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA) estimuló la síntesis de lípidos (un sello distintivo de la diferenciación) y dio como resultado la translocación y luego la regulación a la baja de cPKCα y nPKCδ. De acuerdo con estos hallazgos, el efecto de PMA fue efectivamente anulado por inhibidores y "silenciamiento" de cPKCα y nPKCδ mediado por ARN de interferencia corto. De mayor importancia, la inhibición molecular o farmacológica de nPKCδ también previno la acción lipogénica y promotora de la apoptosis del ácido araquidónico. Finalmente, también encontramos que la "caída" de la actividad endógena de aPKCζ aumentó notablemente la síntesis de lípidos basales y la apoptosis, lo que sugiere su actividad constitutiva en la supresión de estos procesos. En conjunto, nuestros hallazgos argumentan firmemente a favor del hecho de que ciertas PKC tienen funciones fundamentales, específicas de isoformas, diferenciales y antagónicas en la regulación de la biología de los sebocitos derivados de las glándulas sebáceas humanas.


El mismo gen puede codificar proteínas con funciones divergentes

No es inusual que los hermanos parezcan más diferentes que similares: uno se convierte en florista, por ejemplo, otro en flautista y otro en físico.

Algo de la misma diversidad se aplica a la "prole" de proteínas producidas a partir de cualquier gen único en las células humanas, según un nuevo estudio dirigido por científicos del Dana-Farber Cancer Institute, la Universidad de California, la Facultad de Medicina de San Diego y la Universidad McGill. . En un primer estudio sistemático a gran escala, los investigadores encontraron que la mayoría de las proteínas hermanas, conocidas como "isoformas de proteínas" codificadas por el mismo gen, a menudo desempeñan funciones radicalmente diferentes dentro de los tejidos y las células, por muy parecidas que sean estructuralmente.

La investigación, publicada hoy en línea por la revista Celda, tiene un efecto poderoso en la comprensión de la biología humana y la dirección de la investigación futura. Por un lado, puede ayudar a explicar cómo los meros 20.000 genes que codifican proteínas en el genoma humano, menos de los que se encuentran en el genoma de una uva, pueden dar lugar a criaturas de una complejidad tan enorme. Los científicos saben que la cantidad de proteínas diferentes en las células humanas, que se cree que supera las 100.000, supera con creces la cantidad de genes, pero quedan muchas preguntas. ¿La mayoría de esas proteínas tienen una función única en la célula o sus funciones a veces se superponen? El descubrimiento de que diferentes isoformas de proteínas codificadas por el mismo gen pueden tener funciones divergentes a una escala mayor de lo que se cree sugiere que multiplican enormemente lo que nuestros genes son capaces de hacer.

Diversidad, pista de la enfermedad

Esta diversidad también sugiere que cada isoforma de proteína debe estudiarse individualmente para comprender su función normal y su posible participación en la enfermedad, afirman los autores del estudio.

"La investigación sobre proteínas relacionadas con el cáncer, por ejemplo, a menudo se enfoca en las isoformas más prevalentes en una célula, tejido u órgano dado", dijo el coautor principal David E. Hill, PhD, director asociado del Centro de Biología de Sistemas del Cáncer. (CCSB) en Dana-Farber. "Dado que las isoformas de proteínas menos prevalentes también pueden contribuir a la enfermedad y pueden resultar valiosos objetivos para la terapia con medicamentos, su función también debe examinarse y, para hacerlo correctamente, también necesitamos colecciones de clones completas que cubran todas las isoformas expresadas".

Los estudios funcionales previos de isoformas de proteínas se han realizado generalmente gen por gen. Además, los investigadores compararon con frecuencia la actividad de las isoformas "menores" de un gen con la de su isoforma predominante en un tejido en particular. El nuevo estudio abordó la cuestión funcional desde una perspectiva más amplia: reuniendo múltiples isoformas de proteínas de cientos de genes y comparando cómo interactúan específicamente con cualquier otra proteína humana.

Splicing alternativo

Una de las formas en que las células producen múltiples isoformas de proteínas a partir de genes individuales es un proceso llamado empalme alternativo. La mayoría de los genes humanos contienen múltiples segmentos llamados exones, separados por secuencias intermedias no codificantes llamadas intrones. En la célula, diferentes combinaciones de estos exones individuales se "pegan" o empalman para generar un producto génico expresado final, por lo que un solo gen puede codificar un conjunto de isoformas de proteínas distintas pero relacionadas, dependiendo de los exones específicos que se empalman. Una isoforma, por ejemplo, puede resultar del corte y empalme de los exones A-B-C-D de un gen particular. Otro puede surgir de la omisión del exón C, lo que da como resultado un producto con solo los exones A-B-D.

Para el nuevo estudio, los investigadores diseñaron una técnica llamada "ORF-Seq" que les permitió identificar y clonar una gran cantidad de productos génicos empalmados alternativamente en forma de marcos de lectura abiertos (ORF) y usarlos para producir múltiples isoformas de proteínas para cientos de genes.

De los aproximadamente 20.000 genes del genoma humano que codifican proteínas, los investigadores se concentraron en alrededor del ocho por ciento. Usando ORF-Seq, finalmente crearon una colección de 1423 isoformas de proteínas para 506 genes, de los cuales más del 50 por ciento eran productos genéticos completamente nuevos. Sometieron 1.035 de estas isoformas de proteínas a través de una prueba de detección masiva que las emparejó con 15.000 proteínas humanas para ver cuáles interactuarían.

“El descubrimiento emocionante fue que las isoformas provenientes del mismo gen a menudo interactuaban con diferentes proteínas asociadas”, comentó Gloria Sheynkman, PhD, de Dana-Farber y una de las autoras principales. “Esto sugiere que las isoformas juegan roles muy diferentes dentro de la célula”, al igual que los hermanos con diferentes carreras a menudo interactúan con diferentes grupos de amigos y compañeros de trabajo.

Los investigadores encontraron que en la mayoría de los casos, las isoformas relacionadas compartían menos de la mitad de sus proteínas asociadas. El dieciséis por ciento de las isoformas relacionadas no comparten absolutamente ninguna proteína asociada. "Desde la perspectiva de todas las interacciones de proteínas dentro de una célula, las isoformas relacionadas se comportan más como proteínas distintas que como variantes menores entre sí", afirmó Tong Hao, de Dana-Farber y uno de los autores principales.

Curiosamente, las isoformas que se derivan de una diferencia minúscula en el ADN, una diferencia de solo una letra del código genético, a veces tenían roles marcadamente diferentes dentro de la célula, encontraron los investigadores. Al mismo tiempo, las isoformas relacionadas que son estructuralmente bastante diferentes pueden tener roles muy similares.

Muy a menudo, los socios de interacción de las isoformas relacionadas varían de un tejido a otro, encontraron los investigadores. En el hígado, por ejemplo, una isoforma puede interactuar con un conjunto de proteínas. En el cerebro, un pariente de esa isoforma puede interactuar con un conjunto muy diferente de proteínas asociadas.

"Una vista más detallada de las redes de interacción de proteínas, como se presenta en nuestro artículo, es especialmente importante en relación con las enfermedades humanas", dijo la coautora principal Lilia Iakoucheva de UC San Diego. “Las diferencias drásticas en los socios de interacción entre las isoformas de corte y empalme sugieren fuertemente que la identificación de las vías relevantes para la enfermedad a nivel genético no es suficiente. Esto se debe a que diferentes variantes podrían participar en diferentes vías que conducen a la misma enfermedad o incluso a diferentes enfermedades. Es hora de profundizar en las redes que estamos construyendo y analizando ".

"Las células de diferentes tejidos de nuestro cuerpo comparten el mismo genoma", dijo el coautor principal Yu Xia de la Universidad McGill. "Sin embargo, sus diagramas de cableado molecular son mucho más divergentes de lo que se pensaba. Esta información es crucial para comprender la biología y combatir las enfermedades".

Expansión generalizada de las capacidades de interacción de proteínas mediante empalme alternativo, Cell (2016), por Xinping Yang, Jasmin Coulombe-Huntington, Shuli Kang,. Lilia M. Iakoucheva, Yu Xia, Marc Vidal, http://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674%2816%2930043-5

El trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano (subvenciones P50HG004233 y U01HG001715) la Fundación Ellison el Instituto Nacional del Cáncer (subvención R33CA132073) la Fundación Krembil un Premio de la Cátedra de Investigación de Excelencia de Canadá un Fondo de Investigación de Ontario-Premio a la Excelencia en la Investigación el Premio Nacional de Eunice Kennedy Shriver Instituto de Salud Infantil y Desarrollo Humano (subvención R01HD065288) el Instituto Nacional de Salud Mental (subvenciones R01MH091350, R01MH105524 y R21MH104766 la Fundación Nacional de Ciencias (subvención CCF-1219007) el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) (subvención RGPIN -2014-03892), la Fundación de Canadá para la Innovación (subvención JELF-33732), el Programa de Cátedras de Investigación de Canadá, Institutos Nacionales de Salud (subvención de formación T32CA009361), una beca NSERC, el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (subvención R01GM105431) y un Consejo de Investigación Sueco Beca Postdoctorado Internacional.


Discusión

En este estudio identificamos cientos de genes regulados aguas abajo de la actividad de la isoforma Fru M. Fru MA, Fru MB y Fru MC tienen diferencias en los conjuntos de genes inducidos o reprimidos cuando se sobreexpresan, lo que demuestra que cada isoforma tiene distintas actividades bioquímicas (Figura 2). De acuerdo con esta observación, cada isoforma de Fru M tiene una especificidad de unión al ADN diferente (Figura 3). Nuestros resultados sugieren que existen factores específicos del sexo que influyen en la actividad de la isoforma Fru M, ya que la sobreexpresión de las isoformas Fru MA, Fru MB y Fru MC en machos y hembras dio como resultado diferentes genes que son inducidos y reprimidos por cada isoforma (Figura 2 y archivo adicional2: Figura S1). Los conjuntos de genes identificados como inducidos aguas abajo de las isoformas de Fru M en los machos están enriquecidos con genes con función del sistema nervioso, según las anotaciones de GO (archivo adicional5: Tabla S4).

Además, vale la pena señalar que puede haber otras posibles fuentes de las diferencias observadas en los niveles de expresión génica en estos experimentos. En primer lugar, las proteínas Fru M contienen un dominio BTB que en trabajos anteriores se ha demostrado que contiene un dominio de dimerización que puede mediar interacciones homodiméricas o heterodiméricas. Por lo tanto, algunos de los efectos que observamos podrían deberse a 1) diferencias en las proporciones estequiométricas de Fru M entre sí, y / o 2) diferencias en las proporciones estequiométricas de Fru M con otros posibles socios de dimerización. Sin embargo, según los resultados de la inmunofluorescencia, no observamos niveles sustancialmente diferentes de sobreexpresión de cada isoforma, ni existe una expresión sustancial, si la hay, fuera de lo normal. fru P1 patrón de expresión (consulte el archivo adicional 8: Figura S2). En segundo lugar, existe una asociación significativa entre los genes que son inducidos o reprimidos cuando Fru M está sobreexpresado, con aquellos genes identificados en pérdida de función. fru METRO análisis de mutantes, demostrando la relevancia fisiológica de los genes identificados por sobreexpresión. En tercer lugar, existe un enriquecimiento significativo de las secuencias del sitio de unión identificadas para cada isoforma dentro de los genes que son inducidos por cada isoforma. En cuarto lugar, aunque nuestros criterios eran estrictos (diferencias significativas y sustanciales de dos cepas de tipo salvaje diferentes), las diferencias de cepa pueden explicar algunas de las diferencias entre las cepas masculinas y femeninas de tipo salvaje y las cepas masculinas y femeninas sobreexpresoras de Fru M, respectivamente. Sin embargo, no es probable que estas diferencias de cepas expliquen las diferencias que observamos entre las isoformas de Fru M, que se encuentran en el mismo trasfondo genético, ni las diferencias de cepas pueden explicar las diferencias observadas entre sexos. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que en el contexto de los experimentos de sobreexpresión, cada una de las tres isoformas de Fru M examinadas tiene diferentes actividades con respecto a los genes que son inducidos o reprimidos en los machos, con muchos más genes que tienen expresión inducida en lugar de reprimida en los machos. .

En estudios previos, la producción de Fru M en hembras, por expresión de un tra-2 Transgén de ARNi en fru P1-expresión de neuronas, fue suficiente para dotar a las hembras con el potencial de realizar los primeros cuatro pasos secundarios del ritual de cortejo masculino, seguimiento, golpeteo, extensión del ala y extensión de la probóscide, pero no intento de copulación [14]. Por el contrario, la sobreexpresión de Fru MA o Fru MC en fru P1-expresando neuronas, resultó en moscas que solo mostraban seguimiento y tapping revisado en [4], lo que sugiere que la sobreexpresión de Fru M en las hembras no es suficiente para dotar a las hembras con el potencial de realizar comportamientos de cortejo. Será interesante examinar los 42 genes identificados como inducidos por las tres isoformas de Fru M en las hembras, con respecto a su papel en el establecimiento del potencial de estos primeros pasos de cortejo. Curiosamente, uno de estos genes es Ir54a, que codifica un miembro de una familia diversa de receptores ionotrópicos, algunos de los cuales se expresan en la antena del adulto y subyacen en las funciones quimiosensoriales [35]. También se sabe que Dsx M juega un papel en el establecimiento del potencial de conductas de cortejo [26, 27, 36-38], que no habrían estado presentes en las hembras en las que se produjo Fru M, aunque Dsx M no está presente en todas fru P1-expresando neruons, por lo que es poco probable que explique todas las diferencias entre hombres y mujeres observadas aquí [26, 37]. Nuestros resultados pueden explicar aún más por qué no hubo un rescate completo del comportamiento de cortejo masculino. Está claro que el sexo de la mosca en la que se produce Fru M tiene un impacto en los genes que se inducen y reprimen. Estos resultados sugieren que existen factores adicionales específicos del sexo que influyen en la actividad de Fru M, que pueden incluir Dsx M. Será importante una mayor caracterización bioquímica de las interacciones de la proteína Fru M para comprender las actividades de Fru M.

Tiempo fru Se ha predicho que es un factor de transcripción basado en la observación de que fru codifica productos con dedos de zinc BTB, sin objetivos transcripcionales directos de fru han sido identificados, dejando esta pregunta abierta. Un estudio reciente ha demostrado que Fru M se asocia con un cofactor, Bonus, y posteriormente se asocia con dos proteínas modificadoras de la cromatina, HP1a y HDAC1, sin embargo, no estaba claro si la asociación de Fru M con la cromatina era directa [20]. Los resultados presentados aquí demuestran que Fru M puede unirse al ADN y que tres isoformas de Fru M examinadas tienen diferentes actividades de unión. Dada nuestra observación de que los sitios de unión se enriquecen significativamente en todos los conjuntos de genes identificados como inducidos, pero no reprimidos por Fru M, sugiere que Fru M puede funcionar uniendo el ADN potenciador directamente, pero actúa de manera indirecta para reprimir la expresión génica (Tabla 1 ).

En estudios anteriores, nosotros y otros hemos demostrado que los genes con expresión sesgada por el hombre se enriquecieron en el cromosoma X en la cabeza del adulto [31, 39] y el cerebro [40]. También hubo un enriquecimiento significativo de genes con expresión de sesgo masculino que residen cerca de los sitios de entrada de compensación de dosis [39, 40]. Aquí, observamos un enriquecimiento significativo de genes que residen en el cromosoma X que son inducidos por Fru M en los machos. Esta observación apoya la idea de que a lo largo del tiempo evolutivo puede haber habido una selección de genes con funciones específicas de los hombres para residir en el cromosoma X y, en particular, en los regulados por Fru M. Quizás, las isoformas de Fru M y sus objetivos genéticos han evolucionado para aprovechar las propiedades únicas del núcleo masculino. Estas diferencias incluyen el complejo de compensación de dosis que está unido al cromosoma X masculino que conduce a una cromatina menos compacta revisada en [41], la presencia del cromosoma Y que afecta la arquitectura de la cromatina en todo el núcleo [42] u otras diferencias en la cromatina. y arquitectura tridimensional del núcleo en los machos [por ejemplo, véase [43]. Es posible que haya más interconexiones en el modelo de jerarquía sexual entre el sexo cromosómico, las ramas de la jerarquía sexual y el desarrollo sexual que se encuentra aguas abajo de Fru M que lo que se muestra en el modelo (Figura 1).


Conclusiones

Hemos encontrado que el gen Dlc1 tiene cuatro isoformas transcripcionales expresadas bajo la influencia de tres promotores alternativos. Los promotores alternativos están metilados diferencialmente en tejidos de ratón y esto se relaciona con la expresión diferencial de las proteínas en los tejidos examinados. También identificamos una proteína Dlc1 de 127 KDa que puede originarse a partir de la transcripción alternativa de 6.2 Kb. Generamos un ratón Dlc1 gt que dio como resultado la expresión hipomórfica del transcrito de 6,1 Kb y la proteína Dlc1 de 123 KDa. Los embriones de ratón homocigotos gt Dlc1 gt / gt mostraron anomalías significativas en la vasculatura del saco vitelino y del laberinto placentario, lo que sugiere un papel importante en el desarrollo de la isoforma de Dlc1 de 6,1 Kb durante el desarrollo embrionario temprano. Una deficiencia de esta isoforma dio como resultado un aumento de los niveles de GTP-Rho, lo que resultó en una mayor formación de adhesión focal asociada a fibras de estrés y vinculina. Esto, a su vez, resultó en una mayor movilidad celular.


Splicing alternativo

Hace tres décadas, se descubrió que la función codificadora de algunos genes eucariotas se dividía en segmentos codificantes más pequeños y discretos llamados exones, separados entre sí por largos tramos de ADN no codificante, llamados intrones. Tanto los nucleótidos del intrón como del exón se transcriben, lo que produce una transcripción de ARNm primaria, o molécula de pre-ARNm, a partir de la cual se escinden los nucleótidos de ARN complementarios a los nucleótidos del intrón, lo que constituye el empalme del ARN. Nucleótidos de ARN complementarios a algunos Los nucleótidos de exón también se pueden cortar y empalmar a partir de una molécula de ARNm primaria, aunque estos nucleótidos de ARN pueden variar, dependiendo de, por ejemplo, el tipo de célula, que constituye el AS. Los exones de la transcripción primaria que terminan en todos los ARNm funcionales derivables de una transcripción primaria particular se denominan comúnmente exones constitutivos. Los exones extirpables se denominan comúnmente exones alternativos. La evidencia sugiere que el 95 por ciento de los genes humanos se empalman alternativamente (Chen & amp Manley, 2009, p. 741). El resultado final del procesamiento del ARN, el ARN que abandona el núcleo para someterse a la traducción, se denomina ARNm maduro o funcional.

Para ilustrar el empalme de ARN y AS, imagino un gen estructural eucariota A compuesto por 10 exones y 9 intrones. (A partir de este momento, también utilizaré "intrón" y "exón" en el contexto de moléculas de ARN). En un tipo de célula, la eliminación de intrones y la eliminación selectiva de exones podrían producir un ARNm funcional que contenga los exones 1, 2, 3 , 4, 7, 8 y 10, todos los intrones y exones 5, 6 y 9 se han eliminado de la transcripción primaria. En un tipo de célula diferente, el ARNm funcional podría contener los exones 1, 4, 5, 6, 7 y 9. De manera algo obvia, estos dos ARNm diferentes se traducirán en dos isoformas de proteínas diferentes (en lo sucesivo denominadas isoformas), que podría tener diferentes funciones, como sugirió Yang et al. (2016). Estos autores determinaron el número de socios de unión compartidos entre los miembros de un par de isoformas. En la mayoría de los casos, los miembros de una pareja compartían menos del 50 por ciento de los socios vinculantes, Yang et al. concluyendo, “En el contexto global de los mapas de redes de interactomas, las isoformas alternativas tienden a comportarse como proteínas distintas en lugar de variantes menores entre sí” (p. 805).

AS, entonces, en la medida en que las isoformas son funcionalmente diferentes, permite un proteoma expandido en relación con un genoma fijo, pero también, el esquema de AS proporcionado hasta ahora podría provocar dudas de que la información para la síntesis de proteínas reside únicamente en genes. Sin duda, un gen estructural debería considerarse una plantilla para el ARNm primario asociado. Sin embargo, si un gen estructural también se considera la plantilla para un ARNm funcional que surge solo después de un procesamiento considerable de la transcripción primaria, si este procesamiento implica variable escisión de exones? La transcripción primaria contiene señales estructurales que identifican exones escindibles, y esta información es necesaria para la síntesis funcional de ARNm. Además, cada exón encontrado en cualquiera de los ARNm funcionales derivables de una transcripción primaria particular era, originalmente, parte de esa transcripción primaria. Sin embargo, hay una categoría de información, de importancia crítica para los resultados de empalme, que la transcripción primaria y, por extensión, el gen, no parecen contener. La transcripción primaria, por sí sola, no parece contener la información de cuales exones extirpables para dejar y cuales exones escindibles para empalmar durante un especial evento de empalme. La información almacenada en un gen estructural, tan necesaria para la secuencia de aminoácidos primaria de una proteína, parece al mismo tiempo insuficiente en lo que respecta a especificar esa secuencia en la medida en que más de una de tales secuencias puede resultar del corte y empalme de la transcripción primaria. La información en una transcripción primaria, por sí sola, solo puede indicar qué exones podría ser extirpado, no qué exones voluntad ser escindido, como resultado de un evento de empalme, cuando puede resultar más de una isoforma. A continuación, se presenta evidencia de que factores distintos al gen asociado pueden influir en los resultados del empalme, pero que dichos factores debe existir parece implícito, ya, en el mismo hecho de AS, cualquier influencia que no se deba a un producto directo de un gen se denominará no genética.

Evidencia del papel del contexto, especialmente el contexto no genético, en la regulación de la EA

Que AS puede conducir a la síntesis de isoformas con funciones opuestas se ilustra con un ejemplo de Yang et al. (2016): una isoforma promueve la apoptosis, mientras que la otra la inhibe (p. 806). Un artículo citado por Yang et al., Schwerk y Schulze-Osthoff (2005), proporciona otros ejemplos de pares de isoformas que exhiben funciones opuestas, pero estos autores también escriben: “La acumulación de datos ha demostrado que los patrones de empalme ya se pueden determinar en el promotor de un gen, que evidencia un acoplamiento entre la transcripción y el empalme alternativo ”(p. 8, citando a Goldstrohm et al., 2001). Esta afirmación parece estar diciendo que un gen es capaz de influir por completo en el resultado de un evento de empalme. Schwerk y Schulze-Osthoff continúan resumiendo la investigación, sin embargo, mostrando que un gen para el cual se establece la conexión antes mencionada entre la transcripción y el resultado del empalme tiene cinco promotores, y que la selección de uno de ellos es asociado con un resultado de empalme particular, pero que el desencadenante de esto es una hormona esteroide (pág. 8). Parecería que la información para este resultado de empalme, su "modelo", debido a la dependencia de este resultado de empalme de un factor no genético, debe estar en un ámbito más amplio que el del gen.

La estructura secundaria del pre-ARNm puede influir en los resultados del empalme alternativo. Buratti y Baralle (2004) discuten varios ejemplos de esto, uno (p. 5) es la influencia de una estructura secundaria de pre-ARNm en la expresión de dos exones mutuamente excluyentes, la forma específica de tejido de expresión del exón aquí sugiere un papel en el secundario. -determinación de la estructura y, por tanto, resultado del empalme, para factores distintos del gen relevante. los Drosophila gene Dscam, que puede generar más de 38.000 isoformas, todas o la mayoría de las cuales pueden ser necesarias para el desarrollo normal del sistema nervioso central de la mosca de la fruta (Yue et al., 2013, p. 1822), tiene 115 exones, 20 de los cuales no se empalman alternativamente. Los 95 restantes se agrupan en 4 grupos o agrupaciones (agrupaciones de exones 4, 6, 9 y 17 que contienen 12, 48, 33 y 2 exones, respectivamente), y un solo exón de cada agrupación termina en un ARNm funcional particular ( May et al., 2011, p. 222). De DscamLos 115 exones, entonces, solo 24 estarán representados en cualquiera de las 38,000 posibles transcripciones de ARNm funcional y, por lo tanto, solo 24 en cualquier isoforma. Graveley (2005) propuso un mecanismo para el empalme del grupo 6, que contiene 48 exones, que se basaron en diferentes estructuras secundarias para cada resultado de AS. May et al. proporcionó evidencia experimental de la existencia de estas estructuras y su importancia, pero concluyó que otros factores también eran importantes (p. 227). Ya sea que uno se concentre en la gran cantidad de estructuras secundarias diferentes involucradas en los diferentes resultados posibles de empalme alternativo o en el "... sistema integrador más grande" dentro del cual estos autores creen que está incrustada la influencia de la estructura secundaria, aún debería ser evidente que el La información requerida para los resultados de empalme aquí debe exceder con mucho la que puede ser proporcionada por Dscam sí mismo.

La capacidad de los niveles de zinc endógeno, en Arabidopsis, para sesgar el empalme de la transcripción primaria de un gen que codifica una proteína de secuestro de zinc hacia una transcripción alternativa con una "eficiencia de traducción" mejorada (Remy et al., 2014, p. 1) es otro ejemplo de la influencia de una no- factor genético en AS.

Un segundo ejemplo de la influencia de una hormona esteroidea en un resultado de empalme y, al mismo tiempo, un segundo ejemplo de enlace transcripción-AS lo proporcionan Dowhan et al. (2005). Este artículo resume la investigación que muestra que la unión de la progesterona a su receptor, además de influir en la transcripción, desencadena el reclutamiento de moléculas correguladoras que influyen en los eventos de empalme aguas abajo. Este segundo ejemplo de la influencia de una hormona esteroidea en un resultado de empalme proporciona una evidencia algo explícita de la capacidad de un factor no genético, la progesterona, para regular una molécula reguladora de empalme clave, el factor de empalme. (COMO regulación se atribuye generalmente a la interacción de factores de empalme [proteínas y moléculas de ARN] con secuencias de nucleótidos de ARNm primario, por lo que los factores de empalme desempeñan un papel en AS análogo al que cumplen los factores de transcripción específicos en la transcripción, porque los factores de empalme son proteínas o moléculas de ARN , su génesis también puede involucrar AS.) Esto es digno de mención porque implícito en la noción de un programa genético que impulsa el desarrollo es que los productos del gen regulador, como el lac operón proteína represora, controla los eventos transcripcionales y postranscripcionales hasta un punto que obvia la necesidad de buscar factores fuera del genoma para explicar el control de los procesos celulares (Keller, 2000, págs. 56–57). Thus, one might agree that the discovery of AS should provoke movement away from the characterization of single genes as blueprints for proteins but insist that because splicing factors are direct products of genes, the information for splicing outcomes still lies within the genome as a whole. However, in this splicing outcome, we see regulation by a non-genetic factor, not of transcription but, still, of the identity of the final product of a regulator gene.

An example of an external-environmental influence on AS also manifesting as an influence on the same category of regulator gene as in the previous example is, in A. thaliana, the effect of long-term exposure to cold on which of two splicing factors predominates (Shang et al., 2017, p. 2 of online version).

Syed et al. (2012), in examining the importance of AS to plant physiology, stress the role of splicing factors in AS but then point out the importance of non-genetic factors in the splicing outcomes that dictate the identity of the splicing factors themselves, these non-genetic factors including “temperature, light, salt, hormones, etc.” (p. 3 of online version).

Implications of AS for Conceptualizing the Gene

Prior to the discovery of AS, it seemed reasonable to conceive of structural genes as blueprints for proteins to the extent that genes appeared to be straightforward templates for mRNA molecules, with these appearing to be straightforward templates for the amino-acid sequence of proteins. However, the nature of the processing that primary mRNA undergoes on the way to becoming functional mRNA insures that there is no one-to-one correspondence between DNA nucleotides and translatable mRNA nucleotides in eukaryotes. Additionally, there is the problem, already discussed, of trying to imagine how the information in the gene/primary transcript, alone, is sufficient to dictate cuales excisable exons are to be spliced out when these can vary in a situation-dependent manner. Genes appear very much to be blueprints for primary mRNA molecules but not blueprints for the functional mRNA molecules resulting from AS. Information of a different sort seems required in going from primary to functional mRNA. Furthermore, that this information, whether manifesting as cell-specific secondary structure or hormone or mineral levels, or temperature or light intensity, is not always of a merely ancillary nature is indicated, again, by the fact that AS can result in isoforms with opposite functions.

According to Tress et al. (2017), there is scant evidence, in mammals at least, that anywhere near the same number of isoforms is being generated as are alternative transcripts (functional mRNAs), and when multiple isoforms do result, there is not always accompanying evidence that each is functionally distinct from the other(s). Howver, a splicing outcome non-productive in the sense that one of a pair of alternative transcripts is never translated can still exert a profound regulatory influence on protein synthesis via the orchestrated linkage of nonsense-mediated decay (NMD), a process that results in the degradation of functional mRNA molecules, to AS (Soergel et al., 2000, p. 13). Makeyev et al. (2007) provide an example of this. In mice non-neuronal cells, a splicing factor influences splicing of a second splicing factor's primary transcript in such a way that the resulting alternative transcript is shunted into the NMD pathway and degraded. However, in nervous system (NS) cells, where the second splicing factor is needed, a small regulatory RNA represses the first splicing factor's synthesis to a degree that allows for synthesis of the second splicing factor. Thus, splicing of the second splicing factor's primary transcript, in non-NS tissue, is non-productive the alternative transcript is never translated. Splicing in norteS tissue, however, is productive the alternative transcript is translated.

Intron retention (IR) is a type of AS. One IR variant results in the retention of an intron in the 5′ un-translated region of a functional mRNA, this altering the ease of translation of the transcript and thus providing a means for regulating gene expression. We saw an example of this in Remy et al. (2014) as regards Arabidopsis. Translation of each of two alternative transcripts results in synthesis of exactly the same protein. However, there is a greater need for this protein in root cells. En estas cells, zinc-mediated IR results in an alternative transcript with enhanced translation efficiency.

Regulation of gene expression by shuttling alternative transcripts down the NMD pathway, prior to translation, and intron retention, thus, are two mechanisms by which AS can regulate protein synthesis, and in a tissue-specific manner, even though neither results in the synthesis of more than one protein per gene.

The starting point for this article's analysis of PTM was an already “complete” protein, from where PTM's role in protein synthesis was seen to lie in its capacity to influence protein functioning. The starting point for this article's analysis of AS was the primary transcript, from where AS's influence on protein synthesis was seen to lie in its capacity to provide for the generation of more than one functional mRNA and, presumably, more than one functionally distinct protein. To the extent that this happens and to the extent that non-genetic factors are involved in regulating AS, the gene-as-blueprint and genome-as-developmental-program metaphors seem called into question. However, as just mentioned, there are doubts in some circles about the degree to which alternative transcripts are translated or, when translated, translated into functionally distinct proteins. We have just seen though, that AS can influence protein synthesis even when two different functional mRNAs, derived from the same primary transcript, do not lead to synthesis of two different proteins. AS can influence protein synthesis, not just by providing the basis for generating more than one functionally distinct protein from the same gene but also by regulating the grado of synthesis of a protein that might be the only one associated with a particular gene. (This latter capacity of AS does not challenge the gene-as-blueprint metaphor it does challenge the genome-as-developmental-program metaphor.)


Contenido

ATF3 Edit

Activating transcription factor 3 (Atf3) is a known RAG with numerous promoters. Atf3 expression increases after nerve injury and overexpression of a constitutively active form of Atf3 increases the rate of peripheral nerve regeneration. [7] Four Atf3 isoforms were identified in dorsal root ganglia (DRG) so far. These four isoforms differ in TSS, and one differs in the CDS. However it is unclear which promoters are in use in regenerating DRG neurons. [8]

PTEN Edit

Phosphatase and tensin homolog (Pten) is originally identified as a tumor suppressor gene. [9] Recent studies found that Pten also suppressed axon regeneration in retinal ganglion cells, corticospinal tract, and DRG neurons. [10] [11] [12] So far 3 Pten isoforms (Pten, PtenJ1, and Pten J2) have been identified and analyzed. Pten J1 is identical in sequence to the conventional Pten isoform except for a difference in TSS and a small shift in the CDS. Pten J2 has a truncated CDS, an alternative transcription start site and a longer 3’ UTR compared to the conventional Pten isoform expressed within neurons. The truncated CDS encodes a protein that lacks a phosphate domain. Also, overexpression of Pten J2 and Pten in primary cortical neurons does not influence axon regeneration. So it’s hypothesized that Pten J2 works as regulatory RNA to inhibit the activity of Pten. [8]


Same Gene, Different Functions

Catherine Offord
Feb 11, 2016

CD46, a type I membrane protein, has at least 14 different isoforms. WIKIMEDIA, EMW The human genome contains roughly 20,000 protein-coding genes, yet the number of proteins in human cells is thought to be more like 100,000. Researchers from three institutions in North America have now shown that at least some of the diversity of proteins&rsquo functions in the cell may be due to the widely diverging roles of protein isoforms&mdashstructurally similar variants produced as a result of slight differences during the translation of a single gene. The findings were published yesterday (February 11) in Celda.

&ldquoThe exciting discovery was that isoforms coming from the same gene often interacted with different protein partners,&rdquo study coauthor Gloria Sheynkman of the Dana-Farber Cancer Institute said in a statement. &ldquoThis suggests that the isoforms play very different roles within the cell.&rdquo

Unlike previous functional studies of isoforms, which have generally focused.

The researchers found that, on average, two related isoforms shared less than 50 percent of interacting proteins 16 percent of related isoforms shared none at all. These differences in interaction partners were often associated with only tiny alterations in DNA sequence—sometimes just a single base pair.

“From the perspective of all the protein interactions within a cell, related isoforms behave more like distinct proteins than minor variants of one another,” study coauthor Tong Hao of Dana-Farber said in the statement.

“A more detailed view at protein interaction networks, as presented in our paper, is especially important in relation to human diseases,” added study coauthor Lilia Iakoucheva of the University of California, San Diego. “Drastic differences in interaction partners among splicing isoforms strongly suggest that identification of the disease-relevant pathways at the gene level is not sufficient. . . . It’s time to take a deeper dive into the networks that we are building and analyzing.”


Reagents

DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine), DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine), DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanol-amine), cholesterol (cholest-5-en-3ß-ol), PI(3)P (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-myo-inositol-3′-phosphate)), PI(3,5)P2 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-myo-inositol-3′,5′-bisphosphate)), PI(4)P (L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate), PI(4,5)P2 (L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate), BODIPY TMR-PtdIns(4,5)P2, C16 (red PI(4,5)P2), 1-oleoyl-2-6-[4-(dipyrrometheneboron difluoride) butanoyl] amino hexanoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol-4,5-bisphosphate (TopFluor PI(4,5)P2), and Egg Rhod PE (L-α-phosphatidylethanolamine-N-lissamine rhodamine B sulfonyl) were purchased from Avanti Polar Lipids, Inc. (Avanti Polar Lipids, USA). Stock solutions of lipids were solubilized in chloroform at a concentration of 10 mg mL −1 , except for cholesterol and Egg Rho PE dissolved respectively at a concentration of 20 mg mL −1 and 0.5 mg mL −1 and PIPs, which were solubilized in a mixture of chloroform/methanol (70:30) (v/v) at a concentration of 1 mg mL −1 . All stock solutions were kept under argon and stored at − 20 °C in amber vials (Sigma-Aldrich, France).

Expression, purification, and labeling of proteins

Expression and purification of MBP-CHMP2A-ΔC (residues 9–161) and CHMP3-FL (residues 1–122) was performed as described in [18]. A final gel filtration chromatography step on a superdex200 column was performed in a buffer containing 20 mM Hepes pH 7.6, NaCl 150 mM.

CHMP2B-FL (residues 1–222) and CHMP2B-ΔC (residues 1–154) were expressed and purified as previously described [32]. Both constructs contain a C-terminal SGSC linker for cysteine-specific labeling. Cells were lysed by sonication in 50 mM Tris pH 7.4, 1 M NaCl, 10 mM DTT, complete EDTA free, and the soluble fraction was discarded after centrifugation. The pellet was washed three times a buffer containing 50 mM Tris pH 7.4, 2 M UREA, 2% Triton X-100, 2 mM β-mercaptoethanol, and a final wash in 50 mM Tris pH 7.4, 2 mM β-mercaptoethanol. CHMP2B (-FL and -ΔC) was extracted from the pellet using a buffer composed of 50 mM Tris pH 7.4, 8 M guanidine, 2 mM β-mercaptoethanol over night at 4 °C. Further purification of solubilized CHMP2B included Ni 2+ chromatography in 50 mM Tris pH 7.4, 8 M urea, refolding by rapid dilution into a buffer containing 50 mM Tris pH 7.4, 200 mM NaCl, 2 mM DTT, 50 mM L-glutamate, 50 mM L-arginine at a final concentration of 2 μM. Refolded CHMP2B was concentrated by Ni 2+ chromatography in a buffer containing 50 mM Tris pH 7.4, 200 mM NaCl. A final gel filtration chromatography step was performed on a superdex75 column in the buffer containing 50 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl.

For MBP-CHMP2B-ΔC production, Escherichia coli BL21 cells were transformed with plasmids and grown at 37 °C in Luria broth medium to an OD600 of 0.6. Protein expression was induced by the addition of 1 mM arabinose for 3 h at 37 °C. Cells were harvested by centrifugation and the bacterial pellet was re-suspended in 50 mL of binding buffer (50 mM Hepes pH 7.6, 300 mM NaCl, 300 mM KCl). The bacteria were lysed by sonication for 5 min and cell was pelleted by centrifugation at 20,000 rpm for 30 min. The MBP-CHMP2B-ΔC protein was purified on an amylose affinity column in binding buffer.

Following expression, CHMP proteins were concentrated, labeled overnight at 4 °C with a ratio of Alexa labeling dye per protein of 2 to 1. MBP-CHMP2A-∆C, CHMP3-FL, and CHMP2B ( -∆C and -FL) were labeled with Alexa 488 succimidyl ester, Alexa 633 succimidyl ester, and Alexa 488 C5 maleimide (Thermo Fisher Scientific), respectively. The excess of free dyes was removed by salt exchange chromatography except for MBP-CHMP2B-ΔC where a final gel filtration chromatography (superdex 200) step was performed in a buffer containing 50 mM Hepes pH 7.6, 150 mM NaCl. Immediately after labeling, all aliquots were frozen in liquid nitrogen with 0.1% of methyl cellulose (Sigma-Aldrich) as cryoprotectant. All aliquots were kept at − 80 °C prior to experiments.

GUV preparation for confocal, spinning disk, and FACS experiments

GUVs were prepared by spontaneous swelling on polyvinyl alcohol (PVA)-based gels [84]. A thin lipid solution is deposited on a PVA gel (5% PVA, 50 mM sucrose, 25 mM NaCl and 25 mM Tris, at pH 7.5), dried under vacuum for 20 min at room temperature and rehydrated with the growth buffer at room temperature. Vesicles form within 45 min and are extracted by pipetting directly from the slides on top of the PVA gel.

Composition 1

For confocal and spinning disk microscopy experiments, lipid stock solutions were mixed to obtain DOPC/DOPS/DOPE/Cholesterol/PI(4,5)P2/PE-Rhodamine (54.2,10:10:15:10:0.8) (molar ratio) at a concentration of 3 mg mL −1 in chloroform. In the following, this GUV composition will be referred to as 10% PIP2-GUV. In order to detect the PI(4,5)P2 lipid signal, PE-Rhodamine in the PIP2-GUV lipid stock solution was replaced by TopFluor PI(4,5)P2 with a molar ratio of PI(4,5)P2/TopFluorPI(4,5)P2 of (8,0.5) referred to as FluoPIP2-GUV.

Composition 2

For FACS microscopy experiments, lipid stock solutions were mixed to obtain DOPC/DOPE/Cholesterol/PI(4,5)P2/PE-Rhodamine (72.2:10:15:2:0.8) (molar ratio) at a concentration of 3 mg mL −1 in chloroform. In the following, this GUV composition will be referred to as 2% PIP2-GUV. To compare CHMP protein binding to different PIP species, we replaced PI(4,5)P2 lipids at equal molar ratio by PI(3)P, PI(4)P, and PI(3,5)P2 lipids, respectively. In the following, these GUV compositions will be referred to as 2% PI(3)P-GUV, 2% PI(4)P-GUV, and 2% PI(3,5)P2-GUV.

SUV preparation for QCM and AFM experiments

After preparation of lipid composition 1, at 3 mg mL −1 , in chloroform, the solvent was evaporated by rotating the vial under a gentle stream of nitrogen, at room temperature and then was placed under vacuum for 20 min at room temperature. The dried lipid film was rehydrated in the appropriate growth buffer solution to obtain a final concentration of 1 mg mL −1 . The solution was vortexed for 2 min and then extruded 11 times through a polycarbonate track-etched membrane with pore sizes of 100 nm [85] or sonicated for 5 min until obtaining a clear colorless solution for small unilamellar vesicle (SUV) formation. Produced SUVs were either used freshly for QCM-D experiments and for HS-AFM indentation experiments or stored at − 20 °C in amber vials (Sigma-Aldrich, France) for further use. In the following, this SUV composition will be referred to as 10% PIP2-SUV.

To compare CHMP2B protein binding in the absence of PI(4,5)P2 and to increase the net negative charge of the membrane for QCM-D experiments, SUVs were produced containing DOPC/DOPS/DOPE/Cholesterol/PE-Rhodamine (44.2:30:10:15:0.8) (molar ratio) or (34.2:40:10:15:0.8), at a concentration of 3 mg mL −1 in chloroform referred to as 30% DOPS-SUV and 40% DOPS-SUV, respectively. Moreover, to compare CHMP2B protein binding to a membrane incorporating a higher amount of negative charges as well as PIP lipids, we replaced the 10% molar ratio of PI(4,5)P2 in the PIP2-SUV by 10% molar ratio of PI(3-5)P3 lipids. In all QCM-D experiments, quartz crystal resonance frequency shifts were measured at the overtone 5 of the oscillating crystal and therefore defined as ∆ϑ5.

CHMP supramolecular assembly on GUVs observed by fluorescence microscopy

Freshly produced 10% PIP2-GUVs were incubated with CHMP proteins at concentrations ranging from 50 nM to 2 μM in BP buffer (Tris 25 Mm, NaCl 50 mM pH 7.5) in isotonic conditions for 15 to 30 min. Then, CHMP-coated GUVs were diluted 20 times and transferred to the observation chamber, previously passivated with the β-casein solution and rinsed twice with BP buffer.

Supramolecular assembly of CHMP proteins on GUVs was visualized on an inverted Spinning Disk Confocal Roper/Nikon. The spinning disk is equipped with the camera, EMCCD 512 × 512 Andor Technology (pixel size 16 μm), an objective (× 100 CFI Plan Apo VCoil NA 1,4 WD 0,13), and 3 lasers (491, 561, 633 nm 100 mW). The exposure time for all images was 50 ms.

To further characterize and compare the interaction of CHMP proteins on GUVs, we measured the total intensity of the protein on the vesicle and normalized this value by the GUV area.

Image acquisition for protein quantification was performed using a confocal microscope composed of an inverted microscope (Eclipse TE2000 from Nikon), two objectives (× 60 water immersion and × 100 oil immersion), a C1 confocal head from Nikon, three lasers (λ = 488 nm, λ = 561 nm, and λ = 633 nm). One confocal plane image was taken for each set tension.

FACS experiment for protein-lipid binding assay

2% PI-GUV and CHMP fluorescence intensity was measured with a BD LSRFORTESSA flow cytometry instrument. Data analysis was performed with BD FACS Diva software.

The collected GUVs were transferred to BP buffer and incubated 30 min with CHMP proteins at 500 nM. The vesicle concentration was adjusted in order to count about 10,000 events per condition every 60 s at high speed.

2% PI-GUVs were labeled with Egg Rhod PE (0.8% w/w), CHMP2B labeled with Alexa 488, CHMP2A labeled with Alexa 488, and CHMP3 labeled with Alexa 633. Alexa 488 was excited with a 488-nm laser, and the emission was detected through a 530/30 standard bandpass filter. Alexa 633 was excited with a 633-nm laser, and the emission was detected through a 670/30 bandpass filter. Egg Rhod PE was excited with a 532-nm laser, and the emission was detected through a 610/20 bandpass filter. Two signals were closely analyzed: the protein fluorescent signal and the lipid fluorescent signal. Thus, the fluorescence intensity of the membrane and the fluorescence intensity of the proteins are respectively proportional to the amount of fluorophores in the vesicle and proteins bound to it or present in the detection zone and unbound. The intensity plot displaying the protein fluorescence signal as a function of the lipid fluorescent signal presents 3 regions: (i) unbound proteins (single-positive for proteins only in the top left quadrant), (ii) CHMP proteins bound to GUVs (double-positive for proteins and lipids in the top right quadrant), and (iii) GUVs free of proteins (single-positive for lipids only in the lower right quadrant).

QCM-D experiments

Supported lipid bilayers (SLBs) were generated with or without PIP lipids. In the absence of PI(4,5)P2, SLB made of 30% and 40% DOPS-SUV composition were produced with a buffer containing Ca 2+ (150 mM NaCl, 10 mM Tris (at pH 7.5) + 2 mM Ca 2+ ) [41]. After SLB formation, the bilayer was rinsed with the same buffer but supplemented with EDTA (150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA) to remove Ca 2+ excess. SLBs were also produced in the presence of PIP lipids (PI(4,5)P2 or PI(3-5)P3), with PIP2-SUV or PIP3-SUV lipid compositions, respectively. SLB formation was achieved in a buffer containing 150 mM KCl, 20 mM citrate pH = 4.8 [42]. Following SLB formation, CHMP proteins were injected at a concentration of 200 nM in BP buffer. The interaction between the proteins and the lipid bilayer was directly measured from the fifth overtone of the frequency shift (Δϑ5).

QCM-D measurements were performed using a Q-Sense E4 system (Q sense Gothenburg, Sweden). The mass sensor is a silicon dioxide-coated quartz crystal microbalance SiO2 (QSX-303 Lot Quantum Design France) with a fundamental frequency of 4.95 MHz. The liquid flow was controlled using a high-precision multichannel dispenser (IPC ISMATEC—Germany). All experiments were performed at room temperature with a flow rate of 50 μL min −1 .

Micropipette experiments

The experimental chamber and the micropipette made of a borosilicate capillary (1-mm outer diameter and 0.58-mm inner diameter (Harvard Apparatus, UK)) introduced into the chamber are passivated with a β-casein solution at 5 mg mL −1 in sucrose 25 mM, NaCl 50 mM, and Tris 25 mM (pH 7.5) for 15 min. The chamber is rinsed twice with BP buffer. Then, PIP2-GUVs pre-incubated with CHMP proteins are added to the chamber. Once the chamber is sealed with mineral oil, the zero pressure is measured and the aspiration assay can begin by decreasing the water height gradually, thus increasing the applied tension on the vesicle.

The explored tensions for the aspiration experiments with the different CHMP proteins range up to 1.6 mN m −1 (corresponding to the membrane enthalpic regime). The software EZ-C1 was used for the acquisition of the confocal images.

At high tension, in the enthalpic regime, an apparent elastic stretching modulus of the membrane χ can be deduced from the linear variation of the fractional excess area Δα ( ( Delta upalpha =pi _pleft(1-_p/_voperatorname<> ight)Delta _p/_0 ) where ΔLpag is the variation of the tongue length and A0 the initial area of the GUV) as a function of the applied tension σ using ( Delta alpha =Delta _0+frac<1>sigma ) [86], with ∆α0 being the initial excess area for the reference tension σ0. According to the Young-Laplace equation, the membrane tension is equal to ( sigma =Delta P imes _p/left(2 imes left(1-frac ight) ight) ) where ΔP is the difference of pressure between the interior of the micropipette and the chamber and Rpag y Rv are respectively the pipette and vesicle radius [63].

Osmotic shock on GUVs

10% PIP2-GUVs were either co-incubated with 500 nM CHMP2B-∆C in 50 mM NaCl and 25 mM Tris, at pH 7.4 buffer (CHMP protein binding buffer referred as BP buffer) or transferred to the same buffer free of protein (osmolarity equal to 125 mOsm L −1 ). CHMP2B-coated GUVs and CHMP2B-free GUVs were then transferred to a hyperosmotic buffer with increasing sodium chloride concentrations up to 250 mM NaCl. The effect of the osmotic shock was visualized using confocal microscopy.

HS-AFM imaging-based deformation experiment

PIP2-SUVs were immobilized on a freshly cleaved mica surface and placed into the AFM chamber with BP buffer. For studying the vesicles with proteins, prior to immobilization to the surface, the PIP2-SUVs were pre-incubated with either 1 μM of CHMP2B or 1 μM of CHMP2B + 2 μM of CHMP3 or 1 μM of CHMP2A + 2 μM of CHMP3 for 30 min to allow full protein coverage on the SUV surface. A high-speed amplitude modulation tapping mode AFM (RIBM, Japan) was used for imaging [87,88,89] and deformation experiments, with ultra-short cantilevers (spring constant 0.15 N/m, Nanoworld). Initial imaging (at minimum force) was performed at a free cantilever oscillation amplitude of 5.4 nm and a set-point amplitude at 4.3 nm. The imaging rate was 0.5 frame/s. We regulated the set-point amplitude in a stepwise manner, while keeping the free amplitude constant, in order to increase the imaging force. The imaging force can be estimated in the first approximation as F = kΔz, dónde k is the spring constant of the cantilever and Δz is the difference between free and set-point amplitude of the cantilever oscillation. It follows that the images were acquired with an estimated minimal force of

150 pN. For the measurement of membrane mechanics with and without proteins, image acquisition was first performed at minimal force (

150 pN). Next, step by step, the imaging force was increased with 9% increments, by decreasing the set-point amplitude. After reaching the maximal force, after

8 steps and an estimated final imaging force of

270 pN, the tapping force was reduced again to its lowest value (

150 pN), and the height recovery was recorded. Only those vesicles that exhibited a height recovery of at least 90% of their initial height were considered to be elastically deformed and were included in the analysis. Errors in the relative stiffness are given as standard error of the mean (SEM). Images were analyzed using IgorPro scripts of the AFM manufacturer (RIBM) and ImageJ scripts.



Comentarios:

  1. Frontino

    Quiero decir, permites el error. Puedo probarlo. Escríbeme en PM, discutiremos.

  2. Holgar

    Realmente curioso :)

  3. Trymian

    Vivamos.

  4. Maxfield

    Disculpe por lo que tengo que intervenir ... situación similar. Tenemos que hablar. Escribe aquí o en PM.

  5. Jaedon

    No diría que usando este enfoque y lógica, puedes venir a ese delirio. Entonces, no vale la pena, no vale la pena ... pero, en general, gracias, es realmente interesante y hay algo en qué pensar. ¡Todas las vacaciones felices y más ideas brillantes en ng! ¡Vamos a encender el 31!



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